Toxicidad aguda en semillas de lechuga

Angeles V, Itzel A; Pea G, Karla M; Ramrez V, Juan M; Valencia S, Sandra

Toxicologa 1752 Equipo 3

Resumen

El aumento de la investigacion ambiental en Mexico refleja la preocupacion publica por el medio ambiente. Es
por esto que se ha visto un auge en el uso de los bioensayos, ya que involucran el uso de un organismo vivo para
evaluar la toxicidad de un qumico, e igualmente proveen una imagen integrada de la toxicidad de un efluente,
una muestra de agua, sedimento o tierra de un lugar contaminado. Sabemos que la contaminacin ambiental por
compuestos de zinc resulta importante, al ser compuestos que entran al agua, aire y suelo como resultado tanto
de procesos naturales como de actividades humanas. En este caso el modelo utilizado fue semillas de lechuga
(Lactuca sativa) siendo la variedad Buttercrunch la recomendada por la EPA, FDA y OCDE; es por esto que en
este trabajo se realiz un bioensayo utilizando semillas de lechuga, con el fin de evaluar la toxicidad del acetato
de zinc sobre este organismo de prueba, mediante el estudio de la germinacin y el crecimiento del vegetal tras
una exposicin aguda al compuesto en evaluacin. Para el experimento se trabajaron cinco concentraciones de
0.05 %, 0.1 %, 0.15 %, 0.20 % y 0.30 % de acetato de zinc, un control positivo con solucin de cobre (II) al 4 %
y un control negativo (agua), llevando a incubacin de estas por 168 horas (7 das). Al trmino se cont el
nmero de semillas germinadas, y de estas se midi la longitud de la radcula e hipocotilo, con el fin de calcular
el porcentaje de inhibicin de la elongacin, obtenindose en el control positivo (Cu (II)) que ninguna semilla
germin, mientras que en el control negativo (H2O) se obtuvo una longitud mayor para la radcula e hipocotilo
en comparacin a todos los sistemas de prueba, en los cuales se obtuvieron porcentajes de inhibicin de la
elongacin de entre el 0.43 y 94.01 %, as como porcentajes de inhibicin de germinacin entre 1.43 y 7.86 %,
tiles para la construccin de una grfica dosis-respuesta, en la cual se determin una CL50 de 0.1585 %. Con
base en estos datos, y con la observacin de los efectos subletales (inhibicin de la elongacin, necrosis, etc.), se
determin la generacin de toxicidad aguda en el modelo biolgico y por consiguiente, el posible riesgo
ecolgico y en el humano del acetato de zinc.

Palabras clave: Lechuga, Lactuca sativa, acetato de zinc (II), toxicidad aguda, fitotoxicidad, bioensayo, germinacin, plntula, radcula,
hipoctilo.

Abstract

The increase of environmental research in Mexico reflects the public concern about the environment. Because of
this, theres been a rise in the use of bioassays to evaluate the toxicity of a substance: because they use a living
organism, they provide an integrated picture of the toxicity of an effluent, water, soil or sediment sample from a
polluted site. We know that the environmental contamination by zinc compounds is important, because they can
enter water, air and soil as a result of natural processes and human activities. In this paper, we utilized lettuce
seeds (Lactuca sativa) as a biomodel, considering that the Buttercrunch variety is the one recommended by the
EPA, FDA and OECD. These lettuce seeds were used to evaluate the toxicity of zinc acetate, determining the
vegetables rate of germination and growth after an acute exposure to the zinc compound. Five concentrations of
zinc acetate were used (0.05%, 0.1%, 0.15%, 0.2%, 0.3%), including also a positive control (4% copper (II)
solution) and a negative control (water). All the systems were incubated during 168 hours (7 days). At the end
the number of seeds that germinated was counted, and the length of the radicle and hypocotyl was measured in
order to calculate the percentage of inhibition of elongation, resulting in no seeds germinated with the positive
control (Cu (II)), while in the negative control (H 2O) a greater length for the radicle and hypocotyl was obtained
in comparison to all the tested systems, in which elongation inhibition percentages were obtained between 0.43
and 94.01%, as well as germination inhibition rates from 1.43 to 7.86%. These rates were used to make a dose-
response relationship graph, which was then used to determine the LC50 of the zinc acetate (0.1585%). Using the
LC50 and the observation of sublethal effects (such as elongation inhibition and necrosis) we were able then to
determine the generation of acute toxicity in the biological model and thus, the possible ecological and human
risk the zinc acetate poses.

Keywords Lettuce, Lactuca sativa, zinc acetate (II), acute toxicity, phytotoxicity, bioassay, germination, seedling, radicle, hypocotyl.

Introduccin la variedad Buttercrunch de la lechuga que es

recomendada por la Agencia de Proteccin
El aumento de la investigacion ambiental en Ambiental (EPA), la Administracin de
Mexico refleja la preocupacion publica por el Alimentos y Medicamentos (FDA) y la
medio ambiente. El uso de bioensayos para Organizacin para la Cooperacin y el
detectar cambios causados por agentes txicos Desarrollo Econmico (OCDE) (Cornell
se ha vuelto cada vez ms comn en estudios de University, 2009).
diagnstico y monitoreo. Como indica el
nombre, los bioensayos involucran el uso de un Las semillas de lechuga se han usado, entre
organismo vivo para evaluar la toxicidad de un otras cosas, para probar la efectividad del
qumico. Para usar dichos ensayos en una saneamiento de un suelo contaminado por
evaluacin ambiental, se requiere que posean plomo; disear estrategias de saneamiento para
ciertas caractersticas como: estar un sitio contaminado por el tratamiento de
estandarizados, ser sencillos, de bajo costo, madera con creosota y otros compuestos; y
tener un punto final definido, y ser lo analizar efluentes industriales (Cornell
suficientemente sensibles como para distinguir University, 2009).
diferencias entre lugares geogrficos (Paton et
al. 2005). El zinc es un metal de color grisceo,
oligoelemento esencial en los seres vivo, ya que
Los bioensayos proveen una imagen integrada se encuentra prcticamente en la totalidad de las
de la toxicidad de un efluente, una muestra de clulas, pero existe con mayor abundancia en
agua, sedimento o tierra de un lugar determinados tejidos animales. Este desempea
contaminado. Los bioensayos se basan en que el un papel importante en el crecimiento y
organismo de prueba reaccionar de una manera desarrollo, la respuesta inmunitaria, la funcin
predecible a distintos tipos de contaminantes neurolgica y la reproduccin. A nivel celular,
ambientales (Cornell University, 2009). la funcin del zinc puede ser cataltica,
estructura y reguladora. Casi 100 enzimas
El uso de plantas en los bioensayos es diferentes dependen del zinc para poder
especialmente til para la evaluacin de la incrementar la velocidad (catalizar) de las
fitotoxicidad en suelos contaminados por reacciones qumicas vitales (Rubio, 2007).
diversas sustancias, aunque la sensibilidad de
los parmetros de germinacin y crecimiento se La contaminacin ambiental por compuestos de
hayan puesto a debate (Da Silva et al., 2013). zinc resulta importante, ya que este es un
Las plantas son especialmente tiles para compuesto que entra al agua, aire y suelo como
evaluar efectos txicos de nuevos herbicidas, o resultado tanto de procesos naturales como
compuestos similares a herbicidas (Wang, actividades humanas. La mayor parte de este,
1991). entra al ambiente por el resultado de la minera,
la refinacin de minerales de zinc, plomo y
El usar semillas de lechuga (Lactuca sativa) cadmio, la produccin de acero, la incineracin
provee ventajas sobre otros organismos de de carbn y de desperdicios, el desage de
prueba: Son baratas, fciles de cultivar y no industrias, iodo, abonos, por su presencia en
requieren mantenimiento entre experimentos. Es pilas, bateras, pinturas, esmaltes, caucho, etc.
Todos los productos, actividades y procesos positivo con solucin de cobre (II) al 4% y un
antes mencionados, pueden aumentar los niveles control negativo (agua). Cada lote de acetato de
de zinc en aire, agua y suelo. En el caso del zinc se compona de 7 rplicas, cada una con 20
agua, la cantidad de zinc puede aumentar a plntulas.
medida que la acidez del agua aumenta. Este por
tanto es altamente txico para organismos Tras la incubacin de estas por 168 horas (7
acuaticos, as como plantas. Puede provocas a das) se cont el nmero de semillas
largo plazo efectos negativos en el medio germinadas, y de estas, se midi la longitud de
ambiente acuatico (ATSDR, 2005). la radcula e hipocotilo, con el fin de calcular el
porcentaje de inhibicin de crecimiento.
En este trabajo, se realiz un bioensayo
utilizando semillas de lechuga (Lactuca sativa), Resultados
con el fin de evaluar la toxicidad del acetato de
zinc sobre este organismo de prueba, mediante Los resultados reportados para el experimento
el estudio de la germinacin y el crecimiento del incluyen el nmero y porcentaje de semillas
vegetal (radcula e hipocotilo) tras una germinadas que se obtuvieron en cada sistema.
exposicin aguda al compuesto en evaluacin. Esto se observa en la tabla No. 1. Adems, cabe
sealar que en los sistemas utilizados como
Metodologa controles negativos, la no germinacin fue del
100% (es decir, que ninguna de las semillas
Para el experimento se trabajaron siete lotes de prolifer), mientras que en el control positivo, la
germinados de lechuga: cinco en no germinacin fue nula, pues todas las semillas
concentraciones de 0.05 %, 0.1 %, 0.15 %, 0.20 utilizadas lograron germinar.
% y 0.30 % de acetato de zinc, un control

Tabla No. 1.- Resultados de semillas de lechuga germinadas.

Equi No Germinadas % No Germinadas
po
0.05% 0.10% 0.15% 0.20% 0.30% 0.05% 0.10% 0.15% 0.20% 0.30%

1 0 0 0 0 5 0 0 0 0 25

2 3 0 0 0 0 15 0 0 0 0

3 1 0 1 0 0 5 0 5 0 0

4 2 0 0 0 3 10 0 0 0 15

5 0 0 2 4 0 0 0 10 20 0

6 1 2 2 4 1 5 10 10 20 5

7 0 0 1 3 0 0 0 5 15 0

7 2 6 11 9 35 10 30 55 45

1 0.29 0.86 1.57 1.29 5 1.43 4.28 7.86 6.43

El nmero de semillas para cada sistema fue de 20. Se muestra el nmero de semillas que germinaron
as como el porcentaje que estas representan en comparacin con el total de semillas evaluadas (20)
 en cada uno de los sistemas tras la explosin a Zn(O2CCH3) en concentraciones de 0.05%, 0.10%,
0.15%, 0.20% y 0.30%. Asi, la CI50 indica la concentracion a la que se inhibe en un 50 % la
germinacin.
Adems de la germinacin o no de las lechugas, longitud de la radcula disminuy a medida que
que indica la viabilidad de estas, en el aumentaba la concentracin de Acetato de Zinc
experimento se consider tambin la longitud de en el sistema, sucediendo lo mismo con la
crecimiento de la radcula y el hipocotilo de las longitud del hipocotilo. Como la viabilidad de
plntulas. Estos resultados aparecen en la tabla las semillas en los controles negativos fue nula,
No. 2. Como se observa en esta tabla, la se toma la longitud como 0 cm.

Tabla No. 2 .- Resultados para la longitud del crecimiento de radcula e hipocotilo con diferentes
tratamientos.
Equi Zn(O2CCH3) Zn(O2CCH3) Zn(O2CCH3) Zn(O2CCH3) Zn(O2CCH3) C+ (Cu (II) C- (H2O)
po 0.05% 0.10% 0.15% 0.20% 0.30% 4%)

Radc Hipo Radc Hipo Radc Hipo Radc Hipo Radc Hipo Radc Hipo Radc Hipo
ula cotilo ula cotilo ula cotilo ula cotilo ula cotilo ula cotilo ula cotilo
(cm) (cm) (cm) (cm) (cm) (cm) (cm) (cm) (cm) (cm) (cm) (cm) (cm) (cm)

1 1.05 2.78 0.51 1.57 1.07 1.24 0.025 0.345 0.155 0.2 0 0 - -

2 1.9 2.2 0.92 0.71 0.52 1.62 0.075 0.25 0.13 0.1 - - 1.67 2.31

3 0.65 1.78 0.365 1.48 0 0.16 0.24 0.48 0.115 0.4 0 0 - -

4 0.52 1.47 0.21 0.12 0.2 0 0.1 0 0.1 0 0 0 - -

5 0.915 2.4 0.3 1.1 0.01 0.17 0.06 0.47 0.01 0.11 - - - -

6 1 2.72 0.12 0 0.15 0 0.15 0.15 0.12 0 - - - -

7 1.03 2.8 0.33 0.84 0.15 0.34 0.1 0.24 0.06 0.26 0 0 - -

1 2.3 0.39 0.83 0.3 0.5 0.11 0.28 0.1 0.15 0 0 1.67 2.31

s 0.44 0.52 0.26 0.61 0.38 0.65 0.07 0.17 0.05 0.14 0 0 - -

El nmero de semillas para cada sistema fue de 20. Se muestran los valores promedio de la longitud
de la radcula e hipocotilo que se obtuvieron tras la explosin a Zn(O2CCH3) en diferentes
concentraciones (0.05%, 0.10%, 0.15%, 0.20% y 0.30%).

Con el fin de calcular la concentracin letal 3, donde se observa que para el sistema con una
media (CL50) del acetato de zinc sobre las concentracin de acetato de zinc de 0.05%, el
semillas de lechuga, se debe calcular el crecimiento de la la radcula se inhibe en un
porcentaje de inhibicin del crecimiento de la 40.12%, mientras que la inhibicin del
radcula y el hipocotilo para cada sistema crecimiento del hipocotilo se acerca a 50% en el
(concentracin de acetato de zinc) utilizado, sistema con concentracin de 0.10%, donde la
teniendo en cuenta el crecimiento de los inhibicin se da en un 64.07%.
sistemas control. Esto se refleja en la tabla No.
Tabla No. 3. Porcentaje de inhibicin de la elongacin de la radcula y el hipocotilo para cada
tratamiento respecto al control negativo.
Zn(O2CCH3) Zn(O2CCH3) Zn(O2CCH3) Zn(O2CCH3) Zn(O2CCH3)
0.05% 0.10% 0.15% 0.20% 0.30%
Radcula Hipoco Radcula Hipoco Radcula Hipoco Radcula Hipoco Radcula Hipocot
tilo tilo tilo tilo ilo

% 40.12 0.43 76.65 64.07 82.03 78.35 93.41 87.88 94.01 93.51
Inhibi-
cin
Los resultados reportados indican el porcentaje de inhibicion de la longitud de la radicula e
hipocotilo, comparado con las longitudes de los recipientes de control (sin sustancia toxica).

A partir de los resultados obtenidos en la tabla esta grfica y realizar el clculo

No. 1, se puede trazar la grfica No. 1, que correspondiente, se encuentra que la CL50 que
contrasta la inhibicin de la germinacin de las presenta el acetato de zinc sobre las semillas de
semillas contra la concentracin de acetato de lechuga es de 0.1585%, es decir, una
zinc en cada sistema. Para obtener la CL50, se concentracin cercana al tercer sistema utilizado
realiza una curva dosis-respuesta (grfica No. 2) en la experimentacin (0.15%).
a partir de la primera grfica. Al interpolar en

Grfica No. 1. Porcentaje de inhibicin de la germinacin vs concentracin de acetato de zinc.

Grfica No. 2. Curva dosis-respuesta para acetato de zinc.

Clculo de la CL50:
CL50= 10-0.8
CL50= 0.1585 %

Anlisis de resultados para la especie utilizada, expresada como CL50 o

CE50, estas se refieren a la concentracin que
El bioensayo de toxicidad con semillas de provoca un efecto en el 50% de las semillas
lechuga (Lactuca sativa) es una prueba estatica expuestas en el ensayo. Al realizar la curva
de toxicidad aguda (120 horas de exposicion) en dosis-respuesta, considerando el efecto letal
el que se pueden evaluar los efectos fitotoxicos analizado (inhibicin de la germinacin), se
de compuestos puros o de mezclas complejas en determin una CL50 de 0.1585 %, es decir, que a
el proceso de germinacion de las semillas y en el esta concentracin del txico evaluado debera
desarrollo de las plantulas durante los primeros de presentarse inhibicin de la germinacin en
dia s de crecimiento. Como puntos finales para la la mitad de los individuos de la poblacin
evaluacion de los efectos fitotoxicos, se expuesta, sirviendo esto como parmetro para
determina la inhibicion en la germinacion y la establecer un rango seguro de exposicin a este
inhibicion en la elongacion de la radic ula y del compuesto. Como segundo grupo se encuentran
hipocotilo (Sobrero y Ronco, 2004). las de tipo crnico o subletales, que son pruebas
que tienen como finalidad evidenciar repuestas
Las respuestas de estas pruebas de laboratorio que no implican la muerte de la semilla
para definir ecotoxicidad pueden ser clasificadas evaluada; en este ensayo se determinan factores
en dos grupos: agudas o letales, en este caso las como la conducta de la semilla, fecundidad,
semillas son sometidas a diferentes desarrollo y bioacumulacin, entre otros (Lpez,
concentraciones del contaminante. Al realizar 2007).
este procedimiento se espera obtener respuestas
con base en la mortalidad que permitan indicar Es importante destacar que durante el perio do de
el grado de toxicidad del elemento o compuesto, germinacion y los primeros dias de desarrollo de
la plantula ocurren numerosos procesos reparacin. As mismo modifica la transduccion
fisiologicos en los que la presencia de una de senales, modula la expresion de genes, altera
sustancia toxica puede interferir alterando la la respuesta inmune y afecta la homeostasis
supervivencia y el desarrollo normal de la celular (Hendricks, et al., 2004)
planta, siendo por lo tanto una etapa de gran
sensibilidad frente a factores externos adversos El zinc tambin puede producir citotoxicidad
(Sobrero y Ronco, 2004). por un detrimento de los niveles de glutation
reducido y un incremento de los niveles de la
As pues, con la germinacin de la planta se da forma oxidada del glutation. Tambien in vitro y
el rompimiento de la envoltura seminal, por a niveles elevados, produce muerte celular
medio de factores ajenos a la planta, como lo es debido a que en primer lugar es capaz de
la humedad y la temperatura; las cuales generan generar especies reactivas de oxig eno y en
un espacio adecuado para su germinacin, para segundo lugar a que activa la cascada de la
llegar a la formacin de la planta el embrin MAP-kinasa (Hernndez, 2009). De esta forma,
debe sobrepasar las siguientes fases: Fase de al entrar en contacto con las semillas al estar
hidratacin: La absorcin de agua es el primer estas en su proceso de germinacin, su
paso de la germinacin, sin el cual el proceso no crecimiento se ver afectado ya que su material
puede darse. Durante esta fase se produce una gentico (ADN) se encontrar afectado
intensa absorcin de agua por parte de los directamente por dicho compuesto, produciendo
distintos tejidos que forman la semilla. Dicho que no la semilla no germine o el crecimiento de
incremento va acompaado de un aumento la radcula y el hipocotilo sea diferentes en
proporcional en la actividad respiratoria. Fase comparacin con las de las plntula control -.
de germinacin: Representa el verdadero
proceso de la germinacin. En ella se producen Cabe mencionar que en el ser humano el
las transformaciones metablicas, necesarias principal efecto txico del zinc parece derivar de
para el correcto desarrollo de la plntula. En esta su interferencia con el metabolismo normal del
fase la absorcin de agua se reduce cobre, lo que conduce a una anemia por
considerablemente, llegando incluso a detenerse. deficiencia de ste en caso de nutricin
Fase de crecimiento: Es la ltima fase de la parenteral o en personas con ingestas
germinacin y se asocia con la emergencia de la prolongadas superiores a 150 mg/da. Otras
radcula (cambio morfolgico visible). Esta fase alteraciones que se pueden presentar consisten
se caracteriza porque la absorcin de agua en erosiones gstricas, depresin del sistema
vuelve a aumentar, as como la actividad inmune y disminucin del colesterol plasmtico
respiratoria. (Snchez y Snchez, 2009) unido a las protenas de alta densidad. Dichas
situaciones son poco frecuentes por el amplio
Por otra parte, muchas de las reacciones y margen existente entre ingesta normal y txica,
procesos involucrados son generales para la gran sealndose que los efectos adversos aparecen
mayoria de las semillas, por lo que la respuesta slo cuando se ingiere en cantidades superiores
de esta especie y los datos obtenidos a partir de a 4 8 g de zinc. (Rubio, 2007)
la aplicacion de esta prueba son en gran medida
representativos de los efectos en semillas o As pues, en la prueba tradicional de
plantulas en general (Sobrero y Ronco, 2004). germinacion de semillas, la evaluacion del
efecto en la elongacion de la radic ula y del
En el caso especfico del zinc, este puede hipocotilo de las plantulas permite ponderar el
inducir genotoxicidad, generando dano al ADN. efecto toxico de compuestos solubles presentes
Puede formar entrecruzamientos, y de forma en niveles de concentracion tan bajos que no son
directa e indirecta inhibe la reparacion del ADN suficientes para inhibir la germinacion, pero que
al interactuar una gran variedad de enzimas de sin embargo pueden retardar o inhibir
completamente los procesos de elongacion de la Otro aspecto a considerar es el mayor desarrollo
radic ula o del hipocotilo, dependiendo ello del en la elongacion de la radic ula o el hipocotilo en
modo y sitio de accion del compuesto (Sobrero algunas muestras con respecto al control. La
y Ronco, 2004). Este proceso de inhibicin de exaltacion en un punto final u hormesis no debe
elongacin se puede observar en la tabla 2, en el ser interpretada como un efecto favorable o
que se presentan los resultados para todos los estimulante. Si bien es posible que muchos
sistemas y cmo es que en diferentes lotes compuestos (por ejemplo Cu, Zn) a bajas
expuestos a las mismas concentraciones de concentraciones produzcan exaltacion por ser
txico, van a variar en cuanto al efecto final, micronutrientes vegetales (Sobrero y Ronco,
dando una perspectiva amplia de la importancia 2004).
de la ecotoxicologa, ya que, no todos los
organismos presentan la misma respuesta final, Finalmente, a travs de esta prueba es posible
por lo que es necesario realizar promedios de evaluar el efecto de la adicin de bioslidos al
todos los resultado, as como la determinacin suelo sobre las semillas de lechuga (Lactuca
de la varianza para poder observar que tanto sativa L.). Este bioensayo es importante para
variaron los resultados de los diferentes lotes determinar la madurez de los bioslidos y sus
frente a la misma concentracin. niveles de toxicidad sobre las semillas. La
germinacin debe estar por sobre el 50% para
Teniendo en cuenta el resultado del promedio y considerar que no produce efectos negativos
la desviacin estndar, se determin el sobre las plntulas (Sobrero y Ronco, 2004).
porcentaje de inhibicin de la elongacin, como
se muestra en el tabla No. 3, donde se puede Conclusiones
observar que los valores oscilan entre 0.43 y
94.01 %, estos valores fueron determinados con Se realiz un bioensayo utilizando semillas de
respecto al control negativo, es decir, el grupo lechuga (Lactuca sativa), con el fin de evaluar la
no expuesto al txico de prueba, notndose as toxicidad del acetato de zinc sobre este modelo
que mientras se incrementa la concentracin del biolgico, mediante el estudio de la germinacin
compuesto evaluado, aumenta a su vez la y el crecimiento del vegetal (radcula e
presencia de rasgos indicativos del efecto hipocotilo) tras una exposicin aguda al
subletal, reflejados en los porcentajes ya compuesto de prueba. Se determin que en las
mencionados. Cabe destacar que la radcula semillas de lechuga el acetato de zinc presenta
present mayor sensibilidad desde las en una CL50 de 0.1585 %, valor al cual la mitad
concentraciones ms bajas, indicando que el de la poblacin expuesta debera inhibir su
acetato de zinc daa primordialmente esta zona germinacin, y aunado a la observacin de
de la plntula en el proceso de elongacin. efectos subletales consistentes en la inhibicin
de la elongacin de la radcula e hipocotilo en
Los efectos cuantificados sobre la elongacion de un rango del 0.43 al 94.01 %, se determina que
la radicula o del hipocotilo son efectos el compuesto evaluado produce efectos txicos
subletales. La inhibicion en la germinacion agudos en el modelo biolgico, y por tanto,
podria considerarse como un efecto letal podra considerarse tambin de riesgo para el ser
siempre y cuando se pueda corroborar que humano y a nivel ecolgico.
finalizada la exposicion a una muestra las
semillas no germinaron por muerte del embrion Referencias
y que no existe simplemente un retraso en el
proceso de germinacion, manteniendose la Agencia para Sustancias Txicas y el Registro
viabilidad de la semilla (Sobrero y Ronco, de Enfermedades (ATSDR). (2005). Resea
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