Trabajo Práctico N°2

Ensayo de toxicidad aguda con semillas de lechuga

Lactuca sativa L.

Resumen ● Retraso en la germinación y desarrollo de

plántulas.
Utilizando CuSO4, el objetivo del presente trabajo ● Inhibición en la expansión foliar.
fue evaluar los efectos fitotóxicos de este compuesto ● Efecto en el crecimiento y desarrollo de las
en la germinación de las semillas de lechuga (Lactuca raíces:
sativa L.) y en el desarrollo de sus plántulas. Para ello, Inhibición mitótica en el meristema apical.
se realizaron diferentes diluciones de una solución Desarrollo de raíces cortas y gruesas.
madre de CuSO4. Luego se prepararon 9 placas de petri, Reducción de la biomasa radical.
7 de ellas fueron rotuladas con las diluciones y las
Necrosis radical y en la zona de transición
restantes fueron los controles (como control positivo
se utilizó ZnSO4). En cada placa se colocaron filtros
raíz-tallo.
Whatman, que fueron saturados con 5 ml de dilución y Inhibición en la formación de raíces laterales.
se agregaron 10 semillas por placa. Todas fueron ● Disminución en el contenido proteico de las
incubadas a 22°C y en oscuridad durante 5 días. Por hojas.
último, se registraron los signos de fitotoxicidad, se ● Aumento en la permeabilidad de la
midió la elongación de la radícula y del hipocótilo. Con membrana plasmática y daño en el sistema
los datos obtenidos se calculó el porcentaje de de endomembranas.
inhibición CI50. ● Efecto en la actividad de enzimas
antioxidantes.
Palabras clave— Efecto fitotóxico, CuSO4, semillas ● Disminución del Hierro y Manganeso en raíz y
de lechuga, radícula, hipocótilo, CI50.
alteraciones en la translocación hacia el
tallo.[1]
Introducción
El sulfato de cobre tiene numerosas aplicaciones
Existen diferentes respuestas entre distintas como alguicida en el tratamiento de aguas,
especies de plantas vasculares respecto de los fabricación de concentrados alimenticios para
niveles de tolerancia o toxicidad frente a la exposición animales, abonos, pesticidas, mordientes textiles,
a metales pesados, siendo la Lactuca sativa una de industria del cuero, pigmentos, baterías eléctricas,
las más sensibles. Esta especie es de fácil y rápida medicina, preservantes de madera, industria del
germinación por lo que es posible desarrollar las petróleo, entre otros. [2]
pruebas en pocos días. Los metales pesados son uno de los mayores
El cobre interviene en numerosas reacciones contaminantes y más extendidos grupos de
redox: interviene en la actividad de la enzima polifenol contaminantes en los ambientes por su naturaleza
oxidasa, (teniendo un papel importante en el persistente y su lenta eliminación del medio. Es por
metabolismo de la pared celular), participa de muchas ello que es necesario estudiar su toxicidad.
metaloenzimas que intervienen en procesos Por otro lado, si bien se conoce que el zinc es un
metabólicos de oxidación/ reducción y participa de microelemento necesario para la biosíntesis y
metaloproteínas como la plastocianina (proteína metabolismo de los organismos, también puede ser
presente en los tilacoides y que interviene en muy tóxico para la biota si se excede de las
procesos de transporte de un electrón entre el cantidades traza requeridas. En general, el zinc es un
citocromo f y el fotosistema I durante la fotosíntesis). elemento esencial que actúa como un nutriente
En concentraciones levemente superiores a los vegetal y que es asimilado temprano por las plantas,
requerimientos esenciales para el metabolismo por este motivo, en cantidades elevadas, puede ser
celular, este elemento es sumamente tóxico para la altamente fitotóxico. Es un componente de las
biota. Los efectos fitotóxicos son: metaloenzimas o un cofactor de varias enzimas y
juega un rol importante en la regulación del
● Alteraciones en la fotosíntesis, tales como: metabolismo del nitrógeno, la multiplicación celular,
Genera síntomas de clorosis. fotosíntesis y síntesis de auxinas en plantas, asi como
Inhibición en el transporte de electrones hacia tambien de la sintesis de acidos nucleicos [3]. A pesar
el FSI, por competencia con el hierro. Como de tener todas estas utilidades, muchos autores han
consecuencia, se reduce la actividad encontrado que a niveles elevados, generan retraso
fotoquímica del FSII. en el crecimiento, rizado y enrollamiento de las hojas
Alteraciones en la estructura y composición jóvenes, muerte de las puntas de las hojas y clorosis.
de membranas tilacoides y peroxidación En muchos estudios, entre 100 y 1000 uM después
lipídica de las mismas. de 4 días genera la muerte de las especies vegetales
Disminución en la fijación de CO2. [4].

1
 El ensayo de Lactuca sativa es un método muy 1. Se prepararon diluciones partiendo de una
utilizado para determinar la contaminación del agua, solución de sulfato de cobre 1 g/l, abarcando el
sin embargo no es el único que permite realizar este intervalo de concentraciones 100, 50, 25, 12, 6, 3
tipo de valoración. El bioensayo con Selenastrum y 1.5% (diluciones seriadas al medio, donde el
capricornutum ha sido utilizado también como 100% corresponde al sulfato de cobre sin diluir).
herramienta para el análisis de la calidad del agua. 2. Luego se prepararon 9 placas de cultivos, de los
Un estudio realizado en Bogotá, con fines cuales 7 se rotularon con el porcentaje de dilución.
comparativos, para verificar la sensibilidad de ambos Las dos placas restantes correspondieron a los
métodos, demostró que no existen diferencias controles: una al blanco de agua y la otra, al
significativas entre los mismos. En este ensayo se control positivo.
determinó la sensibilidad de cada organismo frente a 3. Se preparó la dilución del control positivo: Sulfato
Zn (II) como tóxico de referencia para homologar los de Zinc 1 M.
resultados entre S.capricornutum y L. sativa. Sin 4. Se cortó y colocó un disco de 90 mm de papel de
embargo, con S. capricornutum se observaron filtro Whatman en cada placa.
grandes variaciones entre los resultados; por lo cual 5. Se saturó el papel (humedeciendolo) con 5 ml de
se utilizó Cr (VI). Para L. sativa se obtuvo un valor de la dilución o control correspondiente, para evitar la
CE50-120h de 24.48 mg Zn+2/L y para S. formación de bolsas de aire.
capricornutum un valor de CE50-96h de 0.29 mg 6. Se colocaron 10 semillas por cada placa con la
Cr+6/L. Para evaluar la sensibilidad de los indicadores, ayuda de una pinza, de manera que queden
se seleccionaron dos muestras de agua en el río separadas entre sí con el espacio suficiente para
Bogotá y otra en el efluente de la Planta de permitir la elongación de las raíces.
Tratamiento de Aguas Residuales El Salitre [5]. 7. Se taparon las placas y se las colocó en bolsas
Otro tipo de estudio, similar al implementado en plásticas para evitar la pérdida de humedad.
este trabajo de laboratorio, fue el realizado como 8. Se incubaron las placas a 22 ºC y en oscuridad
biomonitoreo de calidad del agua en el Río Chalma, (algunas semillas requieren de esta condición para
México. En este ensayo se intentó evaluar la toxicidad germinar: se trata de semillas fotoblásticas
de un ecosistema dulceacuícola y establecer un negativas).
índice biológico que permita conocer y determinar las 9. Por último se Incubaron por 120 horas (5 días).
condiciones de contaminación del agua del río. Para
ello se eligieron seis sitios de monitoreo Finalmente, para el análisis de resultados, se
representativos a lo largo del cauce, cuatro de ellos visualizó mediante el uso de una lupa, los signos de
ubicados en el Estado de México y dos en el estado fitotoxicidad (necrosis, efecto en pelos absorbentes,
de Morelos. Los resultados se analizaron con etc). Se registraron las semillas germinadas y se
métodos multivariados: un análisis de componentes midió la elongación de la radícula y del hipocótilo.
principales y uno de similitud. Se diferenciaron tres Con estos datos se calculó el porcentaje de inhibición
zonas de acuerdo con los índices de toxicidad CI50 (a partir de tablas Probit).
obtenidos: 1) los tres primeros sitios de estudio
presentaron valores positivos y bajos en toxicidad,
con altas concentraciones de nutrientes, que podrían Resultados y Discusión
estar promoviendo la elongación radical, 2) la parte
media representada por el cuarto sitio, obtuvo el A partir de la generación de tres réplicas, de cada
índice de elongación radical más bajo, lo que clasificó ensayo, utilizando un porcentaje particular de
a este sitio en la categoría de toxicidad moderada y 3) concentración de sulfato de cobre (100, 50, 25, 12.5,
la parte baja del río, cuyos índices clasificaron a esta 6, 3, 1.5) y mediante lupa, es decir confirmación
zona con toxicidad de moderada a baja. Esta parte visual (Fig.1 en anexo), se verificó que al máximo
del río estuvo además asociada con la acumulación porcentaje de concentración no se visualiza
de compuestos lixiviados durante la época de lluvias. germinación en absoluto y que a una concentración
Finalmente, los índices obtenidos mostraron que la de 1.25% la germinación es completa, sin embargo ya
sensibilidad del bioensayo de germinación de las a 3% se observa que comienza a generar efecto
semillas de Lactuca sativa generó respuestas (Fig.2).
biológicas integradoras. Como conclusión los autores Por otra parte se calculó la CI50 (concentración
determinaron que la información podía ser utilizada inhibitoria que se observa en el 50% de los
para la evaluación de riesgos ecotoxicológicos [6]. organismos expuestos) correspondiente a la
germinación, siendo el valor obtenido de 34.
En este trabajo de laboratorio el objetivo final
consistió en evaluar los efectos fitotóxicos de una
solución de sulfato de cobre en el proceso de
germinación de las semillas de Lactuca sativa L. y en
el desarrollo de las plántulas durante los primeros
días de crecimiento.

Materiales y métodos

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Fig.2-Gráfico en donde se observa, del lado izquierdo los controles (blanco Fig.3 - Gráfico que representa la relación concentración-respuesta del
C- y con ZnSO4 C+), y con las distintas concentraciones de sulfato de cobre hipocótilo al sulfato de cobre, convertido mediante tabla Probit con su
a partir de la concentración al 100%, y siguiendo con las 50, 25, 12.5, 6, 3, respectiva línea de tendencia. Mediante el uso de la ecuación se calcula
1.25 %. CI50=11.9.

Para la dilución al 25% de sulfato de cobre se El mismo procedimiento anterior se realizó para el
observó un crecimiento fúngico en una de las cálculo del efecto en la radícula, es decir calculando
réplicas, con lo cual se tomó la decisión de eliminar el promedios de los valores obtenidos en el ensayo de
ensayo afectado teniendo en consideración que la medición y luego normalizandolos al valor del
cantidad de réplicas era mínima, sin embargo el promedio del control negativo. Por último se analiza
hongo presentaba una variante de error que se mediante tabla Probit y se genera un gráfico (ver
consideró superior a lo que brindaría eliminar la Fig.4) para obtener la ecuación de la línea de
réplica completa. Lo que también se observó fue que tendencia que finalmente permitió analizar el valor al
el control positivo, es decir aquel que contiene sulfato cual se produce inhibición del 50%. Se obtuvo que
de zinc, presentó una germinación casi igual que en CI50 correspondía a una concentración de 0.65% de
el caso del sulfato de cobre en concentración 6%, sulfato de cobre. Este valor no podría haberse
esto se considera un error experimental ya que el obtenido con las muestras que se tomaron ya que fue
sulfato de zinc por bibliografía [3][7] se utiliza como inferior a la concentración mínima analizada en este
parámetro para el análisis de contaminación con lo ensayo. Únicamente fue posible mediante el uso de la
cual no debería haber mostrado germinación en ecuación de la línea de tendencia obtenida a partir del
absoluto así como en el caso del sulfato de cobre a gráfico realizado.
los máximos porcentajes. Según el procedimiento
para los ensayos de toxicidad aguda, la aceptabilidad
de los resultados se otorga siempre y cuando, en el
control positivo, el porcentaje de germinación sea
inferior al 90%, entre otras consideraciones [8]. Al no
cumplirse este parámetro sería conveniente realizar el
procedimiento nuevamente.
Por otro lado, de la totalidad de las semillas
germinadas, se midieron tanto la cantidad de
crecimiento (elongación) de la radícula como del
hipocótilo. Los análisis se generaron para las
distintas concentraciones de sulfato de cobre y para
los controles.
En el caso del hipocótilo se calcularon los Fig.4 - Gráfico que representa la relación concentración-respuesta de la
promedios de todas las muestras para cada Radícula al sulfato de cobre, convertido mediante tabla Probit con su
respectiva línea de tendencia. Mediante el uso de la ecuación se calcula
concentración y a estos datos se los normalizó al CI50=0.65.
valor del promedio obtenido para el control negativo
(es decir el blanco). Una vez obtenidos los Como se indicó, los valores obtenidos de CI50
parámetros estandarizados se analiza el valor de para el hipocótilo y la radícula fueron de 11.9 y 0.65
CI50 a partir de la relación concentración-respuesta, respectivamente, lo que indicaría que el sulfato de
siendo la CI50 aquella concentración de la sustancia cobre afecta más rápidamente o con mayor
que causa un 50% de inhibición de la variable intensidad a la radícula que al hipocótilo ya que solo
estudiada con respecto al control. Por este motivo se una mínima cantidad de este compuesto (menos del
analizan los datos a partir de gráficos (ver Fig. 3) y de 1%) genera una inhibición al crecimiento del 50% de
cálculos implementando la tabla Probit (que si bien es las muestras. Sin embargo, el efecto que genera en el
utilizada para analizar mortalidad también se hipocótilo no es muy distinto ya que solo casi un 12%
implementa en los casos de inhibición), en donde se ya afecta a la mitad de la población estudiada en un
observó que la concentración a la cual se verifica un plazo de 120 hs o 5 días.
50% de inhibición es 11.9% de sulfato de cobre. Verificando la resolución 336/03 de la provincia de
Bs. As. se observó que los límites de vuelco de Cobre
en la colectora cloacal deben ser menores a 2 mg/l y

3
en el caso de pluvial o superficial deben ser inferiores Agradecimientos
a 1 mg/l. Por otro lado, la resolución 734/14 establece
un sistema de permisos para el vuelco de efluentes Agradecemos a las profesoras Andrea Guillade, Valeria
líquidos que depende de cada situación en particular Cappa y Estefania Achilli por proporcionarnos los datos
y no define específicamente los lineamientos técnicos necesarios para llevar a cabo el análisis fitotoxicológico de
para llevar a cabo los estudios requeridos que una solución de sulfato de cobre en semillas de lechuga
Lactuca sativa L. y lograr tener una impresión de cómo
permitan acceder a los permisos. Debido a que estas
hubiese sido la práctica en el laboratorio.
resoluciones, actualmente vigentes, establecidas por
la misma autoridad (ADA) mantienen dos criterios
científicos distintos para regular el vuelco de efluentes
se puede evidenciar que no existe una Referencias
reglamentación integral para el cumplimiento de los [1] Sobrero, M. C.; Estudio de la fitotoxicidad de
estándares [9]. metales pesados y del herbicida glifosato en ambientes
acuáticos. Bioensayo con plantas vasculares como
organismos diagnóstico. Universidad Nacional de La Plata,
Conclusiones 2010.
[2] Romero Alvarado, B. R. Determinación de la
Como conclusión, al realizar una comparación concentración letal media (CL50) producida por sulfato de
entre los resultados obtenidos en este ensayo de cobre en alevines de tilapia roja. Universidad técnica de
laboratorio y la legislación Argentina para el vertido de Machala, 2014.
efluentes, teniendo en cuenta que la concentración al [3] Gyana Rout, Premananda Das. Effect of Metal
100% de sulfato de cobre correspondía a una Toxicity on Plant Growth and Metabolism: I. Zinc.
Agronomie, EDP Sciences, 2003, 23 (1), pp.3-11.
concentración de 1 g/l, se puede observar claramente
ff10.1051/agro:2002073ff. ffhal-00885964
que, para el caso del cobre, la legislación no es [4] G. M. Amado Filho, C. S. Karez, L. R. Andrade, Y.
consecuente con las necesidades Yoneshigue-Valentin, W. C. Pfeiffer, Effects on Growth and
ambientales/ecológicas de las especies vegetales Accumulation of Zinc in Six Seaweed Species,
más sensibles en los estadios de mayor relevancia Ecotoxicology and Environmental Safety, 37, 223–228
(germinación). (1997), Article NO.ES971541, Río de Janeiro.
Analizando datos específicos, en el caso de las [5] B. J. Young, N. I. Riera, M. E. Beily, P. A. Bres, D. C.
semillas de lechuga (Lactuca sativa L.), el CI50 para Crespo, A. E. Ronco, Toxicity of the effluent from an
el hipocótilo es del 11.9% de la solución madre de anaerobic bioreactor treating cereal residues on Lactuca
sativa, Ecotoxicology and Environmental Safety, V76,
sulfato de cobre (0.119 g/l) y para la radícula solo el
February 2012, Pages 182-186.
0.65% (0.065 g/l), denotando que se necesitan [6] A. J. Rodriguez Romero, C. A. Robles Salazar, R. A.
mejores resoluciones legales que contemplen no solo Ruiz Picos, E. Lopez Lopez, J. E. Sedeño Diaz, A.
la cantidad de vertido (que claramente no es la Rodriguez Dorantes, Índices de germinación y elongación
correcta para este tipo de especies) sino también radical de Lactuca sativa en el biomonitoreo de la calidad
conocer la vulnerabilidad de los acuíferos, los niveles del agua del río Chalma, Rev. Int. Contam. Ambient vol.30
ya remanentes de microelementos en los mismos que no.3 México ago. 2014.
podrían ser adicionados a los efluentes descargados, [7] Rouphael, Y., Colla, G., Bernardo, L., Kane, D.,
cómo es la fluidez de los ríos, de qué manera y a qué Trevisan, M., & Lucini, L. (2016). Zinc Excess Triggered
Polyamines Accumulation in Lettuce Root Metabolome, As
velocidad se genera el flujo de los nutrientes en los
Compared to Osmotic Stress under High Salinity. Frontiers
ciclos biogeoquímicos (lo que brindaría la posibilidad in plant science, 7, 842.
de generar un parámetro si se necesitan descargar https://doi.org/10.3389/fpls.2016.00842
efluentes en lagos o lagunas) y cómo afecta la [8] G. Castillo, Ensayos toxicológicos y métodos de
temperatura y el pH a la cantidad de descarga que se evaluación de calidad de aguas. Estandarización,
produce. intercalibración, resultados y aplicaciones. IDRC, IMTA,
Según García et al., 2015 [10], para llevar a cabo Canadá. 202 pp, 2004.
la adecuación de las normas a las realidades [9] A. R. García, S. N. Fleite, J. Bereterbide, Manejo de
ambientales y productivas, se hace necesario contar residuos de producciones animales intensivas (avícola,
porcina y bovina). Hacia una gestión sustentable, Proyecto
con una base de datos locales, tanto hidrológicos
INTA-AUDEAS-CONADEV - 940149, 2016
como de los efluentes generados, de manera de [10] García, A.R.; Fleite, S.N.; Ciapparelli, I.; Weigandt,
poder estimar los niveles de vuelco a partir de la C.; Iorio, A.F. de. 2015. Observaciones, desafíos y
capacidad asimilativa del curso de agua. Por otro lado oportunidades en el manejo de efluentes de feedlot en La
se ve reflejada la necesidad de definir una Pampa húmeda argentina. Ecología Austral 25: 255-262.
reglamentación integral para permisos de vuelco en
lugar del cumplimiento de estándares, a partir del
trabajo en conjunto de diferentes sectores, entre ellos
las áreas académicas y de especialistas
(universidades, INTA) que puedan colaborar para
generar la adecuación de la legislación y los permisos
correspondientes.

4
 Anexo

Fig. 4 – Imágenes de las placas de petri al tiempo 120 hs de exposición

con sulfato de cobre. A) Dilución 6 %, B) dilución 12 %, C) dilución 25 %
y D) dilución 50 % (diluciones seriadas al medio, donde el 100 %
corresponde al sulfato de cobre sin diluir).

Fig. 1 – Esquema general del procedimiento a realizar en el ensayo.

Fig. 2 – Placas de petri en donde se incorporan, en cada una, 10

semillas de lechuga Lactuca sativa L (tiempo inicial del ensayo) y sus
respectivos controles, siendo el control negativo sin la incorporación de Fig. 5 – Imagen de la placa de petri al tiempo 120 hs de exposición con
sulfato de cobre y el positivo con sulfato de zinc 1 M. sulfato de cobre, dilución 100 (el 100 % corresponde al sulfato de cobre
sin diluir).

Fig. 3 –Imágenes de las placas de petri al tiempo 120 hs de exposición

con sulfato de cobre. A) Control +, B) control -, C) dilución 1,5 % y D)
dilución 3 % (diluciones seriadas al medio, donde el 100 % corresponde
al sulfato de cobre sin diluir).