UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID

FACULTAD DE FARMACIA

Sección Departamental de Fisiología Animal

MONTAJE DE LA TÉCNICA DE AMPLIFICACIÓN DEL ÁCIDO

DESOXIRRIBONUCLEICO MEDIANTE LA REACCIÓN EN
CADENA DE LA POLIMERASA (PCR). SU APLICACIÓN EN EL
ESTUDIO MOLECULAR DE LA B-TALASEMIA

MEMORIA PARA OPTAR AL GRADO DE DOCTOR

PRESENTADA POR
Rafaela Raposo González

Bajo la dirección de la doctora

Ana María Villegas Martínez

Madrid, 1993

ISBN: 84-669-1320-3
 SIGUIENTE j

UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID

FACULTAD DE FARMACIA

MONTAJE DE LA TECNICA DE
AMPLIFICACION DEL ACIDO
DESOXIRRIBONUCLEICO MEDIANTE LA
REACCION EN CADENA DE LA
POLIMERASA (PCR>. SU APLICACION EN
EL ESTUDIO MOLECULAR DE LA 13-
TALASEMIA

TESIS DOCTORAL

D0. RAFAELA RAPOSO GONZALEZ

MADRID, ABRIL DE 1993
DO ROCIO MU6JOZ CALVO, DIRECTORA DE LA SECCION DEPARTA-
MENTAL DE FIS ZOLOGIA ANIMAL DE LA FACULTAD DE FARMACIA
DE LA U,C.M.

CERTIFICA: Que el presente trabajo de investigación

titulado: “MONTAJE DE LA TECHICA DE AMPLXFI-
CACION DEL ACIDO DESCXIRRXBONUCLEICQ
MEDIANTE LA REACCION EN CADENA DE LA
POLIMERASA (PCR). SU APLICACION EN EL
ESTUDIO MOLECULAR DE LA B-TALASEMIA”,
dirigido por D~ Ana M~ VILLEGAS MARTíNEZ,
constituye la Memoria presentada por D~
Rafaela RAPOSO GONZÁLEZ para optar al grado
de Doctor en Farmacia.

Lo qu. certifico en Madrid a 26 de Marzo

de mil novecientos noventa y tres.

‘~2 Fj~,,

‘~1’
 4 ANA M’ VILLEGAS MARTíNEZ - PROFESORA TITULAR DE
PATOLOGíA MEDICA (HEMATOLOGíA) DE LA FACULTAD DE
MEDICINA DE LA U.C.M.

CERTIFICA: Que D’ Rafaela RAPOSO GONZALEZ ha realizado

en el Hospital CLínico de San Carlos de la
U.C.M. el trabajo titulado: “MONTAJE DE LA
TEONICA DR AMPLIFICACION DEL ACIDO DESOXX-
PRIBONUCLEXCO MEDIANTE LA REACCION EN CADENA
DE LA POLIMRRASA (PCR). SU APLICACION EN EL
ESTUDIO MOLECULAR DE LA 13-TALASEMIA”, para
optar al grado de Doctor en Farmacia, por lo
que autorizo su presentación como Tesis
Doc toral, ya que a mi juicio, se han cubier-
to los objetivos propuestos.

Y para que conste, expido y firmo el presen-

te certificado en Madrid a 26 de Marzo de
mil novecientos noventa y tres.
A mi tesón (firmeza y
constancia en realizar
un trabajo>
Quiero expresar mi agradecimiento:

A la profesora Dra. Dfla. Ana Maria Villegas

Martínez por sus acertadas orientaciones y sugeren-
cias.

A la profesora Dra. Dña, Rocio Muñoz Calvo por su

desinteresada ayuda.

Al profesor Dr. D. Manuel Córdoba Borrego por su

comprensión y amistad.

A todas aquellas amigas que han demostrado su

interés por mi futuro en esta Facultad y dan a la
amistad un sentido real y cotidiano.

A mis compañeras cJe despacho, además, por su

compañía y conocimientos.

A Juan por sus “ratos libres”.

A Maria sin quien mi “mano izquierda” hubiera

sido incapaz de finalizar este trabajo y además
pasarnoslo tan bien.
INDICE
 INDICE

I-JUBTIFXCACION Y OBJEflVOB DEL TRABAJO •

II-RUVIBION BIBLIOGRAYIOA

1. RECUERDO HISTORICO . 5

2. ESTRUCTURA DE LA HEMOGLOBINA . . . . . . . . 13

2.1 ESTRUCTURA PRIMARIA

2.2 ESTRUCTURA SECUNDARIA
2.3 ESTRUCTURA TERCIARIA
2.4 ESTRUCTURA CUATERNARIA
2.5 HEMOGLOBINAS EMBRIONARIAS Y DEL ADULTO
2.6 ONTOGENIA DE LA HEMOGLOBINA HUMANA

3. DIOSINTESIS DE LA HEMOGLOBINA 28

3.1 ORGANIZACION Y ESTRUCTURA DE LOS

GENES DE GLOBINA HUMANA
3.2 SíNTESIS DE GLOBINA
3.3 SíNTESIS DEL HEMO
3.4 ENSAMBLAJE DE LAS UNIDADES DE
HEMOGLOBINA

4. HEMOGLODINOPATIAB. CONCEPTO Y CLASIFXCACION • 51

4.1 TALASEMIAS . . . . 53

GENETICA Y BASE MOLECULAR

MUTACIONES
TALASEMIA ALFA
TALASEMIA BETA
TALASEMIA DELTA-BETA-ALFA
OTRAS
 4.2 PERSISTENCIA HEREDITERIA DE LA
HEMOGLOBINA FETAL <PHHF) 65
4.3 HEMOGLOBINOPATIAS ESTRUCTURALES 66

GENETICA Y BASE MOLECULAR

CLASIFICACION

5. TEONICAS EH BIOLOGíA MOLECULAR 73

SOUTHERN-BLOTTING
RPLF
POR
PCR-OLIGONUCLEOTI DOS MUTADOS

III- MATERIAL Y METODOS

1. SUJETOS ESTUDIADOS 90

2. TECHICAS UTILIZADAS

2.1. DE DESCRIPCION CONVENCIONAL 91

ESTUDIOS HEMOCITOMETRICOS
ESTUDIOS DE HEMOGLOBINAS

2.2. DE BIOLOGíA MOLECULAR 94

EXTRACC ION DEL ADN

ESTUDIO DEL HAPLOTIPO
AMPLIFICACION POR ARMS

IV- RESULTADOS 101

1. RESULTADOS HEMOCITOMETRICOS
2. RESULTADOS DEL HAPLOTIPO
3. RESULTADOS DE AMPLIFICACION POR ARMS
y- DISCUSION

1.COMENTARIOS A LOS RESULTADOS DEL HAPLOTIPO 111

2. COMENTARIOS A LA TECNICA DE ARMS 115

3. MUTACIONES DE LA ¡3-TALASEMIA ENCONTRADAS 119

4. MUTACIONES DE LA B-TALASEMIA EN LITERATURA 122

5. DIAGNOSTICO PRENATAL 132

VI— CONCLUSIONES 135

VII- BIBLIOGRAFíA 138

VIII-INDICE DE FIGURAS Y TABLAS . 167

3- JUSTIFICACION
Y
OBJETIVOS
 Las talasenijas constituyen un grupo heterogéneo de
enfermedades hereditarias en las que existe un déficit de
sl,ntesis en una o mas de las cadenas polipept%.dioas que
forman la hemoglobina.

Los genes encargados de la sintesis de las cadenas de

globina humana se agrupan en dos conjuntos denominados
familia de genes a, situada en el brazo corto del cromosoma
16, y la familia de genes no a localizada en el brazo corto
del cromosoma 11.

La 5-Talasemia está causada por el déficit o ausencia

de sintesis de la cadena B; clinicamente se pueden
presentar como un cuadro severo, transfusi6n dependiente
denominado »-Talaaemia mayor; como una condición cuyas
manifestaciones clinicas son menos graves, conocida como ¡3-
Talasemia intermedie, o bien como un estado de portador
hetarocigótica, generalmente asintomático, llamado rasgo
tulamémico o ¡3—Talameiaia minar.

Estos cuadros talasémicos, hoTnooiqóticos y

heterocigóticos, pueden expresar una gran variabilidad de
manifestaoiones clinicas que obedecen, no solo a las
interacciones de diferentes tipos de 8-Talasemias <50 y St,
sino al elevado polimorfismo genético que interviene en la
génesis de la 8-Talasemia.

A diferencia de lo que sucede en la a-Talasemia, en la

f3—Talasemia son extraordinariamente raras las deleciones
genéticas. Sin embargo, son frecuentes Las mutaciones que
implican a los procesos necesarios para que el flujo de la
información llegue desde e). gen (ADN) a las cadenas de
globina. Comúnmente se origina por mutaciones puntuales, en
las cuales existe sustitución, inserción o deleción de

2
nucleótidos, que son dificiles de poner de manifiesto
mediante la técnica de Southern.

Un gran avance en el estudio de las mutaciones

moleculares de la 8-Talasemia se abrió a partir de 1987 con
la posibilidad de amplificar fragmentos de ADN mediante la
técnica cAe la reacción en cadena de la polimerasa <POR> que
ha revolucionado, no sólo el estudio de la ¡3.-Talasemia,
sino el mundo de la biologla molecular.

Recientemente, una modificación de la PCR denominada

“AmplificatiOn Refractory Mutation System’t (ARMS> o POR con
oíiginucleótidos mutados, permite el estudio directo de 13-
Talasemia.

Un mejor conocimiento de la base molecular de las

talasemias ha permitido una prevención y consejo genético
de los pacientes.

El objetivo de este trabajo ha sido la puesta a punto

de la técnica ARMS, o POR con oíigonucnleótidos mutados, con
la cual es posible detectar en un corto espacio de tiempo
una posible lesión molecular.

Esta técnica ha sido posteriormente aplicada para la

amplificación del ADN en sujetos normales y en pacientes
con Il—Talailemia con el fin de determinar el defecto
concreto causante de la B—TalaSeIWiS en la región centro de
España.

3
Il-REVISION BIBLIOGRAFICA
RECUERDO HISTORICO
1. RECUERDO HISTORICO

Los conocimientos que actualmente poseeemos sobre la

hemoglobina y su patología es el resultado de un gran
número de investigaciones a lo largo de estos siglos.

La unión del 02 a la sangre fue un tópico que suscitó

el interés de todos los científicos del siglo XIX. HOPPE—
SEYLER <:1862), estableció por métodos espectroscópicos el
papel central del pigmento rojo de la sangre para unirse al
02 y fue el primero en utilizar el término HEMOGLOBINA, para
describir éste pigmento.

Detectó los cambios espectrales que se praduoflian,

cuando el 02 era eliminado por reducción química con sulfato

ferroso.

En el s.XX es donde, más avances se han producido y

con un crecimiento exponencial de los conocimientos según
nos acercamos a su final.

Aun sabiendo que todos los descubrimientos no se

producen aislado. sino que en muchas ocasiones unos han
servido de base para otros, podemos considerar una mitad de
siglo, hasta el afta 1949 en que PAULING y sus colaboradores
descubren que la anemia de células falciformes estaba
causada por una hemoglobina anormal.

Este periodo se caracterizó, de una parte, por la

existencia de científicos dedicados a conocer la estructura
y función de la hemoglobina y por otra, médicos clínicos,
que comenzaban a identificar determinadas anemias, cuyas
características clinicas y hereditarias fueron establecien-
do progresivamente (DaciO, 1988).

6
 Estos dos grupos, podríamos decir que se fusionaron
con el descubrimiento de Pauling, pues a partir de enton-
ces, las descripciones clínicas tenían una base molecular
y las alteraciones moleculares tenían su representación en
clínica.

Abordamos los siguientes puntos por separado:

1) Establecimiento de la estructura de la hemoglobina.
2) Conocimiento de la función de la hemoglobina.
3> Descripciones clínicas y descubrimiento de variantes de
hemoglobina.
4) control genético.

1) ESTABLECIMIENTO DE LA ESTRUCTURA DE LA HEMOGLOBINA

Al inicio del s.XX, el avance de la química orgánica

atrajo el interés sobre los grupos prostétidos que cante-
nian hierro.

En 1912 KUSTER estableció la estructura del Heme,

sintetizándose en ísí~ por HANS FISCEER. pronto se eviden—
ció que esta porfirina era el grupo prostético. no sola-
mente de la hemoglobina sino también de otras proteínas
respiratorias como mioglobifla y otros citocromos.

El desarrollo de los espectrofotómetros. permitió la

determinación detallada de las propiedades espectrales de
la hemoglobina. La oxidación a metahemoglObina y la unión
de la hemoglobina con otros ligantes del Hemo, como el CO,
produjeron alteraciones características en el espectro
visible de absorción.

El desarrollo de una nueva rama de la ciencia, la

sioquimica, permitió hacia 1920 que se lograran técnicas
para medir el tamaño de la molécula de hemoglobina.

7
 Fué ADAIR, quien desarrolló membranas coloidales, que
eran libremente permeables al agua y sal pero no a la
hemoglobina, logrando determinar su peso molecular valoran-
do la presión osmótica, estableciendo en 67.000 daltons, lo
que fue comprobado afios después por SVEDBERG mediante
centrifugación analítica, con una diferencia tan sólo de
1.000 daltons (Pm — 68.000>.

Un punto clave en el conocimiento de la estructura de

la hemoglobina ocurrió en 1956 cuando INGRAM separó los
péptidos producidos después de que la globina fuese hidro-
lizada con tripsina, la cual rompe los enlaces peptidicos
solamente a nivel de residuos lisina—arginina.

Del número de residuos obtenidos dedujeron que la

hemoglobina estaba constituida por dos mitades identicas.
Además comprobó tres at¶os después las diferencias entre los
péptidos de la hemoglobina A y de la hemoglobina 8.
(Ingram, 1959)

En 1957 RHINESMITH, SCHROEDER y PAULING por una parte

y BRAUNITZER por otra, indicaron que la hemoglobina era un
tetrámero, compuesto de dos pares de cadenas polipeptidicas
distintas, las cuales fueron denominadas alfa y beta y
asumieron que cada cadena estaba pegada a un grupo hemo.

A principios de la década de los 60, con el desarrollo

de nuevos métodos para determinar la estructura de las
proteínas, se hicieron rápidos progresos en dos frentes:

a> El establecimiento de las secuencias cte aminoácidos en

las cadenas de globina humanas normales.
b) Determinación de la estructura tridimensional de la oxi
y desoxihemoglobina, que fue lograda por MAX PERUTZ y cois,
mediante difracción con rayos x, demostrando como la unión
con el 02 alteraba la conformación de la hemoglobina, lo
quele valió el premio Nobel de Química en 1962.

E
 Esto permitió a PERUTZ en años sucesivos, explicar
propiedades funcionales de la hemoglobina, tales como el
efecto Bohr, interacción con los fosfatos orgánicos y la
unión cooperativa con el 02, así como información sobre la
estructura de variantes anormales, responsables de diversos
trastornos clínicos.

Esta investigación ha progresado tanto en 35 años, que

las coordenadas tridimensionales de los 4.600 átomos no
hidrógeno de la hemoglobina, están establecidos con un alto
grado de certeza.

2~ COHOCIHIEWDO DE LA FUNCION DE LA HEMOGLOBINA

El acúmulo gradual de información sobre la estructura

de la hemoglobina, permitió incrementar los datos sobre el
papel fisiológico en el transporte de 02 y CO2, así como sus
mecanismos de acción molecular.

En 1904 CERISTIAN BOHR, demostró la forma signoide de

la curva de disociación de la hemoglobina y que la posición
de la curva era sensible a los cambios en La presión del
CO2. Esta curva fue definitivamente establecida por BARCROFT
en 1928.

En 1936 PAULING predijo la naturaleza de la unión de

02 al horno, considerando el comportamiento cooperativo de la
hemoglobina como un problema químico. Razonó que la unión
del 02 a uno de los grupos hemo en el tetrámero, ocasionaba
una alteración estructural en la proteína, que hacia al
resto de los hemo más ávidos por el 02, lo que puede
considerares como el primer modelo alostéric’o de la función
de la hemoglobina.

9
 El aumento de datos 002-CO3If, como buffer y sistema de

excreción de ácidos, permitió a BOHR-HASSELBALCH inter-

pi-star que, el mayor efecto del CO2 sobre la afinidad de la
hemoglobina por el 02 era a través del cambio que provoca en
el pH, de tal forma que la dependencia, que el pH tiene la
curva de disociación de la hemoglobina, se ha conocido como
EFECTO 801W.

3> DEBCRIPCIONES CLíNICAS Y HALLAZGO DE VARIANTES DE

KM29L211MA

Paralelamente a estas investigaciones puramente

científicas, se estaban describiendo un conjunto de enfer-
medades, que en principio no se relacionaban con hemoglobi-
nas anormales, hasta 1948 en que HÓRLEIN y WEBER descrí—
brieron una hemoglobina con propiedades espectrales anorma-
les responsable de una cianosis familiar.
En 1922, MASON introdujo el término de anemia de
células falciformes (sickle—cell anemia> , y sugirió que
podría ser una enfermedad de la raza negra. posteriormente
se comprobó que es una enfermedad heredada, no ligada al
sexo y que afecta también a la raza blanca.

En 1925 COOLEY, describe en Detroit cuatro niños con

una apariencia mongoloide peculiar con anemia y hepatoes-
plenomegalia. En años posteriores se le describió a esta
enfermedad como Talasemia y se localizó preferentemente en
el mediterrafleO.

En 1949 PAULING, ITALO, SINGER y WELLS demostraron

mediante electroforesis, que los eritrocitos falciformes
contenían moleculas de hemoglobina defectuosa, denominando-
la hemoglobina de la enfermedad de células falciformes
(Pauling y cola. , 1949> •Este descubrimiento fue e]. pié
para la aparición de toda una serie de hemoglobinopatias
estructurales.

10
 Cada año se describen un número cada vez mayor de
éstas por lo que en 1975 se establece el Centro Internacio-
nal de Información sobre la Hemoglobina para proporcionar
mayor comunicación entre los investigadores, editando un
listado anual con los nuevos descubrimientos y los ya
existentes.

4> CONTROL GEHETICO DE LA HEMOGLOEZNA

El conocimiento del control genético de las hemoglobi-

nas humanas ha tenido dos fases, una primera derivada de la
observación del patrón de herencia y de los tipos de
hemoglobinas descubiertos y otra a partir de la utilización
de la tecnología del DNA recombinante.

El gran número de estudios realizados y los conoci-

mientos a los que se ha llegado en los últimos 20 años en
genética molecular, se deben a la denominada tecnología de
ADN recombinante, con una fecha clave, la del descubrimien-
to en 1970 del enzima TRANSCRIPTASA REVERSA, capaz de
sintetizar una copia de ADN (ADN complementario> a partir
de una molécula de ARN obtenida del citoplasma de una
célula sucariota. (Baltimore, 1970; Temin, 1970; High,
1985>

Pronto se vió que en condiciones adecuadas éste DNA se

hibridaba de una manera altamente específica al DNA o RNA
complementario, lo que permitió demostrar la presencia de
esa secuencia complementaria y de esta forma DEISSEROTH y
cols. establecieron con técnicas de hibridación en solu-
ción, que los genes de globina alfa y beta residian sobre
cromosomas diferentes, localizando el gen alta sobre el
cromosoma 16 y el beta sobre el 11.
Otro descubrimiento clave, fueron las ENDONUCLEASAS de
RESTRICCION las cuales cortan el ADN cuando encuentran
determinadas secuencias de nucísótidos. (Nathans, 1975>

11
 En 1975 SOUTHERN introdujo un método de hibridación,
que perndtia inmovilizar uno de los componentes de la
reacción, el DNA objeto de estudio, al transferirla sobre
nitrocelulosa, después de haber sido separado según su
tamaño mediante electroforesis en agarosa previa digestión
con endonucleasas. <Southern, 1975; Orkin, 1984>

El progreso sobre todo en los Citimos 10 años ha

permitido, que muchos transtornos monogénicos puedan ser
examinados, lo que supone un mejor conocimiento de la base
molecular de los mismos y la posibilidad de detección
prenatal de portadores (Antonarakis, 1989>

La fabricación por bacterias del producto de un gen

determinado <vacunas, hormonas, etc> abre un campo a las
posibilidades de la reparación de los genes anormales o
frenados en su expresión.

12
ESTRUCTURA
DELA
HEMOGLOBINA
 2. ESTRUCTURA DE L4
HEMOGLOBINA

Cuando Perutz se propuso en 1937 escoger la hemoglobi-

na como proteína cuya estructura quena resolver, no cantó
con la complejidad de ésta, por lo que tuvo que esperar 20
años para resolver dicho problema, pero sin duda éste ha
sido uno de los grandes triunfos de la moderna biología
molecular y por tanto el primer paso para el conocimiento
de las hemoglobinas anormales (Bunn, 1986; Weatherall,
1981; Lehmann, 1976)

La hemoglobina es la proteína vital que transporta O?

desde los pulmones a los tejidos y facilita la vuelta del
CO2 desde los tejidos a los pulmones. Se localiza en el
interior de los hematíes. En un hematíe hay alrededor de
280 millones de moléculas de Hb, cada una con un peso
molecular de 64.458 daltons, forma elipsoide y dimensiones
64x55x60 A.

Como todas las proteínas consta de aminoácidos, unidos

unos a otros en una secuencia lineal llamada cadena pali-
peptidica. Los aminoácidos son de 20 clases diferentes y su
secuencia en la cadena está determinada genéticamente.
Una molécula de hemoglobina está compuesta por cuatro
cadenas polipeptidicas, dos cadenas alfa de 141 restos de
aminoácido cada una y las cadenas beta de 146 restos cada
una. Las cadenas a y $3 tienen diferentes secuencias de
aminoácidos, pero se entremezclan para formar estructuras
tridimensionales similares.
Cada cadena contiene un grupo HEMO, que consiste en un
anillo de átomos de carbono, nitrógeno e hidrógeno, denomi-
nado protoporfirina IX, con un átomo de hierro ferroso en
el Centro. una única cadena polipeptidica combinada con un
sólo hemo se llama subunidad de hemoglobina ó monómero de
hemoglobina.
14
 En la molécula completa las cuatro subunidades están
estrechamente entrelazadas, como un rompecabezas tridimen-
sional, formando un tetrámero.

El grupo hemo se combina por si mismo con el 02 tan

fuertemente que el enlace, una vez formado, es difícil de
romper. Esto ocurre porque un átomo de hierro puede existir
en dos estados de valencia: hierro ferroso, que transporta
dos cargas positivas y el grupo férrico, que transporta
tres cargas positivas.
Normalmente, el hierro ferroso reacciona con el 02 de
modo irreversible para formar hierro férrico, pero cuando
el hierro ferroso está acoplado en los pliegues de la
cadena de globina, queda protegido de manera que la reac-
ción con el 02 es reversible.
Para que la globina funcione con eficacia deben
satisfacerse tres condiciones:

1* Libre acceso del H20 a la superficie de la globina para

mantenerla en solución, para ello el exterior molecular
debe ser rico en cadenas laterales hidrofilicas polares.

O O O O O
I I I ji I
‘NH,-C-C-NH-C-C-NH-C-C- - -NH-C-C-NH-C—C0

R R R R R

El monómero de hemoglobina de caballo según la imagen

generada por ordenador (Perutz, 1979> quedaría reflejado en
la figura 1.

Los restos más numerosos son los hidrófobos (Ala, Val,

Leu) siendo tambien muy abundante la histidina, cuyo grupo
imidazol es responsable de una parte esencial de las
propiedades funcionales de la molécula, como son: El poder
tampón y el efecto ahor.

15
 fi

FIO. 1
SIJDUN1DAI) DII
HEMOOLOIIINA

La cadena alta: consta de 141 aminoácidos en secuencia

lineal. El hierro del grupo herno está unido por un enlace
covalente al imidazol de un residuo histidina en la posi-
ción 87, es la llamada histidina proximal.

La cadena beta: es ligeramente más larga que la aif a,

consta de 146 aminoácidos. El hamo se une a la histidina
92.

Las cadenas delta, gamma, epillen y seta: hay una

homología estructural entre delta, gamma, epeilon y la
cadena 8, no en vano son productos de un grupo de genes
localizados en el cromosoma 11 y tienen también 146 aa.
De la misma forma la cadena zata es homóloga con la ú,
posee 141 aa y es, como la a, producto de los genes situa-
dos en el cromoSoma 16.

16
2* El interior de la molécula debe seguir siendo hidrofóbí—
co, resultado de su alto contenido en aminoácidos lipofilí—
con.

3* La molécula de globina debe mantenerse razonablemente

rígida, lo que logra con una proporción extraordinariamente
alta de aminoácidos en disposición helicoidal.

5,
2.1 ESTRUCTURA PRIMARIA

Se refiere al esqueleto de la cadena polipeptidica de

globina y establece de modo especifico la secuencia de sus
4
aminoácidos,
Las proteínas están compuestas por a-aminoácidos
unidos por un fuerte enlace covalente llamado enlace
peptidico, que se establece entre los grupos carboxilo y
amino de los aminoácidos.

Los aminoácidos tienen un grupo amino cargado positi-

vamente y un grupo carboxilo cargado negativamente, neutra-
lizándose estas cargas al establecerse el enlace peptidico,
permaneciendo sólo cargados sus residuos N—terminal y 0-
terminal. Quedan también cargadas las cadenas laterales
(grupos R) , pudiendose dividir los aminoácidos según la
naturaleza de estos grupos laterales en hidrofilicos o
polares, que se disponen en la superficie de la molécula o
tapizando la cavidad central de la misma; e hidrofóficos,
situados en el interior molecular.

17
 A

4.

I’In 2 IWrRIIRA PRIMARIA DR LA CADIU4A ~PA Lo. .qnalo. hc¡k01d4148 w scfián c«~ Iowa. msyUouL.., So odios la roIscí&,
aol lino ~tm LA hiaUdWa proutul y dial

2.2 USTRUOThP.A SUOUUDARIA

Se refiere a la relación espacial entre residuos que

están próximos el uno del otro en la secuencia lineal.
Las subunidades de hemoglobina son un buen patrón de
a hélice dextrógira, conteniendo aproximadamente 3,6 restos
aminoácidos por vuelta, manteniendose estables al formarse
enlaces de hidrógeno intracatenarios entre el carboxilo de
cada residuo y el grupo amino de otros aminoácidos.

En su estado nativo, alrededor del 75% de la molécula

de hemoglobina es una a—hélice, pero hay tramos que adoptan

18
una posición lineal, los cuales están situados entre las
héticOS, por donde la cadena suele angularse. Además hay
das pequeños Segmentos helicoidales en los extremos,

Loe segmento. helicoidales se denominan con letras que

van desde la A a la H, comenzando por el extremo N-terminal
de la molécula y los no helicoidales reciben su denomina-
ción a partir de las hélice. entre Las que están situados,
es decir: HA, AB, CD, EF y así hasta GH (los segmentos
teóricos 80 y DE no existen como secuencias no helicoida-
les) Loa dos pequeños segmentos lineales situados en los
extremos se denominan NA y HO,

Debido a que el nQmnero de aminoácidos en las cadenas

es diferente, 141 en a y 146 en ¡3., y con objeto de lograr
una máxima homología entre las subunidades, cada aminoácido
es numerado de acuerdo con su posición en la cadena lineal
y con el lugar que ocupa en cada segmento, así por ejemplo
la histidina re es ia a—87 y 0—92.

znsnEs¡aUn TIROIflIA

Hace referencia a cómo está plegada tridimensionalmen-

te la cadena polipeptidica, refiriéndole a la situación en
el espacio de los residuos aminoácidos que forman parte de
la estructura lineal, lo que facilita la comprensión de las
propiedades funcionales de la proteína.

La secuencia primaria de los aminoácidos es la que

determina fundamentalmente los plegamentos de la proteiria
en el espacio tridimensional y solamente la secuencia
primaria de aminoácidos es determinada genéticamente,
produclendose posteriormente las estructuras secundaria Y
terciaria por uniones entre los radicales de los aminoáci-
cias que forman la misma.

19
 Loe plegamentos hacen que dentro de la forma esferoi—
dea que adopta la molécula, se cree una cavidad donde se
alojará el hemo, denominada “bolsillo”, limitada por las
hélices B, G y 11 en el fondo, por las E y F en sus paredes
y con una abertura, próxima a la superficie, tapada en
parte por la hélice C y 0. Esta cavidad está esencialmente
tapizada por residuos cuyas cadenas laterales, fuertes
hidrófobas, evitan la presencia de 1120 y por tanto la
1
oxigenación del átomo de 02.

0
r~1

OnI

ViO, 3 DIACRAMA DULA ESTRUCTURA TERCIARIA DII l.A CADENA BETA

2.4 ESflWCTTIRA CUATIRNARZA 1

se refiere a la forma como se articulan las cuatro

subunidades, lo cual se realiza no por fuertes enlaces
covalentes, sino por uniones más débiles como son los
fi
enlaces iónicos y fuerzas no covalentes tipo Van der Waals.

20
 La unidad funcional cte la hemoglobina es un tetrámero
de forma elipsoide, pero puede considerarse como dos
12
cimeros colocados uno encima de otro.

Las diferencias físicas y químicas que se producen

entre la forma OXI y DESOXI se manifiestan por cambios en
la estructura cuaternaria de la molécula.

Al observar un tetrámero de hemoglobina se aprecia que

F.
cada cadena alfa contacta con las dos cadenas ¡3 a lo largo
de dom diferentes superficies, de aquí que si las unidades
son designadas Alfa 1, Alfa 2, Beta 1 y Beta 2, pueden
definirme dos interfasés entre distintas subunidades: ~í
y a, ~2, que son estructuralmente idénticas a las a2 8~ y a2

8,.

La interfase a1 $3, y a2 permanecen relativamente

~2

fijas durante la oxigenación. La unión entre estos dimeros

es muy estrecha debido a los 40 contactos entre residuos
que en esta interfase se producen, incluyendo 9 puentes de
hidrógeno, por lo que no hay diferencias entre la forma oxí
y la desoxihemoglObina, permitiendose movimientos sólo de
íA.

El contacto en la interfais a ~2 y a2 ~ son menos

rígidos y periiiten una mayor movilidad durante la oxigena-
ción (7Á>

En la desoxihelflOglObifla (también llamada forma Tensa

“T”> hay alrededor de 40 contactos, incluyendo 19 puentes
de hidrógeno. Cuando la hemoglobina se oxigena (oxihemoglo-
bIna 6 forma Relajada “R”> el numero de contactos desciende
a 22, incluyendo 12 puentes de hidrogeno.
Durante la transición de la estructura 1’ a la R
existe, por tanto una reestructuración de las subunidades
con respecto al otro par.

21
 stt.
I~j

55.5

Cada columna a está fuertemente unida a la cadena 13 y

el dímero así formado se mueve como un cuerpo rígido. si un
1
dímero se mantiene fijo, el otro gira 15 grados alrededor
de un eje y se desplaza un tanto a lo largo de éste. La u
simetría doble de la molécula se mantiene , si bien el eje 1
de simetría ha girado 7,5 grados. <Perutz, 1979>.

55,
15

1>1<1 1 RULUflhIISCWRACION 1)11 LAS SUI)UNIDADIL¶ d~irMI LA traosbcI&i ib 1. niruclurA 1 It e,nctur. It

Los contactos entre cadenas similares son muy escasos,

ami entre las cadenas al a2 solamente se producen en la
forma desoxí, aunque desempeñan un importante papel en la
interacción Hemo—Hemo, efecto Batir y el transporte de CO?

En cuanto a las cadenas 131 y 132 al estar más separadas

que las alta permiten en la forma desoxí, que entre ellas
se aloje una molécula de 2,3 DPG, lo que contribuye a
aumentar la estabilidad de esta conformación.

22
 ~ ~1

t.
‘5

53 53,
55
.35

FIO. 5 MOLIICUtA COMPLUTA DII NEMOOLOIIINA

2.5. flIMOpLOflfllM EMDRXOflRIM Y DEL AflULTO

1

Las cadenas de hemoglobina humana han sido denominadas

de acuerdo con las letras del alfabeto griego, Alfa, Beta,
Gamma,Delta, Epsilon y Zata.

Las HEMOGLOBINAS EMBRIONARIAS fueron descubiertas en

1961 por Huehns y colaboradores (Huetine y cola, 1961) en la
sangre de embriones humanos. Se denominaron Gower 1. y
Gowwer 2, posteriormente capp y colaboradores denominaron
Hb Portland a una nueva hemoglobina, con propiedades
electroforéticaS semejantes a la Hemoglobina A a pH alcali-
no, pero que migra más rápidamente que ésta a pH ácido.

23
 4

Son trés hemoglobinas transitorias, con una elevada

afinidad por el 02•

1: es un tetrámero compuesto por subunidades

denominadas (Zata 2 Epsilon 2)
GOVER 2: es un tetrámero compuesto por subunidades
denominada. (Alfa 2 Epsilori 2). Las cadenas épsilon están rS
{s~5
codificadas por un gen del complejo de genes de la cadena
beta, situado por tanto sobre el cromosoma 11.
PORTLAND: tiene (Gamma 2 Zeta 2> La cadena Zeta .
jI
jj 1,
muestra una fuerte homologla estructural con la cadena Alfa ¡
II‘9’‘fi
-9
(gamuzorra y cols.,1974>, y cuyo gen se sitQa en el cromo-
soma 16.
55

5 555

LSS
1~
1 ~
~..rno9iou.,’. C~ ., ~ ~, OoA a, £, ~i y, «,fi, a, fl~ II
‘fi Y ~
______ HbA

Al

~ 5

I’IO~ 6 NIIMOCLODINAS 1
Durante la vida fetal, la hemoglobina predominante es
la Hemoglobina FETAL <Kb r) que es una( Alfa 2 Gamma 2) y 1~
aunque está presente en grandes cantidades al nacer (65 a
9~%), en la vida adulta molo se producen trazas (menos del 1~
1%> (Pataryal,1972)
‘$55

24 fi 1

,
 ~i~
La hemoglobina E’ es una proteína heterogénea, su
cadena Camina, que difiere de la Beta en 39 de los 146
aminoácidos, puede contener un residuo alanina ó glicina en
la posición 136, siendo designadas como A gamma 6 G gamma
resp#ictivanwnte.

En el recien nacido el 75% es O gamma y el 25% A gamma 55

(relación 3/1) ,por el contrario en el adulto, la pequeña 12’
55
cantidad de Kb F que poseen contiene 40% de G gamma y 60% 9

~, s~.3
de A gamma. La transición a este patrón de adulto tiene
lugar durante el primer año de vida, 9£

Otra importante heterogeneidad de la cadena gamma ha

sido documentada, se trata de una sustitución de la Treoní— 555

na por .tsoleucina en la posición 75, esta sustitución se

fis ¿
produce exclusivamente sobre la cadena Gamma A por lo que
se le designa Gamma AT. Esta cadena gamma es la que forma j~)
fi,
9
la variante de la Hb E’ denominada SARDINIA cuya presencia
se ha visto en el 30% de los recien nacidos blancos y en el
20% de la raza negra <Trecartin y cols.,1981; Firastu y

1
cois. 1984)
,

~ ti,
~.
La Kb F puede estar aumentada en trastornos heredita— ‘5
~1fi
ríos tales como 8—Talasemias, Persistencia Hereditaria de 9 ~fi ~

la Hemoglobina Fetal, Anemia Drepanocitica y en trastornos

adquiridos tales como Anemia Megaloblástica, Aplasia
Medular y en algunas Leucemias. ji 1
1
fiSfi~
fi 5.-Si
Los niveles de Kb E’ pueden tambien verse afectados por 5555~
diferencias en la atracción para el ensamblaje de unas ¡ ~fi

cadenas con otras, sugirieridose que las subunidades alta se

combinan menos facilmente con las gamma, que con las beta1
5’ fi

habiendose observado por tanto, Kb E’ más baja en reden

nacidos con a—Talaffiemia, que en aquellos que tienen los ¡ fi fi

cuatro genes normales (Bunn,1987>, lo mismo que en casos de fi fi,

fi 3,’
deficiencia de hierro (Adame y cols.,1985).
-fi 11]2-
25
 fi’ (55
La hemoglobina adulta normal (Hb A) es un tetrámero de
globinas que consta de dos cadenas alf a y dos cadenas beta .3ty
(a2 ~ como ya se ha comentado la cadena a contiene 141.
1
,
‘55 35
restos de aminoácidos, mientras que la cadena 5 la constí—
tuyen 146 aminoácidos. En el adulto normal, el 97% de la
hemoglObina es A , mientras que en el recien nacido su fi,
1 -~1
cuantía es del 20 al 40 % y solamente una pequeña cantidad
es Kb A2 (a2 ~2)
La Kb A2 en el adulto representa el 2,5 % del total de .9

hemoglobina, mientras que en el neonato no suele superar el A

0,5 %. En cuanto a la estructura hay una marcada homología
-fi-fi’

entre la cadena ¡3 y la delta(s), difieren solamente en

¡fi’’
de los 146 aminoácidos. 5‘3 5
3 s35s~’

El significado fisiológico de la Hb A1 no se conoce, su

función es probablemente la misma que la de la Hb A. Puede
4 -

encontrarse aumentada en 5—Talasemia, en algunas variantes

de hemoglobinas inestables, hemoglobina A/E , Anemia j i~fi
Megaloblástica y en hipertiroidismo. Por otra parte está .3 45

disminuida ó normal en estados de carencia de hierro,

Anemia Sideroblástica y en Talasemias a, 6, 65, Hb Lepore 4
SI
y 2H11? (Bunn y cols.,19’77).
3fi

5 ¡

5.
fi fi

2.6. ONTQGENIA DI LA HEMOGLOBINA HW(M1A

<5

35
Las hemoglobinas que predominan en el embrión son la
Gower 1, Gower 2 y Portland; la proporción de las dos
primeras fué del 42% y 24% del total respectivamente, el I
resto fui Hb Fetal. En las etapas posteriores la proporción
Si’
de hemoglobinas Gower desciende hasta ser casi indetecta—
bles en la lOl a 121 semana de gestación.

El tiempo a. aparición y desaparición de la Hb Port-

land ha sido más difícil de determinar.

26

fi
fi
3fi
 1 s’3
SS

La hemoglobina Fetal aparece precozmente durante la

1k
.13.

gestación, 30 % del total de la Hemoglobina de embriones se

incremerita posteriormente hasta un 90 % del total hacia la “4Á
8A a 10~ semana, permaneciendo así hasta poco antes del t- -

parto. ~1
A los seis meses de vida extrauterina la cantidad de
SI
Kb F es el 1 % 6 inferior, aunque pueda encontrarse normal—
mente en niveles de 2 a 5 * en niños normales, para poste—
fi ¡
riormente al año, situaras en los valores que mantendrá
durante toda la vida.
La hemoglobina A, en cantidades del 5 al 10 % es
detectada en fetos normales desde la 6~ semana en adelan --

te, aunque electroforéticamente no sea demostrable hasta la —

12’ semana <Pataryas y cols.,1972>. fi ir

Pequeñas cantidades de cadena beta pueden coniprobarse ~- ~fr
por síntesis de globinas antes de la SI semana. posterior— -fi’

mente, aunque se observa un ligero incremento en la sinte—

mis de cadena beta (hacia la 12~ a 20~ semana) la propor-

$1, fi’ ~4.

ción permanece constante hasta iniciarse la síntesis de -

5 5335
hemoglobina del adulto.
La hemoglobina A2 es la última en aparecer, comenzando
su producción en el tercer trimestre de vida intrauterina,
1
fi’

detectandose solo trazas de Kb A2 en la sangre de cordón

umbilical. Su síntesis va incrementandose a lo largo de los
seis a doce primeros meses de vida hasta alcanzar el nivel
definitivo.
SS
El déficit 6 anomalía de la cadena alfa se manifiesta fi~
-

mejor en el periodo neonatal. En esta etapa de desarrollo, 3

la cadena 13 va aumentando progresivamente con respecto a la

cadena gamma y puesto que la apetencia de la cadena a es
mayor por la 8, se detectan mejor las pequeñas cantidades
de Kb Bart (4 gammaS).

hemoglobinas
alteraciones
con la
Además,
Epailon,
como
de
Gower
la Gamma,
lamisma
cadena
2, F,pueden
Beta
Alfa
A yyafectar
seA2
Delta,
combina
respectivamente,
a para
todas
secuencialmente
tornar
las etapas
las -

del desarrollo.
~fi

27

~fi
 BIOSINTESIS
DELA
HEMOGLOBINA
 fi S~fi~ fi’

¡‘fi’> ‘fi

fi fi 35
3. IIIOSINTESIS DE LA
- <¡>55
fi fi 5!

‘354

Li~.S2RGAMIZACZON Y ESTRUCTURA DE LOS GENES DE HEMOGLOBINA

fl fi

1-RUODURDO HXS’PORICO

El siglo XXI será la época del gen. En los laborato—

ríos e institutos de investigación de todo el mundo, 1’
3

equipos de científicos están tratando de obtener el secreto

de la herencia humana, el objetivo final se conoce como
~< r~-~ -

GENOMA HUMANO, esto es, el conjunto de unos 100.000 genes

que contienen todas las instrucciones para que la naturale-
353 ‘5’.>-
-fi <‘-fi’

za cree un ser humano. Por tanto, para principios delsiglo

XXI, los científicos esperan haber desenredado, disecciona—
35
i~
do y comprendido las instrucciones escritas en cada gen. 55 .3
¿3
Las consecuencias serán enormes, el conocimiento del fil’

‘A

genoma huinano no es un fin en si mismo, más bien abrirá un 35 5 ‘fi,

53 5 Si~
camino hacia una mata superior, volver a escribir la ‘SS
5,
‘fis
herencia y si así lo decidimos nos podremos liberar de
55’,
enfermedades como la fibrosis quistica o el cancer <Spritz
y col,., 1980; Eaton, 1980) 535

Este viaje se inició en 1953, en la universidad de

Cambridge, cuando James Watson y Francis Crick, descubrie-
ron que el mensaje de nuestra herencia estaba escrito en 553

forma química, codificado en las espirales de la molécula

de doble hélice del ADN.
45
El ADN se localiza en el núcleo formando parte,
junto con nucleoproteinas e histonas, de los cromosomas.
-33-
Está constituido por un azucar, la desoxiribosa, al que se - 1, 0
L ‘3
unen unas estructuras anulares cíclicas nitrogenadas, las
bases que pueden ser de dos tipos: púricas <Adenina y
5335>
Guanina> o pirirnidicas (Citosina y Tuina).
29 35
435

F
 551

2 12
El compuesto químico formado por la unión de una base
a la desoxiribosa se denomina nucísósido, éstos se unen
entre si mediante residuos fosfato originando una estructu-
ra denominada NUCLEOTIDO. El ADN está formado por cadenas
de nucleótidos conectados entre si por puentes fosfato que
¶ -fi]-’

unen el extremo 5’de un azucar con el 3’ del siguiente.

Paralelamente a la cadena de ADN se coloca otra igual y
complementaria, de manera que frente a una guanina <O)
siempre me coloca una citosina (C) y frente a una timina
(T) siempre se coloca una adenina (A), ver figura 7.
5,
ENLACE DE NIOACCVC

?~MINA “— >‘M ADENINA

fi o.. -‘
o It fi H

o” ir>
“‘cx.
cfi
-—
fi 3555

F
o /Ot~P4

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~ ¡‘.Sfi

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‘5
55
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55
‘fi

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‘~ ‘h-’~
‘.3 5
0
~
~iB A LA 4IN A
53fi

IALANINA

[‘10.1ESTRUCtURA DEL ADN

—‘fis

30
 E¡fi;

La doble hélice así formada tiene un eje central,

constituido por las bases apiladas, y un esqueleto perifé-
rico constituido por los azucares unidos mediante grupos
fosfato.
Mientras que la información hereditaria está escrita
]t1341 4.32. -

en la secuencie de nucleótidos del ADN, la estructura de ‘3’,]

‘‘53 ¿3’’
~¡‘fl ‘3
cada proteína va a depender de la secuencie de sus amincá—
cidos. La diferencia esencial radica en que el ADN contiene 55%

cuatro nucleótidos distintos mientras que las protelnas

$~{ ‘~IL
3

contienen 20 aminoácidos diferentes.

La clave genética o código genético, va a ser el $~‘L
diccionario que relacione los lenguajes del ADN y las

proteínas. El texto nucleico se lee en una dirección -~

k’’~ 4i~:
prefijada y contiene señales de iniciación y terminación y5s
5 54¡ ¡
del mensaje; los nucleótidou comprendidos entre una y otra 5¼
se leen sucesivamente en grupos de tres <codones).
cada triplete de nucleótidos significa un aminoácido
determinado. Hay 64 tripletes posibles, tres de ellos no
significan ningOn aminoácido y se usan como señales de t
terminación. Los otros 61 tripletes significan aminoácido; 4(<Ik
como sólo hay 20 aminoácidos distintos, varios tripletes t>’ ~
pueden determinar un mismo aminoácido. Un triplete, el que
determina el aminoácido metionina, se usa aonio señal de
iniciación,
Li ~o ~‘~<~“
3 5’
“
Ss’. 5’
-> ík >5

5535 ~fifi~:
‘fi ‘fis

ría- a ‘4. 1 1,5

EL CODIGO GENETICO y 5555

uFI
l4l’~
_________________________________________________________________________________ fi;, 1’ ¡‘5
fi fi
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‘fi’

¡fi

fi’>,’

£Ú~i$•I lo •fl~ ft d•~IIO

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So •pcOOíO’Ofl ¡QS fluC!@flídOt
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•It*’ ~fi 541? c~d’Ififi’S4dOl DO> mcl 0* gulíclUOlO lullItul’ fil jídIOl íUI
~n ~ Ig TI -
dOlOSIffiídfiñl 553
__________________________________________________ 4
‘555-4

31 5~ 4
11’ - ¡‘5,.
‘5>

5,,
 El genoma humano está constituido por alrededor de
3x10! pares de bases (la unidad habitual de medida del ADN
es el kilobase (Kb), de tal manera que podemos decir que el
genoma humano mide tres millones de kilobasesj agrupados en
secuencias denominadas genes que codifican entre 30.000 y
555331 ‘~5 fi

100.000 proteínas diferentes. De todo el genoma humano,

sólo el 10 % de sus secuencias están encargadas de codifi -j~~[J
car proteínas.

El ADN no pasa al citoplasma, lugar donde tiene lugar ~

la síntesis de proteínas por lo que debe transmitir su
Y fi¡~ -

información a una molécula intermediaria, el ARN. ~ 35.

‘¡fi

Un gen no es sino un fragmento de ADN que contiene la ,s -

‘<35
información necesaria para sintetizar una cadena polipeptí— 555»
dica.

No toda la secuencia de nucleótidos que constituyen j~

los genes está implicada en la síntesis proteica, podemos -fi’

precisar que los genes están formados por dos tipos de 1 -

segmentos: los encargados de codificar las proteínas, ]

IXONIS y otros, utilizados en la regulación de la expresión x;] ‘~

genómica, Los IN’tRO>4UI. Además de estos segmentos, en el

extremo !3’de los genes, se localizan secuencias que no se
ifi;
transcriben pero son de gran importancia para regular el <

Inicio de la transcripción <promotores) y la intensidad de

los mismos <potenciadores) . >55
55,’
‘fi’

La información se transmite desde el gen hasta la 5

fi’
¡
fi

proteína siguiendo la secuencia: ‘<“fi si,

‘fi>” 5 ~~ifi4
fi

5 “‘5>
tRAHg’I&WCION TRADUCCION 533 fi5fi

ADN >ARN >PROTEXNA <

2
~
f5i 53<
RI&PI I<’A(ION f ¿ fi>

53 3
,1
32 5

‘u -a
‘53 fi fi

fi fi

3]
453
 II
El primer flujo de información necesita de la presen-

.4 -$1h.
cia de una enzima, la ARN polimerasa encargada de pasar la
información del ADN a una molécula de ARN, ésta última tras ~

sufrir una serie de modificaciones en el núcleo por las que ¡2, ¡jS¡5{ -
pierde las secuencias correspondientes a los intrones, pasa Si

al citoplasma denominándose ARN mensajero <ARNm> . Una vez

en el citoplasma, el ARNm se une a los ribosomas, estructu—
ras que contienen otro tipo de ARN, el ARN ribos6mico
(ARNr) . Un tercer tipo lo constituye el ARN de transferen -4
Y
cia (ARNt> que actúa reconociendo los dos códigos en juego
(el de bases y el de aminoácidos>, existiendo al menos un ‘uj1
ARNt especifico para cada aminoácido, Estas moléculas
transportan una secuencia de bases codificadas por sus
aminoácidos que son complementarias al codon del ARNnI y que
se denomina anticodon de). ARNt. El apareamiento codon—
ant icodon es el proceso responsable de la incorporación del
354$ 53%’’
aminoácido a la cadena proteica en síntesis (Watson y ‘< $
cols., 1986> 5553 fi’

¡ 3

¡~sI
fi,’ 1’’ LS
‘1 :~ 5,,

‘fi>’’

‘:35>
1~4 5
¿¡¡3
¡ ¡ 551
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5323,5

F
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‘fi
fi’’

$ 1
4”3’’
fi
fi I.fifi
‘5 33’1]
‘5 35 ‘5S35554
fis
4”
5335
fis
‘fis»

fi
fi fi

5 ‘si’fi’¡fi’fi
- -‘¡¡fi,
33 3.
fi»

fi 1’
II-EEMOOLODZNA

El numero y la estructura de las diferentes hemoglobí—

nas humanas normales requería que hubiese al menos un gen
distinto para cada una de las cadenas de globina. ¡-‘fi 555
fi fi jis

Del estudio de las variante. de hemoglobina y del

análisis de la heterogeneidad bioquímica de las cadenas
gamma y alfa estaban duplicados. Sin embargo, la conexión
de los distintos genes no a se estableció al estudiar las k
variantes de hemoglobina que contenían cadenas fusionadas,
presumiblemente resultantes del entrecruzamiento no homolo— 3
go entre locus de genes de globina no a. Ami pues la Hb
Lepore con su fusión delta—beta, estableció que el gen de
globina delta estaba localizado sobre el lado 5’( o ti—
terminal> del gen de globina beta, mientras que en la Hb 3545
Kenia con su cadena fusionada gamma—A—beta proporcioná t
datos para la poeicidn del gen gamma A sobte el lado 5’de
los genes delta y beta.

DeisserOth y colaboradores establecieron claramente

que los genes de la globina humana alfa y beta residían
sobre cromosomas diferentes <Deisseroth y cols.,1976>, y
que los genes alta se localizaban sobre el brazo corto
(banda p 2.3.3> del cromosoma 16 <Gonzalez-’RedOridO y cola.,
1988>, mientras que el grupo de los genes beta se situaban
en el cromosoma 12. sobre el tercio distal del brazo corto
más allá de la banda p 14 (Deisseroth y cola., l978>~

Los genes de la globina humana se agrupan en dos

conjuntos denominados familia Alfa 6 grupo “Alfa—Like” y
familia Beta 6 grupo “Beta—LikB” distribuidos en el
cromosoma desde el 14—terminal (5’> al e-terminal (3’) en el
mismo orden en el que se expresan durante el desarrollo.

34
 %ft~q

fi.. ‘ ¡‘‘44

HEJ
5’ 4 A .3
~“

5’

5’ 8 Pi 3,

LE 5’ ,t’IvB.1 IVB.2 ~~45 a’

IÓS 146

¡‘jO 9 MANtO CROMOSOMICO

El grupo de genes alfa está localizado’ en un segmento

de 40 Kb sobre el cromosoma 2.6 p 13.3 en el siguiente
orden:

ú1—a2—al—01—3’
5’-Zeta 2-Pseudo Zeta 1—Pasudo a2-Psetldo

‘6

— —
4t1’ —
‘~> —
¿..

o .~ (CroffiOSO<~1á II>

O, A. ~d ~
a a — •~ — nl fu 3’
-4

2KÚ

(crvnlosooU 16) y región 00-a

‘¡o o ~ ~,~n»ca ó. ¡o~ gws .tuo codlftc*o la sInItUhI dc las CRdCSI gIolñ*iICAj rcgióti
(Cf~noM*na Ib

35

>
 it 3

Incluye por tanto trés genes funcionales, trés pseudo— :11

genes y un gen descrito recientemente *í, todavía con
funciones no definidas <Grosveld y cols,,1981).

El grupo de genes beta se localiza en el tercio distal

del brazo corto del cromosoma 11 más allá de la banda ~, 14, tsk
en el siguiente orden:

5’-Epsilon-Galflma O—Gamma A-Pseudo 8-Delta— B—3’

1
Al principio se detectaron dom pseudogeries en el grupo
de genes no alfa, uno entre los genes Gamma A y Delta
(¡‘seudo 8 1) y otro 5’en el gen D~psilon que le llamaron
¡‘seudo 13 2, conf irmandose posteriormente que éste último no - SS55
3>’

era un verdadero pesudogen.

Los pseudogenes son estructuras genéticas con alta [II

homología con los auténticos genes, pero que no correspon—
den a cadenas polipeptidicas conocidas y en los que se han
encontrado anomalías estructurales, que pueden prevenir su
expresión normal, se especula que su aparición se deba a
fenómenos de duplicación genética, seguidos por mutaciones
que le confieren alteraciones que impiden su expresión.

Si so realiza un ESTUDIO DE LOS GENES, vemos que están 53

separados entre si por una cantidad variable de pares de
bases, conocidas como “distancias intergénicas”, observan—
dose que los genes que han aparecido en una duplicación
relativamente reciento, están situados más próximos que los
evolutivamente más antiguos, tal como sucede con los dos
genes alfa, delta, beta y los dom gamma, mientras que las ÑI3~ >3’
distancias son mayores con los genes epsilon y zeta. Y1il~~.
(3

3~13

36

3313

3’ 3:
 Así mientras que sólo 4 Kb separan los dos genes alfa,
más de 20 Kb les separan del gen embrionario zeta, ocu-
rriendo lo mismo con el grupo beta donde sólo 5 a 6 Kb
median entre el par de genes delta, beta y los dos gamma
siendo las distancias mucho mayores, de 15 a 16 Kb las que
le separan del gen epsilon.

En este ADN intergénico existen “secuencias repetía—

vas” del mismo denominadas Mu 1 o Kpnl cuyo papel preciso
se desconoce.
En el extremo 5’ de los genes de globina hay tres
grupos de secuencias que son comunes a todos ellos, que se
sitúan a una distancia relativamente similar del lugar de
iniciación de la transcripción <el lugar 5’CAP del ARNm)
que se conocen como “cajas promotoras” y que presumiblemen—
te constituyen lugares de unión u otras señales reguladoras
para la ARH polimerasa II.

Estas cajas promotoras son la ATAA, situada 30 nucleó—

tidos del lugar CAP, la CCAAT situada a 75 del CAP y la
tercera más variable que se sitúa a unos 100 nucleótidos
del CAP y es la GGGGGCG. (Michelson, 1983)

Estas secuencias son fundamentales para la expresión

normal de genes de globina, de tal forma que en ocasiones
una expresión disminuida de los genes beta de la globina,
en ciertas formas de 8—talasernia, son debidas a sustitución
de bases en esas secuencias. En el extremo 3’ todos tienen
la mecuencia NAUMA la cual se considera una señal para la
adicción de]. pali A al ARN transcrito.

~37
 si:1 3’
‘‘¾‘

[‘fr~7j”f7¶t’~’tj
Secuencie no
3, 13
5 uit í.fijS U >3 codificante (¡VS í¡> 3’. ‘q T
II
‘u
1
2
4 5 1
3 1

s354’
fi’

1 -QEGIGM DE ALTA N~Y1Ot~IA NECESARIA PAPA LA TRAl4CRIPCIOt~ CO<IPtET’A

CAJAS PR~<10TGPAS LUGAR CAPUnIcIo del ~Am)

4
533

* 4
•n ACATT oce.. ‘fi
35’
4
5’,
555
- Se~aIss o~ra él pr~ssrnIento~l RNAm
351
3-tUGARES DE ROflJRA (SPtICING) 5’ 3,
3U•” VS ...A43
3,35%
55
5-SERAL DE PctIAceNILACIc*~ 5, 3,
ten ALJAAA 00(2V pb>$• OC
O
‘353
SeA. 1 Lugar de adtccl6n del PilA ‘o
fis,53

3 32.
o -Se?iales dé IrbIuCCI<~paLgMLL
2 -COOCfl INICIAOC~ < AUG en el RRArn ) (INICIO DE LA TRASLACIG*I)

4- CCOGN FINALIZAD~ (UAA en PHAn) (FINAL DE LA TRASLACIG*{>

Q EXGUES E INtRCf4ES 323

1>1<1 Ii ANA’roM¡A i’¶JHCIONAL DRÉ. Ot’.H Dli OLQDINA MITA
E SERALES NEcESARIAS.

38
 1-
Los genes tienen dom secuencias de bases que se
transcriben a AiiNm, pero se prenden antes de que éste
llegue al citoplasma, denominadas secuencias no codificado-
ras 6 INTRONES, que leparan a tres fragmentos de secuencias
denominadas codificantes o EXONES cuya transcripción, si
produce ARtE detectable en el citoplasma y por tanto inter-
viniendo en la síntesis de la proteína (Lawn y cols, 1980>
33
Los exones de los genes a tienen una longitud de 93,
204 y 126 pares de bases que codifican los aminoácidos que
‘u
van del 1 al 31, del 32 al 99 y del 100 a). 141 en la
estructura primaria y sus intrones tienen una longitud de 3]
127 y 134 bases de longitud. 323
íI
Los genes 8 también tienen tres exones, que codifican
los residuos aminoácidos del 2. al 30, del 32. al 104 y del 132
53
105 al 146 respectivamente, separados por dos intrones de
122 al 130 bases el primero y de 850 a 914 bases el segun-
do.

33
51 >~~y

1 31 32 99 00 141 5’
¡ 1 1 ¡ 32
32
ALFA [E7II~~
Ib ZIIIII] fi,

i 30 3? lOA lOS 4
¡ 1 1 1 ¡
BE fA IvsI 42

o 20
05 lo :5

Kb

lid. Ii I3STRUC1’URA DII LOS CENES ALFA Y 3131’A

39

‘5>-
32 II35’

Por tanto el axón central de los diferentes genes de 33

globina codifican la región de unión con el Memo y la
Si 0143
mayoría de los contactos entre subunidades Alfa 1- Beta 2,
32 mientras que Los dos genes laterales codifican las regiones
que no se unen a]. Memo (High, 1985).

En .1 estudio de las secuencias codificantes de los

exones, si bien parece que todos los posibles codones para
un aminoácido dado se utilizan de una manera aparentemente
al azar sin predilección estadisticamente significativa, se 33
Y >535
5’ ha observado una marcada tendencia al uso de ciertos ~ss
codones de entre los posibles para algunos aminoácidos,
como es el caso de la valina con el codon CUG y la leucina
con e). OUG.

S313]

>0

513
>35,

1‘3531
SS]
3235
145s
[35

~fi

40

fi’
 3.2. fIWPuhII DE LA aLguna

Las etapas incluidas en la expresión genética y en la

síntesis proteica me ilustran esquemátjcam~~~~ en la Fig.la

OO#O II P&M$CA LA NIMCOL.OBINA

• fi> 4s..n.**a >‘. fi—. o<IAaU~yflAno

ti —a—. —
O~’CACCATOOTOCACCTOACTOCTOAO..
—4 — a ... al-aTOOTACcACOTOOACrOACaCTC.
SIM ~ u. a. ea-e. k veas.. 4 .b —‘

—r —. ~04~.*p*~M n.a-

GACAC4MJGOI.flCACCUOACUCCUCAO,,
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>4ACACCAUOdUG CACCUGMX>CCUGÁC..
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-.1 $e., — te~@ O’U 0.1042

2AIJRWA LA IUU.<OOLOIJINA
rin U cOMO Sil I

Siguiendo el esquema anterior podemos considerar dos

etapas en la síntesis proteica:
1. Traiiuoripa±6n
Venómeno básico niendiante el cual una parte del ADM es
copiado al ARN.
Todo gen es transcrito, sufriendo posteriormente una
serie de modificaciones como son, la adición en la región
5’ de la estructura CAP y en el 2’ una cadena de residuos
poliadenilicos, el ¡‘oh A, proceso que se conoce como
“CAPPIWQ”,

42.

3-
 Seguidamente es separada la parte del ARtE que corres-
ponde a los intronee y aproximados y unidos los extremos
finales de las secuencias codificantes para formar ARNm
maduros Este proceso es lo que se conoce como “SPLZOU4G’0 ~
BupálMe. En este empalme parece ser importante la unión del
fragmento con un ARtE de bajo peso molecular (RNA Ul), el
cual forma parte de una pequeña partícula ribonucleinica
nuclear y La presencia de secuencias de nucleótidos especi-
ficas en las uniones entre exones e intrones,

Algunos tipos de 8—Talasemias pueden producirse por

una anoma Ita de Éste fenómeno. Deepues de este procesamien-
to en el nucleo. este ARtE maduro es transportado al cito-
plasmo.

~AOVCCCfi

•“.•.M
? —
&MjÑOAC.OO
A*N’1

~iSQ5QMA

‘la
k ~
Jis
-¡e>
4fl2 I~CL<A~

»
t*~

2
,WMBAAflÁ 11<hJJI.AR

VIO-lA IQHTMU DEGLODINA

42
 2 .Traduoci6a
Comprende el conjunto de procesos que se realizan en
el citoplasma del eritroblasto para producir las cadenas de
globiflá. El &RHm es e]. molde sobre el que secuencialmente
los residuos de aminoácidos se unirán unos a otros siguien-
do varias fases:

* Activación: el KRHt se encuentra doblado en su mitad

dejando en esta doblez un triplete de basen un aparear
(anticodon) , que debe Compementarme con los codones de
ARHm. A cada molécula se le une por esterificación un
aminoácido especifico, catalizándose este proceso por una
aminoacil-kRHt-sintetasa en presencia de ATP y magnésio,
originando un amino&cil-A.RHt,

-j1 5~I*$$

4’.. UIO~V*~Si Sil fi>A h.S)i*N. 4

VIO lituana él. migas *gn la aánulS del AMIn da la Bik~fi

* Iniciación: en esta etapa se produce la unión del ARNm al

ribosoma, con reaccione. enzimátical complejaS que aproxi-
man hasta juntar el ARRiO, La subunidad ribosómica 40S, un
A.RNt iniciador especial, el cual lleva el aminoácido
metionina y la subunidad robouóffiiC5 SOS. La reacción
requiere un numero de factores proteicos añadidos GPT Y
ATP.

4,
 tI codon iniciador AUG del ARHm (complementario del
UAC del ARHt) señala el punto de arranqus para la traduc-
ción del ARHm, constituye tambien el único codon para el
aminoácido metionina, siendo posteriormente escindido.

* Elongación: cuando van llegando nuevos ARNt con su

aminoácido <aminoacil ARHt) al ribosoma, se unen a éste
mediante la intervención de un factor de elongación EF—í,
en presencta del cofactor GPT.
Se va uniendo al codon complementario del anticodon
tranefiriendose e]. aminoácido transportado a la cadena en
formación, abandonando el ribosoma y avanzando un puesto el
aminoácido reden llegado, con lo que queda litre un nuevo
punto aceptor, repitiendose ami el proceso.
El ribosoma se desplaza como a través de un rail
realizando La lectura del ARt4m desde el extremo 5’ hasta el
3’ de una forma ininterrumpida y sin saltos, hasta encon-
trar la señal de finalización.

1S*.>fl

talO Ifihln#Ir*olta¿I0l
én
1k<n idal áRHm 0. ~UU4

cm kti M42i4M<flI de lo. ARNI

.rgWo. os

44
 ilis 3

* rínalización: la cadena peptidica crece hasta que el

ribosOrnfi encuentra alguno de los trés codones de finaliza-.
ción tuu~, UAQ, UCA) que le indican que la síntesis de la
5
‘fi
cadena debe cesar. Separándose el Polipéptido del ARNt por
acción de la Per3tldil—Transferasa, que en presencia de un
factor dé liberación actúa como una hidrolasa, disgregAndo—
se así mismo Las dos partes del ribosonia que participarán ‘
53j~;
posteriormente en la síntesis de otras cadenas.

\IY
YtEGULACION ~Z LA,STNTESIS DE LA GLOBINA 3$

Los factores específicos que activan la expresión del

gen de globina en las celulas eritroides y la suprimen en 3244

las no eritroides,
caracterizan no me los
y diferencian conocen, aunque de
genes activos algunos datos
los inactí—
vos y proporcionan alguna información sobre los prerrequi—
Li3532323213
sitos para la expresión~ del gen de globina, así:
01

- El estado de metilación del ADN de un gen, influencia ¿3

su capactdad para ser expresado. En general los genes que
están siendo activamente transcritos están casi siempre
hlpomotilados. En Los tejidos no eritroides los genes de
globina están generalmente motilados extensamente como
puede esperarse de genes inactivos.
5s]33
ser unAunque La hipometilación del MW del
en el
gen,lado
es 5’ pueda s
prerrequisito para la expresión probable
34
que no gea el suceso primario y sean otros factores respon—
sables del inicio, una vez que el gen está en situación de
ser expresado (ProudfOot y cols.,1980). Además otros 34$fi fi
fi

factores deben ser requeridos para causar su metii.ación en

regiones especificas de un gen determinado en un tejido y
tiempo especifico del desarrollo. }>S3?fi

SSS

- Estructura de la cromatina: el ADN se encuentra en la (4

celula asociado con distintas proteínas para formar la
cromatina. La estructura física de la cromatina puede

VI
3?-
variar en regiones donde el ADN está transcribiendose
activamente, siendo más sensibles en esta situación a la
digestión por nucleasas, por lo que en algunos aspectos, la
sensibilidild de un gen dado a la nucleasa, parece ser otro
prerrectuicito para La expresión del mismo.

- Asociación con la matriz nuclear es otro dato de los

genes activamente transcritos, es decir que tienden a estar
asociados preferencialmente con una estructura filamentosa
reticular, Llamada matriz nuclear,

Ya en el citoplasma, a nivel de la etapa de iniciación

de la cadena, parece tener lugar una regulación menor de su
síntesis por el grupo Memo, dado que la presencia de Memo
o de hierro estimulo la misma y en situaciones de deficit,
se origina un freno en la síntesis principalmente de la
cadena a, produciendose una situación de seudo a-talasemia,

46
 3 (Moore,1980>

El Fiemo consiste en un ión divalente de hierro rodeado

por un anillo de Protoporfirina ix, cuando el hierro se
oxida forma el Memo.

La stntesis del hamo comienza con la condensacian de

Glicocola y Succinil-CoA, y consta de varias etapas
fundamentales, dos de ellas mitoconciriales, (Ver fig. 17).

En la primera de ellas se sintetiza el precursor:

ácido delta amino levulinico (Delta-ALA), mediante la
acción enzimática de la delta amino levulinato sintetasa
(Delta—AladiLfltetaSS] cuyo cofactor es el piridoxal fosfato
(Vit. B~> y el ión ferroso.

CíI~

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Iflid II fl>~aa <Uit bio.tfiIUU dcl flema

47

L
 tV’S
313’

5S,,’s3í
35] ~;3;
En la segunda etapa, con intervención de una cadena 333
enziniática donde destaca la ALA-Deshidrasa, se produce la
condensación de dos moléculas de ALA para formar Porfobili—
nógeno (PBG).

En sucesivas etapas, y a través de varias reacciones 3’,>

de isomerización, con condensación de cuatro moléculas de
PBG, se forma un tetrapirrol, la Protoporfirina IX al que
35
finalmente se incorpora el hierro (Fe++), mediante una
reacción enzimática catalizada por una Hemosintetasa
obteniendose así el grupo Heno (Gidari,l977).
h 3t13
3>
La síntesis del heme es en gran parte controlada por ‘3’
el proceso de represión del producto final y feedback 3
negativo (inhibitorio) de la enzima ALA—gintetasa. El
propio grupo hemo tiene dos efectos sobre esta enzima, el
primero, interacciona directamente con la enzima y la 33]St~

inactiva (represión del producto final), y en segundo

33,
lugar, la ALA-Sintetasa tiene una vida media corta, sus
niveles celulares descienden rápidamente despues que su
1%- -

síntesis es suprimida debido a una inhibición feedback 3

-4335’-
(Tenhunen,1972). Similares mecanismos afectan la actividad
de la hemosintetasa pudiendo limitar la formación del heno tU
desde la Protoporfirina (Lebo y cols.,1979). 1~ y
>5 fi
- ,35: s~ s>5
SL,’’
~
La síntesis del hemo es tambien controlada hasta
cierto punto por la síntesis de globina; la inhibición está
probablemente mediada por la vía del hierro libre, el cual
se acuinula en ausencia de síntesis de globina. sj¡
5fi’!

La reducción anormal de la síntesis del heno observada

en la talasemia presumiblemente resulta de un mecanismo fi332
similar debido al inicial descenso en la síntesis de
globina que ocurre en este desorden. it
y ~>fi fi

~
<3,33 <fi
fi fi
fi’

s333
48 ,j
fi’ fil
35, 14
fi fifi

1’5 fi

fi>
 d
3 • 4 • ENSAMBLAJE DE LAS SUBUNIDADES DE HEMOGLOBINA
it ~
534

Las propiedades fisiológicas de la hemoglobina depen— ji13 ~

den del ensamblaje ordenado de subunidades en las celulas
eritropoyéticas. 5]

Una biosíntesis eficiente de hemoglobina requiere la

producci6n balanceada de cadenas polipeptidicas a y 3, ti
‘fi’

permitiendose un ligero desajuste en la biosíntesis, debido 1<

a los eficaces mecanismos proteolX.ticos de los precursores
eritroides (Jelinelc,1982)
1>
Una vez que cantidades equivalentes de subunidades a
y 8 han sido traducidas de sus respectivos polirribosomas -
y que el Hemo ha sido insertado, las subunidades de hemo-
globina formarán dimeros a—A facilitados por la atracción
electrostática de la subunidad a cargada positivamente con
la subunidad 3 negativamente cargada. Estos dineros se 3”

disocian muy lentamente, al contrario que el tetrámero el

it
cual fácilmente se disocia en dimeros (Anfinsen, 1973 ;
11 5

Perutz,1970) . 4 - -

15
Este modelo de ensamblaje de la hemoglobina explica
los diferentes niveles de mutantes de hemoglobina con
cargas positivas y negativas que pueden encontrarse en 3~5 ~3
heterozigotos, así como el efecto que las a—Talasemias y 4321333
los estados de deficiencia de Hemo ejercen en la modifica- 7323]] 3

ción del nivel de las variantes de hemoglobina. ,

¿4
Como podría esperarse del patrón de herencia, ya que
Y~ ‘
4
‘a
un gen es heredado de cada padre, un individuo heterozigoto ¿3 3
para una variante de cadena 3 debería tener aproximadamente 323>~]
niveles iguales de hemoglobina normal y anormal, sin <fi

embargo diversos factores independientes influencian la “~3f

formación de hemoglobina normal y de mutantes. ¿37
fi--fi>’>

fit~

fi >5
3>3,3] fi if
fi fi
fi,
101,3

‘fi 3
__________________ ¡“fi’>
 Así, algunas variantes se sintetizan en una cuantía
significativamente más baja que su contrapartida normal,
tal es el caso de la Hb E, Hb Lepore y lib Knosos (Orkin y lid-
cols.,1984), en las cuales la mutación conduce a un detecto
fi”
en el procesamiento del ARNm y por tanto a una síntesis 4
fi”
3, reducida de la proteína y en consecuencia un fenotipo
~fi talasémico. 33~ -

355

fil 3
3, En contraste, la gran mayoría de las variantes tienen
unos indices de transcripción y traducción normales,
existiendo otros factores que influencian la cuantía de 333.5 -

esta hemoglobina en los hematies~ así:

Y
<fi 1. -

fi 1) la estabilidad de la subunidad anómala. La mayoría de 3. 3.

las variantes inestables de la cadena 5, representan menos ]sl~ -

de 20 % del total de hemoglobina, debido a un aumento en el 3j3]~

catabolismo de la variante tanto en el precursor eritroide 3i]s~ -

354
como en la circulación perifirica. 34 -

2) la diferencia en la velocidad del ensamblaje de las

subunidades, lo que puede explicar las desigualdades en los ~33fi~
~, -
niveles de la mayor parte de las variantes estables. ¶13
En este último caso, si la variante fi es producida con
velocidad, estabilidad y solubilidad normal, los heterozí-
gotos deberían tener igual cantidad de hemoglobina normal ],j
que anormal, sin embargo en muchas ocasiones no ocurre así, ti{i
encontrandose variantes 8 en cantidades significativamente
más bajas que la hemoglobina A.
f fi fi

Esto suele producirse con las hemoglobinas anormales,

que poseen cadenas cargadas positivamente en las que además ~,
1501’
al asociarse con a-Talasemia, la cantidad de variante ~,

cargada positivamente disminuye en proporción al numero de »j’

genes cx delecionados. En contraste, las variantes cargadas ¶y,33~3~ Ii
negativamente están a menudo presentes en cantidades
mayores que la hemoglobina A en los heterozigotos, cuando 3 35’ 5
1-]
se asocian con a—Talasemia (Beale,l9 65).
¿33

¡
: ti

¿j S~ “ 735
50 fi U
~333S5

‘5, ~ ti
5’ ‘5

fi”>
HEMOGLOBINOPATIAS
 4. HEMOGLOBIINOPATL&LS
CONCEPTO Y CLASIFICACION

Las hemoglobinopatias son alteraciones cualitativas o

cuantitativas de la globina, sin embargo el término de
hernoglobinopatia se emplea para las alteraciones de la
estructura y síntesis de la proteína <Weatherall, 1981;
Bunn, 1986)

Se originan como alteraciones secundarias a mutaciones

genéticas, cuya consecuencia puede ser una modificación
estructural (hemoglobinopatias estructurales) o una dismi-
nución, más o menos intensa, de la síntesis de una cadena
globinica estructuralmente normal <talasemias)’. Finalmente
hay un tercer grupo caracterizado por un fallo genético del
cambio en la producción de hemoglobina fetal a hemoglobina
adulto, producido normalmente durante el proceso neonatal,
denominado persistencia hereditaria de la hemoglobina
fetal; no tiene significado clínico y su síntesis se centra
en el estudio de la regulación de genes.

Aunque el presente trabajo se dedica especialmente a

las ¡3—talasemias, comentaremos brevemente los conceptos y
clasificación de los demás transtornos, puesto que en
poblaciones donde las talasemias son comunes, a menudo
existen individuos dobles heterozigotos para ambos trana-
tornos.

52
4.1 TALASEMIAS (Villegas y cols., 1988; Bank y cols., 1968;
Nathan, 1972)

Son alteraciones genéticas cuyo resultado es la

ausencia, o producción disminuida de una o más de las
cadenas de globina normales. El término talasemia procede
del griego (Thalassa y Haima) y significa “mar y sangre”,
refirendose a la elevada frecuencia de esta enfermedad en
cierta población cercana al mar, que en un principio era el
Mar Negro, aunque posteriormente se ha hecho extensiva a].
Mediterraneo, en cuyo litoral también es frecuente esta
enfermedad.

La secuencia de aminoácidos es normal, por lo que las

talasemias se consideran defectos cuantitativos, ya que
estructuralmente la globina es generalmente normal (Ramot
y cols., 1973).

Se clasifican según la cadena afectada en Alfa, Beta,

Delta, Gamma, Delta-Beta , Gamma-Delta-Beta y Epsilon—
Gamma—Delta-Beta o según sus manifestaciones clínicas en
formas mayores, intermedias y menores, dependiendo de la
gravedad de cada una de ellas.

Las alfa y Beta talasemias son además subdivididas en

formas Alfa0 y Beta0 en las cuales no se produce cadena
afectada y formas Alt a~ y Beta~ en las que algo de cadena
se sintetiza pero en cantidad reducida.

El defecto de síntesis ocasiona un desequilibrio en la

producción de ambas cadenas, precipitándose en la médula
ósea o posteriormente en el eritrocito maduro la que se
produce en exceso, con el consiguiente transtorno en la
maduración y supervivencia de la célula.

53
GENETICA Y BASE MOLECULAR

La herencia en la talasemia sigue las leyes de Mendel,

3>5
siendo autosómica codominante. Las mutaciones que originan
las talasemias pueden afectar al propio gen de la globina
o a cualquiera de los procesos necesarios para que el flujo
de información llegue desde el gen a la cadena de globina. 32133
Las nutaciones causantes de talasemia más comunes son
5-313
(Kazazian, 1985; Nienhuis, 1984>:
Sa

Deleci6n del gen: Como consecuencia de un entrecruzamiento 5-

no homólogo durante la meiosis, un cromosoma puede resultar 113

con grandes pérdidas de material genético que incluya uno
o variosgenes de globina o fragmentos de un gen. La mayor
parte de las mutaciones causantes de a-talasemias son de
este tipo. Sin embargo, en la 13—talasemia este mecanismo su
causal es muy poco común. S
533 35

Mutaciones que afectan al promotor: El promotor del gen lo

forman unas secuencias situadas unos 150 nucleátidos
“corriente arriba” del primer exón del gen de globina. fi

Estas secuencias son esenciales para una correcta inicia—

ci6n de la transcripción. Las mutaciones que afectan al
promotor pueden ser de dos tipos:
4
1 [fi

13]
1332<
a> Mutaciones en las secuencias del promotor que y
actúan sobre la expresión del gen.
b) Mutaciones en secuencias alejadas del promotor que
influyen en su función. Se han descrito casos de gamma-
delta-beta-talasemia originada por una delección de los
genes gamma y delta quedando intacto el gen 8, sorprenden-
teniente no funcionante <Chebloune y cols., 1984; Wood y
cois., 1978).

54
 k
3327
Mutaciones que afectan al procesamiento del ARR. B
Se distinguen:
a> Alteraciones en el Splicing. Algunas mutaciones que 53’5

afectan sin sentido a las regiones fronterizas exón-intrón,

y
pueden alterar la correcta expulsión de las secuencias de
los intrones de la molécula de pre—ARNm, dando lugar a un Y
.33,>

APN anómalo. Se han descrito varios casos de J3—talasemia 3s

producidos por estas mutaciones (Nienhuis, 1987>.

b> Alteración de la señal de poliadenilación. En el
extremo 3’ del ARNm existe una secuencia de nucleótidos que
actúa como una señal que permite la adición de un tracto de
residuos de adenosoma (poliA) . Se han descrito a—talasemas

.
“no deleción” por anomalías de nucleátidos a este nivel
(Bunn, 1987)
y37 -

Mutaciones que alteran la traducción. En el proceso de

3
traducción del ARNIII a cadena de globina. pueden darse 32s
mutaciones que afectan al codon que indica la terminación 3
de la síntesis de la cadena de globina, dando lugar a la 3~
3<33
-
aparición de cadenas de globina acortadas o elongadas
<Orkin y cols., 1981; Piratsu y cols., 1984).

a) Síntesis de cadenas de globina acortadas. La

aparición prematura en el ARNm de un codon de terminación 53

(UAA, UAG ó UGA> puede deberse a substitución de un nucleó- t ~. -

tido por otro o a delección de un nucleáticlo con altera— 1334 3 32 . -

ción en el marco de lectura del código genético. Se han ~

351>32! 32.-
descrito varias mutaciones de este tipo causantes de la 13—
talasemia (Baglioní y cols., 1969). 321
fi fi

b) Producción de cadenas de globinas elongadas. El 1

532<
‘a
codon de terminación de la síntesis de cadena de globina es
UAA y el a y 13-AR.Nm. La substitución de un nucleótido en
este codon hace que la cadena se elongue hasta encontrar un
nuevo codon de terminación. “4. <4
Yfii} fi
3 fi

fi fi fi

55 5,

¿3¡’ 35” ‘fi ‘fi

ji
 531333332.5
‘1~1’3~ -“—————I

13]

primera descripción de una de estas cadenas elonga-

La 2~1
das fue la hemoglobina Constant Spring (CS) producida por
un ARNm que codifica 172 aminoácidos en lugar de los 141 de
la cadena normal. El a—ARNm OS se encuentra cuantitativa-
ti]
mente deficitario quizás debido a su inestabilidad. 4 33
- -

En las tablas 1 y II se detallan las alteraciones

33
moleculares más importantes encontradas en a y 5 talase— 323
53,
mias. 33
32fi<
TABLA 1. Base molecular de las betata¡asemlaa 1.’ -

~ talasemia 3+-talaseinia Localización de la alteTacidrI

Deleción ADN (secuencias codiflcadoras) 3,3
ALteraciones que afectar Promotor (transcripción) 3>
Alteraciones en el spUcin al promotor
9 Alteraciones en -el spUcing Spticin~ (procesamiento) 32~35
Cadenas acortadas Traducción
‘33
:5 3

‘5
TABLA II, Base molecular 35<32
de la altatalascula
di
‘
--
Delación
Talasernia alfaa — 0/01

Talasemia alt al cts’ — — ¡ca

Talasemia altai ‘Iran? — — a

Enfermedad de la HbH —a,’— —

Hidropesía Letal por Kb Bart — —1— —

No dajeción
Cadenas a alongadas: Mb Cc’nskznt Spring, etc.
Otras mutaciones ~
3/ 32’ fi fifi

(3’ ‘5’
‘5” fi fi fi
93’
‘fi

51,

fi fi

sw3’
‘3,
$

-¿
~,t
t-
S33

3351

:¡13213¡fiSYÍ.fififi.A¡.
fi
fi,>>-
35 -s fi,>

5, fil
56

<14
 Talasemias Alfa (Wise, 1970; Wasi y cois., 1973)
313’
(5
35 Hay dos formas clinicas importantes de talasemia alta,
el Hidrops Fetal por hemoglobina Bart y la enfermedad de la
32 hemoglobina H, las cuales resultan de la interacción de dos
35 determinantes genéticos talasémicos alt a (alt a0 y altat).

TALABEMIA ALFA0 resulta de la pérdida (deleción) de

fi ambos genes de globina alta del cromosoma 16, cuyo haploti—
3 po sería (——/>.

TALABEMIA ALFAt resulta bien por la deleción solamente

de uno de los genes de cada par, o en otros casos denomina-
dos no deleción en los que el gen está intacto, pero tiene
fi mutaciones que le hacen inactivo parcial o completamente.

Se clasifican en:

1. Tipo delecián cuyo haplotipo es (-alfa/) (—a/-a)

2. Tipo no deleción: se han caracterizado diversos

tipos cuyo haplotipo seria (alfa alfa T/> o (alta alfa).

3. Hemoglobina Constant Spring, se considera otro

grupo de no deleción, se origina por la mutación de una
única base en el codon de terminación de la cadena alfa2
continuando la lectura del A~J cuando deberla finalizar y
por tanto sintetizandose una cadena alta con 31 aminoácidos
más en el extremo o terminal, pero en cantidad reducida
dado que el ARN alargado es inestable. El haplotipo es
(alta CS¡> y se coiwporta como a~ talasemia (- a>.

Considerando que la síntesis de la cadena alta está

regida por cuatro locus, de la interacción de los determi-
nantes genéticos citados anteriormente podemos esperar los
siguientes fenotipos:

57
 —

1. Estado de nortador silente o a4heterooiaátioa 3t

Son los heterozigotos para el determinante alfa4, es
la forma más leve de enfermedad y su genotipo puede ser:
H
(—alfa/alfa alta),(alfa alfa rfl/alfa alfa> 6 (alfa alfa
OS/alta alfa). Hematologicamente son normales y algunos de 134r
34 -
ellos tienen un 1—2% de hemoglobina Bart al nacer.

2. Rasco talasémico alta

3-
Que resulta del estado heterocigótico para el determi-
nante alfa0 (--¡alfa alta) o del homocigótico para el
determinante alfa~(—alfa/—alfa> o (alfa alta OS/alfa alfa
OS>. Se manifiesta por una seducción marcada del VOZ’! y 11CM 3 -
con una hemoglobina A2 normal o disminuida, así como un 5
a 10 % de hemoglobina Bart al nacer.
SS

3. Enfermedad de la hemoalobina H <Clegg, 1967>

Es el resultado del estado doble heterocigótico para j
el determinante alta0 y alfa4. Su genotipo puede ser <— -~
alta) , (——¡alfa alfa T> , (——¡alfa alta OS) . ~32
Los pacientes presentan anemia microcitica de intensí—
dad variable con acentuada dismorf la eritrocitaria, reticu- 323
locitosis, signos bioquímicos de hemólisis y esplenomega- 3 21
lía. La confirmación electroforética y la sintesis in vitro
de cadenas de globina, así como el estudio familiar y 33~
genético confirman el diagnostico (Kan y cols., 1975; oid Y
y cola., 1977; Kirchsmanr¡ y cols., 1978). ~~L~
1k’
4. Hidropesía fetal por hemoglobina nart 3j~’j32 ‘32< ¿fi
#fi

Es el resultado del estado homocigótico para el

determinante talasémico alfa0, cuya genotipo es <-—/-—)~
Es incompatible con la vida, constituye una causa de fi fi 5’S-~

aborto hacia la 30 semana del embarazo o de muerte fetal <$fi5ifi

‘fil ‘3,’-’

Sí

4
poco después del nacimiento; mostrando la electroforesis un
80% de hemoglobina Bart y 20% de hemoglobina Portland con
ausencia total de hamoglobina A y F <Weatherall y cois., pi
1970) . 1.3 sfi
fi
fi
fi ‘fi
~i>S
‘fi ‘
35
fi’

35 !f’~ 31332357
58 ~s”’3
,‘1 >5 ‘<1
¿3fi 3’‘335’
3. ‘;‘ 3 y:
]‘32
5133” 3’ fi

‘it
<‘53<
1
3 <3
 335
Talasemia Beta <532<
>532<3
53
La intensidad del déficit de cadenas depende del grado
4
de alteración genética y puede variar desde una ausencia 35
1333 -
completa de síntesis <SO> hasta unasintesis parcial pero ¿3
siempre deficiente (5k). La diferente expresividad clínica
de la ¡3—talasemia resulta de la combinación de ambas
321
13--
posibilidades (¡30 y ~‘a>o de cada una de ellas con el gen 5’
normal (Kantor y cole., 1980; Wasi y cois., 1973>. 32
3232132:
La participación de un mismo par cromosómico de ambas
formas se traduce en diferentes genotipos <5+/J3+43+/¡30 ~
¡30/flO) cuya expresividad clínica o fenotipo seria la fi— 32324
Talasentia homoc±g6tica, mientras que la combinación del gen
(32
¡3+ O ¡3~>5~ con el gen 5A normal darla lugar a dos posibles 1321

fenotipos (¡3+/¡3A y ¡30/BA) cuya expresividad clínica seria la s~]3

8—Talasemia heterocigótico. La IS-talasemia homocigótica

incluye lo que se conoce con el nombre de Talasemia Mayor
o Intermedia en algunos casos y la 13-talasemia heterocigó—
tica el rasgo talasémico o la Talasemia Menor. (Bravernian,
32]~,3]
1981; Testa y cole., 1981).

13. fi

La variabilidad clínica del síndrome talasémico puede

~]S’~3:
~‘. - fi

obedecer, no sólo a una interacción exclusiva de los genes

5+ y ¡30 entre si, con el gen 8Á normal, sino también a la de 332-3
cada uno de ellos con otros genes talaséIl¶icOS, tales como ti#~
la PHHF, delta-beta-talasemia, hemoglobina Lepore, etc. 32- fi

5<’ 5--’’
Debido al elevado polimortisnio genético y a la exis-
tencia de diversos mecanismos fisiopatológicos en el
desarrollo de la anemia, la expresividad clínica de la ¡3—
talasemia puede variar considerablemente (Oomi y cole.,
fil--
1977)
Weatherall ha establecido una clasificación clínica de
la ¡3-talasemia heterocigota y homocigota, de acuerdo con
que el gen ¡3 afectado presente una reducción (8k> o ausencia
(>30) de síntesis de cadenas globinicas.
~321’
]:~;~
53
Ip’
fi ‘fil’ ‘ 5’ ‘ fi”

59 :353

4fi ~?“ ~t
LL
 Tipo , Expresividad /¡enIaw¿uQica

33—/dhlse’>Il¿í IIeYt’I’fijtt~4o1d
[JI J5cmIa
3,3 aLasemia Anemia microcitica
W talasemia ada HbA=35-ó ~
variedad ‘nodci
~ talasemia
con HbA: normal
ti PO 1 alasem a si Le nteí Hb HBA~ normales
tipo 2 Anemia microcíuca
HbA~=3,5 %
3~—talase,iíia Iío,,rne’~o¡a
fYíaLasemia Anemia intensa
con requerimiento
transfusional periódico
HbF=70-95 %
3,” talasemia Anemia muy intensa
con requerimiento
cransfusional periódico
HbE=98 % HbA,=2 %
3,3’ aLasemia
variedad moderada> Talasemia intermedia
(Hb=90-l It g/l)
HbF= 2040% HbA<=2-5 %
f3 calasemia
con [‘IbAsnormal
tipo ¡ Talasemia intermedia
(Hb%90-Ill g/I>
Upo 2 HbF= LO-30 % HbA.=3-4 %

Tabla III CIMH.oido dc las toes. mM frecuecte.

de fi-Uhwmia

La 8—talasemia heterocigótiaa es la forma más frecuen-

te en nuestro medio y se caracteriza por una pseudopoliglo—
bulia microcitica con discreta anemia, rara vez se observa
esplenomegalia (Villegas y cols.; 1990). Esta forma clini-
camente asintomática de IS—talasemia heterocigota se conoce
también como “rasgo talasémico”. Su diagnóstico suele
realizarse con motivo de un examen hematológico practicado
en el curso de un estudio familiar. Muy frecuentemente
suele confundirse con anemia ferropéiiica, por ello es
importante el diagnóstico diferencial con el fin de evitar
al paciente una prolongada, inutil y nociva terapeutica
marcial. (Benz y cols., 1984; Schwartz, 1970).

60
 El procedimiento más asequible en la prática para el
fi diagnóstico de ¡3-talasemia heterocigota es la electrofore- 5’i
13.]33
sis de hemoglobinas, donde se observa un aumento caracte-
ristico de la fracción de hemoglobina A2 <mayor o igual al

2,5%). Existe una forma “silente” con hemoglobina A2 y E

fi normales, en la cual es necesario recurrir a técnicas más 32
especificas que serán tratadas en otro capitulo con mayor
~32~3
amplitud.
En paises como España, en los que existe una moderada
incidencia de ¡3-talasemia heterocigota se considera muy 3 232
necesario tanto el escrutinio sistemático del déficit como
-3,51
la realización de un consejo genético a los individuos
afectos, con el fin de prevenir la talasemia homocigótica.
Ir

La B-’raíasemia bomocigota o anata de Cooley, se

caracteriza por una expresividad clínica variable, pero
SS
generalmente intensa. Esta se inicia a partir de los seis
meses del nacimiento y se caracteriza por una intensa
anemia que obliga a instaurar un régimen transfusional
periódico, con objeto de mantener el nivel mínimo de ¿
hemoglobina. La anemia se acompaña de esplenomegalia, que
aparece casi siempre a partir del primer año de vida y de 43
hepatomegalia variable; se produce también un retraso del 3 -
desarrollo óseo y del crecimiento corporal. (Forget y ,5-~.. S~ -
cols. , 1974; Chang, 1979> . fi

El cuadro clínico de la talasemia mayor suele agravar- fi’

se por las complicaciones debidas al exceso de hierro del
organismo, o hematocromatosis secundaria a la mayor absor-
ción de hierro a nivel intestinal y efecto del regimen « -
transfusional. Entre tales complicaciones destacan cirrosis
hepática, diabetes mellitus y miocardiopatia que en general
constituyen la causa de muerte de estos pacientes, casi
siempre antes de los veinticinco años de edad. (Bank, 1966)
El diagnóstico de la 5—talasemia homocigota se basa en
la observación morfológica de sangre periférica y en la
práctica de estudio de hemoglobinas.

‘1’~ 35fi

fi fil’
3~~5 ~fi
 La 8—talasemia intermedia constituye un cuadro hemato-
lógico muy heterogéneo con un curso más benigno que el de
la ¡3—talaseTnia mayor. En general, la sintomatología no es
tan grave, con menor requerimiento transtusional. El curso
clínico es muy variable, sobreviviendo los pacientes largos
perlados con relativa buena salud o presentando serias
complicaciones, con malformaciones óseas, infecciones de
repetición y sobrecarga férrica. <mein y cols., 1984>

Considerada a nivel molecular, la IS—talasemia interine-

dia es sumamente compleja con una larga serie de interac-
ciones entre diferentes tipos de talasemias, tales como f3’*
talasemia/ delta-beta—talasemia, asociaciones de a y 13—
talasemia, o de talasemias con hemoglobinopatlas estructu-
rales, etc, (Villegas y cols.,1992).

62
r

TulalOfliA Delta Beta <Ottolenghi y cols.,1976; Bernards y :553

33

cola., 1979>
51
3, -‘

Se debe a un defecto en la síntesis de las cadenas

delta y beta. Se caracteriza en su forma heterocigótica por
un cuadro talasémico menor con hemoglobina A2 normal y
35 -

niveles relativamente altos de hemoglobina fetal, así como

ausencia de hemoglobina A y A2 en el estado homocigótico con
clínica de talasiniia intermedio. La hemoglobina fetal se
encuentra heterogefleamente distribuida en los hematíes. 11
IP --

31 -

Talaselia Gana—Delta-Beta (Orkin y cola,, 1979; Orkin y

cola., 1981)
Se han observado solamente en portadores heterocigótí—
1-fi--
cos. Se caracterizan por hemólisis neonatal y cambios
hematológicos de talasemia beta, con un nivel normal de
hemoglobina A2 en el adulto.
Otras variantes menos frecuentes serian:
-

-
-
Talasemia gamma
Talasemia delta
etc. 3
~ 53
331’’ -
<Sfi’
32,3 ‘‘‘“fi

11~
~32
~32
“‘32
33s ~3 ‘fi

‘jj ‘si!

‘31 ,¿S
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131~”
<~,

32::, “~‘‘
51331” 3
‘732 1~~
“5 fi

4,
53>,

63 ~333
555 1-

32, 453 3232

1132~
fi’

“fi
5 323
 ~‘í

sindromem hemoglobina Lepore <White Y cols., 1972; Gilí y

t
cole. , 1972>

Se origina por la síntesis ineficaz de una cadena no

31<
alfa híbrida, estructuralmente anormal, formada por una 3s~
porción N—terminal idéntica a la cadena delta y por una o fi-

terminal idéntica a la beta, Son productos de un gen nuevo,

fusionado durante el entrecruzamiento en la meiosis de los
¡533’
genes delta y beta y transmitido posteriormente de forma 4
mendeliana simple, 3%
3,3
13

El punto de fusión ea variable habiendose detectado

343
tres tipos de entre los posibles: Boston, Baltimore y
Hollandia con propiedades similares. (Clegg y cols.., 1965> 32~
fo3 32• -

La síntesis de la cadena Delta Beta de la hemoglobina 35

Lepore sigue un patrón casi idéntico al de la cadena delta 321
de la hemoglobina A
2, por ello no se detecta en la electro— Y
foresis alcalina de la sangre de cordón en el periodo
neonatal. <Ottolenghi y cola,, 1979) 3

Su movilidad el,ctroforética a pH alcalino la sitaa ljhc1

entre la hemoglobina A2 y la hemoglobina A, ligeramente más
anódica que la hemoglobina 5, no separándose de la hemoglo-
bína A a pH ácido.

En el estado homocigótico las manifestaciones clínicas

varian entre una forma intermedia y mayor, no se sintetiza 1/1 323
hemoglobina A ni hemoglobina A2, apareciendo solamente {~S 1
~;fi 32
Fetal y Lepore en una cuantía media del 15% del total, no 3
muy diferente a la que se cuantifica en estado heterocigó-
tico, que sin embargo cursa con cifras mucho más bajas de 1<
lib F. 3

l3,333~ 3

64 ]~3

55<
 325

4.2 PERSXBTENOIA HEREDXTARIA DE EBMoGLOBXNA FETAL <PHEII

¿5

Se denomina así a aquellas condiciones en las cuales .1

5’
la producción de hemoglobina fetal en eJ. adulto excede el 32
nivel normal en ausencia de cualquier cambio hematológico
mayor (Tate y cola., 1986; Bernards, iseo>.
Son fenotipicamente heterogéneos tanto en la cantidad 1
de hemoglobina fetal producida como en relación de las
cadenas gamma G/ gamma A que contienen.
¿fi”

Según la patología molecular pueden agruparse en:

TiDo delección, son la mayoría, se debe a la pérdida de

cantidad variable de material genético, que incluye gene— ~<
¿fi

ralmente los genes delta y beta. 3,

fi’

~
Tioo no delección, se han descrito muchas variantes, en las 5]
que la mutación de la única base dentro o fuera del grupo
de genes gamma—delta—beta origina el transtorno.
En estos casos la producción de cadena gamma deriva
casi completamente de uno de los dom genes gamma. El gen
beta sobre el cromosoma afecto se expresa correctamente. -3 2
3232
II
“4

65

k.
4.3 HEMOQLODUlOPATIA¡ ESTRUCTURALES

Las hemoglobinopatias se caracterizan por presentar

una cadena de globina estructuralmente anómala, debida
generalmente a la substitución de un aminoácido por otro
siendo su síntesis normal en la mayoría de los casos
(Winter, 1986>

En 1949 nace el concepto de patología molecular al

descubrir Pauling y colaboradores la hemoglobina S en un
paciente con anemia de células falciformes.

Las mutantes de hemoglobina son un excelente ejemplo

de cómo el cambio en la estructura de una proteína puede
modificar su función y ser causa de enfermedad.

Actualmente existen más de 140 variantes de hemoglobi-

na que afectan a la cadena alfa, 240 a la beta, 17 a la
delta y 48 a la gamma,(Fairbanks, 1980; Oíd y cole., 1982)

Las variantes de hemoglobina se denominaron inicial—

mente segOn las sucesivas letras del alfabeto, Actualmente
para identificación se hace referencia en primer lugar a la
cadena donde se ha producido la mutación, seguido de la
posición que ocupa la mutación en la hélice o interhélice,
reseñando posteriormente el aminoácido sustituido o dele—
cionado. Ami en la hemoglobina complutense que se origina
por la substitución de glutamina por ácido glutámico en la
posición 127 de la cadena 8 (posición H5de la hélice) , la
identificación es [13127(H5>Gln-*GluJ o por ejemplo la
hemoglobina 5 que se designa Alfa2 8260Ir.Vd 6 simplemente
Alfa2 ~26 VII, en ambos casos indicando la naturaleza de la
sustitución en el 59 residuo aminoácido numerado desde el
extremo 14 al O.

66
 ‘132
‘<3

fil
4
Aunque se recomienda que los supraindices sean evita—
33
dos, no se ponga la cadena de globina no afectada y se
indique rutinariamente la posición helicoidal. Así la
‘5
hemoglObina 5 se designará por 86<AZ>GlU—val. ~3
-
15

La designación de la “porción helicoidal” tiene la

ventaja de aportar información automáticamente de la región 3,3
funcional y de la posible homología con variantes que
1~
afecten a regiones similares en otras cadenas de globina . 31
Así las hemoglobinas Chesapeake y Wood tienen ambas la
sustitución FG4GU, la primera en la cadena a y la segunda
en la (3, puesto que es una función importante para el 3

control de la afinidad por el 02, no sorprende que ambas 2 3

variantss tengan una expresión clínica similar. (Rieder, 3,

1974> fi fi fi
¿55,~

13

43

1
55”fis

fil
43”

wfi [fi

5’

55?

53SS’’
fil’
1
fis

67

u
 i~fi
genética y base lioleanlar

Las hemoglobinopatias se heredan con carácter autosó— ~3

mico dominante siguiendo las leyes de Mendel, Si ambos
padres son portadores heterocigóticos de la variante (AS)
la mitad cte su descendencia serán portadores (AS) , la
“fi

cuarta parte serán normales (AA) y la otra cuarta parte

‘fi,

“‘4’fis
padecerán de anemia de células falciformes (SS) .

En una proporción no despreciable de casos, las hemo-

globinas inestables pueden originarse por mutaciones
‘<‘a
espontáneas, no estando afectado ningún otro miembro de la
familia.
31
Lesión molecular. Diversas mutaciones en el ADN del gen de
globina causan alteraciones en la estructura de la cadena
de globina. Así por fusión de genes tenemos la hemoglobina 53
Lepore <fusión delta—beta> y la hemoglobina Kenya (fusión
gamma—beta) . (Ramírez, 1979> 4
3 ‘3 fi
fi’
44
sustitución de un asinoAcido. El 95% de las hemoglobinopa—
tías estructurales se originan por sustitución de una de

las bases del triplete que forman cada codon. Esto da lugar
al cambio de un aminoácido por otro. La hemoglobina 5 se
4
fi fi fi

produce por una mutación puntual del codon ¡36, que en lugar 4
de ser CAO que codifica al glutámico, se convierte en GUC
que codifica Valina. <‘ fi
S’<5

Se han descrito cinco variantes de hemoglobina origí— ¡553

fiflfi fi

nadas por la substitución conjunta de dos aminoácidos, por

ej. hemoglobina O Harlem (Bunn, 1987; Weatherall, 1981).

Elongación de La cadena, Se produce por mutaciones puntua—

5,55’

les en los codon de terminación de cadena.

3332;
El ejemplo más clásico lo constituye la hemoglobina
OS, originada por la mutación del codon tIAA de terminación
por CM. 13
:51

1<

68 55’
fil

‘5”

5~3,
‘fis
 Las variantes de la cadena a producen un cuadro de a—
talasemia, mientras que las hetnoglobinopatías con cadena 8
elongada pueden producir anemia hemolítica o ser asinto-
máticos en su estado heterocigótico, <IHIC, 1988)

Acortamiento de la cadena, se origina por la pérdida de uno

o varios aminoácidos (hasta E residuos) como consecuencia
de la deleción de uno o más codones, En general, se produ-
cen cadenas acortadas muy inestables dando lugar a un
cuadro de hemoglobinopatia inestable con cuerpos de Heinz.

H,moglobiflop&tiai con cadenas híbridas. Se producen por un

entrecruzamiento no homólogo durante la meiosis.

En cuanto a la herencia de las hemoglobinopatias

estructurales, como se comentó anteriormente, se considera
como caracteres codominante; de acuerdo con la herencia
mendeliana clásica.

Algunas variantes solamente muestran manifestaciones

clínicas cuando están en estado homocigótico, en contraste,
las hemoglobinas inestables y aquellas con anomalías en la
afinidad por si. 02 suelen causar morbilidad en estado
heterocigoto.

Los honiocigoticos se han encontrado principalmente

entre variantes con alta frecuencia genética tales como 5,
0 6 E, y entre algunas de moderada frecuencia (D—Punjab, O-
Arab> e incluso entre variantes raras , fruto estas últimas
de matrimonios consanguíneos (Casals y cols., 1986).
En ocasiones las variantes de hemoglobina son el
resultado de mutaciones espontáneas, dado que la mutación
es a nivel de célula germinal, sólo será padecida por la
persona afectada, los padres y hermanos serán normales, A
este grupo también se les llama como mutaciones de ItNOVOII,
fenómeno que se encuentra más frecuentemente entre aquellas
hemoglobinopatias que cursan con manifestaciones clínicas.

69

1~
clasificación

Para su mejor comprensión, las hemoglobinopatías

estructurales se han clasificado en cinco grupos, de
acuerdo con sus manifestaciones clínicas coma se ve en la
tabla IV de la página siguiente. (Myers y cola., 1985)
Sin embargo no todas las variantes de hemoglobinopatia
producen sintomatología clínica, existiendo un gran número
de ellas que son totalmente asintomáticas en el estado
heterocigótico.
Las manifestaciones clínicas de las hemoglobinopatias
pueden llegar a comprenderse mejor relacionandolas en lo
posible, con el lugar que ocupa el aminoácido sustituido
(Mercola, 1980>
Según sea el lugar que ocupe y eJ. tipo de aminoácido
cambiado en la molécula, así será la alteración que cause
en la estructura y función de la misma. si se produce en
una parte crítica que altere sus propiedades físicas,
podría originar un transtorno clínico de severidad varia-
ble.
Por tanto según la patología molecular se pueden
considerar tres grandes grupos:

1- Sustitución de un aminoácido externo (polar> en la

auperf lele de la molécula.
Solamente en algunos casos da lugar a anemia hemolíti-
ca, cuando están en su forma homocigótica.
Hemoglobinas 5, 0, D y E son las más frecuentes.

2— suutitución de un aminoteida interno (no polar>

siempre va a resultar de ella una anomalía severa,
tanto en la estructura como en la función.
Pueden hacerse tres grandes subgrupos:
Hemoglobinas inestables
Metahemoglobirlas
Hemoglobinas con afinidad alterada por el ~2

70
 553

La sustitución puede ser de un aminoácido hidrofóbico

fi’
por otro hidrofóbico, en cuyo caso es menos grave que si la
sustitución es de un hidrofóbico por otro hidrofilico cuyo
cuadro hemolítico es más intenso
532
3— cambios en las monta de contacto entre aubunidadea (alfa
í beta 1> y (alfa 1. beta 2>
Estos cambios pueden debilitar la hemoglobina hacien—
dola inestable y en otros casos puede alterar La colabora-
ción hemo—hemo y aumentar o disminuir la afinidad de la
molécula por el ~2

Así pues, las variantes estructurales más frecuentes fi’

3,

en la población mundial son hemoglobina S, O, D y E. Las 53

tres primeras sólo producen sintomatología en el paciente

homocigótico. La mayoría de las variantes ocasionan hemo-
globinopatias inestables, otras producen aumento de la
afinidad de la hemoglobina por el ~2 y algunas originan
3,533
‘3,315
metahemoglobinemia congénita. No es raro encontrar varian- y
tes que dan lugar a transtornos mixtos, asociandose mesta— 3,3fi
533
bilidad molecular con alteración de la afinidad por el ~2
junto con rnetahemoglobinemia (Winter, 1986>
y
55’],
1$
51135

sSS5,
“fi
5’’

13 2
315
1
~‘

32,
71

1~

-Á
 fis-’
I-A5INT~ÉlATícAs (Son a rnayorra)
Podadores de lib $ (en COfldiclones muy especialeg pueden dar SIÉ’ltncnas)
HbC
¡lb O
¡lb E
II- ANEMIA HEI%tITICA

A- SINORfl DE FALCIFGÑJ’IACIc*~
(Enterm,daó de células taIcfrormes>
‘-Ss
2- SC
3- SO Los Angeles
4- 50 Arab
5- $ Beta Lalasemía
B HEM~LCeINAS INESTABLES

Iii- PctIGtOOULIA

Hemoglobinas £01> ALTA AFiNIDAD por e102

ErILrocítosíg tamiiIar(’ 40 ramIllas>
IV- CIANOSIS FAMILIAR
HemoglobInas con BAJA AFINIDAD por el 02
¡lb Kansas
¡lb BeÚ~ Israel
¡lb SL. Mandé

Hemoglobinas ti
METAHEMOOLOOJHAS
ti-Bostee
M-Saskat~n
1141<lwaukee-
M-lwate y
t’1-HydÉ-Park
ti-FM Osaka
y-VARIANTES ESTRUCTURALES ~.JE
Cc*4 FENOTIPO TALASEMICO
SE EXPRESAN h
A- FenoUpo os TALASEPnA ¡3
- Hornoqioblhas Leporo
y;- -1’
2- ProcesamIento anormal de PNAm ¡lb E, ¡lb Knossos
3- ¡nestablildad extrema ¡lb Indiaripolis
A- FenotIpo de TAtASE<IIA ALFA
4’) 4
1 4luLanLes de TERIIINACIctI DE CADENA
¡lb Constad Sprlng 321
lib Icaria 13’:-’-
Hb Seal Rock
¡lb koya Dora
33, 1
2-11*5TA? ‘UPAD EXTREMA
¡lb ~JOr)9Szs
>5 -

Tál. 1V CWUk.oIdn clhdu do ks HwwrItbornks ~flnjcwr.kn

~fi -

53
551

72 y

y
7
33-51. .32
TEGNICAS UTILIZADAS
5. TECNICAS EN BIOLOGIA MOLECULAR

Los medios de que disponen los investigadores para

analizar el genoma humano han evolucionado considerablemen-
te, Así, hace veinte años se descifró el código con el que
está escrito el mensaje genético; hace diez años, el
aislamiento de un gen y la lectura de un mensaje de algunos
miles de nucleátidos eran el máximo exponente de la técnica
del momento.

Ahora puede ya iniciaras la batalla asaltando al.

propio gen defectuoso. El territorio a explorar es amplio:
los cromosomas humanos están formados por moléculas linea-
les de ADN bicatenario de una longitud total aproximada de
tres mil millones de pares de bases. En comparación, un gen
típico, esto es, una unidad completa de información genéti-
ca, es un segmento muy pequeño que abarca sólo unos diez
mil pares de bases. A pesar de todo, si se correlaciona la
herencia de un segmento concreto de ADN, un “marcador”, con
la herencia de una enfermedad, puede localizarse el gen
mutante hasta en una distancia de uno o dos millones de
pares de bases, esto es, menos de la milésima parte del
genoma humano. Con eme grado de precisión, el gen queda al
alcance de las herramientas moleculares, lo que posibilita
clonarlo y examinar su actividad. La identificación de un
marcador gen6tico estrechamente ligado a una enfermedad
permite, además, seguir la herencia del gen que causa dicha
enfermedad. (Ausubel y cois., 1939)

Las nuevas tecnologías suponen, a menudo, un cambio

rápido y sustancial sobre la forma de abordar los problemas
científicos que se nos plantean. La tecnología del A]»?
recombinante <Watson y cole., 1986) ha tenido un enorme
impacto en la investigación y diagnostico de las bases
moleculares de las enfermedades.

74
 33

Sin embargo, los métodos que se emplean en el análisis

molecular son laboriosos y requieren una elevada especialí—
zación.

En los últimos años se ha desarrollado una nueva

tecnología, basada en la amplificación de secuencias 32
especificas del ADN, que se conoce como reacción en cadena 1
de la polimerasa o POR (polsnnerase chain reaction> (Mullís,
1987; Mullís y cois., 1988; Eríich y cola., 1989>.

La evolución que la POR ha supuesto en el campo de la

investigación genética y molecular es comparable a la
producida por el descubrimiento de los enzimas de restric-
ción (Botsein y cols,, 1980) o de los polimorfismos del A]»?
(Antonarakis y cola., 1985>. Un gran número de métodos de
estudio molecular se han visto sustituidos, complementados
o altamente facilitados por la POR. La aplicación de la
nueva tecnología a la investigación ha permitido importan-
tes contribuciones sobre la variabilidad, expresión,
recombinación y evolución genética (Wrischnilc y cols.
1987; Friedman y cois,, 1988; Kawasaki, 1989). Entre los 3,3
métodos más utilizados, destacan los citados a continua-
ción:
[s
3

SOUTHflM-ULOTflNQ

~)fi

Descrito originalmente por E.M. Southern en 1975, esta h

técnica se apoya en el caracter singular de la molécula de
ADN. A lo largo de las des cadenas del ADN, las bases se
aparean de acuerdo con ciertas reglas, de manera que la
secuencia de una cadena constituye la única posibilidad de 5?

apareamiento para la secuencia de la otra. En una muestra

de Am.? “desnaturalizado”, esto es, calentado o expuesto a
un pH alto para reparar sus cadenas, un fragmento de ADE de
cadena sencilla puede actuar de sonda que busque y se una 113
a su secuencia complementaria.
‘5’,
y
133
‘533”
75 ‘13,11

‘553
y
‘4‘fi
 En esta técnica, una vez separados los fragmentos de
ADN por electroforesis, se desnaturalizan y transfieren del
gel a una membrana, donde se ponen en contacto con una
sonda de ADN marcada con un isótopo radiactivo. La sonda
sólo se híbrida, se une al fragmento o fragmentos que
complementan su secuencia de bases. El marcaje radiactivo
permite detectar la posici6n de los fragmentos y, por
tanto, sus tamaños, <orkin ~fcols.,, 1982>.
El procedimiento requiere la purificación del ADN, su
digestión con nucleasas de restricción, la separación de
los fragmentos generados mediante electroforesis en aqaro—
ea, la desnaturalización y fraccionamiento de estos frag-
mentos y su transferencia a membranas de nylon o nitrocelu-
losa. Una vez fijado el ADN a la membrana, ésta es incubada
con una sonda de ADN (fragmento de Al»? que contiene secuen-
cias complementarias a las que se quiere estudiar), marcada
con un isotopo radiactivo o un colorante. Tras la híbrida—
ción, la sonda que no se ha fijado se retira y el lugar al
que se ha fijado se detecta mediante autortadiograf la.
El proceso más detalladamente seria:
a> Purificación del ADN. Para poder analizar el ADN es
necesario contar con ADN puro de alto peso molecular. Los
diferentes métodos de aislamiento del A]»? constan, en
general, de dom atapas bien diferenciadas: una primera en
la que se rompen las células mediante un detergente y se
aislan los núcleos por centrifugación; y una segunda, en la
que los núcleos son resuspendidos y tratados con un deter-
gente iónico, como el SDS, que disocia el complejo AL».?—
proteínas y desnaturaliza las nucleasas citoplasmáticas.
Una vez separadas, las nucleoproteinas son degradadas,
mediante tratamiento con enzimas proteoliticos y retiradas
mediante extracción con solventes orgánicos como el fenol
y el cloroformo. El ADN así purificado permanece en la fase
acuosa y, en presencia de etanol y una concentración
relativamente alta de cationes monovalentes, que provocan
un cambio estructural en las moléculas del ácido nucleico,
se agrega y precipita.

76
4145? ‘5’
5’ /5

b> Diciestión con endonucleasas de restricción. El ADN

obtenido con los procedimientos de extracción antes señala-
dos presenta un tamaño superior a 100 Kb, lo que impide su
posterior manipulación y análisis, Para poder manipular el
ADN es necesario digerirlo previamente con endonucleasas de
restricción; éstas son enzimas bacterianos que reconocen y
cortan secuencias especificas de ADN bicatenario. La
actividad de las endonucleasas de restricción se mide en
unidades, definiendose una unidad de enzima como la canti-
dad del mismo necesaria para digerir completamente un pg de
ADN en una hora, siendo la temperatura óptima de la reac-
ción de la mayoría de las endonucleasas de restricción de

En 1978 Kan y Dozy demostraron que el tamaño del

fragmento generado por una determinada endonucleasa varia,
dando lugar a un polimorfismo en el tamaño de los fragmen-
tos generados por dicho enzima denominados RUt?: RESTRIO-
TION FRAGMEN? LENGHT POLYXORIISN.
Estos RFLP reflejan el polimorfismo existente habi-
tualmente en el ADN humano y se heredan de acuerdo con las
leyes de Mendel (White, 1988>. Aunque cada enzima detecta
un nQmero limitado de polimorfismos, el gran número de
endonucleasas de restricción disponibles y el alto grado de
heterogeneidad genética permiten detectar un número casi
ilimitado de RFLP. (Ver figura 18 en la página siguiente)
c) Electroforesis en celes de Maroma. La electroforesis en
geles de agarosa permite separar las moléculas de ADN de
acuerdo con su tamaño existiendo una serie de parámetros~
el gradiente de voltaje aplicado, la dimensión de los poros
del gel, la conformación del ácido nucleico y su tamaño, la
concentración de sal en el tamp6n, etc. que condicionan los
resultados de la electroforesis.
La corriente aplicada a los extremos de un gel de
agarosa genera un campo eléctrico con una tuerza que está
definida por la longitud del gel y la diferencia de poten-
cial en ambos extremos <Y/cm)

.77

*
 MUESTFAS
DE SANGRE

A E c

DIoEMiR
EL. AON CON
flESTRICTASÁS

TRM4SPERIR
A MEMBRANA
1
~hgII Anilúl, do I’RL¡

AÑADIR
SONDA
RADIACTIVA 4,
“\

EXPONER A
~NA PELíCULA
OS RAYOS X ~1~

4,
A

e
C

78

—---
 Las moléculas de ADN expuestas a este campo eléctrico
migran hacia el ánodo debido a la carga eléctrica negativa
de los fosfatos presentes en la doble hélice, estando
limitada la velocidad de migración por la fricción del ADN
con la matriz del gel. En general las moléculas de ADN
migran a través del gel a una velocidad proporcional a la
intensidad de la corriente aplicada.

U quo.. Lii
Twpfl
!>fl~ 4~ 45~

1.14*) WC4tA.4,
fi.bfil.
N SS

1 SS_______________

•a..

151
;,.~ q A) RÚvro.cohacaeMs Jo tui rgbou da ,kciro(o<oais con un gel do qarou. [II
ADN mijes desde cl polo negativo al positivo debido

• ia ~aepnegativa do loe gruj’o. toetset LI) flhnstsrnols Jal ADN modIuw el m¿todo descrito pat Saolhern. El paso de 14 soLucide salina
,3 5

• tanta del gol do agarna nnjúfi al AUN alen .14.044 IMada Lía ittdfIlbtUU dc nylao.
43
3 3
El grado de separación de las moléculas de ADN depende
del tamaño de los poros del gel, que es proporcional a la
concentración de agarosa en el mismo. Cuanto mayor es el
tamaño de los poros (menor concentración de agarosa> , mejor
351
se separan los fragmentos de mayor peso molecular; mientras
que al existir menor tamaño de los poros (mayor concentra-
ción de agarosa> se separan mejor los fragmentos de bajo
peso molecular.
En general, concentraciones de agarosa entre 0,5% y 1%
permiten separar fragmentos entre 0,5 y 30 Kb (Jordan,
.
1989) El tamaño de los fragmentos generados puede deterxni—
3,3
132
narse comparando su movilidad con la de un control de
3 33
tamaño conocido, generalmente el fago lambda digerido con
la endonucleasa de restricción Hind III. 3 5

79

35 4

u
 Transferpnci& de ADN. El estudio del ADN genómico de los
eucariotas sufrió un espectacular avance con la posibilidad
V35
- t?’1’ de transferir el ADN a soportes sólidos como son las
membranas de nitrocelulosa y nylon, Previamente a la
53<
fi transferencia, es necesario desnaturalizar el ADN (conver-
tirio en ADN monocatenario> sumergiendo el gel en una
solución alcalina que rompe los enlaces de hidrógeno que
unen las dom hélices de ADN. Una vez neutralizada la acción
‘5,
del alcalí, el ADN se puede transferir,

La transferencia se realiza pasando una solución con

5?fi,
-elevada concentración salina a través del gel. La rapidez

de transferencia depende del tamaño de los fragmentos y de

la porosidad del gel. En geles de agarosa al 0,8%, los

fi fragmentos inferiores a 1 Kb se transfieren en una hora,

fi fi

mientras que los mayores de 15 Kb necesitan una noche. Una

vez transferido, el AD!.? se fija de manera irreversible a la

membrana calentandola a 80~C. o fijándola con luz ultravio-

leta.

e) aar.attj.ft..flSIiAgX.iSg. La posibilidad de encontrar una

secuencio especifico de ADN en una población de fragmentos

es extremadamente compleja dependiendo de la disponibilidad

de sondan complementarias al ADN de interés que puedan ser

marcadas. 32k $

Los dos métodos más frecuentemente utilizados para

marcar las sondas de A~4 son: 1> el método de marcaje en

cremallera o “Nick transíation” en el que la secuencia de

nucísótidos del A~< se renueva totalmente pero no existe

síntesis de nuevo ADN y 2) el método del marcaje aleatorio

o “Random Primad” en el que se incuba el ADN a marcar con

43’-

una mezcla de todos los hexanucieótidos posibles. En esta

reacción, el ADN inicial sólo sirve como molde para la

53

síntesis del ADN marcado <ver figura 20>. 4

‘55

30

[353
 .5.
fi,’

P.agn~o.~tos Papq) de
300u1 IdOS
qe ADN niIrOcOiuIOU

Gel -~e’Y, “;,‘

fi’3r.)A.-v’.

‘~
a -1CC61’...h.a

ON. q
fi fi—.
rdVOuCiOfififiS ‘ 5
‘5 <opi,k;ctiW

1~ eí.c.oío,,,u, imprognacíor,
53 iUottrngp
‘53

4. Soduaoo dé AONC
SOOdI rftdtacIiva

Lovoflzacitn de los
fragmentos de restricción
Correspon difinías
a porciones del gen

Pépo* dfi
n.tt0C4UOI4

Radiouiatograf¡a
íf’u%n’rial

Hg 20 flsqvca do 1* knioa do S«fl.m.bIotJqo as~bsIs 4. ADN caUsal. «*cwksuj da rutrkoldc e bibridseióa ccc AUNo socd.
fi fi,

fi co<np.ttbl

f> Prehibridación e hibridación. Una vez marcada la sonda

a utilizar, se debe favorecer la unión de la misma a las
fi secuencias del AL»? genómico que reconoce. Para ello se
utiliza una solución denominada de prehibridación que
acondiciona a la membrana y otra llamada de hibridación,
que contiene la sonda y favorece su unión específica a las
secuencias complementarias. Para obtener resultados inter-
pretables es importante prevenir la unión inespecifica de
la sonda a la membrana, ya que, de otra manera, aparecerán
áreas que oscureceran la autoradiografia e impedirán ver
las bandas de Interés. Para evitarlo, se humedecen las
membranas con una solución que contenga la Solución de
fi Denhardt’s (compuesto por BSA, PVP y Ficolí> y SDS <dodecil
sulfato sádico>, encargados de bloquear la unión inespecí-
K
fi

fica del AD!.? a la membrana.

81 ~5t
fil

5,
‘fi’
51
41’ Tras la hibridación, la sonda flO hibridada específica-
mente es retirada mediante lavados de la membrana con
fi fi,
soluciones con elevada Concentración de sal.

533

Peso
53’-
3<-
3 Plancha de cristal

5?-
Toallas de papel
Papel secante
Nitrocelulosa
Gel de agarosa
Soporte
Celofán
.fl—flfl—flfl,/tfl--—/fl—-j Bandej a
Esponj a
Papel de 3mm
53

6 x SSO

i~ 21 IIaq*as aJe Sovdurn.Blcu¡q

82
 REACCION EN CADENA DE LA POLZMERAsA <PCE
st.

r3ásicaffiente la POR es un método sencillo para el

cionais “in vitro” de cualquier Segmento de ADN permitiendo
fié

disponer, de forma rápida y eficaz, de cantidades suficien-

tea del mismo para su posterior estudio molecular,

Esta técnica creada por Mullís (Mullis,1990), se basa

en la repetición cíclica de trés reacciones similares
modificando exclusivamente la temperatura a la que se lleva
a cabo. Las tres reacciones se realizan en el mismo tubo y
además del ADN se necesitan oligonucleótidos que reconozcan
los extremos del fragmento a amplificar y actúen como
CEBADORES o PRIMERS de la reacci6n y una mezcla de desoxí—
fi”
fi nucleótidos que permiten generar las nuevas cadenas de Am,?.
Esta amplificación es posible gracias a la enzima Taq
polimerasa del microorganismo Tbermus Aquaticus, que
permite la síntesis de ADN a temperaturas por encima de
YOQC y resiste perfectamente 94-95~C necesarios para
separar las dos hebras del ADN (Jeffeys y cols.,1988>.

El primer paso de la reacción se lleva a cabo a una

temperatura de 9490 y tiene como finalidad la transforma—
clOn del ADN bicatenario en monocatenario mediante desnatu—
fi ralización por calor. En una segúnda etapa los oligonucle6—
tidos se unen a las secuencias complementarias de ADN (esta
reacción se suele llevar a cabo a una temperatura de 65QC>

Finalmente, en una última etapa, la enzima Taq polime—

rasa sintetiza nuevas cadenas de ADN monocatenario a partir
de los oligonucleótidos. Una característica fundamental de
la POR es que el ADN así sintetizado sirve como sustrato
para la siguiente reacción, la amplificación se consigue al
realizar una serie de 20 a 30 ciclos con lo que la capaci-
dad de sintetizar nuevo ADN moflocatenario se incrementa
exponencia lmente. 3<’ -

83

3 3
55
‘3
 ‘3 -

¶ft*~ofl
A £LONOA~ LOS CEOAOCflCS PAAA
flIOiCAA COPIAS OS LAS CAOÉI<AS OFANA

Ni,

J
4”,

j
—fi

j
Nr L
33

1>1<, 22 flu~uuu do La ?CR

Luego en términos generales, la POR se basa en la

1’
4 -
í~
capacidad de una enzima AL»? polimerasa termoestable para ir
aponiendo bases complementarias a una determinada secuencia
de ADN acotada en extremos 5’y 3’ por dos pequeños fragmen-
tos de Arn¡ complementarios que actuan como iniciadores de
la reacción (Saikí y cols.,1988>.
Uno de los principales problemas de la PCE es la
posibilidad de contaminación con material genético extraño,
la rigurosidad en los diversos procedimientos del laborato-
rio consigue disminuir la posibilidad de contaminación de
la PCR (Erlich,1989).
84
 ‘4.-
“53

Los productos obtenidos en la amplificación pueden

analizarse mediante una amplia variedad de técnicas que
incluyen la hibridación mediante Dot—aíot <figura
23>, la simple visualización del producto en geles de
agarosa O poliacrilamida (figura 24>, el análisis con
enzimas de restricción <figura 25> 0 la secuenciacián
directa del ADN amplificado.

2 3 4 ‘fi’

.kaA <r”fififl’.< bp

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fi ~fifiI fi~ ‘~fifii fi~fifi nfi~~t4 ~

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It II ________________________________________

6..OM-TOOAG O TAO-0kT400-3’
4
8-AG O TAO-3’
3-TO O ATO-&

,15, iii 340

NORMAL
VICIURA 21
MUTADO 10* 280 254
A O O O E P

-oea
-340
-258
-254
-102

85

)
 Las posibilidades de actuación para detectar una
mutación previamente conocida más corrientemente utilizadas
en los laboratorios de investigación sorn

i> Detección directa de una mutación usando oligonucleetí-

dos radiomarcados; un oligonucleótído es una pequeña
secuencla de DHA <aproximadamente de 20 bases de exten-
sión> , que ha sido sintetizada incorporando en su centro la
base complementaria con la mutación siendo el resto de la
secuencia, en dirección 5’3’, complementaría con la secuen-
cia del ADH en torno a la mutación.

La eventual hibridación, caso de estar presente la

mutación buscada se pondrá de manifiesto incorporando al
oligonucleótido fósforo radiactivo como trazador.

2> Detección directa de una mutación usando endonucleasas

de restricción, son capaces estas enzimas de digerir ADN a
la altura de determinadas secuencias de reconocimiento
especifico para cada enzima. Una mutación en la secuencia
del AL»? puede modificar la secuencia de reconocimiento de
la enzima, en el sentido de abolir en punto de digestión
o en el sentido de hacer reaparecer un punto de digestión
previamente irreconocible para la enzima, en ambos casos,el
resultado es una modIficación en los tamaños de los frag-
mentes de ADN ampLificado obtenidos cuando éste se somete 3

a la acción de la enzima, objetivables mediante simple

electroforeslm en gel de agarosa.

Esta técnica tiene una ventaja obvía, que es poder

prescindir del uno de oligonucleotidos radiomarcados y de
‘5- la delicada metodología que coníleva. El inconveniente es
que no todas las mutaciones tienen una enzima que las
reconozca, por lo que su uso está restringido a aquellas
mutaciones reconocibles mediante enzimas de restricción.
5’

86
si 32
‘fi

4
<‘5 m
fi
 La automatización del proceso de la POR supone la
~0ibilidad de analizar un considerable numero de muestras
sin demasiado esfuerzo, Sin embargo, es preciso que se
desarrollen métodos que permitan automatizar los pasos
previos y posteriores a la amplificación, tales corno la
preparación de las muestra, o el análisis de las mismas,

La PCR ha simplificado y aumentado las posibilidades

diagnósticas del ADH en medicina. La nueva tecnología
permite e]. diagnóstico preciso de la patología hereditaria,
que Incluye tanto los procesos en los que el defecto
molecular es conocido en detalle, como aquellos para los
que solo ha sido posible la localización cromosómica del
defecto en cuestión.

Por otra parte, ha revolucionado la tecnología del ADN

recombinante en el campo do la investigación genética y
molecular, Las aplicaciones médicas de la POR son abundan-
tes, antes de 1987 el diagnóstico prenatal de enfermedades
como la anemia de células falciformes, beta—talasemia y
hemofilia me realizaban mediante la tecnología de Southern
y se tardaban varias semanas en la obtención de resultados
(Orkin, 1982).

Desde finales de 1987, el diagnóstico de estos proce-

sos puede realizarme en menos de una semana mediante la POR
(Saiki y cols. ,l999)

Las apiloaciones de la POR van desde la fibrosis

quistica <Kerem y cols.,,1989>, carcinomas <Boa y cols.,
1987; ahibata y cole., ísee>, leucemias (Dobrovic y cois.,
1988), en medicina legal y forense (Li y cols., 1988), en
patología infecciosa <saag y cols,, 1988; Thiers y cols.,
1988> etc.

8~7
 A.B.M.5’ Amclifiaation Refraatory Mutatip~ Svstem

Una modificación de la técnica de la POR ha sido

utilizada en nuestro trabajo, oVíginaríame~~~ descrita como
ARME O POR con oligonucleótidos mutados (Newton y cois,,
i989> para la detección directa y diagnóstico prenatal de
las mutaciones de f&—talasemia <Oíd, 1990> . El procedimiento
tiene la ventaja de no ser radiactivo y requiere menos de
5 horas para su realización,
Esta técnica se basa en la amplificación enzimática de
un fragmento de ADN acotado por dos oligonucleótidos
iniciadores o ‘tprimers”, que hibridan cada uno de ellos a
secuencias complementarias de la doble hélice de AD»; estos
oiigonucle6tidos se orientan de tal modo que sus extremos
3 quedan enfrentados,
Los oligonucleótidos ARMa fueron diseñados para
detectar un ADN normal y otro mutante, El nucleótido 3’ del
iniciador mutante es complementario de la secuencia mutante
y el iniciador normal es complementario de la secuencia de
ADN normal.

Para que un iniciador sirva de modelo a la enzima DNA

polimerasa, el nucleótido 3’ terminal tiene que estar
perfectamente unido a la secuencia del ADH modelo. Bajo
condiciones cuidadosamente controladas un iniciador con su
nucleótido 3’ terminal desemparejado puede no funcionar
correctamente y no ocurrir la amplificación.

Se incluye tambien para la realización de esta técnica

dos iniciadores control A y a,
los cuales amplifican la
región del ADN a corta distancia de la amplificada por los
iniciadores de &RMS originando un fragmento de un tamaño
distinguible del producido por los iniciadores de ARNS.

La utilización de esta técnica será explicada

ampliamente en el capitulo de material y métodos en su
apartado correspondiente a técnicas empleadas.

88

>
it
¡II-MATERIAL Y METODOS
SUJETOS ESTUDIADOS
 I t.. soarros I5TUnr~ps

Se ha realizado el estudio de un total de 42 muestras

de sangre pertenecientes a enfermos portadores de ¡3-talase—
mía; 34 de ellos con 8-Talasemia beterocigótica y 7 homoci-
g6tica y 1 con ¡3—Talasemia intermedia, cuya elección se
realizó en los Servicios cte Hematología y Pediatria del
Hospital Clínico de San Carlos.

Los enfermos con 5—Talasemia mayor homocigota pertenecen a

5 familias, en cada una de estas familias se analiza el
haplotipo de ambos padres heterocigotos para la ¡3-Talasemia
y su hijo homocigoto, una de estas familias presenta dos
hijos con (3—Talasemia mayor.

El criterio de inclusión de dichos enfermos para este

estudio se realizó en función de la sintomatologla clínica
y de los parámetros hemocitométricos, de la presencia de
normoblastos, microcitosis e hipocromia en ~.aextensión de
sangre periférica asl como de la dosificación de hemoglobi-
na Y.

90

‘u
 2.- TUC>hXOM UflLIZÁDÁS

j.?ECXICAI DI DIUCRIPCZON CONVUNOXoIAL

ESTUDIOS HEMOCITOMETRICOS

ESTUDIOS DE HEHOGLOBINAS

2.TECNICAB DI BIOLOGíA MOLECULAR

ESTUDIO DEL HAPLOTIPO

EXTRACCION DEL ADH

AMPLIFICACION POR ARMS

2.1,TICNICAS DI DIUCAIPCIOH OONVNNCIONAL

La recogida, manejo y conservación de las muestras se

realizó siguiendo las directrices publicadas por el “Inter-
national. Comuitee for Standardization in Haematology”
(ICSH>
** Los ElTUOXOl EENOOITOMITRZOOU se realizaron en un STKR

Ceunter <Caulter Electronics.Ltd USA>, determinandose:

-Recuento de hematies (RIO> expresados en hematíes X
1O’2/L
-Tasa de hemoglobina (ID> en g/dl
-Hematocrito (RITO> expresado en %
-Volumen corpuscular medio (VOX> orn femtolitros (lO’~l>
-Hemoglobina corpuscular media (ECU> expresada en
picogramos (1O”2g>
-Concentración de hemoglobina corpuscular media <CXCII>

9’

5’-
** La ULNCTROTORNUZS DM RUHOGLODIN¡a se realizó en acetato
de celulosa en solución alcalina <pH 8,e)~ ííguian~~ las
normal de la 10511 <¡05W 1978> En la Figura 27
se
muestra el patrón de bandas obtenidas por elec’ero±ore
mis.

e
A 98%

u A, 2 %

u A ‘0%
9’ 90 %

II
A ~.9$I,4 lfifl *fififi-’~~4 4~
A, normal o~
.3. ao.roc ji
A latas

~II
4.
•,.*fi’.•i, •ífifi‘5 ~>A
•‘AI*-Pfit ‘lifi>’ti A 4tfi
A, normal o-.
~S.25.40%
A 2560%

0*’4 a-’--.. w—8 ¡ u A, 3.12 ~

1’ ~o,malo
A l.gs,ammnt,
dlsl¶vnulda

fi”N”t fi’¶jfi9 1

II ¡ A, mnyla~bIe
‘0’ 80.100%
A razas

u ¡
•‘*‘4W’t~~~*fl.* SC.
‘~.‘.~$0 lA .~3.i ‘0. 2840 %
A 2580%

4 A

2
~
ji
1 ¡
fi

si
19<’ tI ti p,ORUI’ORLUI&tJfl 1EM00b08124A8

92

1
** ¡~a cuantificación de la XUXOGLODfl<A A2 se llevó a cabo
por cromatogr&f la en columna de intercambio aniónico, La
Hb A> me e luye de forma específica bajo estrictas
condiciOflOl de pH y fuerza lónica, cuantificándose por
lectura fotométrica a 415 nm.

** Los niveles de RIXOOLODZNA Y se cuantificaron por el

método de desnaturalización alcalina descrito por BetJce
<Betke y cola,, 1959; Villegas y cols., 1983).

** Para el estudio de retiauloaitos se ha empleado el

método de Dacio mediante la tinción con Azul Brillante
de Creulí <Dacio y cols., 1984),

93
 2.2. TIaMIna UN DIOLoaz~ MOLECULAR

EXTRACCION DEL ADIL

í** Centrifugar de 10 a 20 ml de sangre venosa recogida en
EDTA centrifugando a 3000 rpm durante 20 mm a 4~C
2** El plasmts es cuidadosamente eliminado y el leucocríto
~ 1a¡,~É>, coat’1 es separado con pipeta Pasteur
3** Conservar a -7090 en un eppendorf en caso de no
realizar la prueba inmediatamente
4** Descongelar la muestra y adicionar ío ml de solución
HP—40 al 0,1% en reticulocite salino y depositado en
un tubo Fa Icen
9* Mezclar y agitar a 3000 rpm, 20 minutos a 490
6** Eliminar el sobrenadante y adicionar 10 ml de tampón
de lisis al precipitado. Mezclar y adicionar 0,5 ml de
solución de SDS al 10%
7** Añadir 0,5 mg de Proteinasa 1<. Mezclar e incubar a
37~C un mínimo de 4 horas (puede quedar toda la noche
en incubación)
3** AdicIonar 1/5 del volumen de tampón 5 X ANAE
9** Adicionar 1/2 del volumen de cloroformo—alcohol
isoamilico (24:l,v/v) y 1/2 del volumen de fenol
previamente saturado con tris-ClH lM, pH 8
l0** Mezclar y centrifugar a 3000 rpm 20 minutos a 4~C
11** Con cuidado transferir la capa superior acuosa a un
tubo nuevo utilizAndo una pipeta de boca ancha para
tomar la viscosa solución de A!»?
12** Repetir una megúnda extracción con fenol, y repetir
los pasos <9), <10> y (11>
lJ** Adicionar 1/2 del volumen de cloroformo alcohol—
imoamilico, mezclar y centrifugar a 3000 rpm,20
minutos a 400
14** Transferir la capa acuosa, como en (11>, y realizar
una nueva extracción con cloroformo, repitiendo <12)
y <13) 3<

94

¡
.1
 precipitar el Al»? adicionando iiío del volumen con
GUJa 4K

16** si el ADN precipita cotao una masa gelatinosa, es

recogIdo por centrifugación a 3000 rpm 20 ¡tUn a 42C
si no se observa precipitado, la solución se sitúa a
-2090, al menos una hora antes de centrifugar. El
precipitado entonces, es redisuelto en un mililitro de
agua destilada Y •L ADN 05 de nuevo precipitado como
en <15>
17** Se elimina el liquido sobrenadante por inversión y al
precipitado de ADN se le adiclona 1. ml de agua desti-
lada
18** La concentración de ADH es medida por observación de
la densidad óptica de una alícuota llevándola a 1 ml
con agua destilada, leyendo la absorbancia a 260 nm
<una lectura de 20 correspondo a 3. mg ADN/ml) frente
a agua destilada en un espeotrofotómetro Bau Sch &
Lomb spectronic.

?MPONEU Y IOLUCIONIO UtZLZUAOAU

.-RETICULOCITE SAtINO’
0,13 M CiNa
5 nÚl ClJ<
7,4 mM Cl7Mq.6I~0

-SOLUCION NP—40 AL 0,13

1 mi/l H~O destilada

-SOLUCION DE LISIS
10 mM dHa
10 mM EDTA
10 mM Trim-CXH, pH 8

95

1
~SOLUCION 5 X &NAE
0,1 M CINa
0,01 M Acetato Ha, 3 H20
1 mM EDTA
0,9% 505

-SOLUCION 10% 8DB

10 g Lauril Sulfato Sódico/loo ml H20

-SOLUCION XM TRIS pH 8
Tris...•..... 60,5 g
Clii 30 ml
¡<>0 cap 500 ml

-SOLUCION 48 dNa
23,4 g dNa! 100 ml 1I~0

-CLOROFORMO-ALCOHOL ISOAMILICO (1/24, ‘4v>

100 ml alcohol isoamilico
2,5 1 cloroformo

96

3.

1
fi’
~fl¿~IO DE~I HAPLOTTPQ

se estudian 5 familias con ¡3-Talasemia. En cada

familia 9~ analiza el haplotipo de ambos padres heterocigo-
tos para la fl-Talasemia, y su hijo homocigoto, una de estas
ramillas presenta dos hijos homocigotos con ¡3-Talasemia
mayor.

El ADN se aisló según el método de Poncz <Poncz y

cols.,1962> .
5 »g de ADN se digirieron con las siguientes
enzimas: Mmd Ib Xn I~ Mmd ¡iz, ¡va II, Upe 1 o 3am HZ.

Los fragmentos de ADN despues de realizar electroforé—

sin en gel de agarosa se transfirieron a un filtro de
nitrocelulosa. Dichos fragmentos se hibridaron con sondas
especificas: epuilon <~ >, gazne <5), pacudobeta <M$) y
beta <8> , según técnicas previamente descritas (Gilman y
cols.,1983>

97
 AMPLIFICACTON POR ARME

COKDXCXOHUS DE MPLZIZOACXOH

El AD1J fué aislado de sangre periférica

según la
técnica descrita anteriormente, La POR se realiz6
en una
mezcla que contenla <para 4 mi> 1

TampónlOxcetus 500 4
Agua esterilizada ,,‘,.,.
2700 pl
1 ,25n~I4 N’rP 800 pi.
EsperrnidinalM ,...,,.,,,•,,,,, 4 pl

Estando constituido el tampón lo x Cetus (para 5 mí) por:

214 011< . ,,i •44~•••• 1,25 ml

114 Tris pH 8,4 e, •i.,*~, 0,50 ml
114 Cl~Mq .... 75 ¡¡1

H>Oenterilizada .••....,.. .,... 3,2m1

En un Eppendorf situamos de 0,5 a 1 gg de ADN, siendo

adicionado a 20 ¿sí de la mezcla de POR hasta un volumen
total de 25 4, conteniendo 3. i¿l de cada uno de los cuatro
iniciadores <don comunes, un control y el ARME normal o
mutante> y de 0,5 a 1 4 de la enzima Taq polimerasa
(Cetus. Perkin—Elmer> . A esta mezcla le adicionamos 25 Ml
de parar ma <Stqn> para evitar la evaporación y se intro-
dujo en el ciclador.

98
cICLO TERMICO
El Eppendorf se introdujo en un ciclador térmico <DNA
Thermal Cycler. Perkin-’Elmer) y sometido a 29 ciclos según
el programa:
9390 1. minuto
5500 1 minuto 28 ciclos
7200 l,Sminutos
y un ciclo final con una extensión de 7290 durante 3
minutos.
El proceso total de amplificación dura aproximadamente
unas 4 horas.

REVELADO
20 pl de la muestra de ADN amplificado se mezclaron
con 5 pl de una mezcla de ficolí al 15% y azúl de bromofe—
nol al 0,05% para posteriormente ser introduéidos en un gel
compuesto por agarosa al 1,5% y agarosa “nusieve” al 1,5%
en 1. X AGB.
SS realiza la electroforésis a 100 voltios durante 30
minutos, siendo posteriormente teñido durante 10 mm. en
una solución de bromuro de etidio, y situado en un transi—
luminador (Chromato-VUE. Mod,TM—20) y fotografiado (Proce—
sador Mitsubishi>
SOLUCIONES
- FICOLL-BROMOFENOL

ficolí 400 •... ,,.... 15 g

azul bromofenol 0,05 g
1 X AGB osp •.,..... , 100 ml
-BROMURO DE ETIDIO
1 mg bromuro de etidioll 1 X AGB
-SOLUCION DE 50 X AGB
2MTris..... 242,28g
lM Acetato S6dicO,3H20 ,,.,.. 136,08 g
lOmb! EDTA 3,72 g
Adicionar 75m1 de ácido acético glacial hasta pH 8,3

99
DISEÑO DE LOS OLZGONtJcLfotrzDoe RIUTADoS

Los oligonucleótidog fueron sintetizados por Genset

(Paris) y distribuidos por Izasa, habiendo sufrido un
proceso de purificación por cromatografla de alta presión
(¡-IPLO) . un par de iniciadores control <A y E con 861 Pb>
fueron Incluidos en cada ensayo, así como un iniciador
común (0) .L.os INICIADORES DE ARMS utilizados fueron:

1 VSI nt 110 390 pb (ri y m)

c octcn 39 436 pb (n y rn>
1 \FSI Nr 1 283. pb (n y m)
1 ~~>SIN’¡’ 6 286 pb (n y
1~ nt 1 634 pb <n y m)
IVSIIntY4S 738 pb <n y m)
codon 6 ......... , 207 pb (ni>
208 pb (n)

Como marcadores hemos utilizado O X174 RE’ digerido con

Hae III (Haemophilus Aegyptus), que corta al ADN por:
GO CC
CC oc;
obteniendo 13. fragmentos de un tamaño que vA de 3.353 pb a
72 pb. Del mismo modo hemos utilizado el Marcador VI de
Boehri n ger, que proporciona 12 fragmentos con un tamaño
que vA de 2 176 pb a 154 pb.

fi
y32.

3
1. —

1.

loo
SIGUIENTE
ANTERIOR

IV RESULTADOS
-
 ‘4- <Y¾.4.M ruco ‘~~ 7k
HLflW ~.r1O~
44 444 444 %4 444~
tMMtO rl.Me~J
.—~ ,.~
0t’~’QN
4.4 4%’ 4%’ 44% 4444
HNN r.ItrIC%4 flN ‘Mr~<fl
0N~ 0ri~O qr,0
NMC
242 CtiN
~4% 44’ 44’ ‘4’.
—‘ 0~ 0O%r~
‘4’ 44 ‘ “000
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W~t0 10
-
0400 0¿nO~ NOV9
44% 44~
o%•wrn 0C.4r.~ LflNW r-1
040N
enN~C’l
‘-¿rl
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-4
000 000 0000
CSOW
4’’ 4’’ 4’’ 44% 4444
rcv~ W.0V~ .~..q.ifltn
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102
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<0 ‘o ‘o 4-
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•0
o, cf,
‘oo,
4% 4%
.5 4% 4% 4%
‘o ‘o o,
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o 5- 5-
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54- 4- 4-
c 4-
8
2 u, u, 0
8
•0
8
CC sc
sc 4% mCC sc
o 4% 4%4% 4%
5 4%
o z
5 5 5 5:
04
H
¡4
o
++ 44- +4- + ¡ +4 4’ 4+ 4+ +4-
Dv) II II II 3+ 3+ 4+
=
0. —+ ~~ci +4- ++ +4 ++ 4-4 44:4+4* +4
II II II ¡ .4—
4+ +4 .44
4+ +4- 4+
++ ++ 44-
+4 -‘-4 4+
III ej 4+ 4+ ++ +1 44 i-4- H
ca It
o
o
‘vi 1
+4- 4+ 4-4 ++ 4+ ++ ++ ++ 44 + + 4-4- ++
nIt
4+ + + 4+
sc
>1
II II 1+ II +3 II II ‘4- II II II II II II
II II II
u 4- = II II 4 II 4-1 II II II II
II II II II II II +44+ tI ti II II II II II II
(.4 C
+ II 4-1 4+ +4 +1+1 II II II II II
II II
II II II 4. II 4-1 II II II 1 II ¡ II II II II r
—+ 1
u c ++ ++ +3 ++ 1+ II II 1+ 4+4+4+ ++ +444
uJ w Lii
w w o:
w
o: o:
o o
-Le) Lii o: cI~- o
o 04
1- .4
o .4
Ir>
.4 .4
.4
.4 .4 sC 2 .4 o- sc 2 .4 o o- 2
5-
.4 2 u-co o-
2 -J -J
-J
2 2
sc
.4
u-
.4
u- u-
.4
u-
sc
u-
103
3-RESULTADOS DE AMPLIWICACIoN POR ARMS

La aplicación por nuestra parte de la metodologla

correspondiente a la técnica de amplificación con nucleóti-
dos mutados o ARMS, nos ha permitido establecer unos
resultados correspondientes al análisis molecular de las
nutaciones (3—Talasémicas estudiadas en el Hospital Univer-
sitario San Carlos de Madrid, que detallamos a continua-
ci6n.

N~ de pacientes estudiados 42

con B—Talasemia heterocigota .. 34

con ¡3—Talasemia homocigota .... 7
con ¡3—Talasemia intermedia .... 1

N~ de cromosomas estudiados 37

Tipo de lesión:

Mutación sin sentido codon 39 ...... 10

IVS—1 nt 6.. 8
IVS—1 nt 3. • 11
EVS—1 nt 110 3
2ntcodon8 2
Mutación desconocida* ~5•5•5t5555•5~5 3

* En uno se ha realizado su secuenciación demostrándose en

el codon 11 deleción de un nucleótido (- ‘1’)

Tabla VI]

104
 1353— —861 pb

-436 pb

234

Figura 28

Análisis de ADN con el iniciador normal <APMS normal> para

la mutación del codon 39 en las columnas 2,4,6,8 y 10; las
columnas 3,5,7,9 y 1). corresponden respectivamente a los
pacientes 2,4,6,8 y 10 con el iniciador mutado (ARMS
mutado) para la mutación del codon 39.
Se observó la presencia de hibridación en las columnas
donde hemos depositado los iniciadores normales y carecen
de ella los mutados, lo que indica ausencia de mutación del
codon 39 en los 5 pacientes estudiados. Pudiendo suceder
que éstos pacientes presenten 8-Talasemia heterocigótica
debida a otra mutaci6n diferente del codon 39 ensayada. En
la columna 1 marcador de longitud Phixl74 digerido con Hae
III.

105
 1353-
603— —436 pb
28t- 286 Pb

F,gii<a 29

En las columnas 1, 4 y 5 se ha realizado el análisis del

AON con el iniciador normal para la deleción nt 6 del IVS-
1; en las columnas 2 y 3 con el iniciador normal para la
mutación del codon 39. Las columnas 7, 10 y 13. corresponden
respectivamente a los pacientes 1, 4 y 5 con el iniciador
mutado para la deleción nt 6 del IVS—l. Las columnas 8 y 9
pacientes números 2 y 3 estudiados, con el iniciador mutado
para la lesión del codon 39. El paciente i (7> con ¡3-
Talasemia homocigota, es homocigoto para la mutación nt 6
del. IVS—l, los pacientes 2 (8> y 3 (9), son heterOCigótiCOS
para la mutación del codon 39. Los pacientes 4 (10) y 5
(11) con 8—Talasemia heterocigótica no presentan la muta-
ción nt 6 iVS—l. La columna 6 contiene el marcador de
longitud Phi x 174 digerido con Hae III.

106
 1353... -861 pb

21— -288 pb
234-

Fisura 30

Iniciador normal y mutante para la mutación del

nucleátido 6 en el IVS-l. En este caso las columnas 2 y 3
corresponden a un paciente homocigótico para la mutación
del nt 6, en la colunina 2 se situó el iniciador de ARMS
normal y en la 3 el AR14S mutante para esa mutación. Las
columnas 4, 5 y 6 corresponden a tres pacientes heterocigó—
ticos estudiados con ARMS mutante para la mutación nt 6 del
IVS—1. En la columna 1 se situd el marcador de longitud
Phixl74 digerido con Hae III.

107
 1 ~ 5678 Q1O11
1353- —861 pb

60% —436 pb

Figura 31

Las columnas 2 y 3 corresponden a un paciente homocicjótico

para la mutación nt 6 del IVS—1, situandose en la columna
2 el iniciador ARMS mutado y en la columna 3 el ARI4S
normal. En el resto de las columnas se han estudiado una
serie de pacientes para la nutación del codon 39, incluyén-
dose en las columnas 4,6,8 y 10 los iniciadores de ARMS
normales y en las columnas 5,7,9 y 11 los iniciadores de
ARMS mutados para la mutación del codon 39.
Los pacientes 4(5) y 6(7) son heterocigóticos para la
mutación del codon 39. En las columnas 8 y 9 paciente
normal que carece de la mutación buscada. En las columnas
10 y 11 paciente con B—Talasenia mayor doble heterocigótico
presentando mutación del codon 39 y otra mutación diferen-
te. Columna 1 marcador de longitud VI de Boehringer.

108
 3,234567

1353 —861 Pb
281- —281 pb
234

Figura 32

AnálisiS de ADN con el iniciador normal <ARIAS normal> para

la mutación nt 1 del IVS—2. en la columna 3 y ARMS mutante
para la misma mutación en la columna 4. Resultando un
paciente homocigóticO para dicha mutación. En las columnas
5 y 6 hemos situado el ARIAS mutante en dos pacientes
diferentes para la mutación nt 1 del IVS—1; resultando dos
pacientes normales, pudiendo ser heterocigóticos para otra
mutación distinta a la ensayada. En la columna 1 el marca-
dor de longitud Phixl74 digerido con Hae 1711, y en la
columna 7 el marcador de longitud VI de Boehriflger.

109
V-DISCUSION
1.COXEIIIARIOS A LOS RESULTADOS DEL flPLOTzpo

La introducción en los últimos años de las técnicas de

biología molecular ha contribuido decisivamente a precisar
la base molecular de las talasemias. En el periodo que va
de 1980 a 1986 el estudio de la 13-talasemia consistió
basicamente en el estudio del haplotipo, seguido de la
donación y secuenciación de los fragmentos de ADN que
forman los genes.
La búsqueda de polimorfismos con enzimas de restric-
ción permite definir los diferentes haplotipos. Se denomina
haplotipo, a la combinación de una serie de puntos positi-
vos, si el lugar para la enzima está presente, o de puntos
negativos, si el lugar para la enzima está ausente. En el
primer caso aparecen bandas de menor longitud, por la
acción específica de la enzima sobre la secuencia de la
cadena. En el segundo ‘caso los fragmentos son de mayor
longitud (Oíd y cols.,1984).
En el año 1982 Orkin y colaboradores <Orkin y cois.,
1982> , identificaron nueve haplotipos en la familia de
genes de la globina 8, figura 32.

~ G~’ A~ tP
t
— a

~HM¿4IHtdE HndIj A,aIIBaflHI

RAR.Dt POS
+ — — —— 4. ~
II — + + —+ + +

III — + — 4+ + —

IV - 4. - 4+ - +

y + - - -- + -
- +
VI — 4. 54 - -

VII + — — -— -1’
Vii - t - 4- + -

Ix - + - 4*

Fipu 32

111
 se observa como dichos haplotipos se corresponden
generalmente con una determinada mutación de ¡3-Talasemia.
Por ejemplo, en la población mediterranea, el haplotipo 1
se asocia con la forma común de talasemia producida por
inutacion O-—A en el intrón 1 (IVS-1) situado en la posición
110 de la caden ¡3. Esta asociación entre hapJ.otipo y
mutación ha sido utilizada con éxito para caracterizar
nuevas mutaciones, facilitando la donación y secuenciación
posterior de las mismas.

Determinamos el haplotipo, mediante el empleo de

enzimas de restricción, de 10 puntos polimórficos en la
familia del gen de globina ¡3. Estudiando 16 enfermos con ¡3—
Talasemia pertenecientes a 5 familias, 6 de ellos presentan
¡3—Talasemia mayor.
Los puntos polimórficos estudiados han sido los siete
descritos por Orkin, a los que se añade e). punto polimórfi-
co para la enzima de restricción Aya II, gen pseudobeta(—
Wainscoat y cols.,1984>, el. punto 3 del gen beta, para la
enzima Hpa 1 (Kan y Dozy,1978> y el punto situado 5
respecto al gen gamma, para la enzima Xmn 17 (Gilman y
Huisman, 1985>

En la población mediterranea el haplotipo más común es

sí 17 (+———-++) y se asocia generalmente con la mutación
causada por la sustitución O—-A en la región del primer
intrón ¡3, posición 110 (IVS—1, 110 I3~> (Kazazian y cols.,—
1984)
Conociendo los haplotipos de un paciente con ¡3-Talase—
mía se puede predecir con bastante seguridad la mutación
específica de ¡3—Talasemia que presenta dicho individuo.
Ahora bien, el mismo haplotipo puede, asimismo, estar
ligado a cromosomas normales no talasémicos o a otras
diferentes mutaciones que producen talaseltia.

112
 EJ. haplotipo 17 además de estar ligado a la mutación
del primer intrón, posición 110, puede observarse en la
mutación C--T en el codon 39 de la cadena 13, (839), en la
mutación CAG--G-G en el codon 6, (1306>, en la sustitución de
la base T——G en la posición 116 del intrón 3., <1< 116) y en
la sustitución en el codon 27 GCC——TCC, produciendo la
hemoglobina de Knosos (Weatheral,1986).

En nuestros casos, los 20 cromosomas estudiados

pertenecen a 10 enfermos con ¡3—Talasemia beterocigota y por
tanto de sus hijos enfermos con iS—Talasemia mayor.
Se observa en 8 de ellos el haplotipo V (3 B~ y 5 frt;
en 8 el haplotipo 1 (4 B’~’ y 4 EA); en 2 el haplotipo VI
<J
3tII>, y en 1. el. haplotipo IV (J3~’). Todos los cromosomas
pertenecen a los previamente descritos por Orkín, excepto
uno < 5A. haplotip +-+>.

Los cromosomas (3—Talasémicas corresponden a los

haplotipos y (3 cromosomas), VI (2 cromosomas), 1 <4
cromosomas) y IV <1 cromosoma>. Aunque no es posible hablar
de frecuencia con tan escaso numero de pacientes, si
podemos decir que estos resultados difieren parcialmente
del único estudio realizado en la población española, en la
que se estudian 21 pacientes con 3—Talasemia mayor. En este
trabajo los haplotipos talasémicos más frecuentemente
hallados son el II en 22 cromosomas, el 1 en 11 cromosomas
y el IV en 6 cromosomas (Estivill y cols..1986).

EJ. punto polimórfico para la enzima Aya II, en eJ. >3

está presente en todos los cromosomas estudiados. Este
punto polimórfico está ausente generalmente en los cromoso-
mas de ¡3-Talasemia con el haplotipo 17 y la mutación G—-A,
en la posición 110 del primer intrón >3. Sin embargo, está
casi siempre presente en los cromosomas normales o en los
cromosomas talasémicos con otro tipo de talasemia (Thein y
cois. 4985>

113
 Los fragmentos polimórficos del ADN pueden utilizarse
como marcadores genéticos para el diagnóstico prenatal de
la 8—Talasemia.

Los puntos polimórficos más útiles son aquellos que

raramente se encuentran en los cromosomas normales. El
diagnóstico prenatal basándose en los puntos polimórficos,
utilizando enzimas de restricción, pueden realizaras en
otras enfermedades congénitas como: Hemofilia A, Fenilceto—
nuria, Enfermedad poliquistica renal, Corea de HuntingtOn
y Distrofia muscular de Duchenne <oíd, 1986).

El diagnóstico prenatal de ¡3—Talasemia no hubiera sido

posible establecerlo con la enzima Aya II, en ninguna de
las familias estudiadas. Tampoco hubiera sido posible en la
primera familia con ninguna de las enzimas de restricción
empleadas, ya que tanto ].os cromosomas normales como los 8—
Talasémicos poseen un misma haplotipo y <+——--+.->.Sin
embargo, este diagnóstico es facil de obtener en la segúnda
familia, ya que los genes 8-Talasémicos corresponden a los
haplotipos IV y y, siendo en ambos progenitores el haploti-
PO 1 el que corresponde al cromosoma normal.

En la tercera familia, el diagnóstico prenatal tambien

es posible, ya que el lugar poliznórfico para la enzima I{ind
III está presente <++> en el gen B—TalasénIicO en los dos
hermanos homocigotos, mientras que ambos lugares están
ausentes (--) en el cromosoma normal (BA) de ambos padres.

114
 2.COMEIITARIOB A LA TEONICA DE AMPLZFXCACION POR ¡DM5
<PCE CON OLIGONIJCLEOTIDOS MUTADOS

A partir de 1987 la posibilidad de poder amplificar

fragmentos de ADN mediante la técnica de la reacción en
cadena de la polimerasa <PCR) ha revolucionado el mundo de
la biología molecular y el estudio de la ¡3-Talaseflia, entre
otras enfermedades (Saiki y cols.,l987).

Una modificaci6n de la POR denominada “Aniplificatiofl

Refractory MutatiOrl System” o POR con oligonucícótidos
mutados, ha sido desarrollado por nosotros en este trabajo.

Esta técnica se basa en la amplificación enzimática de

un fragmento de ADN acotado por dos oíigonucleótidos
iniciadores o Ilprimersfl, que hibridan cada uno de ellos a
secuencias complementarias de la doble hélice de ADN; estos
oligonucleótidos se orientan de tal modo que sus extremos
3’ quedan enfrentados.

Para diagnosticar una mutación específica, la técnica

requiere dos oligonucleótidos iniciadores de igual secuen-
cia excepto en el nucleótido 3’ terminal, uno de los cuales
es complementario de la secuencia de ADN normal y el otro
cambiado un nucleátido en el ADN mutante.
Para que un iniciador sirva de modelo para la ADN
polimerasa, el nucleátidO 3’ terminal ha de estar perfecta-
mente unido a la secuencia del ADN diana.
Bajo condiciones cuidadosamente controladas, un
nucleótido con su 3’ terminal desemparejado puede no
funcionar correctamente y no producirse la amplificación.

La amplificación de la secuencia diana resulta de

sucesivos ciclos de desnaturalización, alineamiento Y
polimerización enzimática por extensión de iniciadores.

115

>
 Los oligonucleótidos de ARME fueron diseñados para
detectar un ADN normal y mutante. El nucleótido 3’ del
iniciador rnutante es complementario de la secuencia mutan-
te, y el iniciador normal es complementario de la secuencia
de ADN normal, INICIADOR COMUN O, emparejado a cualquiera
de los iniciadores de ARME normal o mutante, facilitando la
detección de la mutación o la ausencia de ella.

Las muestras de ADN fueron estudiadas para estas

mutaciones usando diferentes reacciones, cada una conte-
niendo los dos INICIADORES CONTROL A y B (amplifican la
región del ADN a corta distancia de la amplificada por los
oligonuc.leótidos de ARME y deben producir un fragmento de
un tamafio distinguible del producido por los iniciadores de
ARMS),ambos A y a amplifican un fragmento de 861 pb del 3’
final del gen de ¡3 globina; y uno de los INICIADORES NORMAL
o MUTANTE de ARMS para cada una de las mutaciones.

Despues de la amplificación y la electroforésis,la

presencia de una bande amplificada además de la control a
861. pb, en una de las reacciones significa una mutación
particular de 13’-Talasemia. Si solo aparece la banda control
en las reacciones, se puede decir que ninguna de las
mutaciones comunes está presente, y la muestra de ADN se
debe ensayar con las mutaciones menos frecuentes.

A continuación pasamos a exponer los problemas deriva-

dos del montaje de esta técnica, puesto que para la reali-
zación de esta técnica las condiciones de trabajo han de
estar prefectamente controladas en lo que se refiere:
En primer lugar, al laboratorio, dentro del cual se debe
evitar la manipulación de otras muestras de ADN pues con
facilidad se podrían originar resultados erróneos por
contaminación con dicho material.

116
 Muy recientemente se ha puesto a punto un sistema
biol6gico para suprimir las contaminaciones, Consiste en
utilizar, para la producción de las copias a partir de la
molécula inicial, un elemento que normalmente no entra en
la composición del ADN, el uracilo. El ADN amplificado
contiene por tanto, uracilo (en vez de timidinas) , lo que,
en la mayor parte de Los análisis, no tiene importancia
alguna

Este ingenioso procedimiento permite, a continuación

y antes de una nueva amplificación, liberar los fragmentos
de ADN producidos. Para ello basta tratar las muestras de
material genético con un enzima bacteriano que destruye las
moléculas de ADN que contienen uracilos. De este modo,
cualquier ADN contaminante procedente de una amplificación
anterior queda destruido. Como el enzima es sensible al
calor, queda inactivado en la PCR siguiente, por lo que no
ataca el ADN que se desea amplificar.

En segúndo lugar, se han de cuidar al máximo las

condiciones de trabajo puesto que al utilizar tan pequeñas
cantidades de muestra (0,5 a 1 4> y reactivos, cualquier
pequeño error en la manipulación sería reflejado en los
resultados.

En este sentido, aunque la técnica ARMS tiene la

ventaja de ser simple, rápida y no radiactiva, hay que
mantener un control exahustivo en todos y cada uno de los
pasos, que comprenden desde La extracción del ADN, evitAndo
la degradación del mismo en el momento de su utilización,
hasta la adición de una concentración exactamente controla-
da al eppendorf donde vamos a realizar la amplificación.

Los problemas de ésta técnica no sólo son los inheren-

tes al ADN, tambien nos vamos a encontrar con los corres-
pondientes a los reactivos utilizados, así, todos los

117
iniciadores -“primers”— han de ser adicionados en idéntica
concentración (picomoles), necesitando alguno de ellos una
previa dilución y otros tal y como son servidos por las
casas comerciales; adicionando el iniciador exacto que
corresponda con la mutación buscada, así como la adición de
un iniciador control evitando con ello la amplificación de
otro fragmento distinto. Sin olvidar la introducción de un
marcador de longitud, ya que cada mutación se corresponde
con una banda a una determinada longitud.
De igual modo, los desoxinucleótidos trifosfatadOs,
mezcla PCR y los iniciadores adicionados han de estar
conservados a -20~C, y para su utilizaci6n conviene que
sean previamente separados en alícuotas evitando su altera-
ción con constantes ciclos de congelación y descongelaciórt,
lo que supone al mismo tiempo una nueva posibilidad de
contaminación.

A estos problemas propios de lo que podemos denominar

“sustancia de trabajo”, hay que añadir los correspondientes
al utillaje empleado, lo que comprende la utilización de
pipetas exclusivamente para esta técnica, programación
adecuada del ciclador y la exposición final al transilumi—
nador, la cual ha de ser controlada con el fin de evitar la
desaparición de bandas amplificadas a causa del elevado
tiempo de exposición.

No se deben pasar por alto, los enormes problemas que

pueden surgir en el resultado final del trabajo por causas
absolutamente incontroladas como puede ser un fallo en la
luz o un cambio en la tensión de la misma, que originaria
una desprogramación en el dolador térmico con las consi-
guientes variaciones de las temperaturas seleccionadas.

Debido a todos y cada uno de los factores anteriorffien

te mencionados, con facilidad pueden observarse mutaciones
inespecificas apareciendo una o varias bandas que no se
corresponden con ninguna mutación buscada.

118
p-MUTACIONIB DE 8-TALASNZA ENCONTRADAS

Las mutaciones i3-Talasémicas más frecuentes

halladas
por nosotros en este trabajo comprenden el cambio G - A en
el nucícótido 1 del IVS-3. y la mutación sin sentido del
codon 39.

Ambas mutaciones constituyen aproximadamente el 62 %

de las mutaciones f3—Talasémicas encontradas y junto con la
mutación por cambio T - O en el nucleótido E del IVS-1
(23,5 %> completan el 85,5 % del total de lesiones.

Valores que difieren a los encontrados por Aniselem y

colaboradores <Axnselem y cols..1988) referidos a las
mutaciones talasémicas halladas en otros sujetos homocigó-
ticos espafloles, donde un 64% del total corresponden a la
mutación sin sentido del codon 39 seguida de un 16 % de la
mutación en el nucleótido 6 del IVS—1 y Únicamente un 3 %
del total de las mutaciones corresponde a la mutación del
nucísótido 1 del IVS-l.

De las mutaciones encontradas, algunas corresponden a

i3~—Talasemia como las que ocasiona la pérdida de dos
nucícótidos <AA> en el codon 8 y que altera el marco de la
lectura de]. código genético; la mutación sin sentido del
código genético del codon 39 (0 - T> o el cámbio de G A -

en el intrón 2. que modifica los lugares de empalme y

origina un ARN inestable. Estas talasemias en el estado
homocigótico producen cuadros talasémicos severos, transfu-
sión dependientes.

Por el contrario, las lesiones en el interior de los

intrones IVS—1 2.10 y IVS-2 745 producen un cuadro de f3~-
Talasémia con cantidades variables en la producción de
cadena beta.

119
 Mención aparte merece la mutación del nucleótido 6 en
la posición 2. <IVSL) . Esta lesión se describió ( Orkin y
cols,,1982),Qfl sujetos de la cuenca mediterranea y se vió
asociada al haplotipo VI de Orkin. Parece que el estado
hoffiOClgótiCO se asocie a un tipo más benigno de 6—Talasemia
que en ocasiones se ha interpretado como ¡3—Talasemia
silente intermedia.

En dos de éstos niños con B-Talasexiiia homocigota <F.J.

y s.j.>, el estudio fué realizado a la edad de 12 y 13 años
cuando llevaban ya diagnosticados varios años y en régimen
hipertransfulional. Pensando que podrian tener una mejor
calidad de vida, sin los riesgos que conlíeva el régimen
tranufusioflal y la aplicación de quelatos de hierro (Desfe—
rroxiamifla) , se les suprimieron las transfusiones y se
mantuvieron en observación médica. La hemoglobina y el
valor dci. hematocrito fueron paulatinamente descendiendo,
siendo nuevamente reevaluados a las 16 semanas y presenta-
ron unos valores de hemoglobina de 6,7 —6,8 g/dl, siendo
de nuevo transfundidoS, encontrandose en la actualidad con
régimen hipertrafllfuliOnal.

De estos resultados observamos que el curso clínico de

la enfermedad, es más grave en estos pacientes siendo
transfusión dependiente a diferencia de otros casos descri-
tos en la literatura que presentan un curso más benigno.

Otros dom pacientes, uno con ¡3—Talasemia mayor y otro

con ¡3-Talasemia intermedia, no pudieron ser catalogados
tras ser estudiados con 24 nucísótidos mutados diferentes.
Recientemente en uno de los caSOS se ha realizado la
secuenciación de la cadena beta, demostrándose que tanto el
paciente con ¡3-Talasenlia intermedia como su madre con ¡3-
Talasemia minor, se produce una mutación en el codon 11 por
deleción de un nucisótidO <-T), originando una alteración
en el marco de la lectura del código genético.

120
 Esta lesión habla sido previamente descrita en un
paciente mestizo mejicano, comentando en el trabajo origi-
nal su etiología en la etnia indígena, no obstante, noso-
trol oreemos que al ser tanto la madre como el hijo descen-
dientes de españoles oriundos de Cáceres, es posible que la
lesi6n se origine en España y ha sido llevada a América en
tiempos del descubrimiento,

En nuestros resultados, la aparición o no de bandas

nos informará si el paciente presenta una determinada
mutación f3-Talasémica, así como de su caracter homocigótico
o heterocigótico del mismo, según el siguiente esquema:

HIBRIDACION
A.RMS normal ARMS mutante MUTACION

+ Mormal.Heterocigoto para
otra mutación

+ + Heterocigoto para la
mutacion estudiada

+ Homocigoto para la muta

cian estudiada

HomocigotO para otra

mutacion. Doblemente
heterocigótico para
otras dos mutaciones

121
4. MUTACIONIS DE LA ¡3-flLASEXIA EN LA LITERATURA

Las variaciones en el ADN son múltiples y ocurren

de diferentes formas, incluyendo sustitución de nucleátidos
(Kan y Dozy,1978>,inserción o delec~i6n de un grupo repeti-
do de secuencias cortas (Nakamura y cols.,1987>,variación
en el numero de GT repetidos en un “locus” (Weber y May,-
2.989> y variación de la longitud en el 3’ terminal de
secuencias Mu <Economou y cols.,1989>.

Muchas de estas variaciones suceden en las secuencias

entre genes e intrones y solo una pequeña fracción de las
variaciones induce una mutación productora de enfermedad.
En contraste con los genes de a—globina, un simple gen
de ¡3 globina está presente por genoma haploide en humanos.
La ¡3-Talasemia ha sido considerada como una variación
fenotipica dependiente de muchos factores, incluida la
naturaleza de la mutación involucrada;existiendO dos
estados de ¡3—Talasemia, rasgo y enfermedad, en comparación
con los cuatro estados de a-Talasemia (portador silencioso
con 3 genes funcionales; rasgo a—TalaséIflico con 2 genes
funcionales; Enfermedad de Hb H, 1. gen funcional y la
Hidropesía de Barta, sin genes a funcionaleS>

La i3—Talasemia está generalmente causada por mutacio-

nes puntuales, éstas fueron ampliamente estudiadas desde
1980 a 1986, normalmente por análisis de haplotipO del
grupo de genes de ¡3 globina, seguido de la donación y
secuenciación del gen mutado,AlrrededOr de 40 mutaciones
puntuales productoras de ¡3-Talasemia se descubrieron hasta
mediados de 1987 <Treismar’ y cols.,1983> en este año fué
posible amplificar regiones del gen de 13 globifla, inicial-
mente con ADN de leucocitos <Saiki y cols.,1SES; Mullis y
Faloona,1987) y secuenciación directa de los productos
amplificados (Engelke y 7).
00~5~,1988fl1Ong y cols.,198
122
 Utilizando esta aproximación en individuos selecciona-
dos, conociendo el fallo de alelos comunes del grupo etnico
representado por el paciente sujeto a estudio, alrrededor
de 50 alelos más han sido caracterizados en menos de dos
alice (Kazazian y cols.,1990),

En marzo de 1990 el numero total de mutaciones que

producen ¡3-Talasemia conocidas, son 91, las cuales son
recogidas en la tabla VIII y figura 34 según Razazian.

Los genes de ¡3-Talasemia alcanzan una frecuencia

significativa en muchas partes del mundo incluyendo la
cuenca Mediterranea, SE Asia, India ,Africa e Indonesia.
Las regiones con menor frecuencia incluyen Norte de
Europa, Korea, Norte de China y Japón.

El espectro de alelos de ¡3-Talasemia han sido determi-

nados en una amplia variedad de grupos de población, inclu-
yendo la raza negra Americana (Antonaraicis y cols. ,1984;An—
gastirijotis y cols.,1981); Indios asiáticos <Kazazian y
+ cols.,1984;Thein y cols.,1988); Italianos y Griegos (Kaza—
zian y cols.4984); Españoles (Amselemy cols.,1988);Turkos
(Diaz—Chico y cols.,1988); judíos Kurdos (Rund y cols.,—
1989>; Chinos (Zhang y cols.,1988); Japoneses (Hattori y
cols.,1991) y Thailandeses (Fucharoen y cols.,1989> entre
otros.

En la mayor parte de las poblaciones afectadas, tales

como los pueblos mediterraneos, Chinos, SE Asiático,IndioS
Asiáticos y raza negra originaria de Africa, un conjunto de
alelos específicos de grupos étnicos explican aproximada-
mente del 90 al 93% de los genes de 13—Talasemia. Por
ejemplo, entre los chinos de la provincia de Kuontung,
cuatro aleles explican el 90% de los genes de ¡3—Talasemia
<Kazazian y cols.,1986). Por otra parte, un gran numero de
alelos raros se han observado en cada grupo etnico.

123
 T.bI. VIII. Muuc(o.os pw>wales de a 5-T.laacmnl.

ryp,
MgI #¿‘lt Cisas io~j~~ — —d Orgín

ionÑncItonai ,RNA

u <ojo.’ 1 ASí o Chinas. al

Zi XOO.’ 19 Cf o Moditeran.an. Europea., 128,25
3~ <oclon >5 Q.A3 0 Asían flOran 76
43 cOdo.’ ¶23 A.?) o Polish. Swiss 77 46
ql ~odon37 3Q.A> O Saudí Arabia.’ >4
8> .000fl 43 0.31 O Chinos.
7> codo.’ 6 1 A.?) O Slack 54
O Thai 49
8> codon38<C.A>
b P,smophíIl míalfiflIl:
9> —3 cOdo.’ II—Ql o Médila,ranfln
O> —ZcodooBt—CT> o Maditwran,an 83
III —Icodo.’6l—A3 o Mediteiranea.’ 75, 2Db
‘23 —2 codo.’ 8<—AA> o T~j,kisI loo
33> —Icodo.’$8/9(—OI O Aiim india.’ 76
>43 —3 codo.’ II (—7> 0 Maticen 3.
151 ~. IcadO.’ 14115< “0> O Chinasa 20
>8> —3 caUca’ lOl—CI o Asían india.’ 75
37> ..1 codo.’ 27~28 (MC> o Chinas t
IB> —3 codo.’ 383 —CI O Ir,do.’aeisn 340
¡ codo.’ 36~37 <—Ti o Irania.’ lis
203 —icodon 37<-O> o Kurdish 1>5
211 —lcodOfl3l-39 o Turki.h 121
22> -4 codoflí 41/421 —CnT> O Asían india.’. Chino 76. 80
23> -1 codon 443—CI o l<urdish 83
24> *3 codon4ll”A> O Suinan,asa Black §
O Swiss 28
25> —3 codo.’ 64—0>
O Chineas 20a
28> ..I codo.’ 71<4.?>
O Chineas 27
27> -.3 codoní 7>/72 I+A>
O italia.’ 38
283 Icedon 78(—C>
293 —3 codo.’ 82/83>—O> O Azacbaiimni
O Italia.’ 1>4
303 .ZcodonO4¼.?O>
O American Biack 338
3’> .- Icedon, 06/107 -.0>
32> .-I codón ‘09<—O> taihua.’ian 1~
Pvanch 32
333 .2. .3 COdO” II43-~CT. -.0> .3
it aiiari
34> —1 codo.’ 1261—Ti
20> .-4codona 328-329.
II cOdOlll 332~>38, 1 ZSa
irísh
—Bcodon 329
~Lnithato<
codón muUflt#
38> ÁTO.AOO
o Chinos 3.
o Yugos iavíati 69.
37> ATO.ACO
II RNA Procssarng n,uíaqn
1. SiJIiCO iunctiOai CI¶W9U1
II iVS..I 00511101 1 30-A> O Meditarransa.’ >02
2> ‘VS-> 00Bí<í0.’ 3>04> o Asía.’ India.’, Chinas. 78
3> iVS.2 polilla.’ 3(0-Al o Meo, Tu.’isiatt Ani Eludí 129.28. 137
4> VS-. 1 008iIlO.’ 2 (T~0> o Tunga.’ 28
si vs- 1 oouíuio.’ 2 (7-CI o EiacJ 55
8> VS-? 3-snd~>7b0 O Kuwaiti 73
7> IVS-I X-m,d -25 bp Asía.’ india.’ 305
8> VS-> 3’-snd 0-C> o ilaiian t
9> IVS-2 3-snd A~O> o Ameirca.’ Siadí 6. 8
lO> VS-a 3’-end >A-C> O Aa,wica.’ Biadí lO?
II> VS-> 3-snd’44 bp O Madita<Tancafl 73
32> ¡VS-’ 3—.od <O-A> o ~ 338

124

Av
 Tabla VI>J. Mulacicoes pwiwulos dc I.TaluacmIa (co.’I.)

TYpo
4uifiJ~I Cisco —JI Osgín 8 ale’enc.
•~
t> Cí,nsmnBuB cna.’on
‘3> VS-? pOSiIiOO 6 <O—C> Asían india.’, Chinos., Melanesias, 27, 63. 76
14> VS-! ooan.ooO (O-TI M.diteersíwa.’, BIadi 9,54
5> ‘VS- 1 póeiuiOn 6 <O-Al 4. Algeos.’ 84
36> VS-> 00011100 6 EtC> M.ditusraflftn 02
7> ¡VS-! flOliliO.’ .- 3 OC>
codo.’ 30> Tur,ísian. Siack 28.54
8> VS- 3 ooe.IioO — 3 lO-A>
<codo.’ 30> BulgafiCfl 70a
‘9> iVS-3 goeiu>c.’ —3 Cd)
<codo’, 29> Lebaí,n. 24

20> IVS-2 3.’.nd CAO-MO iranés’,, Egyp:ia.’, Eliot 54, >39

Saíjd¡ Arabia’, ¶39
23> IVS-13 0<1<1 TAO-CAO
A>grian 13
22> IVS-2S’ 00<1 —BIT-O>
o. i.’lvnS VS cheogos
+ Medta<r..’•ai, 24. 36
23> iVS-3 DOI>ííOO 130 <O-A>
o Madlta,rs.’esn 89
24> VS-! oosflíoa’ >36 <1-0>
Maditwr ansi.’ 39
25> VS-? 00031i00 706 <T-O> 4.

MedItsrrs.’ean 302
28> iVS-2 Q0531300 146 <C•C> 4-

27> IVS-2 pouition 664 <e-Ti o Chinase 2?

<1. Codlng <egoo.’. substltí¿tiotle

aflbctí.’g p.oceess.’g~
E SE. Asia.,. Europea.’ 101. 103
26> codo’. 26(0-A> 98
4. Amvioan Biack
20! codon 24 IT-A>
Medltaí’rffiaas, 52
30> codo’i 27 lO-TI Knossos
Malayuíao 140
33> codo.’ ISlA-O> Malay

Iii, T,snacrioIiooal ifluláníl

.3- Turkish 57
1>
4. Meditar, a.’eifl
2> -92 C-T
A.’,. Blsck, As, indian 97
3> ~aeC-T +
lis
3- 3<urdi•ii
4> -SIC-A 02
+ Msdllmranea.’
5> —67 C-O
tebaMBe
a> -eec-a .3-
Japinase ¶26
.3-
7? —31 A.O 45
.3- TurIosh
Si —30T-A la
4. Chinas.
9> .-30T•C 6. 69
Arrwícan Elack, Chinese
‘O> -29A-O lía
4. Ku<diSh
ji> —28A-C 04
4. Chinos.
‘2> —26A4

¡V RNA clnng. + poivadeovlStIOfl n)UtWt 99

Americal’ alad
II MTAAA — AACAA1.
4.
líq
KwdiSi
2> MTAAA — AATMO 4.

4- Aral~
3> MTAA —A<—MTM> 69a
Meditaífl*bW
4> MTfl.A — AATOAA +
89.
Malavelad’
5> AATAA& — MTAOA +

V. Cap Bits mutasile

1> Aa¡windiatl — 37

125
 Tabla VIII Muucloíiu pwiblak dc B-Taiasctnia (coqil.)

TVe. etano.
u CItas ——Ji
01
vi ,>t,t!gbI#
1, QI00t

!urop San
coOOa’ 332 C¶,AvQ>
21 ¡~.‘
82
Japones.
codO” tío LEí-PíO>
II J-~~ 7 3a
BritisIl
cO<>Ofl 327. Ol.’.P¿o>
4! oodOí~S 127-326 JaQfin,It 62
&OO. Qire AIa-P<O> Italia.’ II>
4.
5> codO.’ 60 <Val-.Olu>

5,
4; 4
3-

00 bU
itt ,1

f rrameshift
Transcripción

9 Empalme ARN
Codon sin sentido

It Globina inestable
Lugar de cabeza

Pequeña Deleción
4, Aclaramiento ARN

Y codon iniciador

FIgure 34. MutacioneS pínttlJAiCS productom dc B~Ts1alCl1ilt

126
 En el amplio grupo de pueblos mediterraneos, es impor-
tante reseñar que alguno de los 31 aleles observados en
diversas regiones de esta cuenca Mediterránea, la frecuen-
cia de los alobe varia mucho de un pueblo a otro y debido
a que muchos de éstos son propios de cada región, un gran
numero de individuos con 13—Talasemia mayor, portan dos
alelos diferentes y son llamados dobles heterocigóticos
para la lesión molecular. Verdaderos homocigotos que portan
dos copias del mismo alelo son una minoría.

Es digno de tener en cuenta que la alta frecuencia de

alelos de ¡3—Talasemia claramente confirma la divergencia de
las razas humanas; cada grupo étnico y/o racial tiene su
específica batería de alelos. Cuando la misma mutación
aparece en don grupos étnicos o raciales, en diferentes
cromosomas chequeados probablemente la explicación se debe
en este caso a dos origenes independientes.

127
 MUTACZONPJB DI LA B-TALASENZÁ EN ESPAÑA

España es un área geográfica cuyas características

raciales han sido fruto de la emigraci6n de numerosos
pueblos que a lo largo de los siglos han colonizado la
península ibérica. Unos provenían de Europa y otros de
oriente a través del mediterraneo o de la costa norteafri-
cazia.

Todos estos cambios etnicos han propiciado el desarro-

lío de una gran heterogeneidad de patologías y de lesiones
moleculares de la hemoglobina, con la aparición de casos de
talasemias en poblaciones supuestamente carentes de ellas
antes de la emigración territorial (Martin G.,1989).

La incidencia de la 13—Talasemia heterocigota es alta

en España y pudiendo incluso alcanzar cifras del 7% en
algunas regiones (Baiget M.,1986;Mulloz y ools,,1982;Oliva
E. ,í991> . El estudio más completo sobre 13—Talasemia reali-
zado en Espaf¶a fué llevado a cabo por Calero y colaborado-
res <Calero y cols.,1990> sobre 825 casos de 13—Talasemia en
Madrid, procedentes de todas las regiones de Espalia;
encontrandose una significativa correlación entre e). origen
de los pacientes y la incidencia de la malaria en el pasado
<la malaria fué oficialmente erradicada de España en 1964)
La mayoría de los pacientes con 13—Talasemia heteroci—
gota procedían de zonas de pasado endémico o intensa
malaria (Badajoz,Cáceres,TOledO,Ciudad Real etc.).
En la figura 35 se recoge el mapa de Espafla mostrando
la distribución geográfica de la malaria en 1933.
El intento de relacionar la incidencia de la talasemia
con la existencia de la malaria ha proporcionado resultados
conf íictivos.Por una parte, en áreas tales como Sardinia y
Milanesia esta relación ha sido mostrada (Flint y cole.,—
1986; Siniscalco y cols.,1966).

128
 Se cree que la ¡3—Talasemia tiene una distribución
geográfica particular porque individuos portadores del
rasgo talasémico tienen menos mortalidad cuando infectados
por el parásito de la malaria que los individuos normales
que carecen de dicho rasgo talasémico. A causa de la
distribución de alelos de 13-4alasemia y su incidencia, es
razonable creer que alguna mutación que origina deficiencia
de 8 globina en individuos que residen en una región
infectada de malaria está sugeto a una selección positiva.

I~ Regiones con malaria endémica

Regiones con malaria severa
Regiones con malaria menor
____ Regiones libres de malaria

Figura 35

129
 )4o obstante, en otras áreas tales como Grecia y
Chipre, la talasemia se produce igualmente en áreas con o
sin malaria <Plato y cols.,1964¡ Staxnatoyannopoulos y
cols.,1964>, cuya prevalencia fué superior al % encontrado
en Espafla.

Dentro de un mismo marco etnico, el tipo de mutación

se repite homogeneamente en el 90—94% de los casos, es
decir, cada grupo de poblaoiónposee unas mutaciones que le
son propias, con un predominio de 4 o 5 de estos alelos
mutados.
En la cuenca Mediterránea se han descrito algo más de
30 mutaciones, lo cual supone el que con relativa frecuen-
cia en la ¡3-Talasemia homocigota se produzcan cuadros
heterogéneos por la asociación de dos de estas mutaciones.
Completando los datos actualmente disponibles sobre la
heterogeneidad molecular de la ¡3-Talasemia en la cuenca
Mediterranea, en la tabla IX tomado de Kattamis y colabora-
dores (iCattamis y cols. ,1990), se presenta una recopilación
de las mutaciones de ¡3-Talasemia y sus porcentajes halladas
en diferentes paises.

N’crornouomcu ¡VSI-NO CV-3D NS!.] !VS!•6 (V52-745

Crecía 348 42,6 16,9 13,2 7,2 6,9
Orvcia/iuilia 158 33.5 27,8 9,5 ¡0,8 57
halla <¡3 31 27,5 8 16,8 6,2
Sardiniíi 404 0,4 95,4 0 0 0.4
Sicilia 07 20,8 36,1 3,1 28,9
Turquía ¡92 36,4 3,9 5,7 11,6 4.2
Chipre l06 60,9 1,5 11,7 8,7 5,2
Libano 50 62,0 4,0 0 8,0 4,0
Yugocslavía ¡30 33,0 5,3 13,0 24,0 2.7
Túnez 68 7,5 19,0 lS ¡0,5 7.5
Pianola lOS 25,7 4tO 10,5 8,6 2,8

labia OC

130
 En función de los datos obtenidos, podemos comentar
que los estudios moleculares realizados en diversos puntos
de España, demuestran que aproximadamente el 93% de las
mutaciones corresponden a 5 tipos diferentes de mutaciones:
Mutación sin sentido codon 39 0 T <45,4%); —

cambio de T - O en el nucleátido 6 del IVS—1 <16%>; cambio

de G —A en el nucleótido 3. del ivs-í <14,3%>; cambio en el
nucleótido 110 del IVS’-l <9,3%) y cambio O — G en la
posición 745 del IVS-2 <7,5%>. Estos datos quedan refleja-
dos en la siguiente tabla x.

Barcelona Andalucía Madrid Total

NQ CROMOSOMAS
ESTUDIADOS 57 25 37 119 100

TIPO DE LESION:

Sin sentido 0 39 37 7 10 54 45,4

IVS—1 nt 6 9 2 e í~ 16

IVS—1. nt 1 2 4 11. 17 14,3

IVS-’3. nt 110 5 3 3 11 9,3

IVS—2 nt 745 — 9 — 9 7,5

mt codon 6 3 - — 2,5

2nt codon 8 1 - 2 3 2,5

Mutación
desconocida — — 3 2,5

Tabla X

131.
5. DIAQklOSflOO YRENA<rAL DE LA ¡3-TALASEMIA

Debido a la falta de una terapéutica eficaz ante estas

enfermedades hereditarias,como son las 8—ralasemias,
durante los Qitimos años se viene realizAndo un esfuerzo
gigantesco para establecer el diagnóstico precoz prenatal
de los fetos afectados <Orkin, 1982)

El material fetal puede obtenerse mediante amnniocente-

sim, por punción de sangre fetal o merced a la biopsia de
las vellosidades coriónicas (Alter, 1988)

En la actualidad el método más ampliamente utilizado

es la biopsia de las vellosidades coriónicas, ya que reune
dos ventajas fundamentaleel Puede realizarse durante el
primer trimestre de gestación1 con lo que reduce el angus-
tioso tiempo de espera y por otra parte, evita la contami-
nación materna al realizarse la selecci6n del material
fetal tras el análisis microscópico de la biopsia de las
vellosidades coriónicas <Oíd, 1986) El riesgo para el feto
.

es sin embargo más elevado <2-4%) con la biopsia coriónica

86).
que con amniocentesis (0,3%> (Cao y cols.;19

La aplicación de las técnicas de biologla molecular y

del ARN recombinante han desplazado actualmente a otros
métodos diagnósticos permitiendo diagnósticar la enfermedad
a nivel molecular.

Para establecer un correcto diagnóstico siempre será

necesario estudiar previamente a los padres y hermanos del
feto propósitus. El análisis del ADN permitirá elegir el
tipo de técnicas moleculares diagnósticas.

132
 Existen dom diferentes métodos de estudio: La detec-
ción directa y el análisis indirecto basado en el estudio
de los fragmentos de restricción polimórfj.ca o diagnóstico
por ligamento (“linkage”>

Cuando la mutación no puede detectarse directamente

con una enzima de restricción o con una sonda de oligonu—
cleátidos sintéticos, el diagnóstico prenatal de las
enfermedades hereditarias monogénicas ha de realizarse
mediante el estudio de los fragmentos de restricción
polimótf lea <FRLP>

Un panel de enzimas y sondas especificas de ADN se

requieren para determinar que combinación (haplotipo) va
ligada al rasgo patológico de una determinada familia.

Un requisito previo, indispensable para establecer el

diagnóstico, es el que los padres presenten un haplotipo
diferente, ami. como el estudio previo al menos de otro
hermano normal u homocigótico para la enfermedad.

A pesar de su complejidad, en relación con los métodos

directos, siguen conservando un notable valor en el diag-
nóstico prenatal, ya que éste puede realizarse a pesar de
no conocerme el defecto molecular exacto que lo produce.
Fué hasta el año 1986, el método de diagnóstico prenatal de
la 5—Talasemia.

En la actualidad, utilitándo ADN amplificado por POR

bien directamente mediante técnica de ARMS o bien seguido
de hibridación y/o digestión con endonucJ.Sa5a5 de restric-
ción del producto amplificado1 el diagnóstico prenatal es
casi siempre viable de tres a siete días del muestreo
fetal, habiendo disminuido considerablemente el error
diagnóstico <Al-ter ¡1988>.

133
 Esta técnica de ARME permite el análisis directo de
algún lugar -“locus”— de interés, siendo aplicable a
cualquier enfermedad heredada de la que se conozca la
lesión previa mediante secuenciación incluso puede ser
aplicada al diagnóstico prenatal, estudiando el material
fetal.

134
VI-CONCLUSIONES
1— El método seleccionado para la amplificación del ADN,
reacción en cadena de la polimerasa con oligonucleótjd~s
mutados, tiene las ventajas de ser rápido, simple,
perfectamente reproducible y no radiactivo.

2— En once pacientes con ¡3-Talasemia heterocigótica, se

encontró la mutación conocida por el cambio de guanina
por adenina (O * A) en el nucisótido 1 del intrón 1
<IvS—í, nt 1>, lo que supone un 29,7% del total de las
mutaciones estudiadas.

3- En diez enfermos se encontró la mutación sin sentido del

codon 39 debida al cambio de citosina por timina (C 1
T), lo cual supone un 27% del total de las mutaciones.

4— En ocho enfermos se halió el cambio de timina por

citosina (T • O) en el nucleótido 6 del intrón 1 <IVS—1,
nt 6>. La frecuencia fué del 21,6%

5— Tres enfermos presentaban la mutación del nucleótido 110

de]. intrón 2. <IVS-1, nt 110> producido por el cambio del
nucisótido guanina por adenina (a -* A). Supone el 1,8%
de las mutaciones encontradas.

6— En tres enfermos no pudo ponerse de manifiesto la lesión

molecular pese a que el estudio fué realizado con 24
nucisótidos diferentes normales y mutados-
En uno de
ellos la secuenciación posterior del ADN ¡3 amplificado
puso de manifiesto la deleción de un nucleótido <-a’> en
el codon 11- Se trata de la 2’ deleción de este tipo
descrita en la literatura mundial.

136
7— El 85% de los enfermos, tal y como sucede en otros
paises de la cuenca mediterránea, corresponden a las
mutaciones IVS—1, nt 1; IVS—1, nt 6 y rnutaci6n sin
sentido del codon 39.

9- No se ha confirmado, en dos pacientes homocigóticos con

la mutación IVS—1, nt 6, el carácter benigno, no trans-
fusión dependiente de la enfermedad.

9— Finalmente, el estudio del haplotipo en 7 pacientes

homocigóticos con ¡3-Talasemia (2 hermanos) mostró que 4
cromosomas corresponden al haplotipo 1, 3 al V, 2 al VI
y 1 al IV. se conf irmó la asociación entre eJ. haplotipo
VI de Orkin y la mutación IVS—l, nt 6.

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 VIII-INDICE DE
FIGURAS Y TABLAS
 INDICE DE PIGURAS

Figura 1 Página 16 Subunidad de hemoglobina

Figura 2 Página 18 Estructura primaria de la cadena

alta

Figura 3 Página 20 Diagrama de la estructura terciaria

de la cadena beta

Figura 4 Página 22 Reestructuración de las subunidades

de hemoglobina

Figura 5 Página 23 Molécula completa de hemoglobina

Figura 6 Página 24 Hemoglobinas

Figura 7 Página 30 Estructura del AD»

Figura 8 Página 31 código genético

Figura 9 Página 35 Mapeo cronosómico

Figura 10 Página 35 Localización cromosómica de los

genes que codifican globinas

Figura 11 Página 38 Anatomía funcional del gen de

globina beta

Figura 12 Página 39 Estructura de los genes alta y beta

Figura 13 Página 41 Cómo se fabrica la hemoglobina

Figura 14 Página 42 síntesis de globina

168
Figura 15 Página 43 Eliminación de intrones del ARNm de
la beta globina

Figura 16 Página 44 Elongación

Figura 17 Página 47 Esquema de la biosíntesis del hemo

Figura 18 Página 78 Análisis de FLRP

Figura 19 Página 79 Representación de una cubeta de

electroforesis

Figura 20 Página 81 Esquema de la técnica de Souther—

Blotting

Figura 21 Página 82 Souther—Blotting

PlEura 22 Página 84 Esquema de la reacción en cadena de

la polimerasa

Figura 23 Página 85 Esquema de Dot-Blot

Figura 24 Página 85 Visualización en geles de agarosa

Figura 25 Página 85 Análisis con enzimas de restricción

Figura 26 Página 89 Polimerización en cadena del ADN

Figura 27 Página 92 Electroforésis de hemoglobinas

Figura 28 Página 105 Amplificación por ARMS

Figura 29 Página 106 Amplificación por ARI’48

Figura 30 Página 107 Amplificación por AR>dS

169
Figura 31 Página 108 Anplificlacziófl por ARMS

Figura 32 Página 109 Amplificación por ARMS

Figura 33 Página lii Clasificación de Orkin

Figura 34 Página 126 Mutaciones puntuales productoras de

beta talasemia

Figura :35 Página 129 Malaria en España

170
 INDICE DE TABLAS

Tabla 1 Página se Base molécular de la 5—Talasemia

Tabla u Página 56 Base molécular de la a—Talasemia

Tabla III Página 60 Clasificación de las formas mas

frecuentes de B—Talasemia

Tabla IV Página 72 Clasificación clínica de hemoglobino—

patias estructurales

Tabla y Página 102 Resultados hemocitométricos

Tabla VI Página 103 Resultados del Haplotipo

Tabla VII Página 104 Resultados de amplificación por ARMS

Tabla VIII Página 124 Mutaciones puntuales de B-Talasemia

Tabla Ix Página 130 Mutaciones mediterraneas mas frecuen

tes en distintos paises

Tabla X Página 131 Mutaciones en diversos puntos de

España

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