UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID

FACULTAD DE MEDICINA
DEPARTAMENTO DE FARMACOLOGÍA

TESIS DOCTORAL

Determinantes moleculares de la modulación farmacológica de los

canales cardiacos humanos que generan la corriente Iĸ₁

PRESENTADA POR
Pablo Dolz Gaitón

Directores

Eva Delpón Mosquera

Ricardo Caballero Collado
Juan Tamargo Menéndez

Madrid, 2014

©Pablo Dolz Gaitán, 2014

 UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID
FACULTAD DE MEDICINA
DEPARTAMENTO DE FARMACOLOGÍA

DETERMINANTES MOLECULARES DE LA MODULACIÓN

FARMACOLÓGICA DE LOS CANALES CARDIACOS
HUMANOS QUE GENERAN LA CORRIENTE IK1

TESIS DOCTORAL DE
D. Pablo Dolz Gaitón

DIRECTORES

Dra. Eva Delpón Mosquera

Dr. Ricardo Caballero Collado
Dr. Juan Tamargo Menéndez

Madrid, 2014
  
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

A mis padres y a María.

AGRADECIMIENTOS
  
 AGRADECIMIENTOS

 
La principal razón de que esta Tesis Doctoral sea una realidad es que tres profesores de la
Universidad Complutense de Madrid hace ya unos cuantos años escribieron un excelente
proyecto, fruto de su pasión por la farmacología y la electrofisiología. Y gracias a ese
proyecto, pudieron ofrecerme la oportunidad de incorporarme a su grupo de investigación.
Tras cuatro años, puedo decir que jamás había aprendido de nadie tanto en tan poco tiempo.
Por todo ello quiero agradecer a mis directores de tesis, los Profs. Eva Delpón, Juan Tamargo
y Ricardo Caballero.
Por supuesto, sin el esfuerzo y dedicación de mis compañeros de laboratorio estas páginas
no se hubieran llenado de resultados. Se suele decir que el trabajo de investigación es un
trabajo en equipo y nunca ha sido tan cierta esta frase. A los ya doctores, Ricardo Gómez,
Irene Amorós, Adriana Barana y Marta González, les quiero agradecer todas esas horas
metidos en una jaula de Faraday para hacer esta Tesis posible. También quiero agradecer a
mis compañeros Marcos Matamoros, Marta Pérez-Hernández y Mercedes Núñez, que
recientemente se incorporaron, por su dedicación y compañerismo. A Sandra Sacristán y
Paloma Vaquero que saben perfectamente que juegan un papel imprescindible para que el
laboratorio funcione fluidamente.
A mi madre, sin ella jamás habría podido comenzar este viaje. Y a mi padre, pues sin él
me hubiera quedado a mitad de camino. A los dos, gracias por el cariño y el apoyo
incondicional todos estos años. Sois y seguiréis siendo mi ejemplo a seguir. A mi hermana, la
otra doctora; los dos hemos finalizado una etapa muy importante de nuestra vida y sin
embargo, seguimos igual que siempre.
A mis amigos de la terreta, Octavio y Cata, por las interminables tardes al lado del
Chamaerops humilis. A Iván, incondicional, por haberme introducido en mi otra gran pasión:
la música. A Marta y Víctor (ya doctor), por todos esos viajes, hechos y por hacer, que no son
más que una excusa para vernos y comer. A mis amigos madrileños, Camilla, Juan, Luna,
Fer... Habéis conseguido que me sienta como en casa.
A los Profs. Maria Isabel Colado e Ignacio Lizasoain, actual y anterior Director del
Departamento de Farmacología de la Facultad de Medicina de la Universidad Complutense de
Madrid, por haberme acogido amablemente en el Departamento.
A María, pues nunca nadie me dio tanto por tan poco. Si la autoría de un trabajo se
midiese en paciencia y sacrificio, sin duda tu nombre debería estar en la portada. Sólo espero
poder hacer lo mismo cuando te encuentres en mi lugar dentro de unos meses. Ciertamente,
no podría haber escogido mejor compañera de viaje.

  vii  
SUMMARY
  
 SUMMARY
 

INTRODUCTION AND OBJECTIVES

The outward inward rectifying K+ current (IK1) activates during phase 3 of the cardiac
action potential (AP). This current shapes the final phase of the AP and therefore controls the
AP duration (APD) and cardiac refractoriness. IK1 is also the main responsible of maintaining
the membrane potential during phase 4 (i.e., resting potential) in cardiac cells. One of the
most distinctive features of the channels that generate IK1 is the “inward rectification”,
consisting in a large conductance when K+ enters the cell at potentials negative to the K+
reversal potential (EK), but a small one when K+ exits the cell at potentials positive to the EK.
Inward rectification is due to the channel block by polyamine and Mg2+ ions. Moreover,
phosphatidil-4,5-inophosphate (PIP2) is essential to increase the channel open probability. In
human myocardium it has been described the presence of 3 clones that generate IK1: Kir2.1,
2.2 and 2.3. IK1 density is 6-fold higher in ventricles than in atria, a difference that has been
attributed to the non-uniform expression of Kir2.x channels. It has been shown that the main
determinant of human IK1 is the Kir2.1 protein. In fact, loss and gain-of-function mutations of
the gen that codifies this channel (i.e., KCNJ2), produce Andersen-Tawil syndrome and
Short-QT syndrome III, respectively.
Fibrillation, such as atrial (AF) or ventricular (VF), is a fast and turbulent cardiac
electrical activity that leads to the loss of contractile function in myocardium. Nowadays, both
represent a serious healthcare, being AF the most common arrhythmia. It is widely accepted
that these arrhythmias generate by the “re-entry” of a cardiac impulse forming rotors. It has
been shown that an increase in IK1 amplitude leads to an increase in the rotor frequency and
stability. Furthermore, the increase in Kir2.1 channel expression observed in AF has been
identified as one the causes of the limited success of conventional AF treatment with class Ic
antiarrhythmic drugs (i.e., flecainide and propafenone). It has been proposed that the selective
inhibition of atrial IK1 could be a safe and effective alternative for the AF pharmacologic
treatment. Nonetheless, nowadays the molecular determinants of the pharmacologic
modulation of IK1 human channels remain unknown.
Therefore, the main objectives of this Doctoral Thesis were:
1. To analyse the effects of flecainide on the currents of heterologously expressed human
cloned Kir2.1, Kir2.2 and Kir2.3 channels and on human IK1.
2. To identify the probable binding sites of flecainde into the channels and describe the
mechanisms in which this interaction induces the effects described.
3. To analyse the effects of propafenone on the currents of heterologously expressed
human cloned Kir2.1, Kir2.2 and Kir2.3 channels and on human IK1.

xi
 SUMMARY
 

4. To identify the probable binding sites of propafenone into the channels and describe
the mechanisms in which this interaction induces the effects described.

METHODS AND RESULTS

We first studied the effects of flecainide on the currents generated by Kir2.1, 2.2 and 2.3
human cardiac channels transiently transfected on Chinese hamster ovary (CHO) cells, by
using the whole-cell configuration of the patch-clamp technique.
Flecainide increased the current amplitude generated by homo-tetramers of Kir2.1
channels (IKir2.1), an effect more marked at physiological potentials. This effect was not
present in currents generated by homo-tetrameric Kir2.2 or Kir2.3 channels, nor it was when
channels were formed by hetero-tetramers. In both, human and guinea-pig atrial myocytes, no
change in IK1 amplitude was observed when perfused with 1 µM flecainide. However, in
guinea-pig ventricular myocytes, where Kir2.1 channels contribution to IK1 is higher, an
increase in IK1 amplitude was observed when perfused with flecainide.
In single-channel patch-clamp experiments, 1 µM flecainide increased the open
frequency, the open probability and the mean open time significantly, an effect identical to
that produced by an increased PIP2-channel interaction. Flecainide did not modify the current
generated by the low PIP2-affinity mutant, Kir2.1L222I, proving that PIP2 is needed for the
flecainide increasing effect.
Inside-out patch-clamp experiments demosntrated that flecainide produced a rightward
and downward shift of the concentration-effect curve for the spermine blockade, suggesting
that flecainide lowed the channel polyamine affinity by an allosteric modulation. Moreover,
flecainide was unable to increase the current generated Kir2.1 channels with mutations that
determine the polyamine binding.
To identify the flecainide binding site, a molecular model was built using the protein-
crystallized structures of the transmembrane and cytoplasmic domains described by X-ray
diffraction. Blind-docking experiments showed that the lowest energy binding site was
located at the βI-sheet region of the cytoplasmic domain. Manual docking experiments
identified the interaction of flecainide with Cys311. This interaction was corroborated with
site-directed mutation experiments.
Flecainide 1 µM also increased currents generated by WT and Andersen-Tawil syndrome-
related mutated channels upon 24 h incubation.

xii
 SUMMARY
 

A high dose of propafenone (50 µM) decreases significatively both outward and inward
currents generated by homo- and hetero-tetrameric Kir2.1, Kir2.2 and Kir2.3 channels.
Furthermore, it abolishes the inward rectification of the channels, and thus, current at
potentials positive to EK was linear function of the voltage. After analysing the effect of
propafenone on human atrial IK1, we demonstrated that the blockade potency order was
Kir2.3=IK1>Kir2.2>Kir2.1. However, propafenone inhibition of the currents generated by
mutants Kir2.1L222I (a mutant with low PIP2 affinity) and Kir2.3I314L (a mutant with high
PIP2 affinity) was no different to that of the WT channels.
The analysis of Kir2.1 unitary currents by single channel patch-clamp showed only two
peaks on the amplitude histogram on control conditions, corresponding to the open and closed
state, whereas in presence of propafenone, three additional open sub-states were observed.
Inside-out patch-clamp experiments demonstrated that after application of propafenone at
the internal side of the membrane, steady-state block was reached with a slow onset block
time course, similar to that observed when the drug was perfused extracellularly under whole-
cell configuration, suggesting that IKir2.1 inhibition was not due to Kir2.1 pore block.
Moreover, in the presence of propafenone, the time required for the current to decrease by
50% of neomycin-induced rundown was significantly reduced, suggesting that propafenone
weakens channel-PIP2 interaction. In another experiment set, we inhibited the entire current
with neomycin, adding after, increasing concentrations of PIP2 to recover the initial current
amplitude. In presence of propafenone, the agonist effect of PIP2, was significatively lower,
proving that the drug decreases the channel sensitivity to PIP2. It has been shown that mutant
channels that exhibit low polyamines affinity also exhibit low PIP2 affinity. Our results
demonstrated that in nearly all of these mutants propafenone-induced block was significantly
greater than in Kir2.1 WT channels, showing that polyamines could be acting as cofactors
with PIP2.
Blind docking and site-directed mutagenesis experiments demonstrated that propafenone
bound Kir2.x channels at the cytoplasmic domain, close to, but not in the pore itself, the
binding site involving two conserved Arg residues (residues 228 and 260 in Kir2.1). Our
results suggested that propafenone incorporated into the cytoplasmic domain of the channel in
such a way that it decreased the net negative charge sensed by K+ ions and polyamines
which, in turn, promotes the appearance of subconductance levels and the decrease of PIP2
affinity of the channels.

xiii
 SUMMARY
 

CONCLUSIONS

In this Doctoral Thesis we have demonstrated that flecainide increases IKir2.1 with two
simultaneous mechanisms: a) by stimulating PIP2 interaction with the channel and b) by
decreasing the polyamine affinity of the channel, decreasing also the inward rectification.
These effects are achieved allosterically as a consequence of the drug binding to Cys311,
located in the cytoplasmic domain of Kir2.1 channels that is not present in Kir2.2 or Kir2.3,
which justifies the effect selectivity
Besides, propafenone inhibits the current generated by all three human cardiac Kir2
isoforms by a novel mechanism and, to our knowledge, never described before for any other
drug. This mechanism consists in the allosteric binding of propafenone to the cytoplasmic
domain, decreasing the total negative charge that K+ ions and polyamines perceive, which in
turn, promotes the appearance of open channel sub-states and a decrease the channel affinity
to PIP2.

xiv
RESUMEN
  
INTRODUCCIÓN Y OBJETIVOS

La corriente de salida de K+ con rectificación interna (IK1) es una corriente que se

activa durante la fase 3 del potencial de acción (PA) generado en células cardiacas. Esta
corriente determina la fase final de la repolarización y participa, por tanto, en el control
de la duración de los PAs (DPA) y del periodo refractario cardiaco. La IK1 es, además,
la principal responsable del mantenimiento del potencial de membrana durante la fase 4
o de reposo de dichas células cardiacas. Una propiedad muy característica de los canales
que generan la IK1 es la “rectificación interna” que consiste en que los canales presentan
mayor conductancia cuando el K+ entra en la célula a potenciales de membrana más
negativos que el potencial de equilibrio del K+ (EK) que cuando éste sale de la célula a
potenciales más positivos del EK. La rectificación interna se debe al bloqueo del canal
por parte de las poliaminas y del Mg2+. Por otra parte, el fosfatidil-4,5-inofosfato (PIP2)
es indispensable para aumentar la probabilidad de apertura del canal. En el miocardio
humano se ha descrito la presencia de 3 tipos de canales que generan esta corriente:
Kir2.1, 2.2 y 2.3. La densidad de la IK1 es 6 veces mayor en tejido ventricular que en
auricular diferencia que se atribuye a la expresión no uniforme de los clones de los
canales que generan los canales Kir2.x. Se ha observado que la principal determinante
de la IK1 humana es la proteína Kir2.1. De hecho mutaciones tanto de pérdida como de
ganacia de función del gen que lo codifica (KCNJ2) producen el síndrome de Andersen-
Tawil y el síndrome del QT corto tipo 3, respectivamente.
La fibrilación, tanto auricular (FA) como ventricular (FV), es una a la actividad
eléctrica rápida y turbulenta que da lugar a la perdida de función contráctil por parte del
miocardio. En la actualidad ambas representan un importante problema sanitario, siendo
la FA la arritmia con mayor prevalencia. Está ampliamente aceptado que estas arritmias
se generan por la “reentrada” de impulso cardiaco en forma de rotores. Se ha descrito
que el aumento en la amplitud de IK1 provoca un aumento en la frecuencia y la
estabilidad de estos rotores. Además, el aumento en la expresión de los canales Kir2.1
observado en FA se ha se ha identificado como una de las causas del limitado éxito de
la terapéutica convencional de la FA con fármacos antiarrítmicos tipo Ic (flecainida y
propafenona). Se ha propuesto que la inhibición selectiva de la IK1 auricular podría ser
una alternativa eficaz y segura para el tratamiento farmacológico de la FA. Sin
embargo, hoy en día se desconocen los determinantes moleculares de la modulación
farmacológica de los canales que generan la IK1 humana.

xvii
 Por lo tanto, los objetivos de la presente Tesis Doctoral fueron:

1. Analizar los efectos de la flecainida sobre la sobre las corrientes generadas por los
canales Kir2.1, Kir2.2 y Kir2.3 humanos registrados en sistemas de expresión
heterólogos y sobre la IK1 auricular humana.
2. Identificar el/los sitios de unión de la flecainida al canal y describir el mecanismo
mediante el cual dicha unión provoca los efectos observados.
3. Analizar los efectos de la propafenona sobre las corrientes generadas por los
canales Kir2.1, Kir2.2 y Kir2.3 humanos registrados en un sistemas de expresión
heterólogos y sobre la IK1 auricular humana.
4. Identificar el/los sitios de unión de la propafenona al canal y describir el
mecanismo mediante el cuales dicha unión provoca los efectos observados.

MÉTODOS Y RESULTADOS

Estudiamos primero los efectos de la flecainida sobre la corriente generada por los
canales cardiacos humanos de la familia Kir2.x transfectados transitoriamente en células
CHO mediante la técnica de patch-clamp en configuración de célula entera.
La flecainida aumentaba la corriente generada por homotetrámeros de subunidades
Kir2.1 (IKir2.1), efecto que es más acusado a potenciales fisiológicos. Este efecto no se
observó en corrientes generadas por canales homotetraméricos de Kir2.2, Kir2.3, ni
cuando los canales estaban formados por heterotetrámeros. En miocitos auriculares
humanos y de cobayo, no se observaron cambios en la amplitud de IK1, al perfundir con
flecainida 1 µM. Sin embargo en los miocitos ventriculares de cobayo, donde la
contribución de Kir2.1 a la IK1 es mayor, si se observó un aumento de la amplitud de IK1
en presencia de flecainida.
En experimentos de registro de corrientes generadas por un solo canal (single
channel), se observó que en presencia de 1 µM de flecainida la frecuencia de apertura,
la probabilidad de apertura y el tiempo de permanencia en estado abierto del canal
aumentaron significativamente, efecto idéntico al producido por un aumento en la
interacción del PIP2 al canal. La flecainida no modificó la corriente generada por el
mutante de menor afinidad por el PIP2, Kir2.1L222I, demostrando que el PIP2 es
necesario para producir el aumento de corriente inducido por flecainida.

xviii
 Mediante experimentos de parche escindido (inside-out) demostramos que la
flecainida desplaza hacia la derecha y hacia abajo la curva concentración-efecto del
bloqueo producido por espermina, lo que sugiería que la flecainida disminuía la afinidad
del canal por las poliaminas mediante una modulación alostérica. Además, la flecainida
no era capaz de aumentar la corriente generada por canales Kir2.1 con mutaciones
dirigidas en los residuos que determinan la unión de las poliaminas.
Para identificar el sitio receptor de la flecainida se construyó un modelo molecular
de la estructura del canal utilizando las estructuras descritas mediante difracción de
rayos X de las proteínas cristalizadas de los dominios transmembrana y citoplasmáticos.
Los experimentos de docking ciego demostraron que el sitio de unión de más baja
energía correspondía a la región de la hoja βI del dominio citoplasmático. Mediante
experimentos de docking manual se identificó la interacción de la flecainida con la
Cys311. Esta interacción fue corroborada mediante experimentos de mutagénesis
dirigida.
La flecainida 1 µM también aumenta la corriente generada por canales Kir2.1 wild-
type (WT) y con mutaciones que generan síndrome de Andersen-Tawil, tras la
incubación durante 24 h.
La propafenona a dosis altas (50 µΜ) disminuye significativamente las corrientes,
tanto de entrada como de salida, generadas por canales homotetraméricos y
heterotatraméricos de Kir2.1, Kir2.2 y Kir2.3. Además, abole la rectificación interna del
canal, por lo que la corriente a potenciales positivos del EK es una función lineal del
voltaje. Tras analizar el efecto producido en la IK1 de miocitos auriculares humanos, se
demostró que el orden de potencia de bloqueo era la siguiente
Kir2.3=IK1>Kir2.2>Kir2.1. Sin embargo, el bloqueo por propafenona de las corrientes
de los mutantes Kir2.1L222I (un mutante con baja afinidad por el PIP2) como
Kir2.3I213L (un mutante con alta afinidad por el PIP2) no era distinto al de los canales
WT.
Al analizar las corrientes unitarias de Kir2.1 mediante single channel se observaron
sólo 2 picos en el histograma de amplitudes en condiciones control, que corresponden a
los estados abierto y cerrado del canal, mientras que en presencia de propafenona se
observaron 3 sub-estados abiertos adicionales.
Los experimentos de inside-out de Kir2.1 demostraron que tras la perfusión de
propafenona en el lado interno de la membrana, el estado estacionario del bloqueo se
alcanzaba con un curso temporal de bloqueo lento, similar al observado al perfundir el

xix
fármaco extracelularmente en configuración de célula entera, lo que confirma que la
propafenona no bloquea el canal al nivel del poro. Además, en presencia de
propafenona, el tiempo necesario para alcanzar un 50% de reducción de corriente
inducido por neomicina, se redujo significativamente, lo que sugiere que el fármaco
debilita la interacción canal-PIP2. En otro grupo de experimentos, inhibimos toda la
corriente de los parches con neomicina, y posteriormente perfundimos con
concentraciones crecientes de PIP2, para poder recuperar la amplitud de corriente
inicial. En presencia de propafenona, el efecto agonista del PIP2, era significativamente
menor, demostrando que éste fármaco disminuye la sensibilidad del canal al PIP2. Esta
demostrado que los mutantes de Kir2.1 con baja afinidad por poliaminas también
muestran baja afinidad por PIP2. Nuestros resultados demuestran que en casi todos estos
mutantes, el bloqueo inducido por propafenona era significativamente mayor que en
canales Kir2.1 WT, demostrando que las poliaminas podrían estar actuando como
cofactores del PIP2.
Los experimentos de docking ciego y mutagénesis dirigida demostraron que la
propafenona se une a los canales Kir2.x en el dominio citoplasmático, cerca pero no
dentro del poro, en un sitio de unión en el que están implicadas dos Arg conservadas
(R228 y R260 en Kir2.1).

CONCLUSIONES

En la presente Tesis Doctoral hemos demostrado que la flecainida aumenta IKir2.1

por dos mecanismos simultáneos: a) favoreciendo la interacción del PIP2 con el canal y
b) disminuyendo la afinidad de las poliaminas por el mismo lo que disminuye la
rectificación interna de la corriente. Estos efectos son producidos alostéricamente como
consecuencia de la unión a la Cys311 localizada en el dominio citoplasmático de los
canales Kir2.1 que no está presente en los canales Kir2.2 y Kir2.3 lo que justifica la
selectividad de su efecto.
Por otra parte, la propafenona inhibe la corriente generada por las tres isoformas de
Kir2 humanas cardíacas mediante un novedoso mecanismo que no ha sido descrito
antes para ningún otro fármaco. Este mecanismo consiste en la unión alostérica de la
propafenona al dominio citoplasmático, que disminuye la carga negativa total que
perciben los iones K+ y las poliaminas, lo que promueve la aparición de subniveles de
conductancia y disminuye la afinidad del canal por el PIP2.

xx
ÍNDICE
  
 ÍNDICE

I. INTRODUCCIÓN……………………………………………………………….1

1. Electrofisiología cardíaca.......................................................................................................................3
1.1. Excitabilidad....................................................................................................................................4
1.1.1. Transporte de iones a través de la membrana celular ............................................................. 6
1.1.2. El potencial de acción............................................................................................................. 8
1.1.2.a. PA rápidos o dependientes de Na+ ................................................................................ 8
1.1.2.b. PA lentos o dependientes de Ca2+ ............................................................................... 12
1.2. Automatismo....................... .......................................................................................................... 12
1.3. Refractariedad ............................................................................................................................... 13
1.4. Propagación del impulso cardíaco ................................................................................................ 15

2. Canales iónicos dependientes de voltaje implicados en el potencial de acción cardíaco ............... 17

2.1. Canales de Na+ .............................................................................................................................. 17
2.1.1. Estructura de los canales de Na+ .......................................................................................... 17
2.1.2. Características de la INa ........................................................................................................ 20
2.1.3. Canalopatías asociadas a los canales de Na+ cardíacos ........................................................ 21
2.2. Canales de Ca2+ ............................................................................................................................. 22
2.2.1. Estructura de los canales de Ca2+ ......................................................................................... 22
2.2.2. Características de la ICa,L ...................................................................................................... 25
2.2.3. Composición de los canales que generan la ICa,L.................................................................. 26
2.2.4. Canalopatías asociadas al canal de Ca2+ tipo L .................................................................... 27
2.3. Canales de K+ ................................................................................................................................ 27
2.3.1. Canales 6TM/1P……………………………………………………………………………29
2.3.1.a. Estructura de los canales Kv ........................................................................................ 31
I. La subunidad α.............. .................................................................................................. 32
II. Subunidades auxiliares................................................................................................... 34
2.3.1.b. La inactivación de los canales Kv ............................................................................... 37
2.3.1.c. Principales corrientes generadas a través de canales Kv
que intervienen en el PA cardíaco....................................................................................... 38
I. La Ito........................ ......................................................................................................... 38
I.a. Características de la Ito1 ......................................................................................... 39
I.b. Composición de los canales que generan la Ito1 ..................................................... 39
I.c. La Ito1 en diversas patologías .................................................................................. 42

xxiii
 ÍNDICE

II. La IKur…………………………………………………………………………………..43
II.a. Características de la IKur ....................................................................................... 43
II.b. Composición de los canales que generan la IKur ................................................... 44
II.c. La IKur en diversas patologías ................................................................................ 45
III. La IKr …………………………………………………………………………………45
III.a. Características de la IKr ....................................................................................... 46
III.b. Composición de los canales que generan la IKr ................................................... 47
III.c. La IKr en diversas patologías ................................................................................ 48
III.d. Canalopatías asociadas a las subunidades Kv11.1 y MiRP1 .............................. 48
IV. La IKs.............................................................................................................................. 49
IV.a. Características de la IKs........................................................................................ 49
IV.b. Composición de los canales que generan la IKs ................................................... 50
IV.c. Canalopatías asociadas a las subunidades Kv7.1 y minK ................................... 51
2.3.2. Canales 4TM/2P……………………………………………………………………………51

3. Canales 2TM/1P…..…………………………………………………………………………….….....53
3.1. Una familia de canales de K+ con rectificación interna ................................................................ 53
3.2. La rectificación interna en los canales Kir .................................................................................... 55
3.2.1. Propiedades de la rectificación interna “clásica” ................................................................. 55
3.2.2. Mecanismos moleculares de la rectificación interna ............................................................ 56
3.2.3. Determinantes moleculares de la rectificación interna......................................................... 57
3.3. Estructura de los canales Kir ......................................................................................................... 58
3.4. Principales corrientes cardíacas generadas a través de canales Kir .............................................. 68
3.4.1. La IK,ATP...................... .......................................................................................................... 69
3.4.1.a. Características de la IK,ATP ........................................................................................... 69
3.4.1.b. Composición de los canales que generan la IK,ATP ...................................................... 69
3.4.1.c. Regulación de la IK,ATP ................................................................................................. 70
3.4.1.d. La IK,ATP en diversas patologías ................................................................................... 71
3.4.2. La IK,ACh...................... .......................................................................................................... 71
3.4.2.a. Características de la IK,ACh ........................................................................................... 72
3.4.2.b. Composición de los canales que generan la IK,ACh ...................................................... 73
3.4.2.c. Regulación de la IK,ACh ................................................................................................. 73
3.4.3. La IK1............................ ........................................................................................................ 74
3.4.3.a. Rectificación interna y excitabilidad cardíaca ............................................................. 75

xxiv
 ÍNDICE

3.4.3.b. Localización de la IK1 .................................................................................................. 77

3.4.3.c. Composición de los canales que generan la IK1 ........................................................... 79
3.4.3.d. Propiedades de los canales Kir2.x ............................................................................... 80
3.4.3.e. Regulación de la IK1 ..................................................................................................... 82
3.4.3.f. La IK1 en diversas patologías ........................................................................................ 86
3.4.3.g. Canalopatías asociadas a los canales Kir2.1 ................................................................ 88

4. Arritmias fibrilatorias………………………………………………………………………………..91
4.1. Génesis de las arritmias fibrilatorrias............................................................................................ 92
4.2. Dinámica de los rotores.................................................................................................................95
4.3. Formación de los rotores ............................................................................................................... 97
4.4. Papel de la IK1 en el mantenimiento de los rotores ....................................................................... 98
5. Fármacos antiarrítmicos………………………………………………………………………...….101
5.1. Clasificación………………………………………………………………………………...…..102
5.2. Farmacología de los FAA del grupo I………………………………………………………......102
5.2.1. Mecanismo general de acción…………………………………………………………......103
5.2.2. FAA del grupo Ic……………………………………………………………………….....104
5.2.2.a. Acciones farmacológicas………………………………………………………...….105
5.2.2.b. Características farmacocinéticas………………………………………………....….105
5.2.2.c. Aplicaciones terapéuticas……………………………………………………………106
5.2.2.d. Reacciones adversas e interacciones…………………………………………….…..107
5.2.2.e. Efectos sobre las corrientes cardiacas……………………………………………….108

II. JUSTIFICACIÓN Y OBJETIVOS ................................................................................................. 115

III. RESULTADOS................................................................................................................................ 119

1. Flecainide increases Kir2.1 currents by interacting with cysteine 311,

decreasing the poliamine-induced rectification.............................................................................121

2. Propafenone blocks human cardiac Kir2.x channels by

decreasing the negative electrostatic charge in the cytoplasmic pore.........................................139

xxv
 ÍNDICE

IV. DISCUSIÓN ..................................................................................................................................... 155

1. Efectos de la flecainida sobre canales Kir2.x……………………………………………………...157

1.1. La flecainida aumenta la IKir2.1 pero no la IKir2.2 o la IKir2.3……………………………………..157
1.2. La flecainida aumenta la densidad de canales Kir2.1 en la membrana……………………...…157
2. Implicaciones terapéuticas……………………………………………………………………...….159
3. Efectos de la propafenona sobre canales Kir2.x……………………………………………….....161
4. Conclusiones……………………………………………………………………………………...…165

V. CONCLUSIONES ............................................................................................................................ 167

Bibliografía ............................................................................................................................................. 171

xxvi
Abreviaturas
  
 ABREVIATURAS
4-AP: 4-Aminopiridina ΔG: Energía de Gibbs
ACh: Acetilcolina GTP: Guanosín trifosfato
ADN: Ácido desoxirribonucleico [H+]i: Concentración intracelular de protones
ADP: Adenosín difosfato HCN: Canales activados por la hiperpolarización y
AKAP: Proteína de anclaje para la PKA regulados por nucleótidos cíclicos (Hyperpolarization
ARNm: Ácido ribonucleico mensajero activated Cyclic Nucleotide-gated channels)
AsODN: Oligonucleótidos antisentido (Antisense HEK293: Células embrionarias humanas de riñón
oligonucleotides) (Human Embrionic Kidney cells)
ATP: Adenosín trifosfato hERG: Human Ether-à-go-go Related Gene
AV: Aurículo-ventricular HTA: Hipertensión arterial
2+ 2+
[Ca ]e/i: Concentración extra/intracelular de Ca HVA: High-Voltage Activated
CaM: Calmodulina I: Intensidad de corriente macroscópica
2+
CaMKII: Proteína quinasa II dependiente de Ca /CaM i: Intensidad de corriente unitaria
CCh: Carbacol IC50: Concentración que produce la mitad de la
CE50: Concentración que produce la mitad del efecto inhibición máxima observada
máximo observado ICa: Corriente de entrada de Ca2+
CHO: Células de ovario de hámster chino ICa,L/ ICa,T: ICa generada por canales tipo L/tipo T
(Chinese Hamster Ovary cells) IA: Corriente transitoria de salida de K+ en neuronas
Cm: Capacitancia de la membrana celular I f: Corriente hiperpolarizante marcapasos (funny
Cmax: Concentración máxima que alcanza un fármaco current)
en una zona de prueba tras su administración IK1: Corriente de K+ con rectificación interna
C-terminal: Carboxilo-terminal IK,ACh: Corriente de salida de K+ activada por ACh
CTX: Caribdotoxina IK,ATP: Corriente de K+ sensible a ATP
CYP2D6: Citocromo P450 IKir2: Corriente de K+ generada por canales Kir2
D: Dominio IKr: Corriente rectificadora tardía de K+ de activación
DEANO: 2-(N,N-Dietilamino)-diazenolato rápida
DHP: 1,4-Dihidropiridinas IKs: Corriente rectificadora tardía de K+ de activación
DIA: Dominio de interacción α del canal de Ca2+ lenta
DIB: Dominio de interacción β del canal de Ca 2+
IKur: Corriente rectificadora tardía de K+ de activación
DPA: Duración del potencial de acción ultrarrápida
DPAn: DPA medida al n % de la repolarización INa: Corriente de entrada de Na+
DPP: Proteínas dipeptidilpeptidasas INa,L: Corriente tardía de entrada de Na+
DTX: Dendrotoxina INCX: Corriente del intercambiador Na+/Ca2+
ECG: Electrocardiograma [ion]e/i: Concentración extra/intracelular del ion
EK: Potencial de Nernst para el K +
Ito1: Corriente transitoria de salida de K+ cardíaca
Em: Potencial de membrana Ito2: Corriente transitoria de salida de Cl- activada por
ENa: Potencial de Nernst para el Na+ Ca2+
ETA: Receptor de endotelina-1 I-V: Relación intensidad de corriente-voltaje
4
F: Constante de Faraday (9.65x10 C/mol) k: Valor de la pendiente de la curva
fo: Frecuencia de apertura del canal [K+]e/i: Concentración extra/intracelular de K+
FA: Fibrilación auricular KACh: Canales de K+ activados por ACh
FV: Fibrilación ventricular KCa: Canales de K+ activados por Ca2+

xxix
 ABREVIATURAS
KChAP: K+ Channel-Associated Protein SQTC: Síndrome de QT corto
KChIP: Kv Channel Interacting Protein SQTL: Síndrome de QT largo
Kir: Canales de K+ rectificadores internos SUR: Receptor de sulfonilureas
+
Kv: Canales de K dependientes de voltaje τ: Constante de tiempo
LO: Longitud de onda T: Temperatura absoluta
Ltk-: Fibroblastos de ratón carentes de tirosina quinasa TALK: TWIK-related ALkalosis-activated K+ channels
LVA: Low-Voltage Activated TASK: TWIK-related Acid-Sensitive K+ channels
minK: Minimal K+ channel subunit TEA: Tetraetilamonio
MiRP: MinK-Related Peptides THIK: Tandem pore domain Halothane Inhibited K+
mitoKATP: Canal KATP mitocondrial channels
+ +
[Na ]e/i: Concentración extra/intracelular de Na TM: Transmembrana (segmento)
NAB: N-terminal A and B box, también dominio T1 TRAAK: TWIK-Related Arachidonic Acid-stimulated
NBD: Dominios de unión de nucleótidos K+ channels
NCX: Intercambiador Na+/Ca2+ TREK: TWIK-RElated K+ channels
N-terminal: Amino-terminal TTX: Tetrodotoxina
ODC: Ornitina descarboxilasa TVPC: Taquicardia ventricular polimórfica inducida
Pion: Permeabilidad de la membrana a un determinado por
ion catecolaminas
Po: Probabilidad de apertura del canal TWIK: Tandem of P domains in Weak Inward rectifier
PA: Potencial de acción K+ channels
PCR: Reacción en cadena de la polimerasa V: Voltaje
(Polimerase Chain Reaction) VC: Velocidad de conducción
PIP2: Fosfatidilinositol-4,5-bifosfato Vmax: Velocidad máxima de la fase 0
PKA: Proteína quinasa dependiente de AMPc WT: Wild type
PKC: Proteína quinasa C
PMA: Miristato-acetato de forbol
(Phorbol Myristate Acetate)
PR: Potencial de reposo
PRE: Periodo refractario efectivo
Q: Carga
Qss: Quasi-Steady-State del canal KACh
R: Constante universal de los gases (8.31 J/mol·K)
RS: Ritmo sinusal
RyR1: Receptor/canal de rianodina tipo 1
RyR2: Receptor/canal de rianodina tipo 2
SA: Senoauricular
SAMDC: S-adenosilmetionina descarboxilasa
sarcKATP: Canal KATP del sarcolema
SAT: Síndrome de Andersen-Tawil
SJLN: Síndrome de Jervell y Lange-Nielsen
SNC: Sistema nervioso central
SNP: Sistema nervioso periférico

xxx
I. INTRODUCCIÓN
  
 INTRODUCCIÓN

1. ELECTROFISIOLOGÍA CARDIACA

El corazón es un órgano que actúa a modo de bomba, enviando sangre a los distintos
tejidos del organismo. Para llevar a cabo su función presenta tejidos especializados en los que
se generan automáticamente impulsos que se conducen de forma organizada y provocan la
contracción rítmica del miocardio. En el corazón además del tejido muscular auricular y el
ventricular, de los que depende su capacidad contráctil encontramos las fibras del tejido
especializado de conducción, encargadas de la transmisión de los impulsos a través del
corazón.

Nodo SA

Aurícula

Nodo AV

Fibras de
Purkinje

Endocardio

Miocardio
medio
Septo
VI Epicardio
VD

Figura 1. Representación esquemática de la actividad eléctrica en el miocardio. Se observan los potenciales

de acción registrados en diversas zonas del tejido cardíaco y su correlación con el electrocardiograma de
superficie. [Adaptada de Nerbonne y Kass, 2005]

En condiciones fisiológicas, el impulso cardíaco nace en el nodo senoauricular (SA),

estructura que se localiza en la confluencia de la vena cava superior con la orejuela derecha y
la pared lateral de la aurícula derecha (Figura 1). El nodo SA genera unos 60-90 potenciales
de acción (PA) por minuto que se propagan sin disminución de amplitud hasta que todas las

3
 INTRODUCCIÓN

células cardíacas son excitadas. Desde el nodo SA, el impulso se propaga por todo el tejido
auricular a una velocidad de 0.3 m/s para, a continuación, llegar al nodo aurículo-ventricular
(AV), única vía que permite la comunicación eléctrica entre aurículas y ventrículos en
condiciones fisiológicas. En el nodo AV, el estímulo se ralentiza antes de pasar al ventrículo
(0.01-0.05 m/s). El impulso pasa después a las fibras de transición y al sistema de His-
Purkinje, a través del cual se conduce muy rápidamente (2-4 m/s). El haz de His se bifurca en
una rama derecha y varias izquierdas, que acaban ramificándose profusamente en fibras de
Purkinje, desde donde la activación se extiende por el músculo ventricular, empezando por el
septo medio izquierdo y la base de los músculos papilares y, de ahí, al resto de los ventrículos.
La rápida velocidad de conducción intraventricular (0.3-4 m/s) tiene como misión permitir
que ambos ventrículos se contraigan de forma sincrónica en un corto espacio de tiempo, algo
esencial para que se realice de forma eficaz la función de bomba (Hoffman y Cranefield,
1960; Delpón y Tamargo, 2010).
Para comprender este complejo mecanismo, que se repite con cada latido, es necesario
conocer algunas propiedades de las células cardíacas tales como la excitabilidad, el
automatismo, la refractariedad y la conducción del impulso cardíaco.

1.1. Excitabilidad

La membrana citoplásmica es una barrera que separa dos medios acuosos de diferente
composición. Esta diferencia en la composición de ambos medios origina un gradiente de
concentración que induce la difusión de moléculas desde el medio donde están más
concentradas hacia el medio en el que lo están menos (Tabla 1). Termodinámicamente, la
difusión es un proceso que disminuye el orden del sistema (es decir, que aumenta su
entropía), lo que implica que la difusión libera energía. Nernst cuantificó esta energía como
una variación de potencial eléctrico:

(1) ∆G = –R·T·ln([ion]e/[ion]i)

donde ∆G es la energía de Gibbs liberada en el proceso de difusión, R es la constante

universal de los gases (8.31 J/mol·K), T es la temperatura absoluta y [ion]e e [ion]i son las
concentraciones extra e intracelulares del ion que difunde.
Así, si la membrana es únicamenente permeable al K+, éste difundirá desde el interior
(donde está más concentrado) hacia el exterior de la célula (donde está menos concentrado),
por lo que el interior se tornará más negativo, con lo que volverá a atraer iones K+ hacia el
interior de la célula. La energía de atracción también puede cuantificarse:

4
 INTRODUCCIÓN

(2) ∆G = –E·z·F

donde E es el potencial transmembrana, z es la valencia del ion en cuestión y F es la constante

de Faraday (9.65x104 C/mol). Con la salida progresiva de K+ de la célula, llega un punto en el
que el gradiente eléctrico se iguala al gradiente químico (de concentración) que causa la
difusión:

(3) E·z·F = R·T·ln([ion]e/[ion]i)

Reordenando los términos de la igualdad, se obtiene la “ecuación de Nernst” (Nernst,

1888):

(4) E = (R·T/z·F)·ln([ion]e/[ion]i)

El potencial al que el flujo neto a través de la membrana de un ion es nulo recibe el

nombre de “potencial de equilibrio” (Tabla 1) y su valor viene dado por la ecuación de
Nernst.

Ion [Ion]e (mM) [Ion]i (mM) Potencial de equilibrio

+
Na 135-145 12 +67
+
K 3.5-5 155 -96
-
Cl 123 4.2 -90
Ca2+ 1.5 10-4 +129

Tabla 1. Concentraciones extra e intracelulares de los principales iones en condiciones fisiológicas. Los
potenciales de equilibrio para cada ion se han obtenido mediante la ecuación de Nernst para una temperatura de
37ºC.

La diferencia de potencial que existe a ambos lados de la membrana se denomina

potencial de membrana (Em) y viene determinada por la concentración de iones a uno y a otro
lado de la misma, así como por la permeabilidad de la membrana a cada ion (Hoffman y
Cranefield, 1960). En condiciones normales, las células musculares auriculares y
ventriculares presentan un Em de aproximadamente -85 mV, mientras que en las células de los
nodos SA y AV el Em es de entre -45 y -65 mV. En las células auriculares y ventriculares el
valor del Em se mantiene constante si la célula no se estimula. A esta diferencia de potencial
se le denomina potencial de reposo (PR) y está determinado por el equilibrio entre la
capacidad de los distintos iones para atravesar la membrana a favor de su gradiente de
concentración y el transporte activo de dichos iones en contra de su gradiente. Pero, además,
algunas células como las nerviosas y las musculares son excitables: son capaces de variar esta
diferencia de potencial generando impulsos eléctricos (o PA) en respuesta a un estímulo

5
 INTRODUCCIÓN

mediante el intercambio de iones entre los medios intra y extracelular. En el miocardio, estos
impulsos se propagan para convertirse en el factor determinante de la contracción rítmica del
corazón. El control del intercambio iónico resulta además esencial para evitar una excesiva
presión osmótica debida a los cambios en la osmolaridad de ambos medios.
Si la membrana de las células cardíacas sólo fuera permeable al K+, el Em debería alcanzar
un valor similar al del potencial de equilibrio para el K+ (EK). Sin embargo, el valor del Em es
menos negativo que el del EK debido a que la membrana es además permeable a otros iones.
Cuando una membrana es permeable a varios iones, el Em depende de tres factores: la
polaridad de la carga eléctrica de cada ion, la permeabilidad de la membrana (Pion) a cada ion
y la concentración de estos iones a ambos lados de la membrana. Por tanto, la ecuación que
define el Em en las células permeables al Na+, al Cl- y al K+, denominada “ecuación de campo
constante” o “ecuación de Goldman-Hodgkin-Katz” (Goldman, 1943; Hodgkin y Katz, 1949),
es:

+ + −
 RT   ([ K ]e PK + [ Na ]e PNa + [Cl ]e PCl ) 
(5) Em =   
ln + + − 
 Fz   ([ K ]i PK + [ Na ]i PNa + [Cl ]i PCl ) 

donde PK, PNa y PCl representan la permeabilidad de la membrana al K+, al Na+ y al Cl-,
respectivamente.

1.1.1. Transporte de iones a través de la membrana celular

En condiciones de reposo, el Na+ y el Ca2+ están más concentrados en el medio

extracelular, mientras que el K+ y los aniones orgánicos son los que predominan en el medio
intracelular. El transporte de iones a través de la membrana se produce a favor de gradiente de
concentración (sin gasto de energía) o en contra de gradiente (y, por lo tanto, con gasto
energético) y requiere de sistemas especializados de transporte como los canales iónicos o las
proteínas transportadoras.
Los canales iónicos son proteínas transmembrana (TM) cuyas principales funciones son:
• Formar poros hidrófilos a través de los cuales los iones atraviesan la membrana a favor de
gradiente de concentración y de potencial eléctrico (gradiente electroquímico), permitiendo el
paso de iones masivamente (hasta 108 iones/s) y generando una corriente iónica.
• Discriminar los iones que pasan a su través, gracias a un filtro de selectividad. El
mecanismo de selectividad se basa tanto en el tamaño del ion en su forma hidratada como en

6
 INTRODUCCIÓN

su carga, de modo que ciertos residuos del canal se alinean en el poro e interaccionan con los
iones formando barreras termodinámicas que favorecen el paso de unos iones frente a otros.
• Controlar la permeabilidad de la membrana a cada ion mediante la transición entre los
diferentes estados del canal (abierto-conductor y cerrado e inactivo-no conductor). Los
cambios conformacionales de la proteína entre los distintos estados (“gating” del canal) se
producen de forma muy rápida (<10 µs). Según el estímulo que origine estos cambios
conformacionales, los canales se clasifican en canales dependientes de voltaje (dependen del
Em), canales activados por ligando (el proceso de apertura y cierre depende de la unión de
moduladores externos como hormonas o neurotransmisores) y canales operados por segundos
mensajeros (el gating está regulado por factores intracelulares como el Ca2+ o subunidades de
proteínas G). En el caso de los canales dependientes de voltaje, la proteína presenta una serie
de aminoácidos que se encuentran cargados a pH fisiológico y que se mueven en un campo
eléctrico muy limitado y confinado en la bicapa lipídica de la membrana celular, originando
unas corrientes que se denominan corrientes de gating (Armstrong y Bezanilla, 1973;
Armstrong, 1974) y cuya magnitud es muy pequeña, ya que en este proceso se produce un
desplazamiento de carga equivalente al movimiento lineal de ≈12–13 electrones (Schoppa y
cols., 1992; Hirschberg y cols., 1995).
Las proteínas transportadoras facilitan el movimiento de pequeñas moléculas a través de
la membrana. Estas proteínas sólo pueden fijar una o unas pocas moléculas al mismo tiempo
para transferirlas al otro lado de la membrana, por lo que la velocidad de transporte es más
lenta que la de los canales iónicos (102-104 moléculas/s). Dentro de este grupo se encuentran
proteínas como las bombas iónicas o los cotransportadores:
• Las bombas iónicas son enzimas de membrana que utilizan la energía liberada en la
hidrólisis del adenosín trifosfato (ATP) para transportar iones a través de la membrana en
contra de gradiente en un proceso denominado “transporte activo”. Debido a su mecanismo,
se denominan ATPasas.
• Los cotransportadores o intercambiadores, al igual que las bombas iónicas, trasladan
moléculas en contra de su gradiente de concentración, aunque en este caso la energía que
alimenta el proceso procede de la difusión de otras moléculas, normalmente iones Na+. Si los
iones Na+ se mueven en la misma dirección que la molécula transportada se habla de un
cotransportador, mientras que si se mueven en dirección contraria se habla de un
intercambiador. Posteriormente, las ATPasas se encargan de restaurar el gradiente de Na+. Por
este motivo, a este proceso se le denomina “transporte activo secundario”.

7
 INTRODUCCIÓN

1.1.2. El Potencial de acción

Las células cardíacas son excitables, es decir, cuando reciben un estímulo de intensidad
suficiente para superar el potencial umbral, generan una respuesta eléctrica o PA al que se
acopla la respuesta contráctil. Por el contrario, cuando no se alcanza el potencial umbral, sólo
se genera una respuesta local que no se propaga a las células colindantes: es un estímulo “todo
o nada”. El PA es un cambio transitorio en la polaridad de la membrana resultante de
múltiples cambios secuenciales en la permeabilidad de la misma a los diferentes iones. La
entrada de cargas positivas en la célula produce la despolarización, con lo que el interior de la
célula va haciéndose más positivo (en su valor máximo, el potencial puede alcanzar valores
cercanos a +40 mV), mientras que la salida de cargas positivas es responsable de la
repolarización.

Parámetro PA Na+-dependiente PA Ca2+-dependiente

Corriente despolarizante en la fase 0 INa ICa
Potencial de reposo (mV) -85 a -90 -45 a -65
Velocidad de conducción (m/s) 0.5-4 0.01-0.1
Amplitud del PA (mV) 100-130 40-85
Velocidad máxima de despolarización 200-1000 2-15
(mV/s)
Factor de seguridad Alto Bajo
Se abole por TTX, anestésicos locales, Verapamilo, diltiazem, DHP,
antiarrítmicos grupo I Ni2+, Co2+, Mn2+, La3+
Tabla 2. Características de los PA rápidos y lentos. TTX: Tetrodotoxina. DHP: Dihidropiridinas.

En el corazón se registran PA de diversos tipos (Figura 1). En las células auriculares y

ventriculares y en las células del sistema de His-Purkinje la despolarización es debida a la
rápida entrada de iones de Na+, mientras que en las células de los nodos SA y AV la
despolarización es debida a la lenta entrada de iones de Ca2+. Por lo tanto, en el corazón
existen células que generan PA rápidos o “dependientes de Na+” y células que generan PA
lentos o “dependientes de Ca2+” (Tabla 2) (Coraboeuf y Otsuka, 1956; Beeler y Reuter, 1977;
Carmeliet y Vereecke, 1979).

1.1.2.a. PA rápidos o dependientes de Na+

Los PA rápidos o dependientes de Na+ presentan 5 fases (Figura 2) (Hoffman y

Cranefield, 1960; Nattel, 2002; Delpón y Tamargo, 2010).

8
 INTRODUCCIÓN

Fase 1 I
Na,L ICa,L
Fase 2
Ito
0 mV
IKur
Fase 3
IKr
Fase 0

IKs
INa
IK1

-85 mV Fase 4

Figura 2. PA auricular rápido o “dependiente de Na+”. Representación esquemática de las distintas fases del
PA, donde se representan las diversas corrientes iónicas de entrada y de salida implicadas en el mismo.

La fase 0 de rápida despolarización de las células miocárdicas se debe a la apertura de los

canales de Na+ dependientes de voltaje y, por lo tanto, a la activación de la corriente rápida de
entrada de Na+ (INa), que desplaza el potencial de membrana desde sus valores en reposo (PR
≈-85 mV) hasta valores positivos (≈+30 mV). La activación de la INa es un proceso muy
rápido (0.5-2 ms) y su inactivación sigue una cinética biexponencial, con un componente
lento (INa,L) que se prolonga durante varios cientos de ms y que contribuye al mantenimiento
de la fase 2 del PA. La magnitud de la INa determina la amplitud, la velocidad máxima de
despolarización del PA y, por lo tanto, la velocidad de conducción intracardíaca (Hondeghem,
1978; Walton y Fozzard, 1979; Hille, 2001). A continuación, comienza la repolarización
celular, en la que se distinguen 3 fases.
La fase 1 de rápida repolarización es consecuencia de la inactivación de la INa (paso del
canal a una conformación no conductora) y de la activación de dos corrientes de salida de K+
dependientes de voltaje: a) la corriente transitoria (Ito1), que se activa e inactiva rápidamente y
que juega un papel fundamental en el control de la duración del PA (DPA) sobre todo a nivel
auricular y del epicardio ventricular (Boyett, 1981; Josephson y cols., 1984; Giles e Imaizumi,
1988; Shibata y cols., 1989) y b) el componente ultrarrápido de la corriente rectificadora
tardía, de rápida activación y lenta inactivación (IKur), que es específicamente auricular
(Fedida y cols., 1993; Snyders y cols., 1993; Wang y cols., 1993a).
La fase 2 (o fase de meseta) representa el delicado equilibrio entre dos corrientes de
entrada, la INa,L (Rudy, 1978; Saikawa y Carmeliet, 1982; Clarkson y cols., 1984; Gintant y
cols., 1984; Patlak y Ortiz, 1985) y la corriente de entrada de Ca2+ tipo L (ICa,L) (Nilius y
cols., 1985; Bean, 1989; Bers y Pérez-Reyes, 1999), y tres corrientes rectificadoras tardías de
salida de K+ de activación ultrarrápida, rápida y lenta (IKur, IKr e IKs, respectivamente)

9
 INTRODUCCIÓN

(Sanguinetti y Jurkiewicz, 1990 y 1991; Wang y cols., 1993a y 1994).

Durante la fase 3, la inactivación de las corrientes de entrada provoca el predominio de las
corrientes repolarizantes de K+ activadas durante la fase 2 y, como consecuencia, el Em
alcanza de nuevo el valor del PR. Además, durante esta fase se produce la salida de K+ a
través de canales que presentan rectificación interna (IK1), lo que acelera la fase final de la
repolarización (Carmeliet, 1993; Lopatin y Nichols, 2001). En las células auriculares, del
sistema His-Purkinje y en los nodos SA y AV, la acetilcolina (ACh) y la adenosina se unen a
sus respectivos receptores (muscarínico M2 y de adenosina A1, ambos acoplados a proteínas
Gi) activando otra corriente que presenta rectificación interna, la corriente de K+ activada por
ACh (IK,ACh) (Sakmann y cols., 1983). La activación de la IK,ACh en las células auriculares
hiperpolariza el Em y acorta marcadamente la DPA (Shen y Kurachi, 1995; Pelleg y
Belardinelli, 1993).
La fase 4 del PA se inicia una vez que el potencial de la célula alcanza de nuevo su valor
de reposo y finaliza al comienzo del siguiente PA. En las células musculares auriculares y
ventriculares esta fase es isoeléctrica y, por lo tanto, el Em se mantiene constante durante el
periodo comprendido entre el final de un PA y el comienzo del siguiente. El mantenimiento
del Em en niveles constantes durante la fase 4 se debe principalmente a la IK1 (Carmeliet,
1993; Lopatin y Nichols, 2001; Anumonwo y Lopatin, 2010), aunque también participan la
activación de la ATPasa dependiente de Na+ y K+ y el intercambiador Na+/Ca2+ (NCX).
En la Figura 3 se muestran todas las corrientes implicadas en la génesis y en el
mantenimiento del PA cardiaco en células auriculares y ventriculares. Al comparar la
morfología de los PA auriculares y ventriculares se observa que la DPA es mayor en células
ventriculares, lo que constituye un mecanismo protector que evita que las primeras puedan
responder a frecuencias auriculares muy rápidas o a una estimulación prematura del corazón.
Dentro del tejido auricular y ventricular se han identificado diferencias en la morfología y en
la duración de los PAs (Figuras 1 y 3), lo que ha sido atribuido a la diferencia de densidad y
del tipo de canal iónico expresado.
Clásicamente, al menos dos tipos de PA han sido registrados en preparaciones de aurícula
derecha AD humana: uno con un pico prominente de repolarización rápida, seguido por una
meseta y otro sin pico, y con una fase de meseta de mayor duración (Trautwein y cols., 1962;
Gelband y cols., 1972). Más recientemente, se han identificado 3 tipos celulares en AD
humana en cuanto a la morfología de su PA. Las distintas morfologías se han asociado a
diferencias en las corrientes de K+ implicadas en la repolarización. (Figura 4) (Wang y cols.,
1993a, Caballero y cols., 2010).

10
 INTRODUCCIÓN

Figura 3. Representación esquemática de PA auriculares y ventriculares con las respectivas corrientes iónicas
que determinan su morfología. [Adaptada de Roberts, 2006]

TIPO 1 TIPO 2 TIPO 3

Figura 4. Caracterización de tres tipos de PA registrados en miocitos auriculares humanos. [Adaptada de Wang
y cols., 1993].

11
 INTRODUCCIÓN

1.1.2.b. PA lentos o dependientes de Ca2+

Los PA dependientes de Ca2+ se generan en las células de los nodos SA y AV, cuyo PR es
de ≈ -55 mV) (Figura 5). A este potencial, la INa está totalmente inactivada, por lo que la fase
0 de los PA en estas células se debe a la entrada de Ca2+ a través de los canales de Ca2+ tipo L.
También se generan PA dependientes de Ca2+ en las células de los anillos de las válvulas
mitral y tricúspide y en células anormalmente despolarizadas (Reuter, 1973; Cranefield y
Aronson, 1975).

Fase 0

Potencial umbral

Fase 4
Potencial diastólico máximo

If

Figura 5. PA lento o “dependiente de Ca2+”. Representación esquemática de las distintas fases del PA,
donde se representan las diversas corrientes iónicas de enrada y de salida implicadas en el mismo.

La activación de la ICa,L es mucho más lenta que la de la INa, por lo que la amplitud de los
PA dependientes de Ca2+ es menor (≈70-80 mV) y su propagación mucho más lenta (0,02-
0,05 m/s), lo que explica su denominación de PA lentos (Isenberg y Klockner, 1982; Noble,
1984). La fase 2 (de meseta) se debe a un equilibrio entre la inactivación de la ICa,L y la
activación de la IKr, y la fase 3 (de rápida repolarización) se debe a la activación de las
corrientes de K+ rectificadoras tardías.

1.2. Automatismo

Aunque todos los miocitos cardiacos son excitables y responden a los estímulos eléctricos
generando PA, algunos, además, presentan actividad automática intrínseca, es decir, son
capaces de generar PA de forma espontánea. En condiciones fisiológicas, las células de los
nodos SA y AV, de los tractos internodales auriculares y del sistema especializado de
conducción His-Purkinje presentan actividad automática, careciendo de ella las células
musculares auriculares y ventriculares (Hoffman y Cranefield, 1960). Los PA generados en

12
 INTRODUCCIÓN

estas estructuras presentan una fase 4 de lenta despolarización diastólica que desplaza el nivel
del Em hasta el nivel de potencial umbral y cuando éste se alcanza, se genera un nuevo PA
propagado. La frecuencia de disparo de una célula automática depende del potencial
diastólico máximo, del nivel de potencial umbral y de la pendiente de la fase 4 de lenta
despolarización diastólica (Figura 5).
Una característica de las células automáticas dependientes de Na+ es que cuando son
estimuladas a una frecuencia mayor a la suya, tanto la inclinación de la fase 4 como la
frecuencia de disparo disminuyen. Esta característica se denomina “supresión por
sobreestimulación” (Hoffman y Cranefield, 1960). En condiciones fisiológicas, las células del
nodo SA generan PA a mayor frecuencia que las restantes células automáticas (60-80
latidos/min frente a ≈15 latidos/min), por lo que actúan como marcapasos dominante y
determinan la frecuencia cardíaca, mientras que las demás células automáticas actúan como
“marcapasos latentes o subsidiarios”.
El mecanismo responsable de la fase 4 de lenta despolarización diastólica varía en los
distintos tejidos cardíacos automáticos. En las células del sistema His-Purkinje esta fase se
debe a la activación mantenida de la corriente hiperpolarizante marcapasos o “funny current”
(If), una corriente de entrada de Na+ y K+ generada a través de canales activados por la
hiperpolarización y regulados por nucleótidos cíclicos (canales HCN, hyperpolarization-
activated cyclic nucleotide-gated), y a la reducción de la IK previamente activada durante la
fase 3 del PA. La If se activa durante la fase 3 cuando el Em se hace más negativo de -50 mV
(DiFrancesco, 2006; Baruscotti y cols., 2010). En las células de los nodos SA y AV, cuando
el Em alcanza valores de -50 mV se activa, además de la If, la corriente de entrada de Ca2+ a
través de los canales tipo T (ICa,T), lo que acelera la fase final de la despolarización diastólica
(Irisawa y Hagiwara, 1988). Finalmente, cuando se alcanza el potencial umbral, se activa la
ICa,L, que es la corriente responsable de la fase 0 del PA en estas células.

1.3. Refractariedad

Desde hace más de 150 años se sabe que el corazón requiere cierto tiempo para recuperar
la excitabilidad tras un primer estímulo, tiempo que se conoce como “periodo refractario”
(Bowditch, 1871).
En las células que generan PA dependientes de Na+, el periodo refractario viene
determinado por la cinética de reactivación de la INa. Los canales de Na+ permanecen en
estado de reposo durante la diástole (fase 4), se abren durante la fase 0 del PA y, a
continuación, pasan a un estado inactivo no conductor en el que permanecen hasta que la

13
 INTRODUCCIÓN

repolarización alcanza valores más negativos de -50 mV. Dado que el estado inactivo no
permite la entrada de Na+, la aplicación de un estímulo durante las fases 1 y 2 y el comienzo
de la fase 3 es incapaz de generar una respuesta propagada. Al periodo de tiempo durante el
que la célula cardíaca es incapaz de generar un PA y permanece inexcitable se le denomina
“periodo refractario absoluto” (Weidmann, 1955; Hoffman y Cranefield, 1960; Hondeghem y
Katzung, 1977). Conforme el Em se repolariza entre -50 y -90 mV, cierta proporción de los
canales de Na+ pasan del estado inactivo al estado de reposo y, por lo tanto, la aplicación de
un estímulo eléctrico es capaz de generar una respuesta. Esta respuesta tendrá menor amplitud
y se conducirá más lentamente. Por lo tanto, existe un periodo de tiempo durante el cual la
célula es excitable, pero en el que aún no ha recuperado la excitabilidad completamente.
Durante este periodo de tiempo, denominado “periodo refractario efectivo”, un estímulo
supraumbral puede producir una respuesta local, pero no un PA propagado (Hoffman y
Cranefield, 1960). Al periodo refractario efectivo le sigue otro periodo de tiempo durante el
cual un estímulo es capaz de inducir la génesis de un PA propagado, denominado “periodo
refractario relativo”. A este nivel, la INa todavía no se ha reactivado por completo, por lo que
si en este momento se genera un PA prematuro, éste va a presentar menor amplitud y una
duración más corta que un PA generado cuando la célula se ha repolarizado y recuperado por
completo su excitabilidad. La duración del periodo refractario cardíaco determina la máxima
frecuencia de estimulación cardíaca y varía con la DPA. Las células auriculares presentan una
menor duración del PA y del periodo refractario que las ventriculares (≈200 ms en las
primeras frente a los ≈300 ms de las segundas), lo que explica por qué la frecuencia de las
arritmias supraventriculares es mayor que la de las ventriculares. El periodo refractario
protege al corazón de aquellas situaciones en las que la frecuencia es muy rápida, y en las que,
por tanto, se impide la relajación completa del músculo cardíaco, disminuyendo su función de
bomba.
En los nodos SA y AV, la fase 0 del PA es debida a la activación de la ICa,L, corriente que
presenta una constante de tiempo de reactivación de entre 100 y 300 ms (Gettes y Reuter,
1974; Bers y Pérez-Reyes, 1999). Por ello, no es posible generar un nuevo PA propagado
incluso hasta después de que la célula se haya repolarizado por completo, es decir, que el
periodo refractario efectivo se prolonga más allá de la DPA. A este fenómeno se le denomina
“refractariedad posrepolarización” (Trautwein y Uchizono, 1963).

14
 INTRODUCCIÓN

1.4. Propagación del impulso cardíaco

La propagación del impuso cardíaco es un fenómeno complejo que depende no sólo del
tipo, tamaño, orientación y geometría de las células cardíacas, sino también de las
propiedades activas y pasivas de la membrana. Las propiedades activas están determinadas
por los mecanismos iónicos dependientes de voltaje y de tiempo que controlan la
excitabilidad y la refractariedad. Por otro lado, la conducción del impulso cardíaco dependerá
del acoplamiento intercelular y de las propiedades de cable de la membrana (resistencia y
capacitancia), esto es, de las propiedades pasivas de la membrana.
Biofísicamente, la membrana es un elemento dieléctrico que aísla dos medios
conductores. Sin embargo, este aislamiento no es perfecto, ya que existen mecanismos de
transporte de iones, por lo que la resistencia al paso de cargas que ofrece la membrana ante
una diferencia de potencial es finita y mesurable. Además, el dieléctrico (en este caso, los
fosfolípidos de la membrana) que aísla los medios extra e intracelular está sometido a una
diferencia de potencial en la membrana, por lo que atrae cargas a las proximidades de la
membrana (los aniones del citosol serán atraídos por el exterior positivo y los cationes del
medio extracelular son atraídos por el interior negativo). En estas condiciones, la membrana
está acumulando carga según la ecuación:

(6) Q = Em · C m

donde Q es la carga acumulada y Cm la capacitancia de la membrana, que depende de las

propiedades dieléctricas de la bicapa lipídica y de la geometría de la membrana. La Cm
impone un retraso en la variación del voltaje y en la propagación del estímulo, ya que
cualquier variación en el Em debe vencer primero la carga acumulada en la membrana.
Los miocitos cardíacos están unidos entre sí por los discos intercalares, que permiten el
acoplamiento eléctrico, y por los desmosomas, uniones especializadas que facilitan el
acoplamiento contráctil. Estas uniones permiten que el miocardio funcione como un sincitio
funcional. Este acoplamiento se realiza a través de uniones de baja resistencia (1-3 Ω·cm2,
unas 700 veces menor que la de la resistencia externa de la membrana), a las que se denomina
“uniones estrechas” (gap junctions). En condiciones fisiológicas, la resistencia longitudinal o
intracelular, determinada por las uniones estrechas y el citoplasma, es mínima, lo que permite
un acoplamiento célula-célula que facilita la propagación sincrónica del impulso cardíaco.

15
 INTRODUCCIÓN

+30 mV
0 mV

-85 mV
-----------------++----------------
Miocitos
cardíacos -85 mV +30 mV -85 mV

Sentido de la conducción

Figura 6. Representación esquemática de la propagación del impulso cardiaco

El impulso cardíaco se genera en el nodo SA y se propaga de forma electrotónica a las

células excitables vecinas, desplazando su nivel de Em hasta el nivel de potencial de
membrana de la célula vecina ya excitada. Cuando esto sucede, se genera un nuevo PA, que a
su vez despolarizará electrotónicamente las células vecinas hasta el nivel de potencial umbral
produciendo la génesis de un nuevo PA y así sucesivamente (Figura 6). La capacidad del PA
propagado para desplazar el PR de una célula adyacente hasta el potencial umbral y generar
un nuevo PA se denomina “factor de seguridad”. Cuanto mayor sea la amplitud de la INa que
genera el PA, mayor será la velocidad de conducción con que éste se conducirá por el
miocardio y, por lo tanto, mayor será el factor de seguridad de propagación del impulso
cardíaco. Por el contrario, en todas aquellas situaciones en las que la INa esté parcialmente
inhibida, en aquellas células que generen PA dependientes de Ca2+, o tras la estimulación
prematura, el factor de seguridad de propagación del impulso será menor (Delpón y
Tamargo, 2010). El bloqueo de la conducción en cualquiera de estas situaciones propicia la
aparición de arritmias por reentrada.
Una vez que los impulsos salen del nodo SA, se propagan con rapidez a toda la aurícula,
produciendo la sístole auricular. A su paso a través del nodo AV, la propagación se ralentiza,
lo que permite que la contracción auricular impulse la sangre hacia los ventrículos,
optimizando el gasto cardíaco y reduciendo la posibilidad de que queden remanentes
sanguíneos en la aurícula. Una vez que los impulsos salen del nodo AV, entran en el sistema
de conducción, donde la propagación es más rápida, permitiendo finalmente la contracción
ventricular coordinada.
La actividad eléctrica cardiaca tiene su reflejo en el electrocardiograma (ECG),
exisitiendo una relación entre los intervalos del ECG y las secuencias de activación y
repolarización. La activación auricular (fase 0 de los PAs) corresponde a la onda P, y la
ventricular, al complejo QRS, cuya duración es inversamente proporcional a la velocidad de

16
 INTRODUCCIÓN

conducción intraventricular. El intervalo PR refleja el tiempo de conducción a través del nodo

AV, el haz de His y sus ramas, y se prolonga cuando disminuye la velocidad de conducción
en dichas estructuras. La duración del intervalo QT refleja el tiempo de repolarización
ventricular (Figura 1).

2. CANALES IÓNICOS DEPENDIENTES DE VOLTAJE IMPLICADOS EN EL PA

CARDÍACO

2.1. Canales de Na+

Los canales de Na+ dependientes de voltaje son fundamentales en la génesis y

propagación de la señal eléctrica en tejidos excitables como el corazón, el músculo
esquelético o el sistema nervioso (Hodgkin y Huxley, 1952a y b; Catterall, 2000; Yu y
Catterall, 2003; George, 2005).
El canal de Na+ presenta, al menos, tres estados conformacionales: reposo, activo e
inactivo. Durante la diástole, el canal se encuentra en estado de reposo y la probabilidad de
que se abra es extremadamente baja. La despolarización de la membrana produce un cambio
conformacional en la estructura del canal que causa su apertura durante 1-2 ms, generándose
una corriente rápida de entrada de Na+. A continuación, el canal se inactiva rápidamente, lo
que produce el cese de la entrada de Na+ (Catterall, 2000; Yu y Catterall, 2003). El paso desde
el estado inactivo hasta el estado de reposo se denomina “reactivación del canal” y es un
proceso necesario para que el canal pueda volver a abrirse. En situación fisiológica, esta
transición tiene lugar durante los primeros 50-100 ms de la diástole por lo que, considerando
que en ritmo sinusal (RS) el intervalo diastólico es de entre 500 y 700 ms, cuando llega el
siguiente latido la mayoría de los canales ya están en estado de reposo y, por lo tanto,
preparados para volver a abrirse (Catterall, 2000; Yu y Catterall, 2003). Además, el canal de
Na+ es la diana farmacológica de los anestésicos locales y de los fármacos antiarrítmicos del
grupo I que, a las concentraciones empleadas en terapéutica, se unen con mayor afinidad a los
estados abierto e inactivo del mismo (Catterall, 2000; Yu y Catterall, 2003).

2.1.1. Estructura de los canales de Na+

Los canales de Na+ dependientes de voltaje están compuestos por una subunidad
conductora α (de la que se han caracterizado 12 isoformas) y una o varias subunidades

17
 INTRODUCCIÓN

accesorias β (β1 a β4) (Figura 7 y Tabla 3) (Catterall, 2000; Goldin, 2002; Catterall y cols.,
2005a; George, 2005; Abriel, 2010).

Subunidad α Subunidad β
Gen Proteína Cromosoma Tejido Gen Proteína Cromosoma Tejido
SCN1A Nav1.1* (α1) 2q24 SNC SCN1B Navβ1.1* (β1) 19q11 SNC
SCN2A Nav1.2 (α2) 2q23 SNC SCN2B Navβ2.1* (β2) 11q24 SNC
SCN3A Nav1.3* (α3) 2q24 SNC SCN3B Navβ3.1* (β3) 11q26 SNC
SCN4A Nav1.4* (α4) 17q21 ME SCN4B Navβ4.1 (β4) 11q24 SNC
SCN5A Nav1.5* (α5) 3p21 MC
SCN6A Nav2.1* (α6) 2q21-23 Útero
SCN7A α7 2q36-37 SNC
SCN8A Nav1.6* (α8) 2q13 SNC
SCN9A Nav1.7 2q24 T
SCN10A Nav1.8 3p22 SNP
SCN11A Nav1.9 3p21 SNC
SCN12A 3p23-21.3 SNC
Tabla 3. Subunidades que forman el canal de Na+ en el hombre. *Subunidades que se expresan en el
corazón. MC: Músculo cardíaco. ME: Músculo esquelético. SNC: Sistema nervioso central. SNP: Sistema
nervioso periférico. T: Tiroides. [Adaptada de Nerbonne y Kass, 2005]

• Subunidad α
Las subunidades α de los canales de Na+ pertenecen a una pequeña familia de proteínas
con una secuencia aminoacídica altamente conservada que se expresan en diferentes tejidos y
que codifican canales cuyas propiedades no son idénticas (Goldin, 2002).
El gen SCN5A codifica la subunidad α Nav1.5, responsable de la INa cardíaca. Esta
subunidad está formada por 4 dominios homólogos (DI a DIV), con 6 segmentos TM
dispuestos en α-hélice cada uno (S1 a S6). Los segmentos de cada dominio se conectan
mediante secuencias hidrofílicas no conservadas. El lazo que une los segmentos S5 y S6,
denominado “lazo P”, es extracelular y forma parte del poro iónico. Los extremos carboxilo-
y amino-terminal (C- y N-terminal, respectivamente) y los lazos de unión entre los diferentes
dominios son intracelulares (Goldin, 2002; Yu y Catterall, 2003) (Figura 7A). En la mebrana
la proteína del canal de Na+ orienta sus cuatro dominios de forma simétrica de manera que los
S5 y S6 junto con los lazos P forman las paredes del poro hidrófilo. Los S1-S4 de los cuatro
dominios quedan apartados del poro, rodeados por los fosfolípidos de la membrana.
Clásicamente se ha considerado que el S4 queda, a su vez, rodeado por el resto de segmentos
TM (Figura 7B).

18
 INTRODUCCIÓN

Figura 7. Estructura del canal de Na+. Esquema de las subunidades α y β del canal de Na+. (A) En la
subunidad α, se indica el sensor de voltaje, el filtro de selectividad y los diferentes dominios (DI a DIV). (B)
Estructura del canal plegado en la conformación que adopta en la membrana. [Adaptada de Amin y cols., 2010]

La mayor parte de los residuos que forman los S5 y S6 de los 4 dominios son hidrófobos.
Por su parte, los S4 presentan un residuo cargado (Arg o Lys) cada tres aminoácidos,
formando una hélice de cargas positivas en la membrana. En total, 22 aminoácidos cargados
positivamente (cuatro cargas positivas en el DI, cinco en los DII y DIII y ocho en el DIV) que
aparecen conservados en todas las isoformas del canal de Na+ y que actúan como “sensor de
voltaje” (Stühmer y cols., 1989). La teoría más aceptada acerca del sensor de voltaje es que
los S4 se mueven físicamente a través de la membrana desde el interior hacia el exterior en
respuesta a la despolarización, exponiendo al exterior dos cargas positivas que se encontraban
previamente ocultas en el interior de la membrana (Yang y cols., 1996; Bezanilla, 2000 y
2002). Cuatro de los residuos presentes en los lazos P forman un anillo que se denomina
“locus DEKA”: Asp en DI, Glu en DII, Lys en DIII y Ala en DIV. Esta estructura determina
la conductancia y la selectividad iónica del canal al Na+, así como la unión de toxinas (Noda y
cols., 1989; Terlau y cols., 1991). La sustitución de estos cuatro aminoácidos por residuos de
Glu (que son los aminoácidos presentes en las posiciones análogas en el canal de Ca2+)
convierte los canales de Na+ en selectivos para el Ca2+ (Heinemann y cols., 1992).

19
 INTRODUCCIÓN

• Subunidades auxiliares
Las principales subunidades reguladoras del canal de Na+ son las subunidades β, de las
que en la actualidad se conocen 4 isoformas (β1 a β4) (Tabla 3) (Morgan y cols., 2000; Goldin,
2002). Son proteínas con un único dominio TM, un extremo N-terminal extracelular y un
extremo C-terminal intracelular y presentan una secuencia tipo inmunoglobulina que las
diferencia del resto de subunidades accesorias (Isom y Catterall, 1996). Estas subunidades no
forman parte del poro conductor del canal, pero regulan el gating del mismo, su expresión en
la membrana y la unión con otras moléculas de la matriz extracelular y del citoesqueleto
(Isom y Catterall, 1996).
Su implicación en la regulación del canal de Na+ cardíaco no está clara todavía, aunque
mutaciones en cada una de las cuatro subunidades auxiliares han sido relacionadas con
diferentes síndromes arritmogénicos (Abriel, 2010). Además, la presencia de la subunidad
Navβ1.1 disminuye la afinidad de anestésicos locales y fármacos antiarrítmicos del grupo I
por la subunidad α Nav1.5 (Balser y cols., 1996; Makielski y cols., 1996; Balser, 2001).

2.1.2. Características de la INa

La INa es la responsable de la fase 0 de los PA generados en las células musculares

auriculares y ventriculares y en el sistema de His-Purkinje (Brown y cols., 1981; Fozzard y
cols., 1985). La despolarización inicia un cambio conformacional que produce la apertura del
canal de Na+ (Hirschberg y cols., 1995; Yang y Horn, 1995). La INa alcanza un pico máximo
en 0.5-2 ms, y, a continuación, se inactiva de forma rápida (Figura 8). El umbral de activación
de la corriente se encuentra en -60 mV y alcanza su valor máximo entre -30 y -20 mV
(Hodgkin y Huxley, 1952a y b; Armstrong, 1981). La inactivación no sólo cierra el canal,
sino que impide la reapertura del mismo hasta que haya pasado el tiempo suficiente para su
recuperación, determinando así la frecuencia máxima de excitación celular y preservando el
gradiente iónico intracelular, lo que impide la muerte celular.
La inactivación de la INa cardíaca sigue un proceso biexponencial, presentando un
componente rápido y uno lento (Rudy, 1978; Saikawa y Carmeliet, 1982; Clarkson y cols.,
1984; Patlak y Ortiz, 1985; Balser, 2001). La rapidez de la activación y la inactivación sugiere
que ambos procesos podrían estar acoplados (Aldrich y cols., 1983; Catterall, 2000; Balser,
2001; Ulbritch, 2005). Incluso, el canal puede pasar al estado inactivo sin haber pasado por el
estado abierto (“inactivación del estado cerrado”) (Horn y cols., 1981). Se ha demostrado que

20
 INTRODUCCIÓN

la “inactivación rápida” depende de tres residuos hidrofóbicos presentes en el lazo DIII-DIV,

la “secuencia IFM” (Ile1488, Phe1489 y Met1490) (Eaholtz y cols., 1994).

50 ms

-120 mV

A B

1 nA

2.5 ms
1 nA

5 ms

Figura 8. Registros de INa. (A) Trazos de INa registrados en nuestro laboratorio en un miocito auricular humano
tras la aplicación de pulsos de 50 ms a potenciales entre -100 y +30 mV desde un potencial de fijación de -120
mV. (B) INa registrada en nuestro laboratorio en una célula CHO transfectada de forma transitoria con la
subunidad α Nav1.5 y la subunidad β1 tras la aplicación de pulsos de 50 ms a potenciales desde -80 hasta +70
mV desde un potencial de fijación de -120 mV.

Además, el extremo C-terminal participa en la estabilización de esta inactivación,

disminuyendo la probabilidad de reapertura (Mantegazza y cols., 2001; Cormier y cols., 2002;
Motoike y cols., 2004). La “inactivación lenta” es un proceso que se prolonga durante varios
cientos de ms y que es responsable del control de la entrada de Na+ durante la fase de meseta
del PA cardíaco, contribuyendo de este modo al mantenimiento de dicha fase (Clarkson y
cols., 1984; Carmeliet, 1987; Fozzard y cols., 1987; Balser, 2001). La inactivación lenta
disminuye al aumentar la concentración extracelular de Na+ (Oxford y Yeh, 1985) y parece
estar regulada por un complicado mecanismo en el que están involucrados los cuatro
dominios del canal (O’Reilly y cols., 1999; Vilin y cols., 1999).

2.1.3. Canalopatías asociadas a los canales de Na+ cardíacos

La importancia de los canales de Na+ se pone de manifiesto por la existencia de diferentes

enfermedades causadas por mutaciones en los genes que los codifican, y que afectan a la
función nerviosa o a la del músculo esquelético y/o cardíaco (Cannon y cols., 1991; Wallace y
cols., 1998; George, 2005; Zimmer y Surber 2008; Abriel, 2010).

21
 INTRODUCCIÓN

A nivel cardíaco, las mutaciones en el gen que codifica la subunidad Nav1.5 (SCN5A) se
han relacionado con la aparición de arritmias ventriculares (síndrome de QT largo [SQTL],
síndrome de Brugada), fibrilación auricular (FA), con defectos en la conducción intracardíaca
y/o muerte súbita en recién nacidos (Wang y cols., 1995a; Chen y cols., 1998; Schott y cols.,
1999; Wei y cols., 1999; Schwartz y cols., 2000;Veldkamp y cols., 2000; Tan y cols., 2001;
Grant y cols., 2002; Darbar y cols., 2008; Amin y cols., 2010; Wilde y Brugada, 2011 ).

2.2. Canales de Ca2+

Los canales de Ca2+ dependientes de voltaje permiten la entrada de Ca2+ en respuesta a la

despolarización de la membrana y son esenciales para acoplar las señales eléctricas en la
superficie celular con la respuesta fisiológica a nivel celular (Nilius y cols., 1985; Bean,
1989). Inicialmente, los canales de Ca2+ dependientes de voltaje se clasificaron según la
magnitud de la despolarización requerida para su activación: los que requerían una fuerte
despolarización (HVA, High Voltage Activated) y los que requerían una despolarización
menor (LVA, Low Voltage Activated). Los canales LVA son los que hoy en día se conocen
como canales de Ca2+ tipo T, que se activan rápidamente a Em ≈-50 mV y que se inactivan
también rápidamente (Catterall y cols., 2005b; Nerbonne y Kass, 2005). Los canales HVA se
abren cuando se despolariza la membrana hasta ≈-30 mV y su inactivación puede prolongarse
hasta 100 ms. Hasta el momento, se han identificado 5 subtipos de canales de Ca2+ con
distintas propiedades cinéticas, biofísicas y farmacológicas (L, N, P, Q y R). Sin embargo, en
el miocardio humano sólo se ha demostrado la presencia de los canales de Ca2+ tipo L y tipo
T.
Los canales tipo L se localizan principalmente en los túbulos T de la membrana, próximos
y enfrentados a los receptores de rianodina del retículo sarcoplásmico (RyR2). La entrada de
Ca2+ a través de canales tipo L promueve la apertura de los RyR2 con la consiguiente salida
de Ca2+ desde el retículo. Es decir, que la ICaL provoca la “liberación de Ca2+ inducida por
Ca2+” y con ello dispara la respuesta contráctil de los miocitos cardiacos. A su vez, la ICaL
determina el Em de la fase de meseta del PA. Por su parte, los canales tipo T se localizan
principalmente en las células auriculares y en las células del nodo SA y en las fibras de
Purkinje, mientras que su presencia en las células ventriculares es mínima (Mitra y Morad,
1986; Hagiwara y cols., 1988; Bean, 1989; Yuan y cols., 1996).

22
 INTRODUCCIÓN

2.2.1. Estructura de los canales de Ca2+

Los canales de Ca2+ dependientes de voltaje son heterotetrámeros compuestos por las
subunidades α1, β y α2/δ, y, en algunos tejidos, la subunidad γ (Bodi y cols., 2005; Catterall y
cols., 2005b; Nerbonne y Kass, 2005). Hasta ahora, se han identificado los genes que
codifican la expresión de 10 subunidades α1 (Catterall y cols., 2005b), 4 subunidades β, 4
complejos α2/δ y 8 subunidades γ (Tabla 4), aunque, a nivel cardíaco, sólo se ha demostrado
la existencia de las subunidades reguladoras β y α2/δ. Los diferentes tipos de corriente de
entrada de Ca2+ (ICa) se definen en función de la subunidad α1 que forma el canal, mientras
que las subunidades reguladoras α2/δ, β y γ modulan su tráfico a la membrana y/o las
propiedades biofísicas de la corriente (Figura 9) (Bodi y cols., 2005; Catterall y cols., 2005b;
Nerbonne y Kass, 2005).

Figura 9. Estructura del canal de Ca2+ tipo L. [Adaptada de Bodi y cols., 2005]

• Subunidad α
La familia Cav1 codifica las subunidades α1 de los canales de Ca2+ tipo L, siendo la
Cav1.2 (α1C) la que se expresa predominantemente en el corazón (Bodi y cols., 2005). La
familia Cav2 codifica las subunidades α1 de los canales tipo P/Q, N y R, que se encuentran
mayoritariamente en el cerebro, y la familia Cav3 codifica las subunidades α1 de los canales
tipo T (Tabla 4) (Pérez-Reyes, 2003). Los canales de Ca2+ presentan una gran homología
estructural con los canales de Na+ dependientes de voltaje. Las subunidades α1 presentan 4
dominios homólogos (DI a DIV), cada uno compuesto por 6 segmentos TM en α-hélice (S1 a

23
 INTRODUCCIÓN

S6) (Figura 9). El canal de Ca2+ presenta 4 cargas positivas en los S4 de cada dominio, dando
lugar al sensor de voltaje. Estos residuos cargados están altamente conservados en todas las
familias de canales de Ca2+. Como en los canales de Na+, el lazo P que une los S5 y S6 de los
cuatro dominios contribuye a formar el poro del canal. Cada uno de los lazos P de los cuatro
dominios contiene un residuo de Glu (“locus EEEE”). Estos residuos forman una zona de alta
afinidad por el Ca2+ que conforma el filtro de selectividad del canal (Mikala y cols., 1993;
Klockner y cols., 1996; Koch y cols., 2000).

Subunidad α1 Subunidades β reguladoras

Proteína Gen Cromosoma ICa Proteína Gen Cromosoma
Cavα1 Cav1.1 (α1S) CACNA1S 1q31-32 L Cavβ β1 CACNB1 17q11.2
Cav1.2*
(α1C)
CACNA1C 12p13.3 L β2* CACNB2 10p12
Cav1.3 (α1D) CACNA1D 3p14.3 L β3 CACNB3 12q12
Cav1.4 (α1F) CACNA1F Xp11.23 L β4 CACNB4 2q23

Cavα2
α2/δ1* CACNA2D1 7q11.2
/δ
P/
Cavα2 Cav2.1 (α1A) CACNA1A 19p13 α2/δ2* CACNA2D2 3p14
Q
Cav2.2 (α1B) CACNA1B 9q34 N α2/δ3 CACNA2D3 3p13
Cav2.3*
(α1E)
CACNA1E 1q25-31 R α2/δ4 CACNA2D4 12p13

Cavγ γ1 CACNG1 17q26

Cav3.1*
Cavα3 (α1G)
CACNA1G 17q21 T γ2 CACNG2 22q13
Cav3.2*
(α1H)
CACNA1H 16p13.3 T γ3 CACNG3 16p12
Cav3.3 (α1I) CACNA1I 22q13 T γ4 CACNG4 17q26
γ5 CACNG5 17q26
γ6 CACNG6 19q13.4
γ7 CACNG7 19q13.4
γ8 CACNG8 19q13.4
Tabla 4. Proteínas que forman los canales de Ca2+ dependientes de voltaje humanos. * Subunidades que se
expresan en el corazón. [Adaptada de Nerbonne y Kass, 2005]

• Subunidad β
Las subunidades β son proteínas citosólicas que se ensamblan con las subunidades α1
mediante un dominio de interacción β (DIB) que se une al dominio de interacción α (DIA) de
la subunidad α1 (Figura 8) (De Waard y cols., 1994; Pragnell y cols. 1994). Estas subunidades
regulan la expresión en la membrana de los canales de Ca2+ HVA (Bichet y cols., 2000).
Además, modulan las propiedades biofísicas del canal (Jangsangthong y cols., 2010) e

24
 INTRODUCCIÓN

intervienen en la regulación por pH (Schuhmann y cols., 1997) o por receptores β-

adrenérgicos (Mikala y cols., 1998). Otro posible papel de las subunidades β es intervenir en
el proceso de “facilitación” de la ICa,L (Cens y cols., 1996; Buraei y Yang, 2010). La
facilitación produce un aumento de la densidad de corriente y una ralentización de la
inactivación tras la fosforilación del canal por la proteína quinasa II dependiente de
Ca2+/Calmodulina (CaMKII) (Sculptoreanu y cols., 1993; Yang y cols., 2003).

• Subunidad α2/δ
El complejo α2/δ está formado por la unión de la subunidad extracelular α2 y la subunidad
transmembrana δ mediante un puente disulfuro (Figura 9). La función del complejo α2/δ varía
según las subunidades α1 y β con las que interacciona, aunque se ha sugerido que el dominio δ
interviene en los cambios cinéticos mientras que el domino α2 es responsable del aumento de
la expresión del canal en la membrana (Hofmann y cols., 1994; Mori y cols. 1996).

• Subunidad γ
La subunidad γ es una proteína con cuatro dominios TM y extremos N- y C-terminales
intracelulares de la que existen al menos 8 isoformas, aunque ninguna de ellas se expresa en
tejido cardíaco (Kang y Campbell, 2003).

2.2.2. Características de la ICa,L

La ICa,L registrada en miocitos cardíacos presenta un potencial umbral de activación de

alrededor de -30 mV y alcanza su máxima amplitud a potenciales entre 0 y +10 mV. La
activación y la inactivación son relativamente lentas, alcanzándose el pico máximo al cabo de
1-5 ms (Figura 10).
La inactivación de la corriente es un proceso que depende del voltaje y de la
concentración intracelular de Ca2+ ([Ca2+]i) (Kass y Sanguinetti, 1984; Lee y cols., 1985;
Zhang y cols., 1994). En los canales de Ca2+, los procesos de inactivación y de recuperación
de la inactivación están regulados por cambios estructurales en diferentes partes de la
subunidad α1, incluyendo el poro, los lazos intracelulares y el extremo C-terminal. Además, se
ha comprobado que también participan interacciones con proteínas intracelulares y
subunidades auxiliares como la subunidad β. La inactivación debida a altas [Ca2+]i representa
un mecanismo de retroalimentación negativo de gran importancia (Brehm y Eckert, 1978) en
el que están implicados un motivo de unión a calmodulina (CaM) (el “motivo IQ”), un motivo

25
 INTRODUCCIÓN

en “mano EF” y los péptidos A y C que se encuentran en el extremo C-terminal del canal
(Figura 8) (Zuhlke y cols., 1999; Peterson y cols., 2000). Así, tras la despolarización y la
entrada de Ca2+, la [Ca2+]i aumenta hasta el rango micromolar, lo que hace que el Ca2+ se una
a la CaM asociada al canal y se promueva la inactivación. En la inactivación dependiente de
voltaje, el lazo DI-DII actúa como partícula bloqueante del canal (Kim y cols., 2004a).

+30 mV +70 mV
A B
-50 mV -70 mV
WT
2 pA/pF

2 pA/pF
100 ms 100 ms

Figura 10. Registros de ICa,L. (A) ICa,L registrada en miocitos auriculares humanos disociados enzimáticamente
en nuestro laboratorio tras la aplicación del protocolo que se muestra en la parte superior. (B) Corriente de Ca2+
registrada en nuestro laboratorio tras la aplicación del protocolo que se muestra en la parte superior. La corriente
fue registrada en células CHO transfectadas de forma transitoria con las subunidades Cavα1.2, Cavβ2 y Cavα2/δ.

2.2.3. Composición de los canales que generan la ICa,L

Los miembros de la familia Cav1 codifican las subunidades α1 de los canales de Ca2+ tipo
L, siendo la Cav1.2 (α1C) la que se expresa predominantemente en el corazón (Bodi y cols.,
2005). Se han identificado tres variantes de la isoforma Cav1.2 (Cav1.2a-c), de las que la
Cav1.2a es la isoforma cardíaca específica. Además, en el corazón estos canales presentan dos
tipos de subunidades auxiliares, las subunidades β y α2/δ (Tabla 4). El canal de Ca2+ tipo L es
una importante diana farmacológica para el tratamiento de diversas patologías. Los fármacos
que inhiben la ICa,L (denominados “antagonistas del Ca2+”) están indicados en el tratamiento
de diversas patologías como angina de pecho, hipertensión arterial (HTA), vasculopatías
periféricas, algunas taquiarritmias supraventriculares y como protectores renales y cardíacos.
Los antagonistas del Ca2+ se dividen estructuralmente en 3 grupos: las DHP (como el
nifedipino), las bencilalquilaminas (como el verapamilo) y las benzotiazepinas (como el
diltiazem). Todos ellos tienen su sitio de unión en el poro del canal (Hering y cols., 1996;
Hockerman y cols., 1995; Schuster y cols., 1996; He y cols., 1997; Hockerman y cols., 1997).

26
 INTRODUCCIÓN

2.2.4. Canalopatías asociadas al canal de Ca2+ tipo L

La canalopatía más importante que se ha identificado es la causada por la mutación

Gly406Arg en el gen que codifica la subunidad Cav1.2 (CACNA1C), que se ha relacionado
con la aparición de síndrome de Timothy (SQTL8) (Splawski y cols., 2004; Bidaud y Lori,
2011). Esta mutación produce un aumento en la amplitud de la ICa,L como consecuencia de la
separación de la unión entre las subunidades α1 y β y se manifiesta con alteraciones
multiorgánicas que afectan al miocardio (prolongación del intervalo QT y arritmias graves e
incluso letales), inmunodeficiencia y autismo, debido a la amplia distribución de la subunidad
Cav1.2 (Splawski y cols., 2004).
Se han descrito otras mutaciones en los genes que codifican la subunidad α Cav1.2
(Antzelevitch y cols., 2007), y las subunidades auxiliares Cavβ2b (Cordeiro y cols., 2009) y
Cavα2/δ1 (Burashnikov y cols., 2010) que reducen la entrada de Ca2+ durante la fase de meseta
del PA y que se han relacionado con la aparición de síndrome de Brugada y síndrome de
repolarización temprana.

2.3. Canales de K+

Los canales de K+ constituyen el grupo más heterogéneo de proteínas de membrana. Se

distribuyen ubicuamente a lo largo de toda la escala filogenética y están presentes
prácticamente en todas las células, donde juegan un importante papel, por ejemplo, en el
mantenimiento del PR celular, el control de la frecuencia de disparo de las células
automáticas, la liberación de neurotransmisores, la secreción de insulina, la excitabilidad
celular, el transporte de electrolitos por las células epiteliales o la regulación de la contracción
del músculo liso esquelético y cardíaco (Tabla 5).
A nivel cardíaco, los canales de K+ juegan un papel fundamental en el PA, ya que
permiten la salida de K+ de la célula, lo que conduce a la repolarización celular. Las cinéticas
de activación e inactivación de cada canal determinan su participación en el control de la
repolarización: los canales que se activan rápidamente intervienen en la repolarización
durante las primeras fases del PA, mientras que los canales que generan corrientes
rectificadoras tardías que se activan lentamente participan fundamentalmente en la
repolarización durante la fase 3. Los canales de K+ presentan una distribución heterogénea en
función del tejido (aurícula frente a ventrículo) e incluso dentro de un mismo tejido
(endocardio frente a epicardio). La heterogeneidad en los tipos y en la distribución de los

27
 INTRODUCCIÓN

canales de K+ determina la diferencia en la morfología de los PA de las distintas regiones del

corazón (Figura 1). Además, la expresión y las propiedades de los canales de K+ también
pueden verse modificadas por fármacos, hormonas y diferentes patologías.

Corriente Subunidad α Subunidad β

Proteína Gen Locus Proteína Gen Locus
IK1 Kir2.1 (IRK1) KCNJ2 17q23.1-24.2
Kir2.2 (IRK2) KCNJ12 17p11.1
Kir2.3 (IRK3) KCNJ4 22q13.10
IK,ACh Kir3.1 (GIRK1) KCNJ3 2q24.1
Kir3.4 (GIRK4) KCNJ5 11q24
IK,ATP Kir6.2 (BIR) KCNJ11 11p15.1 SUR2A ABCC9 12p12.1
K2P K2P1.1 (TWIK-1) KCNK1 lq42-43
K2P2.1 (TREK-1) KCNK2 lq41
K2P3.1 (TASK-1) KCNK3 2p24.1-23.3
K2P5.1 (TASK-2) KCNK5 6p21
K2P6.1 (TWIK-2) KCNK6 19q13-1
K2P9.1 (TASK-3) KCNK9 8q24-3
K2P10.1 (TREK-1) KCNK10 14q31
K2P13.1 (THIK-1) KCNK13 14q24.1-24.3
K2P17.1 (TASK-4) KCNK17 6p21.1-2
Ito1 Kv4.3 KCND3 11p15.1 KChIP2 KCNIP2 10q25
DPPX DPP6 7q36.2-36.3
MiRP1 KCNE2 21q22.12
MiRP2 KCNE3 11q13-q14
Kv1.4 KCNA4 11p14.3-15.2 Kvβ1 KCNAB1 3q25
Kvβ2 KCNAB2 1p36.3
Kv4.1 KCND1 Xp11.23 KChIP1 KCNIP1 5q35
Kv4.2 KCND2 7q31 KChIP2 KCNIP2 10q25
IKur Kv1.5 KCNA5 12p13.3 Kvβ1 KCNAB1 3q25
Kvβ2 KCNAB2 1p36.3
IKs Kv7.1 (KCNQ1) KCNQ1 11p15.5 minK KCNE1 21q22.1-q22.2
IKr Kv11.1 (hERG) KCNH2 7q35-36 minK KCNE1 21q22.1-q22.2
MiRP1 KCNE2 21q22.1
Tabla 5. Subunidades α y β de los canales que generan las diferentes corrientes de K+ cardíacas humanas.
Entre paréntesis, nombre alternativo de algunas de las proteínas. [Adaptada de Tamargo y cols., 2004]

El estudio electrofisiológico del mutante Shaker de la mosca del vinagre (Drosophila

melanogaster), denominado así por el aleteo constante que se observaba en estas moscas al
ser anestesiadas con éter, permitió la clonación y secuenciación del primer canal de K+ (Jan y
cols., 1983). Desde entonces, el desarrollo de las técnicas de biología molecular ha permitido
identificar más de 200 genes que codifican canales de K+ (Coetzee y cols., 1999; Snyders,
1999; Tamargo y cols., 2004; Gutman y cols., 2005; Li y Dong, 2010).

28
 INTRODUCCIÓN

A B

C D

Figura 11. Topología de la subunidad α de los cuatro grandes grupos de canales de K+. (A) Canales
2TM/1P. (B) Canales 4TM/2P (C) Canales 6TM/1P (D) Canales 8TM/2P. [Adaptadas de Choe, 2002]

Los canales de K+ se clasifican de acuerdo al número de segmentos TM y de poros que

presentan (Figura 11):
• Canales formados por 6 segmentos TM y 1 poro (6TM/1P). Incluye también a los canales de
K+ activados por Ca2+, que presentan un segmento TM adicional (S0) en el extremo N-
terminal.
• Canales formados por 4 segmentos TM y 2 poros (4TM/2P).
• Canales formados por 8 segmentos TM y 2 poros (8TM/2P), sólo encontrados en levaduras.
• Canales formados por 2 segmentos TM y 1 poro (2TM/1P). Este grupo, compuesto por los
canales de K+ con rectificación interna (canales Kir), será tratado con más detalle en el
apartado 3.

2.3.1. Canales 6TM/1P

Los canales 6TM/1P agrupan a los canales de K+ activados por voltaje (canales Kv) y a los
canales de K+ activados por Ca2+ (canales BKCa). Tras el clonaje del canal Shaker (Jan y cols.,
1983) se identificaron otras tres subfamilias de genes que codifican la expresión de un gran
número de canales Kv a las que se denominó Shab, Shaw y Shal. En mamíferos, estas cuatro
familias se corresponden con las familias Kv1 (Shaker), Kv2 (Shab), Kv3 (Shaw) y Kv4

29
 INTRODUCCIÓN

(Shal). Hasta la fecha, se han descrito doce familias de subunidades α Kv (Kv1 a Kv12), con
una homología aminoacídica de ≈70% dentro de una misma familia y de ≈40% entre
diferentes familias (Tabla 6) (Gutman y cols., 2005).

Familia IUPHAR Gen Cromosoma Localización

Kv1 (Shaker) Kv1.1 KCNA1 12p13.3 Cerebro, corazón, retina, músculo esquelético, islotes
pancreáticos
Kv1.2 KCNA2 1p13 Cerebro, corazón, retina, músculo liso, islotes pancreáticos
Kv1.3 KCNA3 1p13.3 Cerebro, pulmones, timo, hígado, nódulos linfáticos,
testículos, linfocitos, fibroblastos, osteoclastos, plaquetas,
islotes pancreáticos
Kv1.4 KCNA4 11p14.3-15.2 Cerebro, músculo esquelético, corazón, islotes pancreáticos
Kv1.5 KCNA5 12p13.3 Corazón, músculo liso, pituitaria, colon, riñón, estomago,
aorta, arterias pulmonares, hipocampo
Kv1.6 KCNA6 12p13.3 Cerebro, corazón, pulmones, testículos, músculo liso, arterias
pulmonares, ovarios, astrocitos, oligodendrocitos
Kv1.7 KCNA7 19q13.3 Corazón, músculo liso, placenta, arterias pulmonares
Kv1.8 KCNA10 1p13.1 Riñón, cerebro, corazón, músculo esquelético, glándula
adrenal

Kv2 (Shab) Kv2.1 KCNB1 20q13.2 Cerebro, corazón, músculo esquelético, arterias pulmonares,
pulmones, retina, cóclea
Kv2.2 KCNB2 8q13.2 Cerebro, corazón, lengua, neuronas simpáticas, músculo liso

Kv3 (Shaw) Kv3.1 KCNC1 11p15 Cerebro, pulmones, testículos, músculo esquelético
Kv3.2 KCNC2 12q14.1 Cerebro, islotes pancreáticos, arterias mesentéricas
Kv3.3 KCNC3 19q13.3-4 Cerebro, neuronas del SNC, arterias mesentéricas, córnea
Kv3.4 KCNC4 1p21 Paratiroides, próstata, cerebro, células acinares pancreáticas

Kv4 (Shal) Kv4.1 KCND1 Xp11.23 Cerebro, colon, corazón, pulmones, estómago, testículos,
hígado, riñón, glándulas tiroideas, páncreas, arterias
pulmonares
Kv4.2 KCND2 7q31 Cerebro, corazón, cóclea
Kv4.3 KCND3 1p13.3 Corazón, cerebro, músculo liso

Kv5 Kv5.1 KCNF1 2p25 Cerebro, corazón, músculo esquelético, hígado, riñón,
páncreas

Kv6 Kv6.1 KCNG1 20q13 Cerebro, músculo esquelético, útero, ovarios, riñón, páncreas,
piel, hueso, placenta, próstata, testículos
Kv6.2 KCNG2 18q22-23 Corazón, cerebro
Kv6.3 KCNG3 2p21 Cerebro, testículos, intestino, glándula adrenal, timo,
pituitaria
Kv6.4 KCNG4 16q24.1 Corazón, hígado, intestino, colon

Kv7 (KvLQT) Kv7.1 KCNQ1 11p15.5 Corazón, riñón, recto, cóclea, páncreas, pulmones, placenta
Kv7.2 KCNQ2 20q13.3 Cerebro, pulmones, testículos, corazón, ojo, placenta,
intestino
Kv7.3 KCNQ3 8q24 Cerebro, testículos, retina, colon
Kv7.4 KCNQ4 1p34 Cóclea, placenta
Kv7.5 KCNQ5 6q14 Cerebro, músculo esquelético
+
Tabla 6. Familias de canales de K dependientes de voltaje. [Adaptada de Gutman y cols., 2005]

30
 INTRODUCCIÓN

Kv8 Kv8.1 KCNV1 8q22.3-24.1 Cerebro, riñón

Kv8.2 KCNV2 9p24.2 Pulmones, hígado, riñón, páncreas, bazo, timo, próstata,
testículos, colon, ovarios

Kv9 Kv9.1 KCNS1 20q12 Cerebro, melanocitos

Kv9.2 KCNS2 8q22 Cerebro, retina
Kv9.3 KCNS3 2p24 Cerebro, colon, corazón, estómago, riñón, pulmones,
testículos, piel, útero

Kv10 (eag) Kv10.1 KCNH1 1q32-41 Cerebro, células tumorales

Kv10.2 KCNH5 14q23.1 Cerebro

Kv11 (erg) Kv11.1 KCNH2 7q35-36 Corazón, cerebro, células sanguíneas y tumorales, riñón,
pulmón, hígado, ovarios, páncreas, testículos, próstata,
intestino, útero
Kv11.2 KCNH6 17q23.3 Cerebro, útero
Kv11.3 KCNH7 2q24.2 Cerebro

Kv12 (elk) Kv12.1 KCNH8 3p24.3 Cerebro, ganglios simpáticos, pulmones, útero, testículos,
colon
Kv12.2 KCNH3 12q13 Cerebro, pulmones
Kv12.3 KCNH4 17q21.2 Cerebro, cerebelo, esófago, pulmones, glándula pituitaria

Tabla 6 (Continuación). Familias de canales de K+ dependientes de voltaje. [Adaptada de Gutman y cols.,

2005]

Además, la diversidad funcional de los canales Kv se ve aumentada por factores como: a)

la formación de heterotetrámeros (Christie y cols., 1990; Ruppersberg y cols., 1990;
Covarrubias y cols., 1991; MacKinnon, 1991); b) la presencia de miembros de las familias
Kv5, Kv6, Kv8 y Kv9, que no forman canales funcionales por sí solos sino que son
subunidades moduladoras que se ensamblan con subunidades Kv2 formando heterotetrámeros
(Gutman y cols., 2005); c) la presencia de proteínas auxiliares, que modifican la función y/o
la expresión en la membrana de los canales Kv (Gutman y cols., 2005); d) modificaciones
postranscripcionales (splicing alternativo), que dan lugar a diferentes isoformas de los canales
a partir de la expresión de un mismo gen (London y cols., 1997); y e) modificaciones
postraduccionales, que regulan la función de muchos canales Kv mediante fosforilación,
ubiquitinización, palmitoilización, nitrosilación, etc.

2.3.1.a. Estructura de los canales Kv

La primera estructura cristalográfica de un canal Kv de mamífero se resolvió en 2005. Era

el canal formado por la subunidad α Kv1.2 y la subunidad auxiliar Kvβ2 de cerebro de rata

31
 INTRODUCCIÓN

(Long y cols., 2005a y b), que venía a confirmar los modelos que se habían propuesto
anteriormente para los canales Kv tras la resolución de otros canales de K+ no dependientes de
voltaje (Doyle y cols., 1998; Zhou y cols., 2001) y de canales Kv bacterianos (Sokolova y
cols., 2001; Jiang y cols., 2003a y b). La estructura resuelta se correspondía con la de un canal
tetramérico en estado abierto cuyas dimensiones eran de 135x95x95 Å, con un poro de ≈12 Å
de diámetro (Figura 12).
Existen dos patrones fundamentales de organización estructural en la familia de canales
Kv: los canales Kv1 a Kv4 presentan una estructura denominada T1 o “dominio NAB” (N-
terminal A and B box) en el extremo N-terminal que se ha demostrado fundamental para el
reconocimiento entre subunidades α y responsable de la interacción con subunidades β y otras
proteínas (Figura 13B), mientras que los canales Kv7, Kv10 y Kv11 no presentan ese dominio
T1 (Figura 13C) (Shen y Pfaffinger, 1995; Xu y cols., 1995; Kreusch y cols., 1998; Yellen,
2002).

I. La subunidad α

En los canales Kv, cada subunidad α consta de 6 segmentos TM (S1 a S6) con estructura
de hélice α y conectados entre sí por secuencias hidrofílicas no conservadas (Figuras 11C y
12A). Las cuatro subunidades α que forman el canal se disponen de tal forma que la boca
externa del poro está formada por los lazos P de cada subunidad. Los S1 a S4 constituyen el
sensor de voltaje mientras el segmento S6 y la región peptídica que une los segmentos S4 y
S5 forman la boca interna del poro (Liman y cols., 1991; MacKinnon, 1991; Yellen y cols.,
1991; Yool y Schwarz, 1991).

• El poro iónico
El poro iónico de los canales Kv está formado por una región de 20 aminoácidos del lazo
P (Doyle y cols., 1998; Morais-Cabral y cols., 2001; Zhou y cols., 2001; Jiang y cols., 2002a).
La región que une los segmentos S5 y S6 es el sitio de unión de muchas toxinas y el segmento
de unión de S4-S5 forma parte del receptor para la partícula de inactivación (Isacoff y cols.,
1991). Gracias a estudios de mutagénesis dirigida en canales, se ha podido demostrar que en
el poro iónico se encuentran los lugares de unión para el tetraetilamonio (TEA) (Yellen y
cols., 1991; Choi y cols., 1993), fármacos antiarrítmicos como la quinidina (Yeola y cols.,
1996), o anestésicos locales como la bupivacaína (Valenzuela y cols., 1995; Franqueza y
cols., 1997) y la benzocaína (Caballero y cols., 2002).

32
 INTRODUCCIÓN

A C

Figura 12. Estructura del complejo formado por la subunidad α Kv1.2 y la subunidad auxiliar β2. (A)
Vistas lateral (a la izquierda) y desde el lado extracelular (a la derecha) del complejo Kv1.2/Kvβ2. (B) Modelo
propuesto del canal Kv1.2, donde se observa la diferente posición del lazo S4-S5 en los estados abierto (a la
izquierda) y cerrado (a la derecha). [Adaptadas de Long y cols., 2005a (A) y 2005b (B)]

A B C
K v 1 .x - K v 4 .x K v 7 .x , K v 1 0 .x , K v 1 1 .x

Figura 13. Estructura de la subunidad α de los canales Kv. (A) Esquema de la estructura de la subunidad α
de los canales Kv, donde se observan los 6 segmentos TM y los segmentos N- y C-terminales intracelulares. El
recuadro rosa indica la posición del dominio T1. (B y C) Disposición estructural de los dominios intracelulares
de los canales Kv1 a Kv4 (B) y de los canales Kv7, Kv10 y Kv11 (C). [Adaptadas de Yellen, 2002]

• Sensor de voltaje
La principal característica de los canales Kv consiste en que son capaces de detectar los
cambios de voltaje producidos en la membrana y acoplar esta señal a su funcionamiento
(Armstrong, 1974; Sigworth, 1994; Bezanilla, 2000 y 2002). El sensor de voltaje está
formado por los cuatro primeros segmentos del canal (S1-S4). El segmento S4 contiene cuatro
o más residuos Arg y Lys, cada uno de los cuales separado por dos residuos hidrofóbicos, que
se recolocan en la membrana cuando el Em varía. Así, la apertura y cierre del canal generan un
movimiento del sensor de voltaje de ≈ 12-13 cargas elementales a través del campo eléctrico
transmembrana (Schoppa y cols., 1992; Hirschberg y cols., 1995), resultando en una corriente
de gating que puede ser medida experimentalmente (Armstrong y Bezanilla, 1973).

33
 INTRODUCCIÓN

Mutaciones en las que se neutralizan los aminoácidos cargados del S4 desplazan el valor del
punto medio de la curva de activación del canal, lo que indica que el S4 juega un importante
papel en el cambio conformacional que conlleva su apertura (Liman y cols., 1991; Papazian y
cols., 1991).
Dos son los principales modelos de movimiento del sensor propuestos: un modelo “de
rotación”, con la exposición de determinados residuos del S4 en ranuras acuosas en las que el
campo eléctrico está muy confinado (Figura 14A), y un modelo “de inclinación” o “modelo
de remo”, que implica grandes desplazamientos del sensor a través del campo transmembrana
(Figura 14B) (Jiang y cols., 2003b; Tombola y cols., 2005).
El ensamblaje de 4 subunidades α es suficiente para formar un canal funcional que genere
una corriente iónica. Sin embargo, la presencia de subunidades auxiliares aumenta la
diversidad funcional de los canales Kv (Figura 15 y Tabla 7) y regula funciones como el
gating, la expresión y/o el transporte a la membrana celular de los canales. Además, estas
subunidades pueden servir como sitio de unión de moléculas adaptadoras o de ligandos
exógenos/endógenos.

II. Subunidades auxiliares

• Subunidades Kvβ
La familia de las subunidades Kvβ está compuesta por tres proteínas homólogas
(Kvβ1 a Kvβ3), así como varias isoformas de alguna de ellas (Wang y cols., 1996a; Martens y
cols., 1999). Similares a las enzimas óxido reductasa, su principal efecto es inducir una rápida
inactivación (especialmente las Kvβ1).

Figura 14. Modelos de movimiento del sensor de voltaje. (A) Modelo convencional en el que el movimiento
de cargas se realiza a través del núcleo proteico del canal mediante un movimiento de traslación y/o rotación del
S4. (B) Modelo en el que el sensor de voltaje se encuentra sumergido en los lípidos de la membrana,
produciendo el desplazamiento de cargas a través del campo eléctrico. [Adaptadas de Jiang y cols., 2003b]

34
 INTRODUCCIÓN

Familia Subunidad Gen Cromosoma

Kvβ Kvβ1* KCNAB1 3q25
Kvβ2* KCNAB2 1p36.3
Kvβ3 KCNAB3 17p13
minK y péptidos minK* KCNE1 21q22
relacionados (KCNE) MiRP1* KCNE2 21q22
MiRP2* KCNE3 11q13
MiRP3 KCNE4 2q36.3
MiRP4* KCNE5 Xq22
KChAP KChAP* PIAS3 1q12
KChIP KChIP1 KCNIP1 5q35
KChIP2* KCNIP2 10q25
KChIP3 KCNIP3 2q11.2-11.3
KChIP4.2 CSEN 2q11.1
KChIP4.3 KCNIP4 4p15.3
DPP DPP6* DPP6 7q36.2-36.3
DPP10* DPP10 2q14.1

Tabla 7. Principales subunidades auxiliares de los canales Kv. *Subunidades que se expresan en el
miocardio. [Adaptada de Nerbonne y Kass, 2005]

A B C D

Figura 15. Dibujo esquemático de diversas subunidades auxiliares de canales iónicos. Las subunidades α
aparecen en gris y las subunidades β en rojo. (A) Ensamblaje de 4 subunidades α Kv con 4 subunidades Kvβ
citosólicas a través del extremo N-terminal. (B) Interacción del canal Kv4.2 con un complejo de 4 subunidades
citoplásmicas KChIP. Se observa también la asociación de la subunidad DPPX con la subunidad α. (C)
Asociación de 4 subunidades Kv7.1 con 2 subunidades minK, así como la formación del complejo
macromolecular con la proteína adaptadora yotiao. (D) Complejo molecular formado por una subunidad α Kv,
las subunidades auxiliares Kvβ, MiRP y KChAP y una proteína de densidad pos-sináptica (PSD). [Adaptadas de
McCrossan y Abbott, 2004]

• Subunidad minK y péptidos relacionados

La presencia en el corazón de la proteína minK (minimal K+ channel subunit) es
predominantemente ventricular (Folander y cols., 1990) y por su asociación con la subunidad
α Kv7.1 genera la IKs (Figura 15C) (Barhanin y cols., 1996; Sanguinetti y cols., 1996b). Se
denominaron MiRP (MinK-Related Peptides) a las siguientes subunidades auxiliares

35
 INTRODUCCIÓN

homologas a minK, codificadas por genes KCNE (Figura 15D) (Abbott y cols., 1999;
McCrossan y Abbott, 2004). Se ha demostrado la presencia de MiRP1, MiRP2 y MiRP3 en
tejido miocárdico humano, donde podrían ensamblarse con las subunidades α Kv11.1, Kv7.1,
Kv4.2 y Kv4.3 (Abbott y cols., 1999; Finley y cols., 2002; McCrossan y Abbott, 2004;
Radicke y cols., 2006; Delpón y cols., 2008a).

• Subunidad KChAP
La subunidad KChAP (K+ Channel-Associated Protein) pertenece a la familia de
proteínas inhibidoras del STAT activado (Signal Transducers and Activators of
Transcription) (Wible y cols., 1998). Estas proteínas interactúan con una gran variedad de
factores de transcripción e intervienen en procesos como la apoptosis (Wible y cols., 2002).
Puede unirse al extremo N-terminal de las subunidades α Kv1, Kv2 y Kv4 (Figura 15D)
(Wible y cols., 1998; Kuryshev y cols., 2000b).

• Subunidades KChIP
Las subunidades auxiliares KChIP (Kv Channel Interacting Protein) son proteínas
citosólicas relacionadas con la familia de sensores neuronales de Ca2. Estas subunidades se
unen al extremo N-terminal de las subunidades α del canal afectando a la cinética de
inactivación y/o a la cinética de recuperación de la inactivación (Figura 15C) (An y cols.,
2000; Decher y cols., 2001; Patel y cols., 2002; Wang y cols., 2007). KChIP2a, KChIP2b y
KChIP2c se unen a las subunidades α Kv4.2 y Kv4.3 para regular su expresión en membrana
y modular las propiedades cinéticas de la Ito1 (An y cols., 2000).

• Subunidades DPPX
Las proteínas dipeptidilpeptidasas (DPP) pertenecen a la familia de las serín-proteasas
no clásicas y son glicoproteínas de membrana con un largo extremo C-terminal extracelular
(Figura 15B) (Wada y cols., 1992). Se ha sugerido que tienen como función regular la cinética
y el tráfico a la membrana de los canales Kv4 (Kin y cols., 2001; Nadal y cols., 2003). Se ha
sugerido su asociación con KChIP y la subunidad α Kv4 para generar la Ito1 en el miocardio
(Radicke y cols., 2005).

36
 INTRODUCCIÓN

2.3.1.b. La inactivación de los canales Kv

El estado inactivo es un estado no conductor que la mayoría de los canales Kv alcanzan

tras su activación, aunque puede alcanzarse desde el estado cerrado o sin que el canal se abra
(Rasmusson y cols., 1998; Kurata y Fedida, 2006). Tanto la inactivación como la
recuperación de la misma son fundamentales para determinar la contribución de cada una de
las corrientes de K+ a la repolarización cardíaca. Sin embargo, no existe un único mecanismo
responsable de la inactivación, sino que es un proceso que presenta propiedades diferentes
dependiendo del canal estudiado.
La inactivación tipo-N se conoce como “modelo de la bola y la cadena”, ya que una
secuencia de aproximadamente 20 aminoácidos del extremo N-terminal (bola), que se
encuentra unida al canal a través del dominio formado por el resto de aminoácidos hasta el
segmento S1 (cadena), ocluye el poro intracelular del canal e impide el paso de los iones
(Figura 16A) (Zagotta y cols., 1990; Isacoff y cols., 1991; MacKinnon y cols., 1993; Gómez-
Lagunas y Armstrong, 1995; Lee y cols., 1996). Este mecanismo es un proceso de
inactivación muy rápido (1-10 ms), por lo que también se conoce como “inactivación rápida”
y se produce en canales de la familia Shaker (Kv1.1 y Kv1.4), Shal (Kv4.2 y Kv4.3) y Shaw
(Kv3.1-3.4) (Coetzee y cols., 1999).
La eliminación de la inactivación rápida tipo-N dejó en evidencia la presencia de un
proceso inactivante lento al que se denominó inactivación tipo-C (Figuras 16B y C) (Choi y
cols., 1991; Hoshi y cols., 1991) que depende de cambios conformacionales en la boca
externa del poro que implican también la participación del filtro de selectividad (López-
Barneo y cols., 1993; Rasmusson y cols., 1998). La inactivación tipo-C se diferencia de la
tipo-N en que es un mecanismo en el que las cuatro subunidades del canal actúan de manera
cooperativa, mientras que los dominios inactivantes tipo-N actúan independientemente
(Ogielska y cols., 1995; Panyi y cols., 1995).
La inactivación tipo-C, al igual que la inactivación tipo-N, es independiente de voltaje a
potenciales a los que la activación es completa, lo que sugiere que están acopladas a la
activación. (Hoshi y cols., 1990; Rasmusson y cols., 1995). Además, la recuperación de
ambos tipos de inactivación es voltaje dependiente, debido al descenso del segmento S4
(Rasmusson y cols., 1995) de manera similar al mecanismo propuesto para el modelo de “bola
y cadena” (Rasmusson y cols., 1995).
Sin embargo, la inactivación tipo-C se puede diferenciar fácilmente de la tipo-N ya que no
es sensible a la perfusión intracelular con TEA (Hoshi y cols., 1991; López-Barneo y cols.,

37
 INTRODUCCIÓN

1993) y es sensible a la concentración y naturaleza del catión permeable en el medio

extracelular (MacKinnon y Yellen, 1990).

A B

Figura 16. Modelos de inactivación de los canales Kv. (A) Modelo de “la bola y la cadena”. (B-C) Modelo de
inactivación tipo-C: cambios conformacionales en la boca externa del poro asociados a la inactivación tipo-C
(B) y cambios conformacionales adicionales que tienen lugar durante este tipo de inactivación (C), asociados
fundamentalmente al S6. [Adaptadas de Aldrich, 2001 (A) y Rasmusson y cols., 1998 (B-C)]

2.3.1.c. Principales corrientes generadas a través de canales Kv que intervienen en el PA

cardíaco

Gracias a estudios realizados con la técnica de patch-clamp en miocitos auriculares y

ventriculares, se han identificado al menos 4 corrientes de K+ generadas a través de canales
Kv implicadas en el PA cardíaco: la Ito1, la IKur, la IKr y la IKs.

I. La Ito

La corriente transitoria de salida de K+ fue descrita por primera vez en fibras de Purkinje
de oveja, donde su actividad era evidente en la primera fase de repolarización del PA (Dudel,
1967; Fozzard 1973). Al principio se pensó que era una corriente debida a la entrada de Cl-,
aunque más tarde se describió que está formada en realidad por dos componentes bien
diferenciados, la Ito1 y la Ito2, donde sólo la Ito1 es una corriente de K+, sensible a 4-
aminopiridina (4-AP) e independiente de Ca2+, mientras que la Ito2 es una corriente de Cl-
activada por Ca2+ y de menor magnitud que la Ito1 (Siegelbaum y cols., 1977; Kenyon y
Gibbons, 1979; Coraboeuf y Carmeliet, 1982; Hiraoka y Kawano, 1989). La Ito1 es
responsable de la rápida repolarización del PA durante la fase 1, por lo que determina la altura

38
 INTRODUCCIÓN

y la duración de la fase de meseta (Nerbonne, 2000; Oudit y cols., 2001; Tamargo y cols.,
2004; Niwa y Nerbonne, 2010).

I.a. Características de la Ito1

La Ito1 se activa (alcanza su máxima amplitud en 5-20 ms) e inactiva muy rápidamente en
respuesta a una despolarización (Figura 17), siendo su reactivación también muy rápida (≈50
ms) (Litovsky y Antzelevitch, 1988; Fermini y cols., 1992).
La amplitud de la Ito1 es dependiente de la frecuencia cardíaca, por lo que su papel en el
control de la DPA es más importante a frecuencias cardíacas lentas. Además, en las células en
las que coexiste con las corrientes de K+ rectificadoras tardías, la inhibición de la Ito1 desplaza
la fase 2 del PA hacia valores más positivos, lo que acelera la inactivación de la ICa,L y la
activación de las corrientes de salida de K+, dando como resultado un acortamiento de la DPA
(Fermini y cols., 1992; Carmeliet, 1993; Courtemanche y cols., 1999; Burashnikov y cols.,
2004).

I.b. Composición de los canales que generan la Ito1

Existen dos fenotipos de corriente transitoria: una Ito1 lenta (Ito1,s) y una Ito1 rápida (Ito1,f).
Ambos fenotipos se pueden distinguir en función de sus propiedades biofísicas, moleculares y
farmacológicas (Tabla 10) (Nerbonne y Kass, 2005). Además, se observa un patrón de
expresión para los dos fenotipos según la región del miocardio que se estudia: la Ito1,s se
expresa fundamentalmente en regiones que presentan una DPA más prolongada (endocardio,
ventrículo izquierdo, septo y ápex), mientras que la Ito1,f se expresa mayoritariamente en
regiones epicárdicas, ventrículo derecho y en la base del corazón (Oudit y cols., 2001;
Tamargo y cols., 2004; Niwa y Nerbonne, 2010). Se han identificado tres subunidades α
como posibles responsables de los diferentes fenotipos de la Ito1 (Kv1.4, Kv4.2 y Kv4.3),
aunque las diferencias observadas entre la corriente generada por cada una de estas
subunidades α y las corrientes nativas sugieren la participación adicional de una o varias
subunidades auxiliares (Tabla 10).
En el corazón humano, las subunidades α Kv4.3 son las responsables de la Ito1,f (Dixon y
cols., 1996; Kong y cols., 1998; Dilks y cols., 1999). En el ventrículo humano existen dos
variantes de este canal: una isoforma larga o Kv4.3-L y una isoforma corta o Kv4.3-S (Kong
y cols., 1998).

39
 INTRODUCCIÓN

+50 mV
A +50 mV B +50 mV

-80 mV
-80 mV
-90 mV
500 pA

100 ms

Kv1.4 Kv4.2 Kv4.3

C D

100

75
% Expresión

50

25

0
Kv1.4 Kv4.2 Kv4.3

Figura 17. Características de la Ito1. (A) Ito1 registrada en miocitos auriculares humanos en nuestro laboratorio
tras la aplicación del protocolo que se muestra en la parte superior de la figura. (B) Corriente generada por
canales Kv4.3-KChIP2a registrada en células CHO en nuestro laboratorio tras la aplicación del protocolo que se
muestra en la parte superior. (C) Detección por PCR de los distintos tipos de canales que generan la Ito1
auricular humana (panel superior) y representación de la expresión relativa de su ARNm (panel inferior). En el
panel superior, la flecha corresponde a la banda de control interno. (D) Representación teórica del
comportamiento de la Ito1 durante el PA ventricular [Adaptadas de Caballero y cols., 2004 (B), Bertaso y cols.,
2002 (C), Patel y Campbell, 2005 (D)

Ito Canal τAct (ms) τInact (ms) τRec (ms) Tejido Acción 4-AP Especie
Ito1,s Kv1.4 2-10 80-200 1000-2000 V Abierto Cj, H, Hr, R, Rta
Ito1,f Kv4.3 2-10 25-80 25-80 A, V, Cerrado G, H, Hr, P, R,
Kv4.2 Purk Rta

Tabla 10. Principales características de las corrientes Ito1,f e Ito1,s. A: Aurícula. Act: Activación. Cj: Conejo.
G: Gato. H: Hombre. Hr: Hurón. Inact: Inactivación. P: Perro. Purk: Purkinje. R: Ratón. Rec: Recuperación de la
inactivación. Rta: Rata. V: Ventrículo. [Adaptada de Nerbonne y Kass, 2005]

La secuencia del canal Kv4.3 está altamente conservada (la isoforma humana sólo
presenta tres aminoácidos diferentes al de rata) (Dilks y cols., 1999). La dependencia de
voltaje de las variantes de hKv4.3 expresadas en células CHO se asemeja a las de la Ito1,f
registrada en miocitos ventriculares humanos (Figura 18) (Beuckelmann y cols., 1993;
Wettwer y cols., 1993 y 1994; Näbauer y cols., 1993 y 1996; Amos y cols., 1996). El rango

40
 INTRODUCCIÓN

de voltaje de activación y las características de la inactivación de esta corriente son similares

en las corrientes nativas y en los canales clonados, apareciendo a potenciales más positivos de
-40 mV y con un punto medio de activación de 10 mV. (Beuckelmann y cols., 1993; Wettwer
y cols., 1993 y 1994; Näbauer y cols., 1993 y 1996; Amos y cols., 1996; Kong y cols., 1998).

• Subunidad reguladoras
Las primeras subunidades auxiliares que se relacionaron con la modulación de la Ito1,f
fueron las subunidades KChIP, concretamente la KChIP2 (Bähring y cols., 2001; Kuo y cols.,
2001; Rosati y cols., 2001). La coexpresión de las proteínas KChIP con canales Kv4.x
incrementa de forma muy marcada la expresión de dichos canales en la membrana de la
célula, lo que funcionalmente se puede observar como un aumento en la amplitud/densidad
del pico de corriente sin modificar la conductancia del canal único (Bähring y cols., 2001).
Además, la proteína KChIP retrasa la inactivación de la corriente y acelera la recuperación de
la inactivación, pero tiene un efecto mínimo sobre la cinética y la dependencia de voltaje de la
activación de los canales Kv4.x (Bähring y cols., 2001). Se ha propuesto que cada subunidad
KChIP podría unirse lateralmente con dos dominios T1 del extremo N-terminal de cada
subunidad Kv4.3 (Pioletti y cols., 2006; Wang y cols., 2007).
Las proteínas minK y MiRP modulan las propiedades cinéticas y dependientes de voltaje
también cuando se coexpresan en sistemas heterólogos con los canales Kv4.2 y Kv4.3 (Figura
17) (Zhang y cols., 2001; Deschênes y Tomaselli, 2002; Lundby y Olesen, 2006; Radicke y
cols., 2006 y 2008; Delpón y cols., 2008a; Liu y cols., 2008). En miocitos auriculares
humanos se ha descrito que MiRP2 coinmunoprecipita con los canales Kv4.3 en experimentos
realizados (Delpón y cols, 2008). Además, se ha observado que subunidad MiRP2 disminuye
la densidad de la corriente Kv4.3 coexpresado o no con la subunidad KChIP2 (Jiang y cols.,
2004; Lundby y Olesen, 2006; Delpón y cols., 2008a). Se ha descrito una mutación que
revierte los efectos inhibitorios de esta proteína sobre los canales Kv4.3, incrementando de la
corriente generada por estos canales (Delpón y cols., 2008a).
Las glicoproteínas DPP6 y DPP10 regulan y se coexpresan con los canales Kv4.2 y Kv4.3
en neuronas (Figura 18) (Nadal y cols., 2003; Jerng y cols., 2004; Li y cols., 2006) y su
presencia en el miocardio humano sugiere también su posible participación en la Ito1,f
(Radicke y cols., 2005 y 2007).

41
 INTRODUCCIÓN

DPP6 MinK
(MiRP1 y/o MiRP2)

Dominio T1

KChIP2 Kvβx Kvβx KChIP2

Figura 18. Dibujo esquémático del canal Kv4.3 con sus posibles subunidades auxiliares. [Adapatada de
Niwa y Nerbonne, 2010]

Por último, las subunidades Kvβ1, Kvβ2, Kvβ3, KChAP y Navβ1 también son capaces de
modular los canales Kv4.2 y Kv4.3 in vitro (Figura 17) (Wible y cols., 1998; Pérez-García y
cols., 1999; Kuryshev y cols., 2000; Yang y cols., 2001), aumentando la expresión de los
canales Kv4.3 sin alterar sus propiedades cinéticas (Yang y cols., 2001), o produciendo un
aumento en la densidad del pico de la corriente, una aceleración de la inactivación y un
retraso en la recueración de la inactivación (Deschênes y Tomaselli, 2002; Deschênes y cols.,
2008).

I.c. La Ito1 en diversas patologías

En situaciones como la insuficiencia cardíaca, la hipertrofia cardíaca, la isquemia

miocárdica y el infarto de miocardio se produce una prolongación de la DPA (Kääb y cols.,
1998; Tomaselli y Marbán, 1999; Oudit y cols., 2001). En la hipertrofia cardíaca, esta
prolongación se correlaciona con una disminución de la Ito1 y de los niveles de ARNm de
Kv4.2 y Kv4.3 (Potreau y cols., 1995; Meszaros y cols., 1996; Nattel y cols., 2010). También
se ha descrito una disminución de la Ito1 y de los niveles de ARNm de Kv4.2 y Kv4.3 tras
infarto de miocardio (Kaprielian y cols., 1999; Huang y cols., 2000).

42
 INTRODUCCIÓN

De igual forma, tanto la Ito1 como la expresión de Kv4.3 se encuentran significativamente

disminuidas en pacientes con FA (Van Wagoner y cols., 1997; Bosch y cols., 1999; Grammer
y cols., 2000; Workman y cols., 2001; Michael y cols., 2009; Nattel y cols., 2010, Caballero y
cols., 2010).
De forma teórica se había postulado que el Síndrome de Brugada podría ser consecuencia
de una disminución de las corrientes despolarizantes (INa e ICaL) o de un aumento de las
repolarizantes (Ito1) que actúan durante la fase de meseta del PA (Di Diego y cols., 2002).
Recientemente se ha identificado la primera mutación en KCND3 que produce un aumento de
función implicada en la aparición de Síndrome de Brugada. Esta mutación produce un
aumento en la densidad del pico de la Ito1 en el ventrículo izquierdo precisamente donde la
expresión de KCND3 es mayor (Giudicessi y cols., 2011).

II. La IKur

Las células auriculares presentan una corriente de salida de K+ denominada IKur que se
activa en el rango de potenciales de la fase de meseta del PA (Snyders y cols., 1993; Wang y
cols., 1993a; Amos y cols., 1996; Feng y cols., 1998a). Su exclusiva presencia en el tejido
auricular contribuye a que la DPA en este tejido sea más breve que en el ventricular (Feng y
cols., 1998b; Tamargo y cols., 2009; Barana y cols., 2010).

II.a. Características de la IKur

La IKur se activa rápidamente (<10 ms) y presenta una inactivación parcial o incluso no se
inactiva en absoluto durante el curso temporal del PA (Figura 19A) (Apkon y Nerbonne,
1991; Wang y cols., 1993a; Li y cols., 1996b; Tamargo y cols., 2004). La recuperación de la
inactivación también es un procso muy lento, lo que tiene gran importancia para explicar la
dependencia de frecuencia de esta corriente a potenciales de membrana fisiológicos (Feng y
cols., 1998a y b).
En humanos, la IKur se ha registrado en el tejido auricular, pero no en el ventricular
(Figura 20A) (Wang y cols., 1993a; Li y cols., 1996b), por lo que se ha propuesto como diana
terapéutica para el desarrollo de nuevos fármacos para el tratamiento de arritmias auriculares
(Brendel y Peukert, 2002; Nattel, 2002; Tamargo y cols., 2009).

43
 INTRODUCCIÓN

A B Kv2.1 Kv1.2 Kv1.5 C

100

75

% Expresión
MAH
MAH
50

25

MVH 0
Kv2.1 Kv1.2 Kv1.5

Figura 19. Características de la IKur. (A) IKur registrada en miocitos auriculares humanos (MAH) tras la
aplicación del protocolo que se muestra en la parte superior. Tras aplicar el mismo protocolo en miocitos
ventriculares humanos (MVH), la IKur no aparece. (B) Detección por PCR de canales Kv que generan corrientes
tipo IKur en muestras auriculares humanas (panel superior) y representación de la expresión relativa del ARNm
de cada uno (panel inferior). En el panel superior, la flecha corresponde a la banda del control interno. (C)
Corriente generada por canales Kv1.5 humanos expresados en células Ltk- tras la aplicación del protocolo que se
muestra en la parte superior de la figura. [Adaptadas de Li y cols., 1996b (A), Bertaso y cols., 2002 (B) y Gómez
y cols., 2005 (C)]

II.b. Composición de los canales que generan la IKur

Existen diversas subunidades α Kv que generan corrientes similares a la IKur (Kv1.2,

Kv1.5, Kv2.1, Kv3.1), que difieren en sus propiedades farmacológicas (Tabla 11). La
sensibilidad a 4-AP y la resistencia al TEA y a la dendrotoxina (DTX) de la IKur humana y de
ratón parecen indicar que es la subunidad α Kv1.5 la responsable de generar esta corriente en
ambas especies (Nattel y cols., 1999).

Subunidad α Gen 4-AP (µM) TEA (mM) DTX (nM) CTX (nM)
Kv1.2 KCNA2 200-800 10-560 1-17 14
Kv1.5 KCNA5 50-250 330 >200 >100
Kv2.1 KCNB1 500 6-10
Kv3.1 KCNC1 29 0.1-0.2 >1000 >1000
Tabla 11. Propiedades farmacológicas de los distintos canales Kv responsables de la IKur. 4-AP: 4-
Aminopiridina. CTX: Caribdotoxina. DTX: Dendrotoxina. TEA: Tetraetilamonio. [Adaptada de Nattel y cols.,
1999]

La expresión de canales Kv1.5 humanos en sistemas heterólogos permite registrar una

corriente rectificadora tardía que presenta las características biofísicas y farmacológicas de la
IKur. Aunque la proteína Kv1.5 se expresa en igual proporción en aurícula y en ventrículo
humano, sólo forma canales funcionales en la aurícula (Fedida y cols., 1993; Wang y cols.,
1993a; Li y cols., 1996b). Además, en miocitos auriculares humanos cultivados en los que se

44
 INTRODUCCIÓN

usan oligonucleótidos antisentido contra el ARNm de la subunidad Kv1.5 no se registra la IKur

(Feng y cols., 1997b), confirmando el papel de Kv1.5 en la corriente nativa.
Se ha descrito que las subunidades α de la familia Kv1 se pueden asociar con miembros
de la familia de subunidades Kvβ (England y cols., 1995; Accili y cols., 1997; Martens y
cols., 1999), siendo las subunidades Kvβ1 y Kvβ2 las que se expresan en el miocardio
humano (McCormack y cols., 1999). Cuando se coexpresan con Kv1.5, las subunidades Kvβ1
participan en la regulación del canal proporcionando sitios de interacción para quinasas
(PKA, PKC) (Kwak y cols., 1999) y modificando la inhibición producida por diferentes
fármacos como la quinidina o la bupivacaína (González y cols., 2002). Por su parte, la
asociación de la subunidad Kvβ2.1 con canales Kv1.5 disminuye la expresión en la
membrana, aumenta el grado de la inactivación lenta y desplaza el punto medio de la curva de
activación hacia potenciales más negativos (Uebele y cols., 1996; Accili y cols., 1997).

II.c. La IKur en diversas patologías

En ratas, tras infarto de miocardio, la expresión del gen Kv2.1 disminuye con los
correspondientes cambios en la corriente (Qin y cols., 1996).
Se ha identificado un polimorfismo en la región C-terminal del canal (Pro532Leu) que
aparece con una frecuencia de 1.1% en la población afroamericana (Drolet y cols., 2005;
Simard y cols., 2005). En estos individuos la IKur generada es prácticamente idéntica a la
nativa, sin embargo presenta una sensibilidad menor a fármacos antiarrítmicos como
quinidina y propafenona (Simard y cols., 2005). También se ha descrito una mutación
(Glu375X) en el gen KCNE5 que produce una pérdida de función del canal Kv1.5 y que se
relaciona con la aparición de FA familiar (Olson y cols., 2006).

III. La IKr

El componente rápido de la corriente de salida de K+ con rectificación tardía contribuye a

la fase 3 de la repolarización y juega un importante papel en el control de la DPA y del
periodo refractario (Hancox y cols., 1998; Tseng, 2001; Tamargo y cols., 2004, Sanguinetti,
2010). La importancia de la IKr se ha puesto de manifiesto gracias a diferentes patologías en
las que se producen mutaciones tanto en la subunidad α (Sanguinetti y cols., 1995 y 1996a)
como en las subunidades β (Abbott y cols., 1999), que se pueden manifestar como SQTL o
SQTC (Splawski y cols., 2000; Tamargo, 2000) y que se han relacionado con un aumento del

45
 INTRODUCCIÓN

riesgo de sufrir arritmias. Además, la IKr es la diana terapéutica de los fármacos antiarrítmicos
de clase III (Sanguinetti y Jurkiewicz, 1990; Spector y cols., 1996a; Nattel y Singh, 1999).

III.a. Características de la IKr

La amplitud de la IKr va aumentando progresivamente con la despolarización del Em hasta

alcanzar un máximo a potenciales entre 0 y +10 mV. A potenciales más positivos, la amplitud
disminuye debido a que la inactivación del canal tiene lugar más rápidamente que la
activación (Figura 20) (Sanguinetti y Jurkiewicz, 1990; Li y cols., 1996a; Spector y cols.,
1996b; Smith y cols., 1996; Hancox y cols., 1998; Tseng, 2001). Sin embargo, cuando la
repolarización alcanza valores de Em negativos (en la fase 3 del PA), los canales que generan
la IKr se recuperan rápidamente de la inactivación y vuelven a entrar en el estado abierto (la
velocidad de recuperación de la inactivación a través del estado abierto es más rápida que la
de deactivación), lo que da lugar a una corriente de gran tamaño que facilita la repolarización
final del PA (Figura 20) (Hancox y cols., 1998; Tseng, 2001).

A B
Corriente sensible
a E-4031

I→A

C → A/I A→C

C Despolarización

Repolarización

Lento Rápido

Lento Rápido

Cerrado Abierto Inactivación tipo C

Figura 20. Características de la IKr. (A) Corriente registrada en miocitos ventriculares humanos en ausencia
() y en presencia ( ) de E-4031 tras la aplicación del protocolo que se muestra en la parte superior izquierda y
corriente sensible al E-4031 correspondiente a la IKr, (derecha). (B) Registro de la corriente generada por
subunidades Kv11.1 registrada en células CHO tras la aplicación del protocolo que se muestra en la parte
superior. Se muestran las transiciones entre las diferentes conformaciones del canal (A: Activo. C: Cerrado. I:
Inactivo). (C) Representación esquemática de los distintos estados del canal Kv11.1. [Adaptadas de Li y cols.,
1996a (A), Caballero y cols., 2003 (B) y Sanguinetti y Tristani-Firouzi, 2006 (C)]

46
 INTRODUCCIÓN

Por todo ello, el grado de activación de la IKr durante la fase 2 viene determinado por la
dependencia de voltaje y de tiempo de la activación de los canales, mientras que en la fase 3
su participación está determinada por la recuperación de la inactivación y la deactivación de
los mismos (Tseng, 2001). Tanto las características biofísicas como la distribución de los
canales que generan la IKr son especie-específicas. Así, la densidad de la IKr en el miocardio
humano es mayor en el ventrículo que en la aurícula, mientras que en la rata y el cobayo
ocurre lo contrario (Sanguinetti y Jurkiewicz, 1991; Pond y cols., 2000; Tseng, 2001;
Tamargo y cols., 2004).

III.b. Composición de los canales que generan la IKr

La subunidad α Kv11.1 (antiguamente denominada hERG, human ether-à-go-go related

gene) es la responsable de la generación de la IKr (Sanguinetti y Jurkiewicz, 1990 y 1991).
Además de en el miocardio, esta subunidad se expresa en SN, músculo liso y células
tumorales (Curran y cols., 1995; Tseng, 2001). La subunidad Kv11.1 presenta, al menos, dos
isoformas debidas a modificaciones postranscripcionales en su extremo N-terminal (hERG1a
y hERG1b) con diferentes propiedades biofísicas (London y cols., 1997; Wang y cols., 2000),
y se piensa que ambas isoformas se ensamblan en el miocardio para formar un canal
heterotetramérico (Jones y cols., 2004). Sin embargo, la IKr nativa y la corriente generada por
los canales Kv11.1 (IKv11.1) expresados en sistemas heterólogos se diferencian en el gating y la
conductancia del canal, así como en la regulación por la [K+]e (Tseng, 2001; Tristani-Firouzi
y Sanguinetti, 2003), sugiriendo la participación de subunidades auxiliares en la generación
de esta corriente.
La utilización de oligonucleótidos antisentido contra el ARNm de minK producía una
disminución en la amplitud de la IKr en células AT-1, una línea tumoral de miocitos
auriculares, lo que sugiere la implicación de esta subunidad en la formación de los canales
que generan esta corriente (Yang y cols., 1995b). De hecho, la amplitud de la IKr era
significativamente menor en los cardiomiocitos de ratones minK-/- que en los de ratones
control. Además, la posterior coexpresión de minK en dichos miocitos producía el aumento
de la IKr (Kupershmidt y cols., 1999). La coexpresión de minK también aumentaba la
amplitud de la IKv11.1 en células HEK293 (Human embrionic kidney cells) (McDonald y cols.,
1997).
Por otro lado, las subunidades Kv11.1 y MiRP1 son capaces de formar complejos estables
in vitro (Abbott y cols., 1999; Cui y cols., 2000). MiRP1 se expresa en fibras de Purkinje y

47
 INTRODUCCIÓN

células del nodo del seno, mientras que a nivel auricular y ventricular su expresión es muy
baja (Lundquist y cols., 2005), por lo que se ha sugerido que sólo interacciona con las
subunidades α Kv11.1 en el sistema de conducción (Weerapura y cols., 2002). La importancia
de MiRP1 en la generación de la IKr se ha puesto de manifiesto tras la descripción de
mutaciones en el gen que codifica esta proteína, ya que producen la disminución de la IKr y se
relacionan con la aparición de SQTL6 (Abbott y cols., 1999; Splawski y cols., 2000; Kass y
Moss, 2003).

III.c. La IKr en diversas patologías

En un modelo canino de infarto, la densidad de la IKr y los niveles de ARNm de Kv11.1 se

encuentran reducidos en miocitos ventriculares (Jiang y cols., 2000). Sin embargo, 48 horas
después del infarto, la densidad de la IKr aumenta en las células de Purkinje subendocárdicas,
generando un gradiente en la repolarización ventricular. Esta heterogeneidad en la
repolarización puede aumentar los efectos proarrítmicos de ciertos fármacos en pacientes con
infarto de miocardio. Además, tanto la hiperglucemia como la hipoglucemia inhiben la
corriente generada por canales Kv11.1 y pueden causar prolongación del QT y arritmias
ventriculares, ya que el ATP proveniente de la glicolisis y de la fosforilación oxidativa es
crítico para la función de estos canales (Zhang y cols., 2003).

III.d. Canalopatías asociadas a las subunidades Kv11.1 y MiRP1

Diferentes mutaciones en los genes que codifican las subunidades Kv11.1 y MiRP1 se han
relacionado con la aparición de SQTL y de SQTC.
Se conocen más de 200 mutaciones en el gen que codifica la subunidad Kv11.1 (KCNH2)
asociadas al SQTL (SQTL2). El SQTL2 representa un 30-35% de los casos de SQTL y es el
que mayor mortalidad presenta (Roberts, 2006). Todas las mutaciones identificadas producen
una disminución de la IKr ocasionada por la pérdida/disminución en la función del canal
Kv11.1 (Curran y cols., 1995; Zhou y cols., 1998; Splawski y cols., 2000; Tseng, 2001;
Rajamani y cols., 2002; Kass y Moss, 2003; Sanguinetti y Tristani-Firouzi, 2006, Sanguinetti,
2010; Amorós y cols., 2011).
También se han descrito mutaciones en el gen que codifica la subunidad MiRP1 (KCNE2)
asociadas a la aparición del SQTL6 (Abbott y cols., 1999; Splawski y cols., 2000; Kass y
Moss, 2003).

48
 INTRODUCCIÓN

La inhibición farmacológica de la IKr está relacionada con la aparición de un tipo de SQTL

que se denomina “SQTL adquirido” (De Bruin y cols., 2005; Sanguinetti y Tristani-Firouzi,
2006). Esta disminución de la IKr debida a fármacos está relacionada tanto con el bloqueo de
los canales Kv11.1 que la generan (Mitcheson y cols., 2000), como con la inhibición del
transporte a membrana de los mismos (Dennis y cols., 2007). En ambos casos, se produce un
aumento de la DPA ventricular que prolonga el intervalo QT y el periodo refractario y
favorece el desarrollo de pospotenciales tempranos (Sanguinetti y cols., 1996a; De Bruin y
cols., 2005; Sanguinetti y Tristani-Firouzi, 2006). Además, la prolongación de la DPA es
mayor en las células M que en el tejido subepicárdico y subendocárdico del ventrículo, lo
aumenta la dispersión de la repolarización ventricular (Haverkamp y cols., 2000; Tseng,
2001; Redfern y cols., 2003).
Por último, existen mutaciones en el gen KCNH2 relacionadas con la aparición del SQTC
tipo 1 (SQTC1) (Brugada y cols., 2004). El SQTC se caracteriza por un acortamiento del
intervalo QT del ECG (<360 ms) y una marcada aceleración de la repolarización lo que
predispone a padecer FA, FV y/o muerte súbita (Gussak y cols., 2000; Brugada y cols., 2004;
Bjerregaard y Gussak, 2005).

IV. La IKs

El componente lento de la corriente de salida de K+ con rectificación tardía participa

fundamentalmente en la fase 3 de los PA auriculares y ventriculares (Jespersen y cols., 2005;
Tamargo y cols., 2004). La importancia de la IKs en la repolarización se pone de manifiesto
porque las mutaciones en los genes que codifican los canales que generan esta corriente están
relacionadas con la aparición de diversos síndromes arritmogénicos (SQTL, SQTC, FA).

IV.a. Características de la IKs

La IKs se activa a potenciales más positivos de -30 mV, alcanza la mitad de su activación
máxima a +20 mV (Sanguinetti y Jurkiewicz, 1990; Kurokawa y cols., 2001). La cinética de
activación de la IKs es muy lenta y su amplitud máxima en estado estable (unas 10 veces
mayor que el de la IKr) sólo se alcanza con despolarizaciones extremadamente prolongadas
(Mitcheson y Sanguinetti, 1999), mientras que su cinética de deactivación es también muy
lenta y dependiente de voltaje (Virag y cols., 2001). La IKs es la principal responsable del
control de la DPA ventricular a frecuencias rápidas, ya que, al aumentar la frecuencia
cardíaca, los canales que generan la IKs tienen menos tiempo para deactivarse y se acumulan

49
 INTRODUCCIÓN

en el estado abierto, propiciando una repolarización más rápida y el acortamiento de la DPA

(Jurkiewicz y Sanguinetti, 1993; Delpón y cols., 1995).

A C

Kv7.1+minK
minK

B
Kv7.1

Figura 21. Características de la IKs. (A y B) Corrientes registradas en células de mamífero transfectadas sólo
con las subunidades minK (A) y Kv7.1 (B). (C) Corriente registada en nuestro laboratorio con ambas
subunidades a la vez. [Adaptadas de Sanguinetti y cols., 1996b (A y B)]

V.b. Composición de los canales que generan la IKs

La subunidad α Kv7.1 (antiguamente denominada KvLQT1) se ensambla con la

subunidad auxiliar minK para generar una corriente que se activa lentamente y cuyas
características se corresponden con las de la IKs nativa (Barhanin y cols., 1996; Sanguinetti y
cols., 1996b). La expresión en sistemas heterólogos de la subunidad α Kv7.1 genera una
corriente (IKv7.1) que se activa rápidamente y se inactiva lentamente (Figura 21B) y cuyas
características son claramente diferentes a las de la IKs nativa (Barhanin y cols., 1996;
Sanguinetti y cols., 1996b; Lee y cols., 1997). Por otro lado, la expresión de minK por sí sola
no forma ningún canal funcional (Figura 21A). Sin embargo, la coexpresión de ambas
subunidades produce un incremento de la corriente generada, un retraso de la activación del
canal y la desaparición de la inactivación, de manera que se obtiene una corriente con
características muy similares a las de la IKs nativa (Figura 21C) (Barhanin y cols., 1996;
Sanguinetti y cols., 1996b). Actualmente se acepta que la IKs se genera a través de canales
formados por 4 subunidades α Kv7.1 ensambladas con, al menos, 2 subunidades auxiliares
minK (Chen y cols., 2003a) a través de un dominio en la región C-terminal de Kv7.1 (Schmitt
y cols., 2000).
Hasta el momento se han identificado en el corazón 6 isoformas diferentes de Kv7.1
debidas a modificaciones postranscripcionales, siendo las isoformas 1 y 2 las de mayor

50
 INTRODUCCIÓN

expresión en el miocardio (Lee y cols., 1997; Pereon y cols., 2000). Además, se ha descrito
que la subunidad Kv7.1 puede asociarse in vitro con los otros 4 miembros de la familia de
proteínas codificadas por los genes KCNE (MiRP1 a MiRP4) (McCrossan y Abbott, 2004;
Bendahhou y cols., 2005).

IV.c. Canalopatías asociadas a las subunidades Kv7.1 y minK

Diferentes mutaciones en los genes que codifican las subunidades Kv7.1 y minK se han
relacionado con la aparición de SQTL, Síndrome de Jarwel Langer Nielsen (SJLN), SQTC y
FA familar.
Los SQTL asociados a la IKs se deben a mutaciones en los genes que codifican las
subunidades Kv7.1 y minK (SQTL1 y SQTL5, respectivamente) y se caracterizan por una
pérdida/disminución en la función de los canales resultantes (Chouabe y cols., 1997; Schulze-
Bahr y cols., 1997; Splawski y cols., 2000; Kass y Moss, 2003). De todas ellas, las
mutaciones en la subunidad Kv7.1 son responsables de alrededor del 50% de los casos de
SQTL (Roberts, 2006). Además, se ha descrito una mutación en el gen que codifica la
proteína yotiao (proteína de anclaje para la PKA, AKAP, A-Kinase Anchoring Protein) que
también cursa con prolongación del intervalo QT (SQTL11) (Chen y cols., 2007). La
regulación β-adrenérgica de la IKs requiere el ensablaje de la proteína yotiao con la subunidad
α Kv7.1 (Marx y cols., 2002).
Existen además otras mutaciones en los genes KCNQ1 y KCNE1 relacionadas con la
aparición del SJLN (síndrome de Jervell y Lange-Nielsen), variante autosómica recesiva del
SQTL, que se caracterizan por una pérdida/disminución en la función de los canales que se
forman (Chouabe y cols., 1997; Splawski y cols., 2000; Kass y Moss, 2003).
Por otra parte, se ha descrito una mutación en la subunidad α Kv7.1 (Val307Leu) que
produce una ganancia de función del canal y que está relacionada con la aparición de SQTC
(SQTC2) (Bellocq y cols., 2004) y mutaciones en Kv7.1 (Chen y cols., 2003b) y minK (Yang
y cols., 2004) que se caracterizan también por producir una ganancia de función de los canales
que generan y que se han asociado con la aparición de FA familiar.

51
 INTRODUCCIÓN

2.3.2. Canales 4TM/2P

Los canales 4TM/2P (también llamados K2P) se ensamblan como dímeros y generan
corrientes “de fondo” (background) en una gran variedad de tejidos, aunque en el tejido
cardiaco sus niveles de expresión son muy bajos o incluso nulos (Lesage y Lazdunski, 2000).
Desde que se clonó el primer canal de esta familia, el canal TASK-1 (Lesage y cols.,
1996), se han clonado un gran número de estos canales que se clasifican en diferentes familias
basándose en sus características farmacológicas y funcionales (Lesage y Lazdunski, 2000). A
nivel cardíaco se han identificado 5 familias:

Familia Canal Gen Cromosoma Localización

TWIK K2P1.1 (TWIK-1) KCNK1 1q42 SNC, corazón, placenta, pulmón, hígado,
riñón, páncreas
K2P6.1 (TWIK-2) KCNK6 19q11 SNC, corazón, placenta, pulmón, hígado,
riñón, páncreas, leucocitos
K2P7.1 (TWIK-3) KCNK7 11q12 SNC, ME, corazón, pulmón, hígado,
placenta, páncreas
K2P8.1 (TWIK-4) KCNK8 11q12
TREK/ K2P2.1 (TREK-1) KCNK2 1q41 SNC, corazón, placenta, pulmón, riñón
TRAAK K2P10.1(TREK-2) KCNK10 14q32 SNC, páncreas, bazo, testículos
K2P4.1 (TRAAK) KCNK4 11q12 SNC, ME, corazón, placenta, pulmón,
hígado, riñón, bazo, testículos, retina
TASK K2P3.1 (TASK-1) KCNK3 2p24 SNC, ME, corazón, placenta, pulmón,
hígado, riñón, testículos, bazo, retina,
intestino, piel, útero
K2P5.1 (TASK-2) KCNK5 6p21.1 SNC, ME, corazón, hígado, pulmón,
riñón, páncreas, intestino, útero
K2P9.1 (TASK-3) KCNK9 8q24.3 SNC, corazón, hígado, pulmón, placenta,
páncreas, testículos, leucocitos
K2P14.1 (TASK-4) KCNK14
K2P15.1 KCNK15 20q12 SNC, ME, placenta, testículos, páncreas
(TASK-5/KT3.3)
TALK K2P16.1 (TALK-1) KCNK16 6p21 Páncreas
K2P17.1 (TALK-2) KCNK17 6p21 SNC, corazón, placenta, pulmón, hígado,
páncreas, testículos, ovario, leucocitos
THIK K2P13.1 (THIK-1) KCNK13 14q32 SNC, ME, corazón, pulmón, hígado,
riñón, bazo, testículos
K2P12.1(THIK-2) KCNK12 2p21 SNC, ME, corazón, pulmón, hígado,
riñón, bazo, testículos
Tabla 12. Familias de canales de K+ 4TM/2P. ME: Músculo esquelético. SNC: Sistema nervioso central.
[Adaptada de Nerbonne y Kass, 2005]

• Los canales TWIK (Tandem of P domains in Weak Inward rectifier K+ channels), que
presentan una pequeña rectificación interna.

52
 INTRODUCCIÓN

• Los canales TREK/TRAAK (TWIK-RElated K+ channels y TWIK-Related Arachidonic

Acid-stimulated K+ channels), que son activados por ácidos grasos poliinsaturados y por la
distensión de la membrana (strech).
• Los canales TASK (TWIK-related Acid-Sensitive K+ channels), que son sensibles a la
acidosis.
• Los canales TALK (TWIK-related ALkalosis-activated K+ channels), que son sensibles a la
alcalosis.
• Los canales THIK (Tandem pore domain Halothane Inhibited K+ channels), que son
inhibidos por halotano.

Posteriormente, se adoptó una nueva nomenclatura para nombrar estos canales (K2Px.y) y
los genes que los codifican (KCNK1 a KCNK17) (Tabla 12). Los canales K2P poseen una
región central muy conservada (segmentos TM1 a TM4) y una gran diversidad en los
extremos C- y N-terminales intracelulares (Figura 11B). En estos canales se conserva la
secuencia G(Y/F)G en el primer poro, aunque en el segundo poro es reemplazada por la
secuencia G(F/L)G. El hecho de que los canales K2P estén abiertos de forma casi continua
sugiere su posible implicación en la regulación del Em y de la excitabilidad celular (Lesage y
Lazdunski, 2000; Patel y Honoré, 2001; O’Connell y cols., 2002).

3. CANALES 2TM/1P

Los canales 2TM/1P, también denominados canales de K+ rectificadores internos (Kir),

desempeñan varias funciones importantes como el control de la señalización neuronal, la
frecuencia cardíaca o la liberación de insulina. Desde un punto de vista evolutivo, los canales
2TM/1P son los más antiguos y su estructura recuerda a los S5 y S6 de los canales Kv. Sin
embargo, los canales Kir carecen de una estructura semejante al aparato sensor de voltaje de
los canales Kv (S1 a S4), lo que concuerda con los estudios electrofisiológicos que
demuestran que la conductancia de los canales Kir depende de la diferencia entre el Em y el
EK, y no sólo del Em.

3.1. Una familia de canales de K+ con rectificación interna

Hace 60 años se describió por primera vez el fenómeno de la rectificación interna. En

1949, Bernard Katz (Katz, 1949) describió en el músculo esquelético una nueva corriente de

53
 INTRODUCCIÓN

K+ cuya amplitud, al contrario de lo descrito hasta entonces, aumentaba a potenciales más

negativos del EK y disminuía con potenciales despolarizantes. En los años siguientes, se
demostró la presencia de corrientes rectificadoras internas similares en el músculo cardíaco de
diferentes especies (Weidmann, 1955; Hutter y Noble, 1960; Rougier y cols., 1968; Mascher
y Peper, 1969; Beeler y Reuter, 1970) y se describieron las principales características de esta
rectificación interna. Pero no fue hasta los años 90, con el auge de las técnicas de biología
molecular, cuando se consiguieron clonar los primeros canales que generaban este tipo de
corrientes (Ho y cols., 1993; Kubo y cols., 1993a y 1993b) y describir los mecanismos
moleculares de la rectificación interna (Fakler y cols., 1994; Ficker y cols., 1994; Lopatin y
cols., 1994; Fakler y cols., 1995). Posteriormente, los estudios genéticos y el uso de modelos
animales han permitido la identificación y caracterización de mutaciones de estos canales que
son responsables de alteraciones que afectan la excitabilidad cardíaca.

Familia Corriente Proteína Gen Cromosoma Localización

Kir1 (ROMK) Kir1.1-1.3 KCNJ1 17q25 Riñón, corazón, páncreas
Kir2 (IRK) IK1 Kir2.1 KCNJ2 17q23.1-24.2 Corazón, SNC, ME, ML,
pulmón, placenta, riñón
IK1 Kir2.2 KCNJ12 17p11.1 Corazón
IK1 Kir2.3 KCNJ4 22q13.10 Corazón, SNC, ME
Kir2.4 KCNJ14 19q13.1-13.3 Corazón, SNC, retina
Kir3 (GIRK) IK,ACh Kir3.1 KCNJ3 2q24.1 Corazón, cerebelo
Kir3.2 KCNJ6 21q22.13-22.2 Corazón, páncreas
Kir3.3 KCNJ9 1q21-23 SNC
IK,ACh Kir3.4 KCNJ5 11q24 Corazón, páncreas
Kir4 (BIR10) Kir4.1 KCNJ10 1q22-q2 Glía
Kir4.2 KCNJ15 21q22.2 Riñón, pulmón, SNC
Kir5 Kir5.1 KCNJ16 17q23.1-24.2 SNC, SNP
Kir6 IK,ATP Kir6.1 KCNJ8 12p11.23 Heterogénea
IK,ATP Kir6.2 KCNJ11 11p15.1 Heterogénea
Kir7 Kir7.1 KCNJ13 2q37 SNC, riñón, tiroides

Tabla 13. Familias de canales de K+ 2TM/1P en mamíferos. ME: Músculo esquelético. ML: Músculo liso.
SNC: Sistema nervioso central. SNP: Sistema nervioso periférico.

Tras el clonaje de los primeros canales Kir (Ho y cols., 1993; Kubo y cols., 1993a y
1993b), se han identificado muchas más proteínas pertenecientes a esta familia de canales.
Además, se ha unificado la nomenclatura de los genes que codifican las proteínas que forman
los canales Kir, que han sido nombrados como KCNJ. Actualmente, la familia de canales Kir
se compone de 7 subfamilias (Kir1 a Kir7) (Tabla 13), con distintas propiedades, diferente
distribución y más o menos bien definidas funciones fisiológicas para cada una de ellas (Kubo
y cols., 2005). Las proteínas Kir presentan entre 327 y 501 aminoácidos y una homología

54
 INTRODUCCIÓN

estructural de entre un 30 y un 40%, mientras que dentro de cada subfamilia el grado de

homología llega a alcanzar el 60%.
Los canales Kir se pueden dividir en 4 grupos: los canales que participan en el
mantenimiento del PR (Kir2), los canales acoplados a proteínas G (Kir3), los canales
sensibles a ATP (Kir6) y los canales transportadores de K+ (Kir1, Kir4 y Kir7).

3.2. La rectificación interna en los canales Kir

Los canales rectificadores internos representan una gran familia de canales de K+ en la que
sus miembros comparten bastantes semejanzas estructurales. Sin embargo, aunque todos los
canales Kir presentan una relación I-V con rectificación interna, existen grandes diferencias
en su grado de rectificación, su regulación y su distribución (Tabla 13). Las subfamilias Kir2
y Kir3 son las que presentan corrientes con una rectificación interna más marcada (los canales
que se han denominado como “muy rectificadores”) (Figura 22), similar a la originalmente
descrita por Katz en músculo esquelético (Katz, 1949). En el corazón, sólo hay dos corrientes
con estas características: la IK1, una corriente constitutivamente activa que presenta mayor
densidad en el ventrículo que en la aurícula, y la IK,ACh, una corriente activada por la
estimulación del receptor muscarínico M2 y que presenta mayor densidad en el tejido
auricular, en el nodo AV y en el nodo SA, donde juega un papel muy importante en la
regulación vagal de la frecuencia cardíaca.

A B Potencial de membrana (mV)

0.2
IKir2.1 normalizada
IKir2.1 normalizada

0.0
-170 -120 -70 -20
-0.2
1 mM [K+]e
Rectificación
-0.4
+
interna 4 mM [K ]e -0.6
Conductancia
óhmica
-0.8
-1.0
Potencial de membrana (mV) 10 mM [K+]e

Figura 22. Características de la rectificación interna en la IK1. (A) Relación I-V de la corriente IKir2.1. Se
muestra la corriente esperada si el comportamiento del canal siguiese la ley de Ohm (línea punteada). (B)
Efectos de la [K+]e sobre la IKir2.1. [Adapatadas de Dhamoon y Jalife, 2005 (A) y Gómez y cols., 2009 (B)]

Existe una tercera corriente cardíaca con rectificación interna, la IK,ATP, cuya actividad
está regulada por las concentraciones intracelulares de ATP y ADP, aunque es una corriente
que presenta una rectificación mucho más débil (Lopatin y Nichols, 2001; Anumonwo y
Lopatin, 2010).

55
 INTRODUCCIÓN

3.2.1. Propiedades de la rectificación interna “clásica”

Los canales iónicos se pueden considerar como resistencias eléctricas situadas en la

membrana plasmática que pasan cargas en forma de iones entre dos compartimentos (los
medios intra- y extracelular). Las resistencias que son independientes del tiempo y del voltaje
tienen una relación I-V lineal que se describe mediante la ley de Ohm:

(7) Voltaje = Intensidad · Resistencia

La rectificación interna se puede describir como una relación I-V no lineal donde aparece
una reducción muy marcada y dependiente de voltaje de la amplitud de la corriente conforme
se produce la despolarización de la membrana. Esta reducción, que tiene lugar
aproximadamente en el rango de potenciales entre -60 y -20 mV, presenta lo que se denomina
como “pendiente negativa” (Figura 22A), que es característica de este tipo de canales. Como
resultado de esta relación I-V no lineal, se obtiene una corriente mayor en un sentido que en
otro: los canales de K+ que presentan rectificación interna generan una corriente de entrada de
gran amplitud a potenciales más negativos del EK, mientras que a potenciales más positivos
generan una corriente de salida de mucha menor amplitud (Figura 22).
Otra propiedad exclusiva de estas corrientes es que la rectificación presenta dependencia
de la [K+]e. Concretamente, un aumento de la [K+]e produce una despolarización del EK, un
aumento de la probabilidad de apertura y el desplazamiento hacia potenciales más positivos
de la relación I-V (en paralelo al desplazamiento del EK), dando lugar a un fenómeno de
“sobrecruzamiento” (o crossover) entre las relaciones I-V obtenidas para cada una de las
diferentes [K+]e (Figura 22B). Una importante consecuencia de este fenómeno es que la
amplitud de la corriente aumenta a potenciales más positivos del punto de “sobrecruzamiento”
en lugar de disminuir, como sería de esperar debido a la reducción de la fuerza electromotriz
que se produce al aumentar la [K+]e (Figura 22B).

3.2.2. Mecanismos moleculares de la rectificación interna

Hace 40 años, Clay Armstrong sugirió que la rectificación interna de estos canales podría
deberse al bloqueo dependiente de voltaje del poro iónico por una molécula cargada
positivamente, y que la disociación de este bloqueante de su sitio de unión al canal por el K+
extracelular explicaría la anómala dependencia de la [K+]e que presenta la corriente de salida
(Armstrong, 1969). A finales de los años 80, se demostró que el Mg2+ intracelular puede

56
 INTRODUCCIÓN

ocasionar la rectificación interna de la IK1 en miocitos ventriculares a través del bloqueo del
poro del canal (Matsuda y cols., 1987; Vandenberg, 1987). Sin embargo, las propiedades de la
rectificación ocasionada por el Mg2+ no son suficientes para describir cuantitativamente la
fuerte rectificación que exhibe esta corriente, ya que la dependencia de voltaje del bloqueo
producido por el Mg2+ es débil, y en muchas células la rectificación persiste aún cuando se
elimina el Mg2+ (Oliva y cols., 1990; Martin y cols., 1995). El modelo de rectificación interna
basado en una partícula inactivante volvió a ser tenido en consideración poco tiempo después
gracias al clonaje de los primeros canales Kir a principios de los 90 (Ho y cols., 1993; Kubo y
cols., 1993a y 1993b), que facilitó el estudio de los procesos de rectificación. A partir de
entonces, diversos trabajos demostraron que las propiedades básicas de la rectificación interna
se podían explicar por el potente bloqueo dependiente de voltaje producido por una familia de
cationes orgánicos intracelulares denominados poliaminas (espermina, espermidina y
putrescina) (Fakler y cols., 1994; Ficker y cols., 1994; Lopatin y cols., 1994; Fakler y cols.,
1995).
Las poliaminas están presentes en todos los tipos celulares y sus concentraciones
intracelulares alcanzan el rango milimolar bajo (Cohen, 1998). Sin embargo, sólo las
poliaminas libres originan la rectificación de los canales Kir (Yan y cols., 2005) y la mayoría
de las poliaminas se encuentran unidas a diferentes moléculas intracelulares como el ADN, el
ARN o el ATP (Watanabe y cols., 1991). Entre las poliaminas, la espermina (tetravalente) es
la más potente a la hora de ocasionar rectificación interna, seguida de la espermidina
(trivalente), la putrescina (divalente) y los iones Mg2+ (Lopatin y cols., 1994). De acuerdo con
el mecanismo de la rectificación interna que se ha descrito, la “activación” de los
rectificadores internos con la hiperpolarización de la membrana se debe a la disociación de las
poliaminas y el Mg2+ de sus sitios de unión en el poro. La espermina es la que presenta una
cinética de disociación más lenta, mientras que la disociación tanto de putrescina como de
Mg2+ es prácticamente instantánea (Lopatin y cols., 1995; Ishihara, 1997).

3.2.3. Determinantes moleculares de la rectificación interna

Se han identificado varios aminoácidos que resultan críticos en la rectificación de los

canales Kir. Entre ellos destacan un ácido aspártico localizado en el M2 a la altura de la
cavidad hidrófila (correspondiente al D172 en la subunidad Kir2.1) (Lu y MacKinnon, 1994;
Stanfield y cols., 1994; Yang y cols., 1995a) y dos ácidos glutámicos localizados en la
porción citoplásmica (correspondientes a los residuos E224 y E299 en la subunidad Kir2.1)
(Yang y cols., 1995a; Kubo y Murata, 2001; John y cols., 2004).

57
 INTRODUCCIÓN

Se ha demostrado que las poliaminas se unen con gran afinidad a un sitio próximo tanto al
D172 como al filtro de selectividad, mientras que el anillo acídico formado por el E224 y el
E299 constituye un sitio de unión de baja afinidad (Figura 23) (Xie y cols., 2003; John y cols.,
2004). Ambos sitios parecen actuar de forma coordinada, sirviendo el anillo formado por los 8
ácidos glutámicos (2 por cada subunidad) como un primer sitio de unión que no ocluye el
poro totalmente, pero que favorece la posterior unión al residuo D172, lo que produce
entonces el bloqueo completo del poro y el cese del paso de iones K+ a su través (Figura 23C)
(Xie y cols., 2003). Además, la gran longitud del poro permite la unión de dos o más
moléculas de espermina (la poliamina de mayor longitud con ≈16-18 Å) a un mismo tiempo.
Sin embargo, estos residuos no son los únicos responsables de la rectificación y, de hecho, se
ha demostrado la implicación de otros residuos cargados (los ácidos aspárticos en las
posiciones 255 y 259, principalmente) (Pegan y cols., 2005; Fujiwara y Kubo, 2006; Kurata y
cols., 2007).
Se ha relacionado la cantidad de cargas negativas presentes en la cavidad hidrófila del
poro con el grado de rectificación que presenta el canal (Pegan y cols., 2005). Así, los canales
que presentan mayor rectificación (Kir2) presentan 5 cargas negativas (los residuos D172,
E224, D255, D259 y E299 en Kir2.1) mientras que un canal poco rectificador como es el
Kir6.2 sólo presenta 1 de estas cargas. En este sentido, la introducción de un residuo cargado
negativamente adicional orientado hacia la cavidad hidrófila del poro en este canal le confiere
características de canal muy rectificador (Kurata y cols., 2004).
Sin embargo, la cantidad de cargas negativas no es capaz de explicar por sí sola el
fenómeno de la rectificación ya que existen excepciones, como el canal Kir4.1 (muy
rectificador, aunque presenta “sólo” 3 cargas) (Fakler y cols., 1996a) o el canal Kir7.1 (poco
rectificador, aunque también presenta 3 cargas) (Döring y cols., 1998).
A pesar de todos los estudios existentes sobre el fenómeno de la rectificación inducido por
poliaminas, existen ciertos detalles del mecanismo de bloqueo, como el origen de la
dependencia de voltaje de la rectificación (Shin y Lu, 2005) o la identificación de los sitios de
unión de las poliaminas (Kurata y cols., 2006 y 2007), que siguen sin estar plenamente
resueltos. Por ello, diversos autores han propuesto mecanismos diferentes para explicar la
rectificación (Aleksandrov y cols., 1996; Lee y cols., 1999).

3.3. Estructura de los canales 2TM/1P

La arquitectura general de los canales Kir y los principales determinantes moleculares de

su permeabilidad al K+ y la rectificación han sido ampliamente descritos. A partir de las

58
 INTRODUCCIÓN

estructuras cristalizadas de diferentes canales bacterianos homólogos primero (Doyle y cols.,

1998; Jiang y cols., 2002a; Jiang y cols., 2002b; Kuo y cols., 2003), de la cristalización de la
estructura del dominio citoplásmico de varios canales Kir de mamíferos después (Nishida y
MacKinnon, 2002; Pegan y cols., 2005) y del canal Kir2.2 completo (Tao y cols., 2009) se ha
podido avanzar en el conocimiento de los aspectos fundamentales de la estructura y del
funcionamiento de este tipo de canales de K+ (Figura 25 y Tabla 14).

A B

Figura 23. Determinantes moleculares de la rectificación interna inducida por poliaminas. (A) Vista
superior de la región del poro citoplásmico de Kir2.1, con los residuos E224 y E299 orientados hacia el poro y 4
moléculas de diamina (DA8) unidas a ellos. (B) Representación esquemática de la geometría de la región del
poro citoplásmico en la que se muestran las distancias intra e intermoleculares entre los residuos E224 y E299.
(C) Modelo de coordinación entre el sitio de unión de las poliaminas en el poro transmembrana (D172) y los
sitios de unión en el poro citoplásmico (E224 y E299). [Adaptadas de Xie y cols., 2003]

Atendiendo a su secuencia, los canales Kir presentan una homología mayor que la de otros
canales de K+. Esta homología no se reduce sólo a los segmentos TM (como ocurre en los
canales Kv, por ejemplo), sino que se extiende desde aproximadamente 40 aminoácidos antes
del primer segmento TM (denominado M1) hasta alrededor de 200 aminoácidos más allá del
segundo segmento TM (denominado M2), lo que significa casi los dos tercios de la proteína y

59
 INTRODUCCIÓN

sugiere que estas regiones se encuentran formando una estructura organizada, posiblemente
con una función común para todos los canales Kir.

Canal Característica Resolución PDB id Especie Referencias

KcsA Activado por pH 2.0 Å 1BL8 Streptomyces lividans Doyle y cols., 1998
KcsA Activado por pH - 1F6G Streptomyces lividans Cortés y cols., 2001
MthK Activado por Ca 2+
3.30 Å 1LNQ Methanobacterium Jiang y cols., 2002b
thermoautotrophicum
Kir3.1 Domino intracelular 1.80 Å 1N9P Ratus norvegicus Nishida y
MacKinnon, 2002
KirBac1.1 Rectificador interno 3.65 Å 1P7B Burkholderia pseudomallei Kuo y cols., 2003
Kir2.1 Dominio 2.40 Å 1U4F Mus musculus Pegan y cols., 2005
intracelular
Kir3.1 Dominio 2.10 Å 1U4E Ratus norvegicus Pegan y cols., 2005
intracelular
KirBac3.1 Rectificador interno 9.0 Å 1XL4 Magnetospirillum Kuo y cols., 2005
magneticum
KirBac1.3 Quimera 2.20 Å 2QKS Burkholderia xenovorans Nishida y cols.,
+Kir3.1 +Mus musculus 2007

Kir2.2 Canal completo 3.10 Å 3JYC Gallus gallus domesticus Tao y cols.,
2009

Tabla 14. Canales 2TM/1P cuya estructura cristalográfica ha sido resuelta. PDB id: Número de acceso a la
estructura cristalizada y depositada en el Protein Data Bank.

• Dominio transmembrana
Los primeros canales 2TM/1P cristalizados fueron los canales bacterianos KcsA (Figura
25A) (Doyle y cols., 1998) y MthK (Figura 25B) (Jiang y cols., 2002a). La estructura resuelta
para ambos canales demuestra que están formados por cuatro subunidades α dispuestas
simétricamente alrededor de un poro central. Cada subunidad consta de dos segmentos TM
(M1 y M2) con una estructura de hélice α y los segmentos N- y C-terminales, que son
intracelulares. El M1 y el M2 están conectados por una secuencia de aproximadamente 30
aminoácidos (denominada “lazo P”) en la que se encuentra una porción con estructura en
hélice α (denominada H5) y el filtro de selectividad del canal (la secuencia T-X-G-Y(F)-G)
(Doyle y cols., 1998; Jiang y cols., 2002a). El segmento M2 tapiza la luz del poro, mientras
que el segmento M1 se encuentra orientado hacia el exterior del poro, embebido en la
membrana lipídica.
Mientras que el canal KcsA fue cristalizado en una configuración cerrada, el canal MthK
fue cristalizado en una configuración abierta, por lo que la resolución de ambas estructuras

60
 INTRODUCCIÓN

permitió una primera descripción de los cambios que se producen en el canal en las
transiciones entre ambos estados (Doyle y cols., 1998; Jiang y cols., 2002a). En el estado
abierto, las hélices de los segmentos M2 se desplazan hacia el exterior, de manera que la boca
intracelular del poro se ensancha y permite el flujo de iones desde el citoplasma hasta el filtro
de selectividad (Jiang y cols., 2002a). Este ensanchamiento en la boca citoplásmica del canal
es posible gracias a la presencia de un residuo glicina (en la posición 99 en el KcsA y en la 83
en el MthK) que le confiere flexibilidad y funciona a modo de bisagra (Perozo, 2002).
Posteriormente, se resolvió la estructura de los canales bacterianos KirBac1.1 (Kuo y
cols., 2003) y KirBac3.1 (Kuo y cols., 2005), muy similares a los canales anteriormente
descritos salvo por el hecho de que presentan una pequeña hélice adicional (formada por 11
residuos y denominada “slide helix”) situada en el extremo N-terminal del M1 y que se
dispone paralela a la membrana plasmática (Figura 25D). El canal KirBac1.1 presenta además
una fenilalanina en la posición 146 (en la región inferior del M2), similar a la que presenta el
canal KcsA en la misma región, que se ha propuesto que interviene en el control de la apertura
del poro (Kuo y cols., 2003). Comparado con el otro canal cristalizado en estado cerrado
(KcsA), el canal KirBac1.1 presenta una cavidad central hidrófila más pequeña (≈10 Å de
diámetro) y una diferente disposición de los aminoácidos del filtro de selectividad (Kuo y
cols., 2003).
Pese a la pequeña diferencia entre los radios atómicos del K+ (1.33 Å) y del Na+ (0.95 Å),
los canales de K+ son capaces de discriminar entre ambos con una selectividad superior a
1000 veces y conseguir una velocidad de conducción de ≈108 iones/s. El filtro de selectividad
se encuentra en una región del lazo P formada por una secuencia de aminoácidos altamente
conservada en todos los canales de K+ denominada “secuencia de selectividad al K+” y que se
caracteriza por presentar la secuencia T-X-G-Y(F)-G (Figura 24) (MacKinnon y Yellen,
1990; Heginbotham y cols., 1994).
Una vez en la cavidad central, el ion K+ pierde su capa de solvatación para acceder al
filtro de selectividad. Para compensar el coste energético que supone la deshidratación del ion
al atravesar el filtro, los átomos de oxígeno de los radicales carbonilos de los residuos T-X-G-
Y(F)-G hacen las veces de moléculas de agua, de manera que, durante su paso a través del
filtro de selectividad, los iones K+ se encuentran rodeados de ocho átomos de oxígeno en una
disposición similar a la que adoptan las moléculas de agua que rodean a los iones K+ en el
medio acuoso (Figura 24B) (Roux y MacKinnon, 1999; Zhou y MacKinnon, 2003). El menor
radio atómico del Na+ hace que la distancia hasta los átomos de oxigeno que lo rodean al

61
 INTRODUCCIÓN

atravesar el filtro de selectivodad sea mayor y, por tanto, su deshidratación no sea

energéticamente tan favorable como la de los iones K+.

A B

Figura 24 Representación esquemática del filtro de selectividad de los canales de K+. (A) Representación
esquemática de dos de las subunidades que forman el canal KcsA en una vista lateral, con la región que forma el
filtro de selectividad señalada en rojo. Los sitios de unión de los iones K+ se representan como esferas verdes y
las moléculas de agua como esferas rojas. (B) Detalle de la secuencia del filtro de selectividad del canal KcsA,
donde se representan como esferas verdes los cuatro posibles ocupados por los iones K+. [Adaptadas de Zhou y
MacKinnon, 2003]

Además, el filtro de selectividad presenta una longitud de ≈12 Å, por lo que se ha

postulado que a lo largo del filtro pueden llegar a encontrarse 2 iones K+ (≈2.7 Å) separados
por una molécula de agua (Morais-Cabral y cols., 2001; Zhou y MacKinnon, 2003), de
manera que la entrada del segundo ion produciría una repulsión electrostática mutua que
compensaría la atracción del filtro de selectividad por el primer ion K+ y produciría su salida
hacia el espacio extracelular (Doyle y cols., 1998).

• Dominio citoplásmico
Hasta la fecha se ha obtenido la estructura cristalizada del dominio intracelular del canal
KirBac1 (Kuo y cols., 2003) y de los canales de mamífero Kir3.1 (Figura 25C) (Nishida y
MacKinnon, 2002; Pegan y cols., 2005), Kir3.2 (Inanobe y Kurachi, 2011), Kir2.1 (Pegan y
cols., 2005) y Kir2.2 (Tao y cols., 2009; Hansen y cols., 2011). Todas estas estructuras
cristalizadas comprenden una pequeña porción del extremo N-terminal (aminoácidos del 41 al

62
 INTRODUCCIÓN

64 del Kir2.1, del 40 al 63 del Kir2.2 y del 41 al 63 del Kir3.1) y el extremo C-terminal casi
completo (aminoácidos del 189 al 428 del Kir2.1, del 188 al 427 del Kir2.2 y del 189 al 371

A Filtro de
selectividad B

C D EXTRACELULAR
transmembrana

Filtro de
selectividad
Poro

Slide helix
citoplásmico
Poro

INTRACELULAR

Figura 25. Canales 2TM/1P. (A) Estructura del canal KcsA en una visión lateral del tetrámero. (B) Estructura
cristalizada del canal MthK en el estado abierto (a la izquierda) y modelo hipotético de su configuración cerrada
(a la derecha). (C) Estructura del dominio intracelular del canal Kir3.1 en una visión superior (desde la
membrana hacia el citoplasma) (panel superior) y en una visión lateral (panel inferior). (D) Modelo de la
estructura de dos de las subunidades que forman los canales Kir2 basado en la estructura cristalográfica del
canal bacteriano KirBac1.1. Se pueden distinguir la slide helix (en rosa), los segmentos M1 y M2 (en verde y
amarillo, respectivamente), el lazo P (en azul) y el dominio citoplásmico (en rojo). [Adaptadas de Doyle y cols.,
1998 (A), Jiang y cols., 2002b (B), Nishida y MacKinnon, 2002 (C) y Kuo y cols., 2003 (D)]

del Kir3.1). Las estructuras de los canales Kir3.1 y Kir2.1 fueron resueltas en ausencia de
fosfatidilinositol-4,5-bifosfato (PIP2), por lo que se ha propuesto que representan el estado
cerrado del canal (Nishida y MacKinnon, 2002; Pegan y cols., 2005). Recientemente se han
podido cristalizar las estructuras de Kir2.2 y Kir3.2 en presencia de PIP 2 (Hansen y cols.,
2011; Whorthon y MacKinnon, 2011) ofreciendo una visión más amplia del estado abierto del
canal.

63
 INTRODUCCIÓN

H5

Lazo CD

Lazo G

Figura 26. Alineamiento de las secuencias de los canales Kir2.1, Kir3.1 y KirBac1.1. En gris, los diferentes
elementos de la estructura secundaria del dominoio transmembrana (M1, H5 y M2) y del dominio citoplásmico:
2 hélices α (αA y αB) y 14 segmentos β (βA a βN) y en recuadros rojos, los residuos que miran al poro
citoplásmico. Además, aparecen señalados los residuos GYG del filtro de selectividad (en rosa) y algunos
residuos relacionados con el síndrome de Andersen (en azul) o implicados en la rectificación (en verde).
[Adaptada de Pegan y cols., 2005]

El dominio citoplásmico de los canales Kir está formado por aminoácidos de las cuatro
subunidades del tetrámero y presenta importantes diferencias respecto a las estructuras
tetraméricas de los dominios T1 (Kreusch y cols., 1998) y de las subunidades β (Gulbis y
cols., 1999 y 2000) de los canales Kv ya que éstos no forman un poro central que permita el
paso de los iones K+, sino que su papel parece limitarse a mediar las interacciones entre las
subunidades del canal y de los canales con otras proteínas y ligandos intracelulares. La
longitud del dominio citoplásmico de los canales Kir es, al menos, la misma que la de la
porción transmembrana (Figura 25D), lo que hace que estos canales presenten un poro iónico
con una longitud total que es aproximadamente el doble de la de otros canales de K+ (≈60 Å)
(Nishida y MacKinnon, 2002; Pegan y cols., 2005). Además, diferentes estudios han
permitido determinar que el diámetro del poro citoplásmico es de alrededor de 20 Å en estado
abierto (Lu y cols., 1999) y de entre 7 y 15 Å en estado cerrado (Nishida y MacKinnon,
2002), es decir, lo suficientemente amplio como para permitir la presencia de los iones
hidratados en su interior en ambos casos.

64
 INTRODUCCIÓN

Las estructuras resueltas muestran una elevada organización en los dominios

citoplásmicos de los canales Kir3.1, Kir3.2, Kir2.1 y Kir2.2 (Nishida y MacKinnon, 2002;
Inanobe y Kurachi, 2011, Pegan y cols., 2005, Tao y cols., 2009, Hansen y cols., 2011),
habiéndose descrito la presencia de 2 hélices α (αA y αB) y 14 segmentos β (βA a βN)
(Figura 25). Básicamente, en cada subunidad se distinguen tres elementos: dos láminas β
(formadas por los segmentos βD, βE, βH y βI la primera y por los segmentos βB, βC, βG y
βJ la segunda) que se encuentran en el interior de cada subunidad, y una tercera lámina β
(formada por los segmentos βA, βL y βM) que se dispone en el exterior, cerca de la cara
interna de la membrana (Figuras 25 y 26) (Pegan y cols., 2005). En esta tercera lámina, cada
uno de los 4 segmentos βA, localizados en los extremos N-terminales, interacciona con el
extremo C-terminal de una subunidad vecina, por lo que se ha sugerido que estos segmentos
participan en el ensamblaje de los dominios citoplásmicos de las subunidades Kir.
La parte más estrecha del dominio citoplásmico (2.8-5.7 Å) la constituyen dos lazos
que se encuentran mirando hacia el poro, formados por los aminoácidos que se localizan entre
los segmentos βC y βD (el “lazo CD”) y entre los segmentos βH y βI (el “lazo G”) (Figura
26), y que se disponen como un anillo alrededor del eje del poro (Figuras 27A y B).
Curiosamente, ambos lazos se encuentran precedidos por un residuo glicina (la Gly215 antes
del lazo CD y la Gly300 antes del lazo G, según la numeración de Kir2.1), lo que sugiere que
son secuencias que presentan cierta flexibilidad y movilidad. De hecho, según las estructuras
cristalizadas de Kir2.1, Kir2.2, Kir3.1 y Kir3.2, los lazos G de ambos canales presentan
conformaciones diferentes, lo que confirma que se trata de estructuras suficientemente
flexibles como para permitir los cambios conformacionales que tienen lugar con la activación
del canal (Pegan y cols., 2005). La alanina en posición 306 se encuentra en la parte superior
del lazo G del canal Kir2.1 (Figura 27A) y constituye el punto de mayor estrechez del poro
citoplásmico. Según las estructuras cristalizadas de los dominios intracelulares de Kir2.1 y
Kir3.1, la apertura del poro iónico al nivel de esta Ala306 no es lo suficientemente amplia
como para permitir el paso del ion K+, lo que parece confirmar que ambas estructuras
representan el estado cerrado del canal. Estudios de mutagénesis demuestran que la
sustitución de esta alanina por cualquier otro aminoácido más voluminoso da como resultado
canales no funcionales, posiblemente porque se producen cambios en la conformación del
lazo G que impiden estéricamente el paso de iones K+ a través del poro (Pegan y cols., 2005).
En estructuras recientes se ha observado como el PIP2 facilita el desplazamiento de el lazo G
(Hansen y cols., 2011; Whorthon y MacKinnon, 2011).

65
 INTRODUCCIÓN

Se ha demostrado la participación de varios de los aminoácidos del lazo G en la

regulación de los canales Kir: a) la sustitución de la Cys311 del canal Kir2.1 por residuos
polares (serina), cargados (arginina) o alifáticos (alanina) reduce la probabilidad de apertura y
modifica el gating del canal Kir2.1 (Garneau y cols., 2003); b) la región Glu311-Gly335 del
canal Kir3.2 participa en la regulación por proteínas G de este canal (Ivanina y cols., 2004;
Clancy y cols., 2005); c) el lazo G participa en la dependencia del gating con el pH de los
canales Kir1.1 (Schulte y cols., 1998). Además, se ha propuesto que el lazo G puede
participar en el gating de los canales Kir por promover cambios alostéricos en el filtro de
selectividad o por modificar la afinidad por el PIP2 (Lu y cols., 2001; Garneau y cols., 2003;
Pegan y cols., 2005; Hansen y cols., 2011).
La cavidad central del poro citoplásmico presenta una alta concentración de residuos con
carga negativa (Nishida y MacKinnon, 2002; Pegan y cols., 2005), entre los que destacan dos
anillos acídicos: el primero formado por dos ácidos glutámicos (E224 y E299), y el segundo,
por dos ácidos aspárticos (D255 y D259) (Figuras 25B y 28A y B).
Como se ha mencionado previamente, ambos anillos están implicados en la rectificación
interna que presentan estos canales (Xie y cols., 2003; John y cols., 2004; Pegan y cols., 2005;
Fujiwara y Kubo, 2006; Kurata y cols., 2007). Dada la longitud del poro citoplásmico y la
concentración de cargas negativas que presenta, Nishida y MacKinnon (2002) han propuesto
la posibilidad de que se puedan concentrar varios iones K+ en esta región del poro. Como no
existen sitios específicos de interacción entre esta región del poro y dichos iones, éstos
estarían localizados al azar a lo largo del poro (Nishida y MacKinnon, 2002).
Con la despolarización de la membrana, se produciría la entrada en el poro de una
molécula de poliamina (cargada positivamente) desde el medio intracelular, lo que desplazaría
los iones K+ hacia el poro transmembrana y, de ahí, al medio extracelular. Posteriormente, la
interacción de la poliamina con sus sitios de unión bloquearía el poro completamente,
impidiendo el paso de más iones K+ (Nishida y MacKinnon, 2002). Este mecanismo
explicaría algunas de las características de la rectificación interna relacionadas con la
dependencia de voltaje del bloqueo producido por poliaminas y cationes intracelulares
(Lopatin y cols., 1994; Domene y cols., 2003).

66
 INTRODUCCIÓN

A A306

M301

E224

E229

D259

D255

Hélice αB Hélice αB

Figura 27. Estructura del dominio citoplásmico de los canales Kir. (A-B) Estructura cristalizada del dominio
citoplásmico del canal Kir2.1 (PDB: 1U4F) en vistas lateral (A) y superior (B). En diferentes colores, aparecen
señalados dos de los principales residuos del lazo G (M301, en naranja, y A306, en rojo) y los residuos de los
dos anillos acídicos: el anillo de ácidos glutámicos (E224 y E299, en azul claro y oscuro, respectivamente) y el
anillo de ácidos aspárticos (D255 y D259, en verde claro y oscuro, respectivamente).

La hélice α presente en el extremo C-terminal del dominio citoplásmico (la hélice αB)
protuye hacia el interior celular (Figuras 25C y 28A) (Nishida y MacKinnon, 2002). La
porción del extremo C-terminal que se extiende más allá del segmento βN (donde se incluye
esta hélice αB) presenta una homología mucho menor entre los diferentes canales Kir que el

67
 INTRODUCCIÓN

resto de la proteína, por lo que se puede descartar una función común de esta región para
todos ellos. Sin embargo, si se compara la secuencia de esta hélice αB de los miembros de
una misma subfamilia, la homología sigue siendo muy elevada, por lo que se ha propuesto
que puede estar participando en las interacciones del canal con otras proteínas o mediadores
intracelulares. Esto ocurre, por ejemplo, para los 4 canales Kir regulados por proteínas G
(canales Kir3.1-Kir3.4) (Yamada y cols., 1998), por lo que se ha sugerido que esta región
podría participar en la regulación de los canales Kir3 por proteínas G (Albsoul-Younes y
cols., 2001; Nishida y MacKinnon, 2002).
Más allá de la hélice αB, la estructura del extremo C-terminal no ha podido ser
cristalizada, lo que indica que esta región presenta una estructura extremadamente flexible y
desordenada y/o que para formar una estructura rígida precisa de la presencia del extremo N-
terminal completo (las estructuras de los dominios citoplásmicos cristalizados carecen de los
40 primeros aminoácidos de este extremo) o de otras proteínas citoplásmicas con las que
interacciona (Pegan y cols., 2005). A este respecto, en esta región se ha identificado un
dominio PDZ de interacción con proteínas de anclaje a la membrana (PSD-95, SAP90, PSD-
93, SAP97) (Cohen y cols., 1996; Nehring y cols., 2000; Inanobe y cols., 2002; Leonoudakis
y cols., 2004).

3.4. Principales corrientes cardíacas generadas a través de canales 2TM/1P

Dentro de la familia de canales Kir, las subfamilias Kir2, Kir3 y Kir6 son las que se
expresan en el tejido cardíaco: los canales Kir2 participan en la formación de los canales que
generan la IK1 (Lopatin y Nichols, 2001; Anumonwo y Lopatin, 2010), las subunidades Kir3.1
y Kir3.4 (pertenecientes al grupo de canales acoplados a proteínas G) forman el canal que
genera la IK,ACh, responsable de los efectos cronotrópicos e inotrópicos negativos observados
tras la estimulación vagal (Yamada y cols., 1998; Stanfield y cols., 2002), y las subunidades
Kir6 heteromerizan con el receptor de sulfonilureas (SUR) para formar los canales que
generan la corriente sensible a ATP (IK,ATP), responsable del acortamiento de la DPA que
ocurre durante la isquemia (Nichols y cols., 1996; Seino y Miki, 2003).

68
 INTRODUCCIÓN

3.4.1. La IK,ATP

En el corazón, la corriente rectificadora IK,ATP juega un importante papel durante la

isquemia miocárdica y en el precondicionamiento isquémico (Seino y Miki, 2003; Nerbonne
y Kass, 2005).

3.4.1.a. Características de la IK,ATP

Los canales KATP son inhibidos fisiológicamente por el ATP intracelular, lo que permite
acoplar el Em al metabolismo celular (Yokoshiki y cols., 1998; Seino y Miki, 2003). En el
mecanismo de rectificación intervienen los iones intracelulares Mg2+ y Na+, que bloquean el
canal en su estado abierto (Horie y cols., 1987).
Se ha demostrado que ratones Kir6.2-/- presentan una menor tolerancia al ejercicio
asociada a un aumento del volumen telesistólico residual, un inadecuado manejo del Ca2+,
arritmias ventriculares y muerte súbita tras la estimulación simpática, lo que sugiere que las
subunidades Kir6.2 son las responsables de la adaptación al estrés (Zingman y cols., 2002).

Figura 28. Estructura de los canales KATP. Modelo estructural del canal KATP cardíaco formado por 4
subunidades Kir6.2 (en rojo y amarillo) y 4 subunidades SUR2A (en azul). Cada subunidad Kir6.2 está formada
por 2 α-hélices TM y un largo dominio citoplásmico con un sitio de unión para el ATP. Cada subunidad SUR2A
contiene 3 dominios TM y 2 dominios de unión a nucleótidos (NBD) citoplásmicos. [Adaptada de Moreau y
cols., 2005]

3.4.1.b. Composición de los canales que generan la IK,ATP

El canal KATP cardíaco es el resultado de la asociación de 4 subunidades α Kir6.2 con 4

subunidades auxiliares SUR2A (Yokoshiki y cols., 1998; Seino y Miki, 2003). Las
subunidades α Kir6 están formadas por 2 segmentos TM (M1 y M2) y son las que confieren
al canal la capacidad de ser regulado por el ATP (Tucker y cols., 1996). Las subunidades

69
 INTRODUCCIÓN

auxiliares SUR2A tienen 3 dominios TM (TMD0, TMD1 y TMD2), constituidos por 5, 5 y 6

segmentos, respectivamente, y 2 dominios de unión a nucleótidos (NBD1 y NBD2,
Nucleotide Binding Domain), localizados en el lazo de unión entre TMD1 y TMD2 y en la
región C-terminal, respectivamente (Figura 28) (Conti y cols., 2001; Seino y Miki, 2003).
Estas subunidades son las que confieren al canal la sensibilidad al ADP, a las sulfonilureas y a
los “activadores” del canal (Yokoshiki y cols., 1998; Moreau y cols., 2000; Seino y Miki,
2003). La hidrólisis del ATP en los sitios NBD de SUR2A permite el paso de K+ a través de
la subunidad α Kir6.2 (Yokoshiki y cols., 1998; Seino y Miki, 2003). Sin embargo, hay
estudios que demuestran la existencia de canales KATP cardíacos sin la presencia de la
subunidad SUR (Pu y cols., 2001), por lo que la estructura molecular exacta del canal que
genera la IK,ATP en el miocardio sigue siendo controvertida.

3.4.1.c. Regulación de la IK,ATP

La IK,ATP se inhibe por el ATP intracelular, mientras que se activa por el adenosín
difosfato (ADP), por lo que podemos decir que la actividad de los canales que la generan está
regulada por el cociente ATP/ADP (Yellen, 2002). Además, al igual que en los canales
Kir2.1, el canal KATP está regulado por el PIP2 y otros lípidos de membrana. El PIP2 interactúa
directamente con dos residuos arginina del extremo C-terminal de las subunidad Kir6.2 (R176
y R177), estabilizando el estado abierto del canal y antagonizando la inhibición producida por
el ATP (Fan y Makielski, 1997; Lopatin y Nichols, 2001).
Farmacológicamente, la IK,ATP es inhibida por las sulfonilureas (glibenclamida, glicazida,
glipizida, glimepirida, tolbutamida) y por secretagogos de acción rápida como las glinidas
(repaglinida, nateglinida) y activada por fármacos como el pinacidilo, la rimakalima, el
nicorandil y la cromakalina. Los inhibidores de la IK,ATP previenen el acortamiento de la DPA
y la incidencia de FV durante la isquemia miocárdica (Sanguinetti y Salata, 1996; Grover y
Garlid, 2000). Por ello, pueden representar una nueva estrategia terapéutica en pacientes con
arritmias ventriculares y enfermedad coronaria. Sin embargo, los canales KATP están también
presentes en las células β pancreáticas y en el músculo liso, por lo que los bloqueantes de
estos canales podrían producir hipoglucemia y vasoconstricción coronaria, efectos que harían
disminuir sus ventajas como fármacos antiarrítmicos (Seino y Miki, 2003). Por su parte, los
activadores de la IK,ATP han demostrado efectos cardioprotectores en diversos modelos
experimentales miocárdicos de isquemia/reperfusión, así como en pacientes con infarto de
miocardio agudo (Sanguinetti y Salata, 1996; Grover y Garlid, 2000). Sin embargo, también
producen la activación de los canales KATP vasculares (formados por el ensamblaje de las

70
 INTRODUCCIÓN

subunidades Kir6.1 y SUR2B), ocasionándose una respuesta hipotensiva que limita su uso en
pacientes con infarto de miocardio (Seino y Miki, 2003). Estos activadores producen además
un marcado acortamiento de la DPA, lo que en pacientes con SQTL1 disminuye la dispersión
transmural de la repolarización y contribuye a suprimir la aparición de pospotenciales
precoces y tardíos (Di Diego y Antzelevitch, 1993; Shimizu y cols., 1998).

3.4.1.d. La IK,ATP en diversas patologías

La apertura de los canales KATP durante la isquemia miocárdica produce un acortamiento

en la DPA y una disminución en la entrada de Ca2+ a través de los canales tipo L. Ambos
efectos previenen la sobrecarga de Ca2+, preservan los niveles de ATP y aumentan la
supervivencia celular (Grover y Garlid, 2000; Gögelein, 2001). La activación de los canales
KATP juega un papel importante en el fenómeno de precondicionamiento isquémico, de tal
forma que los corazones expuestos a breves episodios de isquemia resisten mejor una
posterior oclusión coronaria prolongada, reduciendo el tamaño del infarto y la incidencia de
arritmias. Por contra, el acortamiento en la DPA, la acumulación de K+ extracelular, la
despolarización de la membrana y la disminución en la velocidad de conducción producidos
por la apertura de los canales KATP en condiciones de isquemia hacen al miocardio isquémico
más sensible a las arritmias por reentrada (Sanguinetti y Salata, 1996). Recientemente, se ha
sugerido este efecto en el precondicionamiento isquémico es debido a la activación del canal
KATP mitocondrial (mitoKATP), y no a la activación del canal KATP situado en el sarcolema
(sarcKATP) (Grover y Garlid, 2000), ya que los agonistas del mitoKATP reproducen los efectos
del precondicionamiento isquémico, mientras que los inhibidores selectivos de estos canales
suprimen la cardioprotección inducida en el precondicionamiento isquémico. El hecho de que
los canales mitoKATP y sarcKATP tengan propiedades farmacológicas diferentes plantea la
posibilidad de desarrollar nuevos fármacos que produzcan la apertura selectiva del canal
mitoKATP, con lo que se podrían evitar los efectos secundarios hemodinámicos y
electrofisiológicos de los activadores de los canales KATP de primera generación (no
selectivos).

3.4.2. La IK,ACh

A principios del siglo XX, Otto Loewi estableció el concepto de transmisión sináptica
química, tras la descripción de que la liberación de ACh producida tras la estimulación vagal
disminuía la frecuencia cardíaca (Loewi, 1921; Loewi y Navaratil, 1926). Sin embargo, hubo

71
 INTRODUCCIÓN

que esperar hasta la mitad de ese siglo para que Del Castillo y Katz describieran la
hiperpolarización de la membrana celular inducida por ACh en el corazón de rana (Del
Castillo y Katz, 1955). En los años 50, el grupo de Trautwein observó un incremento de la
conductancia al K+ tras la estimulación vagal (Hutter y Trautwein, 1955; Trautwein y Dudel,
1958). Posteriormente, analizaron la cinética de la IK inducida por ACh en el nodo SA de
conejo y propusieron que la ACh activaba una población específica de canales (a los que
llamaron KACh) que enlentecía la actividad marcapasos del nodo SA (Noma y Trautwein,
1978; Osterrieder y cols., 1981).

3.4.2.a. Características de la IK,ACh

La densidad de los canales KACh es muy alta en las células marcapaso de los nodos SA y
AV, donde regula la frecuencia cardíaca (Mark y Herlitze, 2000). Además, juega un papel
importante en el control de la DPA en el tejido auricular, donde la densidad de la IK,ACh es 6
veces mayor que en el ventricular (Schram y cols., 2002).
La ACh estimula los receptores muscarínicos M2 y produce la apertura de los canales
KACh que generan una corriente que se caracteriza principalmente por una activación de
cinética sigmoidal dependiente de tiempo y de la dosis de agonista, por lo que se tardan
cientos de ms en alcanzar el pico de corriente (Breitwieser y Szabo, 1988). Posteriormente, y
aunque la ACh esté todavía presente, se produce la disminución gradual de la corriente hasta
que se alcanza un nivel cercano al estado estable, denominado “quasi-steady-state” (Qss)
(Figura 29A) (Kurachi y cols., 1987a).
La apertura del canal KACh inducida tras la estimulación del receptor muscarínico M2 está
mediada por una proteína G heteromérica formada por una proteína Gα y un dímero Gβγ
(Yamada y cols., 1998). En ausencia de agonistas, la mayor parte de las proteínas Gα se
encuentran unidas al GDP, formando un complejo que posee una alta afinidad por la proteína
Gβγ. La estimulación del receptor muscarínico produce la disociación del complejo Gα-GDP,
lo que permite la formación del complejo Gα-GTP que, a su vez, promueve la disociación de
la proteína Gβγ de la Gα. El dímero Gβγ es la molécula que interactúa con el canal
promoviendo su activación (Figura 29D) (Yamada y cols., 1998). Se ha propuesto que la
desensibilización a corto plazo del canal está mediada por la transición del receptor
muscarínico M2 desde el estado de alta afinidad hasta el de baja afinidad. Esta transición se
debe a la disociación de las proteínas G del receptor tras la aplicación del agonista o por la
fosforilación del receptor muscarínico M2 y la desfosforilación del canal (Yamada y cols.,
1998).

72
 INTRODUCCIÓN

La activación de la IK,ACh hiperpolariza el Em, reduce la frecuencia de disparo de las

células de los nodos SA y AV y disminuye la velocidad de conducción a través de éste último,
efectos que explican por qué la estimulación vagal o la adenosina intravenosa pueden parar
las taquiarritmias por reentrada intranodal (Snyders, 1999; Tamargo y cols., 2004)

3.4.2.b. Composición de los canales que generan la IK,ACh

Hasta la fecha se han clonado 4 miembros de la familia Kir3 (Kir3.1 a Kir3.4) en

mamíferos y un quinto miembro (Kir3.5) en oocitos de Xenopus laevis (Hedin y cols., 1996).
En el corazón humano, los canales que generan la IK,ACh están formados por las
subunidades Kir3.1 y Kir3.4, que se ensamblan para formar una estructura tetrámerica que
presenta una estequiometría 2:2 (Dascal y cols., 1993; Krapivinsky y cols., 1995; Yamada y
cols., 1998). Por el contrario, la presencia de Kir3.2 y Kir3.3 es mínima o incluso nula
(Wickman y cols., 1998). Se ha demostrado que los ratones Kir3.4-/- presentan además una
disminución de la proteína Kir3.1 y una total ausencia de la IK,ACh en el corazón (Wickman y
cols., 1998).
Estos ratones tenían una frecuencia cardíaca normal en reposo, pero no desarrollaban
bradicardia tras la estimulación vagal. Se ha postulado que la subunidad Kir3.1 requiere la
presencia de la subunidad Kir3.4 para translocarse a la membrana celular y formar así el canal
funcional (Kennedy y cols., 1996; Yamada y cols., 1998). Las regiones N- y C-terminales de
la subunidad Kir3.1 son responsables de la unión de la proteína Gβγ al canal, aunque se ha
visto que el extremo N-terminal de la subunidad Kir3.4 también puede participar en esta
unión (Huang y cols., 1995; Tucker y cols., 1996). La unión de la proteína Gα al canal parece
estar mediada, al menos en parte, por el extremo N-terminal de la Kir3.1 (Huang y cols.,
1995).

3.4.2.c. Regulación de la IK,ACh

La IK,ACh es estimulada por el ATP intracelular, el PIP2 y la endotelina A (ETA) e inhibida

por la distensión de la membrana (dependiente de la subunidad Kir3.4) y la acidificación del
medio intracelular (Ji y cols., 1998; Shieh y cols., 2000; Tamargo y cols., 2004).
Para inhibir la IK,ACh de manera farmacológica se puede actuar tanto a nivel de los receptores
muscarínicos M2 como sobre el propio canal. Así, fármacos como la disopiramida, la
procainamida y la pilsicainida bloquean los receptores muscarínicos, mientras que la
flecainida y la propafenona actúan sobre el canal en estado abierto (Inomata y cols., 1993).

73
 INTRODUCCIÓN

También se ha demostrado que el bloqueo del canal por la quinidina y el verapamilo es

mediado, en parte, por un bloqueo de los receptores muscarínicos (Ito y cols., 1989). Además,
tanto el Ba2+ como el Cs+ han demostrado alta eficacia para bloquear los canales de K+
regulados por proteínas G. Estos cationes, cuando se aplican extracelularmente, inhiben la
IK,ACh de manera dependiente de voltaje, con una mayor potencia cuando el Em alcanza
valores más negativos (Carmeliet y Mubagwa, 1986).

A B

Corriente
Corriente basal
basal

Qss

Pico

C D
Receptor muscarínico M2
Ach
Subunidad GIRK1

Canal KAch
Proteína G

Sitio de unión de PIP2

Sitio de unión de la Gβγ

Sitio de unión
de la Gβγ, Gαβγ

Figura 29. Características de la IK,ACh y estructura de los canales KACh. (A) Curso temporal de la IK,ACh
inducida por carbacol (CCh) tras la aplicación del protocolo que se muestra en la parte superior. En la actividad
de la corriente se alcanza un pico de corriente seguida de una rápida desensibilización en la que se alcanza el
Qss. (B) Curva I-V en situación control y tras la aplicación de carbacol (CCh). (C) Esquema representativo de la
estructura de la subunidad Kir3.1, formada por 2 segmentos transmembrana (M1 y M2) unidos por el lazo H5 y
cuyos extremos N- y C-terminal son intracelulares. Se indican los sitios de unión de proteínas G y de PIP2. (D)
Representación esquemática del proceso de activación del canal KACh por proteínas G en respuesta a la
activación del receptor muscarínico M2 tras la unión de ACh. [Adaptadas de Dobrev y cols., 2005 (A-B) y
Yamada y cols., 1998 (C-D)]

3.4.3. La IK1

Hace más de 50 años, cuando la técnica de registro con dos microelectrodos estaba apenas
empezando a desarrollarse, uno de sus pioneros, Silvio Weidmann (Weidmann, 1955),
demostró que en las fibras de Purkinje del corazón de oveja existía una corriente rectificadora

74
 INTRODUCCIÓN

interna (denominada posteriormente IK1) similar a la que Bernard Katz había descrito en
músculo esquelético en 1949 (Katz, 1949). Esta corriente presentaba su mayor densidad a
voltajes alrededor del potencial de membrana y disminuía con la despolarización de la
membrana. Corrientes similares fueron descritas después en trabéculas y músculos papilares
de ventrículo de perro (Mascher y Peper, 1969; Beeler y Reuter, 1970), así como en tejido
auricular (Rougier y cols., 1968). A pesar de que estos estudios no profundizaban en el
mecanismo de rectificación interna, describían por primera vez las principales características
de la IK1, así como su significado funcional a la hora de estabilizar el PR celular (Hutter y
Noble, 1960; Hall y cols., 1963; Noble, 1965; McAllister y Noble, 1966).
A potenciales más negativos que el PR, la IK1 presenta una conductancia mucho mayor
que cualquier otra corriente, por lo que es la corriente encargada de fijar el PR cerca del EK.
Posteriormente, cuando llega el pulso despolarizante, los canales se mantienen cerrados
durante toda la fase de meseta y se abren a potenciales más negativos que -20 mV. Por todo
ello, la IK1 contribuye también a la parte final de la fase 3 de la repolarización.

3.4.3.a. Rectificación interna y excitabilidad cardíaca

Las especiales características de la rectificación interna que exhiben los canales Kir2
hacen suponer que juega un papel fundamental en la estabilización del PR celular y en la fase
final de la repolarización (fase 3) del PA cardíaco, siendo su contribución a la fase de meseta
mínima o inexistente. De hecho, Zaritsky y cols. (2000, 2001) han demostrado en ratones
Kir2.1-/- que la supresión de la IK1 produce un aumento de la actividad espontánea en miocitos
ventriculares disociados y una prolongación de la DPA (Zaritsky y cols., 2000 y 2001). De la
misma forma, una supresión superior al 90% de la IK1 en ratones transgénicos mediante la
transfección de un dominante negativo de Kir2.1 (Kir2.1-AAA, que forma canales no
funcionales porque se elimina el filtro de selectividad) produce una prolongación de la DPA y
de los intervalos QRS y QT (McLerie y Lopatin, 2003). Sorprendentemente, el PR de los
miocitos ventriculares de estos ratones no se modificaba (McLerie y Lopatin, 2003). También
se han descrito graves alteraciones cardíacas en corazones de cobayos en los que se suprimía
la IK1 mediante la transfección por adenovirus de dominantes negativos Kir2.1-AAA: además
de la esperada prolongación del PA, algunos miocitos presentaban actividad marcapasos y, en
el 40% de estos animales, los registros del ECG mostraban latidos prematuros de origen
ventricular (Miake y cols., 2002 y 2003).
También importante, aunque en cierta forma inesperado, es el hecho de que el aumento de
la IK1 en ratones transgénicos ocasionado por la sobreexpresión de Kir2.1 produce múltiples

75
 INTRODUCCIÓN

alteraciones de la excitabilidad cardíaca entre las que se incluyen un acortamiento

significativo de la DPA y varios tipos de arritmias auriculares y ventriculares (Li y cols.,
2004; Piao y cols., 2007b). Noujaim y cols. (2007) han demostrado que este aumento de la IK1
permite la estibilización de las fuentes de reentrada de alta frecuencia (denominadas rotores),
actividad que se suprimía tras la aplicación de concentraciones bajas de Ba2+ (Noujaim y
cols., 2007).
Cada vez hay más evidencias de que una excesiva heterogeneidad en la repolarización es
un factor que determina la aparición de inestabilidad eléctrica en el corazón, insistiendo en la
importancia del papel que juega la IK1 en la estabilidad eléctrica cardíaca. En este sentido,
estudios realizados en corazones de cobayo sugieren que el gradiente existente entre la
amplitud de la IK1 del ventrículo izquierdo y la del derecho puede contribuir a la estabilización
de las arritmias por reentrada en el ventrículo izquierdo (Samie y cols., 2001). Por otra parte,
se ha demostrado que el bloqueo de la IK1 es fundamental para la terminación de arritmias
ventriculares inducidas en corazones de animales de esta misma especie (Warren y cols.,
2003). Asimismo, experimentos en los que se suprimen/sobreexpresan los canales Kir2.1 en
un cultivo en monocapa de cardiomiocitos neonatales de rata han demostrado la importancia
de la heterogeneidad de la IK1 en la génesis y mantenimiento de las arritmias (Sekar y cols.,
2009).
La marcada e inusual dependencia de la [K+]e que presenta la IK1 es otro de los
mecanismos por el que esta corriente participa en la regulación de la excitabilidad cardíaca.
La actividad normal del corazón conlleva grandes variaciones de la [K+] en el reducido
espacio intercelular (entre 0.01 y 5 µM) (Kline y Morad, 1976; Kline y cols., 1980). Es más,
en las fibras de Purkinje, la [K+]e puede sufrir un aumento transitorio con cada latido hasta
alcanzar concentraciones en el rango milimolar (Kline y cols., 1980) e incluso existen
regiones o estructuras celulares, como los túbulos T, donde la acumulación de K+ puede llegar
a ser mayor (Almers, 1972; Clark y cols., 2001). El incremento de la IK1 asociado a esos
aumentos transitorios de la [K+]e tiene consecuencias en la actividad eléctrica cardíaca,
modificando, por ejemplo, la DPA o la propagación del impulso cardíaco (Kline y cols., 1980;
Coulombe y Coraboeuf, 1983; Nygren y Giles, 2000).
Se ha descrito que la amplitud de la corriente de salida de la IK1 depende en gran medida
de la velocidad con la que se repolariza la membrana (y, consiguientemente, de la
repolarización del PA) (Ishihara, 1997; Ishihara y Ehara, 1998). Como se ha mencionado, la
unión de las poliaminas y el Mg2+ al canal depende del Em, por lo que la velocidad de
repolarización de la membrana estaría afectando a las cinéticas de asociación/disociación
estos compuestos y, por tanto, a la amplitud de la IK1.

76
 INTRODUCCIÓN

Por último, a pesar de que está ampliamente descrito el papel de la IK1 en la fase final de la
repolarización del PA y su participación en la onda T del ECG, se desconoce qué corriente es
la responsable (o si hay más de una corriente) de la aparición de la onda U. Sin embargo, un
reciente estudio puede haber contribuido a responder este viejo enigma: el análisis de los ECG
de pacientes portadores de diferentes mutaciones en el gen que codifica el canal Kir2.1 ha
demostrado que amplitud de la onda U viene determinada por la densidad de la IK1 (Postema y
cols., 2009).

3.4.3.b. Localización de la IK1

La IK1 presenta una gran densidad en los ventrículos, mientras que su densidad es
significativamente menor en las aurículas en todas las especies estudiadas (Shah y cols., 1987;
Giles e Imaizumi, 1988; Varro y cols., 1993; Melnyk y cols., 2002; Dhamoon y cols., 2004)
excepto en el ratón (Lomax y cols., 2003). Las propiedades de la rectificación de la IK1
también varían entre células ventriculares y auriculares, ya que a potenciales despolarizantes,
la corriente de salida de K+ es prácticamente nula en células auriculares, mientras que en las
ventriculares presenta una gran amplitud (Giles e Imaizumi, 1988; Koumi y cols., 1995a).
Estas diferencias en la rectificación pueden deberse a que la composición de los canales que
generan la IK1 en ambas cámaras sea distinta, a que éstos presenten diferente sensibilidad a las
poliaminas, a que las concentraciones intracelulares de poliaminas sean diferentes en
aurículas y ventrículos o a una mezcla de todas ellas. La densidad de la IK1 es también
diferente entre ventrículos y entre las distintas regiones de un mismo ventrículo. De manera
general, la IK1 es mayor en el ventrículo derecho que en el izquierdo (Brunet y cols., 2004;
Panama y cols., 2007), aunque existen excepciones como el cobayo, donde es justo al
contrario (izquierdo > derecho) (Warren y cols., 2003). En el ventrículo izquierdo del ratón, la
densidad de la IK1 es mayor en miocitos apicales que en miocitos epicárdicos (Brunet y cols.,
2004), mientras que en el ventrículo izquierdo de gato, la IK1 es mayor en las células
endocárdicas que en las epicárdicas (Furukawa y cols., 1992).
La densidad de la IK1 es pequeña en las células del nodo SA de ratón y de rata (Shinagawa
y cols., 2000; Cho y cols., 2003) e indetectable en las mismas células de conejo (Shinagawa y
cols., 2000). La menor presencia de la IK1 en las células del nodo SA permite mantener un PR
relativamente despolarizado (≈-50 mV) en comparación con el de las células ventriculares (≈-
80 mV), donde la IK1 presenta una mayor densidad (Schram y cols., 2002). La ausencia de la
IK1 en células del nodo AV de conejo (Kokubun y cols., 1982; Munk y cols., 1996) contrasta
con la gran IK1 registrada en células del nodo AV de cobayo (Yuill y Hancox, 2002).

77
 INTRODUCCIÓN

En prácticamente todos los tipos celulares cardíacos en los que se ha registrado la IK1, se
ha identificado la presencia de canales Kir en la membrana externa del sarcolema
(Anumonwo y Lopatin, 2010). La presencia de dichos canales en la membrana de los túbulos
T es indiscutible, ya que la pérdida de los túbulos T que se produce a corto plazo en miocitos
en cultivo se acompaña de una reducción significativa de la IK1 (Lipp y cols., 1996; Mitcheson
y cols., 1996; Christe, 1999). Estos resultados se han visto confirmados además mediante
experimentos en los que se estudia el efecto de la acumulación/depleción de K+ en los túbulos
T sobre la corriente. Clark y cols. (2001) han demostrado que en miocitos ventriculares de
ratón se produce un aumento significativo de las corrientes de cierre de la IK1 en respuesta a
un gran flujo de salida de iones K+ previo (con el consiguiente aumento de la [K+]e), lo que es
consistente tanto con la acumulación de K+ en el espacio intercelular como con la localización
de la IK1 en el restringido espacio de los túbulos T (Clark y cols., 2001). Además, el marcaje
mediante anticuerpos específicos para Kir2.1, Kir2.2 y Kir2.3 demuestra la localización de
éstos en los túbulos T de los miocitos ventriculares (Clark y cols., 2001; Leonoudakis y cols.,
2001; Melnyk y cols., 2002). Otros experimentos han demostrado una gran expresión de
Kir2.3 (comparada con Kir2.1) en las membranas de los discos intercalares de miocitos
auriculares y ventriculares de perro (Melnyk y cols., 2002).
La localización intracelular de los canales Kir2 esta mediada por secuencias de
aminoácidos contenidas en el dominio citoplasmático (Ma y cols., 2001; Hibino y cols.,
2010). La secuencia de exportación del retículo endoplasmatico es F-C-Y-E-N-E y
probablemente sea distinta a la de otros canales Kir (Ma y cols., 2001; Stockklausner y cols.,
2001). Del retículo endoplasmatico los canales pasan al aparato de Golgi y la exportación
desde el aparato de Golgi a la membrana plasmática depende mayoritariamente de dos grupos
de residuos del dominio citoplasmático: R44/R46 del N-terminal y una secuencia de 4
aminoácidos empezando por Y242. En Kir2.1, las mutaciones en estos aminoácidos provocan
la retención de los canales en el aparato de Golgi (Stockklausner y Klocker, 2003; Hofherr y
cols., 2005). Sin embargo, el tráfico de los canales a la membrana celular es un proceso
multifactorial, dado que se han descrito mutaciones de perdida de función en Kir2.1 (V302M,
deleción de S95-F98 en el dominio transmembrana y deleción de S314-Y315 en el dominio
citoplasmático) que provocan la retención de Kir2.1 en el la membrana plasmática (Plaster y
cols., 2001; Tristani-Firouzi y cols., 2002; Bendahhou y cols., 2003). Estas mutaciones
podrían estar interfiriendo directamente en la localización en la membrana o estar provocando
defectos en el plegamiento implicados en los mecanismos de retención y degradación. La
regulación del tráfico de los canales Kir2 no es, por tanto, un asunto trivial dado que
mutaciones de pérdida de función podrían ser rescatadas forzando la expresión de los canales.

78
 INTRODUCCIÓN

3.4.3.c. Composición de los canales que generan la IK1

Aunque está ampliamente demostrado que los miembros de la subfamila Kir2 son los
responsables de la IK1 cardíaca, la composición exacta de los canales que generan esta
corriente varía según la especie y el tipo celular estudiado (Kubo y cols., 2005). También
depende de la localización en la membrana de dichos canales. Un estudio reciente ha
proporcionado un detallado patrón de la expresión de los diferentes miembros de la
subfamilia Kir2 (excepto Kir2.4) en las aurículas, en el epicardio y el endocardio de los
ventrículos y en las fibras de Purkinje del miocardio humano (Gaborit y cols., 2007). No se
han encontrado diferencias significativas entre epicardio y endocardio ventricular ni entre las
cámaras izquierda y derecha. En cambio, sí se han encontrado diferencias en la expresión de
las diferentes subunidades Kir2 en las fibras de Purkinje (Kir2.1 ∼ Kir2.3 > Kir2.2), en el
ventrículo derecho (Kir2.1 >> Kir2.2 > Kir2.3) y en la aurícula derecha (Kir2.3 > Kir2.2 >
Kir2.1) (Gaborit y cols., 2007). Sin embargo, estos resultados contradicen los obtenidos en un
estudio anterior (Wang y cols., 1998).
En el corazón de cobayo, se ha demostrado la presencia de estas tres subunidades Kir2
(Kir2.1 > Kir2.2 ∼ Kir2.3). También se detectaba la presencia de Kir2.4, aunque el marcaje
mediante anticuerpos específicos demostró que su expresión se restringía a las celulas
neuronales presentes en el corazón (Liu y cols., 2001). Los datos sobre la presencia de Kir2.2
en el corazón de cobayo también son controvertidos, ya que un estudio posterior no consiguió
detectar su presencia (Dhamoon y cols., 2004). Tampoco se detectaba la presencia de Kir2.2
en miocitos auriculares y ventriculares de oveja (Dhamoon y cols., 2004). Por último, Kir2.1
es la subunidad Kir2 más abundante en corazones de ratón (Kir2.1 > Kir2.2 >> Kir2.3)
(Zaritsky y cols., 2001).
Para averiguar la composición de los canales que generan la IK1 se han llevado a cabo
diferentes aproximaciones. En primer lugar, Nakamura y cols. (1998) usaron AsODN contra
el ARNm de Kir2.1 en miocitos ventriculares de rata, consiguiendo que la IK1 se viera
drásticamente reducida y que la frecuencia de aparición de la conductancia de 21 pS
disminuyera significativamente, sin afectar al resto de conductancias (Nakamura y cols.,
1998). Estos resultados sugieren que hay diferentes subtipos de canales que pueden contribuir
a generar la IK1 y que, aunque los canales Kir2.1 sean los mayoritarios, tiene que investigarse
la contribución del resto de miembros de esta familia. En segundo lugar, Zaritsky y cols.
(2000) han utilizando ratones en los que se ablacionan los genes que codifican las proteínas
Kir2.1 y Kir2.2 (Zaritsky y cols., 2000). A pesar de que apenas sobreviven unas horas tras su

79
 INTRODUCCIÓN

nacimiento, los miocitos ventriculares de los ratones Kir2.1-/- carecen de IK1, demostrando que
los canales Kir2.1 son esenciales para la generación de la corriente en estos miocitos. Sin
embargo, los ratones Kir2.2-/- sí presentan la IK1, aunque ésta se encuentra reducida en ≈50%
(Zaritsky y cols., 2000), lo que demuestra también la participación de estos canales.
También se ha tratado de averiguar la composición de los canales que generan la IK1
atendiendo a las diferencias que presentan cada uno de los miembros de la subfamilia Kir2
respecto a propiedades como la conductancia, la sensibilidad al Ba2+ y al pH o la cinética de
activación. En miocitos auriculares y ventriculares, se han registrado corrientes unitarias que
presentaban conductancias que iban desde los ≈10-15 pS (correspondientes a canales Kir2.3)
hasta los ≈40-45 pS (correspondientes a canales Kir2.2), pasando por conductancias
intermedias (≈21-28 pS, correspondientes a canales Kir2.1) (Sakmann y Trube, 1984a;
Matsuda, 1988; Burnashev y Zilberter, 1986; Wible y cols., 1995; Liu y cols., 2001). Sin
embargo, la frecuencia con la que se detectan dichas conductancias depende de la especie y
del tejido estudiado, por lo que la contribución exacta de cada uno de los Kir2.x a los
heterotetrámeros que forman el canal sigue siendo un misterio. La sensibilidad al Ba2+
también es distinta para los diferentes canales Kir2.x. Por ejemplo, Schram y cols. (2003) han
demostrado que la sensibilidad al Ba2+ de los canales Kir2.1+Kir2.3 es mayor a la que
presentan cada uno de ellos por separado y similar a la que presentan los canales Kir2.2, pero
diferente a la que presenta la IK1 registrada en miocitos ventriculares humanos, lo que
confirma la participación de varias subunidades α Kir2.x diferentes en la generación de la IK1
humana (Schram y cols., 2003).
Por último, los canales Kir2.x también se diferencian en su cinética activación (Figura
30). Se ha demostrado que la cinética de los canales Kir2.1+Kir2.3 es proporcional al número
de subunidades Kir2.3 que forman parte del canal (Panama y cols., 2007). Analizando la
cinética de activación de la IK1 registrada en miocitos de ratón y de cobayo se ha sugerido que
la participación de los canales Kir2.3 en la corriente en dichos animales es minoritaria (Yan y
cols., 2005; Panama y cols., 2007). Por el contrario, el estudio de la sensibilidad al pH de la
IK1 registrada en miocitos ventriculares de oveja ha demostrado una gran contribución de los
canales Kir2.3 a la corriente en dichos miocitos (Tabla 15) (Muñoz y cols., 2007).

3.4.3.d. Propiedades de los canales Kir2.x

Hasta la fecha se han clonado 4 miembros de la familia Kir2.x (Kir2.1 a Kir2.4) en

mamíferos, aunque la expresión de los canales Kir2.4 en el corazón es mínima (solamente se

80
 INTRODUCCIÓN

ha demostrado su presencia en las células nerviosas que inervan el miocardio) y parece

localizarse preferentemente en el SNC (Liu y cols., 2001), lo que señala a los otros tres
miembros de la familia como los canales responsables de la IK1. Además, se ha clonado un
quinto miembro de la familia Kir2 en peces (Kir2.5) (Hassinen y cols., 2008).

Subunidad Conductancia (pS) Sensibilidad al Ba2+ Sensibilidad al pH Sensibilidad al pH

extracelular intracelular
Kir2.1 20-31 ++ - +
Kir2.2 34-42 +++ - +
Kir2.3 10-14 + +++ +++
Kir2.4 ≈15 + +++ ?

Tabla 15. Propiedades de los canales Kir2.x expresados en sistemas heterólogos. La diferencia en la
sensibilidad al Ba2+ y al pH entre los canales Kir2.x va desde los muy sensibles (+++) hasta los poco (+) o nada
(-) sensibles. La sensibilidad de Kir2.4 al pH intracelular no ha sido determinada experimentalmente todavía.

Los miembros de la subfamilia Kir2 presentan diferentes características cuando son

estudiados en sistemas heterólogos de expresión (Tabla 15). Las 4 subunidades Kir2.x
presentan conductancias distintas (Kubo y cols., 1993a; Morishige y cols., 1993; Makhina y
cols., 1994; Morishige y cols., 1994; Périer y cols., 1994; Raab-Graham y cols., 1994;
Takahasi y cols., 1994; Wible y cols., 1995; Töpert y cols., 1998; Choe y cols., 2000; Liu y
cols., 2001) y diferencias en la sensibilidad al Ba2+, un potente bloqueante selectivo de
canales rectificadores (Liu y cols., 2001; Preisig-Müller y cols., 2002; Schram y cols., 2003),
y al pH intracelular (Qu y cols., 2000; Collins y Larson, 2002) y extracelular (Hughes y cols.,
2000; Yan y cols., 2005; Muñoz y cols., 2007).

A B C

Figura 30. Cinética de activación de los canales Kir2. (A-B) Trazos representativos de corrientes generadas
por los canales Kir2.1 (A) y Kir2.3 (B) registrados al aplicar pulsos entre -130 y -30 mV desde un potencial de
fijación de -30 mV. Los ajustes a una función exponencial para obtener la constante cinética de la activación
(τact) se muestran superpuestos a los trazos de corriente. (B) Comparación de las τact de los diferentes canales
Kir2 a -115 mV. [Adaptadas de Panama y Lopatin, 2006]

81
 INTRODUCCIÓN

Las subunidades Kir2.x presentan también diferentes cinéticas de activación (Figura 30).
La apertura de los canales Kir cardíacos tras la hiperpolarización de la membrana se
caracteriza por una fase casi instantánea (activación) seguida de una ligera caída de la
corriente dependiente del tiempo producida por cationes extracelulares (ver más adelante). La
amplitud de ambas fases depende del tipo de canal y de las condiciones experimentales
empleadas, pero, en general, la cinética de activación viene determinada principalmente por la
cinética de disociación de las poliaminas (y, mayoritariamente, de la espermina) de su sitio de
unión en el canal, además de depender en gran medida del Em y de la [K+]e. La constante
cinética de activación (τact) es similar en los canales Kir2.1 y Kir2.2 (≈0.5-2 ms), mientras que
es ≈7-9 veces más lenta en los canales Kir2.3 (Figura 31) (Panama y Lopatin, 2006; Panama y
cols., 2007).

3.4.3.e. Regulación de la IK1

• Modulación por cationes (Na+, Ca2+, Mg2+, Ba2+)

En experimentos de fijación de voltaje se ha observado que la amplitud de la IK1
disminuye tras la aplicación mantenida de un pulso hiperpolarizante (Maughan, 1976;
Baumgarten y cols., 1977; Sakmann y Trube, 1984b) fenómeno debido mayoritariamente al
bloqueo dependiente de voltaje producido por cationes extracelulares (Biermans y cols.,
1987), siendo el Na+ el principal ion implicado en dicho proceso en músculo cardíaco y
esquelético (Standen y Stanfield, 1979). A pesar de que los cationes divalentes como el Ca2+ o
el Mg2+ son también potentes bloqueantes de la IK1 en el corazón, el hecho de que las
concentraciones de K+ en el rango de potenciales por debajo del EK estén en el orden de
milimolar hacen que su bloqueo sea muy débil y que su cinética de unión sea mucho más
lenta que la del Na+ (Biermans y cols., 1987). En miocitos ventriculares de cobayo, la
eliminación de los iones Na+, Ca2+ y Mg2+ del medio extracelular hace desaparecer de forma
casi completa la disminución de la IK1 dependiente del tiempo (Sakmann y Trube, 1984b;
Shieh, 2000).
El Ca2+ intracelular produce una inhibición dependiente de voltaje de la IK1 (Matsuda y
Cruz, 1993). Aunque el Ca2+ es un inhibidor menos potente que el Mg2+ y sus concentraciones
medias intracelulares son bastante bajas, hay bastantes evidencias de que la [Ca2+]i pueden
tener efectos dinámicos sobre la IK1. Por ejemplo, los aumentos transitorios de la [Ca2+]i que
tienen lugar durante el PA producen la inhibición de la IK1 en miocitos ventriculares de
cobayo (Zaza y cols., 1998). Estos resultados sugieren que los canales que generan la IK1 se

82
 INTRODUCCIÓN

localizan en espacios como los túbulos T, regiones restringidas y próximas a los lugares en los
que se produce la entrada de Ca2+ al interior celular y la liberación de Ca2+ desde el retículo.
Los iones Ba2+ son bloqueantes de la IK1 más potentes que el resto de los cationes
divalentes (DiFrancesco y cols., 1984) y, de hecho, el bloqueo producido por iones Ba2+
extracelulares a potenciales hiperpolarizantes se considera una de las características que
definen a las corrientes rectificadoras internas, por lo que ha sido ampliamente utilizado para
caracterizar los nuevos canales clonados como miembros de la familia Kir. Como se ha
mencionado, cada una de las subunidades Kir2.x posee diferente sensibilidad al Ba2+ (Tabla
15) (Liu y cols., 2001; Preisig-Müller y cols., 2002; Schram y cols., 2003).

• Estimulación adrenérgica
En general, está ampliamente aceptado que tanto la estimulación adrenérgica α (Fedida y
cols., 1991; Braun y cols., 1992) como la β (Koumi y cols., 1995b; González de la Fuente y
cols., 2013) producen una reducción de la IK1, aunque también hay resultados en sentido
contrario (Gorostiza y cols., 1995). A esta variedad en los resultados hay que añadir la
coexistencia de diferentes tipos de receptores adrenérgicos en el corazón. Por ejemplo, en
oocitos de Xenopus laevis, la estimulación de receptores β3 produce el aumento de las
corrientes generadas por los canales Kir2.1 (mediado por PKC) y Kir2.2 (mediado por PKA),
aunque no en la generada por los canales Kir2.3 (Scherer y cols., 2007), mientras que la
estimulación de receptores α1A produce la inhibición de las corrientes generadas por los
canales Kir2.2 y Kir2.3, pero no en la generada por los canales Kir2.1 (Zitron y cols., 2008).

• Modulación por poliaminas

Las concentraciones celulares de poliaminas se regulan por un complejo sistema de
enzimas (Seiler, 1994) que dan lugar a niveles de poliaminas libres que son suficientes para
producir la rectificación interna de los canales Kir que se ha observado experimentalemente.
La concentración citoplásmica de cada poliamina está regulada para que cada una de ellas
juegue un papel específico en la función de los canales (Lopatin y cols., 1995), por lo que sus
niveles se ajustan de forma dinámica para producir la rectificación en el rango fisiológico en
el que se mueven los potenciales de membrana.
Aunque no hay evidencias de que las poliaminas jueguen un papel importante en las
respuestas fisiológicas en las que está implicada la IK1, sí se ha demostrado que la
manipulación de las concentraciones de poliaminas pueden modular las corrientes generadas
por canales Kir2.x (Bianchi y cols., 1996; Shyng y cols., 1996; Lopatin y cols., 2000). Por

83
 INTRODUCCIÓN

ejemplo, Bianchi y cols. (1996) han demostrado en basófilos de rata que la rectificación
interna se atenuaba tras un tratamiento con un inhibidor específico de la S-adenosilmetionina
descarboxilasa (SAMDC), ya que este inhibidor producía el aumento de las concentraciones
de putrescina y la disminución de las concentraciones de espermidina y espermina (Bianchi y
cols., 1996). Asimismo, ratones transgénicos en los que se elimina el gen de la espermina
sintasa presentan una IK1 con una menor rectificación y cinéticas de activación más rápidas, a
la vez que unos niveles indetectables de espermina y un aumento de 5 veces en los niveles de
espermidina (Lopatin y cols., 2000). Sin embargo, la sobreexpresión de la ornitina
descarboxilasa (ODC) en corazones de ratón, a pesar de que producía un aumento en su
actividad y de que se incrementaban los niveles intracelulares de putrescina en más del 35%,
apenas ocasionaba un ligero aumento de la amplitud de la IK1, lo que sugiere que la putrescina
juega un papel poco importante en la regulación de la IK1 (Lopatin y cols., 2000). Por el
contrario, se ha demostrado que la eliminación de la putrescina intracelular sí afecta a la
rectificación de los canales Kir2.3 (Shyng y cols., 1996), mientras que la eliminación de la
putrescina del medio extracelular lleva a la depleción de sus niveles intracelulares, así como
de los de espermidina y espermina, produciendo también modificaciones en las características
cinéticas de Kir2.3 (Lopatin y cols., 1995).

• Modulación por pH
La sensibilidad al pH de la IK1 depende del tejido y de la especie estudiada, posiblemente
debido a la diferente composición de los canales que la generan (Tabla 15). En miocitos
ventriculares de rata y cobayo, la IK1 es insensible a la [H+]i (Ito y cols., 1992; Komukai y
cols., 2002a y 2002b). Por el contrario, la IK1 registrada en miocitos ventriculares de oveja es
inhibida por [H+]i que se encuentran en el rango fisiológico (pKa=7.4) (Muñoz y cols., 2007).
Estos resultados son consistentes con una importante contribución de los canales Kir2.3 a la
IK1 en estos miocitos (Dhamoon y cols., 2004), ya que los canales Kir2.3 son los más
sensibles a la [H+]i que los Kir2.1 (Tabla 15) (Yan y cols., 2005). De hecho, se ha descrito que
son las subunidades Kir2.3 las que confieren sensibilidad al pH a los heterotetrámeros
Kir2.1+Kir2.3 (Muñoz y cols., 2007). Además, se ha identificado a la treonina en posición 53
como el residuo responsable de la sensibilidad al pH en los canales Kir2.3 (Qu y cols., 2000).
Los canales Kir1.1 (homólogos de Kir2.1, pero con una rectificación interna más débil)
son sensibles a las [H+]i que se encuentran en el rango fisiológico (Tsai y cols., 1995). La gran
sensibilidad del canal Kir1.1 a los cambios en el pH está relacionada con la presencia de una
lisina en la posición 80 (Fakler y cols., 1996b), ya que la neutralización de este residuo tiene
como resultado la pérdida de sensibilidad al pH intracelular. Por otro lado, la sustitución del

84
 INTRODUCCIÓN

residuo homólogo en Kir2.1 por una lisina (M84K) hace que este canal adquiera sensibilidad
al pH intracelular (Fakler y cols., 1996b), lo que indica que, a pesar de que este canal no
presente especial sensibilidad al pH intracelular, los requerimientos estructurales necesarios
para ello están claramente presentes. Por lo tanto, no es de extrañar que los canales que se
forman tras el ensamblaje de subunidades Kir2.1 con otros miembros de la familia Kir2
sensibles al pH (p.e., Kir2.3) sí que presenten sensibilidad al pH (Muñoz y cols., 2007).

• Modulación por PIP2

El PIP2 es un importante segundo mensajero de una gran variedad de vías de señalización
(Hilgemann, 1997; Hilgemann y cols., 2001). La primera corriente con rectificación interna
que se demostró que era modulada por el PIP2 fue la IK,ATP (Hilgemann y Ball, 1996) y, desde
entonces, se ha descrito que el PIP2 es capaz de modular todos los canales Kir tanto en células
nativas como en sistemas de expresión heterólogos (Logothetis y cols., 2007; Lopes y cols.,
2007).
El PIP2 produce la apertura de los canales Kir, mientras que su depleción produce el cierre
de los mismos (Huang y cols., 1998; Shyng y cols., 2000; Lopes y cols., 2002; Rohacs y cols.,
2003; Logothetis y cols., 2007). En este sentido, Rohacs y cols. (1999) han demostrado que el
PIP2 es un potente activador de los canales Kir2.1, mientras que su modulación de otros
canales Kir (como los canales Kir3.1 o Kir3.4) es más débil. Además, se ha demostrado la
importancia de la localización de los dos grupos fosfato en las posiciones 4 y 5 de la molécula
de PIP2, ya que el cambio de posición o la eliminación de estos sustituyentes disminuye la
afinidad de estos compuestos por los canales Kir2.1 (Rohacs y cols., 1999). El PIP2 también
afecta a las propiedades de cada uno de los miembros de la subfamilia Kir2. Por ejemplo, se
ha demostrado que la modulación de los canales Kir2.3 por el pH, la acetilcolina o el
miristato-acetato de forbol (PMA, Phorbol Myristate Acetate) depende de las interacciones
entre el PIP2 y el canal (Logothetis y cols., 2007).
Se han identificado numerosos residuos implicados en la modulación de los canales Kir2
por el PIP2, la mayoría de ellos localizados en la parte superior del dominio citoplásmico (la
más próxima a la cara interna de la membrana plasmática) y en la slide helix (Figuras 31B y
C) (Lopes y cols., 2002; Decher y cols., 2007; Logothetis y cols., 2007). Recientemente,
Hansen y cols. (2011) cristalizaron Kir2.2 junto con PIP2 y observaron que éste último
interaccionaba con el canal a través de sus dos grupos acilo y el grupo glicerol con la
secuencia R-W-R (posiciones 78-80) del dominio transmembrana y con el grupo inositol con
la secuencia K-P-K-K (posiciones 186-190) del dominio citoplasmático (Hansen y cols.,
2011). Esto hace que el dominio citoplasmático se aproxime 6 Å hacia el dominio

85
 INTRODUCCIÓN

transmembrana, provocando además cambios conformacionales que fuerzan la apertura del

canal, en consonancia con lo descrito en trabajos anteriores (Figura 31A) (Logothetis y cols.,
2007). Además, se ha demostrado que las interacciones entre el PIP2 y el canal Kir2.1
producen un aumento de la probabilidad de apertura de los mismos, favoreciendo la
estabilización del canal en el estado abierto y facilitando las transiciones desde el estado
cerrado hacia el abierto (Xie y cols., 2008). Se ha propuesto que las poliaminas actúan como
cofactores en esta activación de los canales de Kir2.1 mediada por PIP2. De hecho, la
espermina es capaz de estabilizar los canales en configuración abierta, permitiendo un
aumento aparente de la afinidad de la unión del PIP2 con el canal (Xie y cols., 2005).

3.4.3.f. La IK1 en diversas patologías

La IK1 auricular está aumentada en pacientes con FA crónica (Van Wagoner y cols., 1997;
Dobrev y cols., 2002, Gonzalez de la Fuente y cols., 2012). En la insuficiencia cardíaca
congestiva se han descrito efectos contradictorios tanto en miocitos auriculares como
ventriculares. Concretamente, en miocitos ventriculares, se ha descrito un ligero aumento
(Beuckelmann y cols., 1993; Pogwizd y cols., 2001; Fauconnier y cols., 2005) o ningún
cambio (Rozanski y cols., 1997; Tsuji y cols., 2000). Por el contrario, en miocitos auriculares,
se ha descrito una disminución de la IK1 (Koumi y cols., 1994), aunque no se ve modificada
en un modelo canino de insuficiencia cardíaca (Li y cols., 2000).
Muchos estudios han demostrado que la amplitud de la IK1, así como la de otras corrientes
de K+, se encuentra reducida en animales espontáneamente hipertensos y en modelos animales
de hipertrofia cardíaca (Brooksby y cols., 1993; McIntosh y cols., 1998; Näbauer y Kääb,
1998; Mitarai y cols., 2000). A este respecto, es importante resaltar que numerosos trabajos
han demostrado además que la hipertrofia cardíaca aumenta las concetraciones de poliaminas
(Caldarera y cols., 1974; Bartolome y cols., 1980), sugiriendo la posibilidad de que la
reducción de la IK1 sea consecuencia de las aumentadas concentraciones intracelulares de
poliaminas. Sin embargo, en un modelo de hipertrofia ventricular en gatos, la IK1 está
aumentada en miocitos de ventrículo derecho (Kleiman y Houser, 1989), mientras no se
modifica en miocitos de ventrículo izquierdo (Furukawa y cols., 1993).

86
 INTRODUCCIÓN

B C

Figura 31. Modulación de los canales Kir2 por el PIP2. (A) Representación esquemática de los efectos del
PIP2 sobre el gating del canal. A la izquierda, se muestra el canal en estado cerrado antes de la interacción con el
PIP2. A la derecha, el canal en estado abierto después de interaccionar con el PIP2. (B) Localización de algunos
de los residuos sensibles a PIP2 (en azul) sobre un modelo de la estructura del canal Kir2.1 (realizado a partir del
dominio citoplásmico del canal Kir2.1 y los segmentos TM del canal KirBac3.1). (C) Vista superior del dominio
citoplásmico del canal Kir2.1 con la localización de algunos de los residuos sensibles a PIP2 (en azul). Las
diferentes subunidades Kir2.1 aparecen en distintos colores y numeradas del 1 al 4. [Adaptadas de Logothetis y
cols., 2007]

Los miocitos ventrículares humanos de regiones que sufren isquemia crónica presentan un
PR más despolarizado y sufren la prolongación de la DPA, especialmente en la fase final de la
repolarización (Mubagwa y cols., 1994), lo que concuerda con la reducción de la IK1 que se
produce en el corazón tras un infarto de miocardio (Lue y Boyden, 1992; Beuckelmann y
cols., 1993; Pinto y Boyden, 1998). Durante el estrés metabólico (p.e., durante la isquemia), el
marcado aumento de la IK,ATP enmascara muchos de los efectos que ocurren en otras
corrientes de K+ como la IK1. Sin embargo, utilizando glibenclamida como inhibidor de la

87
 INTRODUCCIÓN

IK,ATP, Xie y cols. (1997) han demostrado que la presencia de iodacetamida como inductor de
estrés metabólico produce una inhibición de la IK1 (Xie y cols., 1997). Además, la supresión
de la IK1 en miocitos ventriculares de conejo elimina la protección frente al estrés metabólico
que produce el precondicionamiento isquémico, un papel que clásicamente se había asignado
a la IK,ATP (Díaz y cols., 2004). Por último, diversos estudios sugieren que la IK1 está
aumentada en condiciones de hipoxia/anoxia (Ruíz-Perich y cols., 1991) o en presencia de
cianida (Muramatsu y cols., 1990). De hecho, un trabajo reciente ha demostrado que el
acortamiento del PA que se produce en la fase aguda de la hipoxia está mediado por la IK1 y
no por la IK,ATP (Piao y cols., 2007a).
Por último, es importante resaltar que la modulación de la relación I-V por la [K+]e no sólo
es una característica biofísica sino que tiene implicaciones fisiopatológicas, ya que la [K+]e se
eleva durante los episodios isquémicos o en presencia de taquiarritmias como resultado de
una acumulación de iones K+ en los espacios intercelulares y en las proximidades de los
túbulos T (Sejersted y Sjogaard, 2000).

3.4.3.g. Canalopatías asociadas a los canales Kir2.1

Hasta la fecha, se han descrito 4 tipos de canalopatías asociadas a canales Kir, todas ellas
en el gen que codifica las subunidades Kir2.1 (KCNJ2): el síndrome de Andersen (SQTL7), el
SQTC3, la taquicardia ventricular polimórfica inducida por catecolaminas (TVPC) y la FA
familiar (Figura 32).
• Síndrome de QT largo
El SQTL7 (asociado a alteraciones de la función de la IK1) se relaciona con el síndrome de
Andersen-Tawil (SAT), que se caracteriza por un fenotipo clínico en el que se ven afectadas
tanto la morfogénesis como la funcionalidad de los músculos esqueléticos y cardíacos. El
SAT es una enfermedad hereditaria que se caracteriza por parálisis periódicas y diferentes
alteraciones multiorgánicas entre las que se encuentran la escoliosis, el paladar hendido, baja
estatura y debilidad muscular (Plaster y cols., 2001; Donaldson y cols., 2003; Terzic y cols.,
2008). Las alteraciones en la actividad eléctrica cardíaca incluyen cortos períodos de
taquicardia ventricular y la aparición de múltiples focos ectópicos ventriculares tras
estimulación adrenérgica, así como la mencionada prolongación del intervalo QT. Sin
embargo, Zhang y cols. (2005) han sugerido que la clasificación del SAT como SQTL7
podría no ser del todo correcta, ya que las modificaciones en el ECG características del SAT
están más relacionadas con alteraciones del complejo T-U (Zhang y cols., 2005). Un amplio
estudio genético realizado para identificar el gen implicado en el SAT lo ha relacionado con el

88
 INTRODUCCIÓN

brazo largo del cromosoma 17, precisamente donde se localiza el locus del gen KCNJ2
(Kir2.1), por lo que se buscaron posibles mutaciones en este gen. Este estudio demostró que
más de la mitad de los pacientes con SAT presentaban mutaciones en el gen KCNJ2 (Plaster y
cols., 2001), por lo que se denomina como tipo 1 (SAT1) al síndrome de Andersen en el que
están afectados los canales Kir2.1 (Plaster y cols., 2001; Andelfinger y cols., 2002; Schulze-
Bahr, 2005; Zhang y cols., 2005).

SQTL7
TVPC
FA familiar
SQTC3

Figura 32. Mutaciones en la subunidad Kir2.1 asociadas con canalopatías. En el dibujo, las diferentes
mutaciones siguen el siguiente código de color: negro para el SQTL7, rojo para el TVPC, verde para la FA
familiar y azul para el SQTC3. [Adaptada de Anumonwo y Lopatin, 2010]

Se han identificado más de 33 mutaciones en el gen KCNJ2 relacionadas con el SAT1

(Figura 33), todas ellas caracterizadas por la pérdida de función del canal Kir2.1, lo que
origina la prolongación del intervalo QT y predispone al paciente a sufrir arritmias cardíacas.
Debido a que el SAT1 es un trastorno autosómico dominante (un alelo mutado y otro sano),
Plaster y cols. (2001) estudiaron en oocitos de Xenopus los efectos de coexpresar las
subunidades mutadas y las WT para dos de estas mutaciones (D71V y R218Q), demostrando
que las subunidades mutadas tenían un efecto dominante negativo por lo que los canales que
contenían la subunidad mutada no eran funcionales (Plaster y cols., 2001). Además, muchas
de las mutaciones relacionadas con el SAT1 se deben a la pérdida de función de los canales
causada por alteraciones en su interacción con el PIP2 (Plaster y cols., 2001; Lopes y cols.,
2002; Pegan y cols., 2006; Terzic y cols., 2008). Por ejemplo, las mutaciones R21Q y R21W
se localizan en un grupo de residuos que están implicados en la interacción del canal con el
PIP2 (Plaster y cols., 2001; Lopes y cols., 2002).

89
 INTRODUCCIÓN

• Síndrome de QT corto
En el año 2005, Priori y cols. (2005) describieron la tercera variante del SQTC (SQTC3),
relacionada con una mutación en el gen KCNJ2 (Priori y cols., 2005). Esta mutación produce
una ganancia de función en los canales Kir2.1, por lo que se traduce en un aumento en el flujo
de salida de K+ y, consecuentemente, en una aceleración de la repolarización.
El SQTC3 se caracteriza por la aparición de ondas T asimétricas en el ECG (Priori y cols.,
2005). El análisis genético de los miembros de una familia con SQTC3 ha permitido la
identificación de una mutación en el gen KCNJ2 en la que se produce la sustitución de un
ácido aspártico por una asparragina en la posición 172 (D172N) de la subunidad Kir2.1
(Priori y cols., 2005). Este ácido aspártico es un aminoácido altamente conservado dentro de
la familia Kir2 y, como se ha mencionado, se ha demostrado clave en la rectificación de estos
canales (Lu y MacKinnon, 1994; Stanfield y cols., 1994; Yang y cols., 1995a). La
coexpresión del canal mutado con el WT en sistemas de expresión heterólogos demostró un
aumento de la corriente generada por dichos canales. Además, mediante simulaciones por
ordenador se demostró que el aumento de la corriente de salida de K+ causado por la mutación
podía explicar el aumento y la asimetría de las ondas T del ECG que presentaban los
pacientes (Priori y cols., 2005). Por último, aunque no se podían realizar estudios de
susceptibilidad a las arritmias en estos pacientes, las simulaciones por ordenador predecían
que las mutaciones causantes del SQTC3 podrían predisponer a estos pacientes a un mayor
riesgo de sufrir arritmias por reentrada (Priori y cols., 2005).

• FA familiar
Estudios recientes encontraron una mutación relacionada con la FA familiar en el gen que
codifica la subunidad Kir2.1 (Xia y cols., 2005). En esta mutación, la sustitución de una
valina por una isoleucina en la posición 93 (V93I) produce un aumento de la corriente,
aunque el mecanismo de este aumento está aún por dilucidar (Xia y cols., 2005).

• Taquicardia ventricular polimórfica inducida por catecolaminas

La TVPC es una arritmia hereditaria en la que los pacientes presentan frecuentemente
arritmias ventriculares y muerte súbita asociadas al ejercicio físico y a la estimulación
adrenérgica (Leenhardt y cols., 1995; Tester y cols., 2006). Se han descrito varios tipos de
TVPC asociados con problemas en el manejo del Ca2+ en los que están implicados los canales
RyR (TVPC tipo 1) (Priori y cols., 2002) o la calsecuestrina (TVPC tipo 2) (Postma y cols.,
2002).

90
 INTRODUCCIÓN

En un estudio reciente para la identificación de arritmias genéticamente determinadas

realizado sobre una cohorte de 541 pacientes, se han identificado en el gen KCNJ2 cuatro
mutaciones relacionadas con la TVPC (R67Q, T75M, R85W y T305A) (Eckhardt y cols.,
2007). El ECG de los pacientes con estas mutaciones presentaba ondas U prominentes,
actividad ectópica ventricular y taquicardia ventricular polimórfica. Sin embargo, no sufrían
alteraciones en los músculos esqueléticos (Eckhardt y cols., 2007). Cuando se expresaban en
sistemas de expresión heterólogos, las corrientes generadas por los canales mutados
presentaban <5% de la corriente generada por los canales WT y dos de estos canales (R67Q y
T75M) tenían además un efecto dominante negativo cuando se coexpresaban con los canales
WT. Además, la mutación T305A afectaba a las propiedades de rectificación interna del canal
(Eckhardt y cols., 2007). Debido a que los pacientes portadores de estas mutaciones no
presentaban los criterios del SAT, se ha sugerido que dichas mutaciones pueden ser
clasificadas como causantes de TVPC.

4. ARRTIMIAS FIBRILATORIAS

Como se ha podido comprobar, tanto el aumento como la disminución de la IK1 puede ser
el origen de arritmias fibrilatorias. Se define como fibrilación a la actividad eléctrica cardiaca
turbulenta en la que la propagación de las ondas eléctricas se produce de forma
desorganizada, dando lugar a la perdida de función contráctil por parte del miocardio. La
fibrilación puede ocurrir tanto a nivel auricular (FA), como a nivel ventricular (fibrilación
ventricular o FV) y dependiendo de su localización puede tener distintas consecuencias
clínicas. La FA, por ejemplo, se caracteriza por una activación rápida (≥ 350 latidos/min) e
irregular de las aurículas, con pérdida de eficacia mecánica por parte de las mismas y suele ir
acompañada de una respuesta ventricular también irregular (Nattel, 2002). Es la causa
cardiaca más frecuente de accidentes cardiovasculares y la arritmia que presenta una mayor
prevalencia. Sin embargo esta prevalencia no está distribuida de forma homogénea en la
población, ya que aumenta con la edad (superando el 10% en pacientes con más de 80 años)
(Fuster y cols., 2006), y está asociada a diversas patologías, alcanzando hasta un 22.5% en
pacientes con infarto de miocardio, un 25% en pacientes hipertensos, un 4% en pacientes con
insuficiencia cardiaca leve/moderada y llegando a un 50% en pacientes con insuficiencia
cardiaca grave (Maisel y Stevenson, 2003). Además, es un factor de riesgo independiente que
aumenta la mortalidad de los pacientes, prácticamente duplicándola en 10 años (Stewart y
cols., 2002; Miyakasa y cols., 2006; Lip y cols., 2012).
Por otra parte, la FV se caracteriza por un ECG en el que los complejos ventriculares que

91
 INTRODUCCIÓN

cambian continuamente de frecuencia, forma y amplitud, alcanzándose frecuencias tan altas

(≥ 500 latidos/min) que no se produce un adecuado bombeo de sangre (Jalife, 2009). Por lo
tanto, la FV es una patología potencialmente letal, siendo la causa más importante de muerte
súbita cardiaca. Cada año, la FV es responsable de alrededor de 300.000 muertes al año, tan
sólo en los EE.UU (Zipes y Wellens, 1998).

4.1. Génesis de las arritmias fibrilatorias

El mecanismo de génesis y mantenimiento de las arritmias fibrilatorias ha sido un tema

de intenso debate a lo largo de más de 100 años (Jalife, 2010). De hecho, muchos de los
conceptos actuales sobre la génesis de estas arritmias se basan en ideas que durante mucho
tiempo fueron desechadas.
Lo que sí está ampliamente aceptado es que estas arritmias se generan por la “reentrada”
de impulso cardiaco. Para entender el concepto de reentrada hay que retroceder a los
experimentos realizados por Mayer en 1906. Mayer demostró que al aplicar una combinación
apropiada de pulsos a la campana contráctil de la medusa Cassiopea xamachana la onda
inducida podía propagarse en una única dirección del anillo y continuar circulando
indefinidamente (Mayer, 1906). Los experimentos fueron repetidos por Mines en anillos
musculares de aurículas de peces teleósteos y en anillos musculares de ventrículos de perro
(Mines, 1913 y 1914; Garrey, 1914). En base a estos experimentos Lewis propuso la hipótesis
del “movimiento circular por reentrada” para explicar los mecanismos que generan la FA y el
“flutter” auricular (Lewis, 1921) (Figura 33A). Según esta hipótesis, serían necesarias una
serie de requisitos para que se produzca la reentrada: (i) un sustrato o tejido miocárdico con
diferentes características electrofisiológicas (conducción y refractariedad); (ii) un obstáculo
anatómico no excitable alrededor del cual circula en impulso (por ejemplo, una vena); (iii) un
bloqueo de conducción unidireccional que obligue a la conducción en una única dirección;
(iv) una región de conducción lenta que permita la recuperación del tejido refractario
proximal a la localización del bloqueo unidireccional; (v) una masa crítica de tejido que pueda
sostener un frente de onda circulante y (vi) un desencadenante que la inicie. Para que se
produzca la reentrada incesante del estímulo en el miocardio se debe producir un equilibrio
adecuado entre la excitabilidad del tejido; de la que depende la velocidad del estímulo, y la
refractariedad.
Este equilibrio fue elegantemente formulado de forma matemática por Wiener y
Rosenblueth en 1945, cuando definieron la longitud de onda como el producto entre la
velocidad de conducción y el periodo refractario efectivo (LO=VC×PRE) (Wiener y

92
 INTRODUCCIÓN

Rosenblueth, 1945). Según este modelo, para que se produzca la reentrada, la longitud de
onda debe ser más corta que la longitud del circuito, de lo contrario, el frente de onda
interaccionaría con el periodo refractario de la propia onda circulante, acabando con la
propagación del estímulo. Cuando la diferencia entre la LO y la LC es muy grande se habla de
circuitos con “gap excitable” en los que hay una amplia franja de tejido que separa la cabeza
de excitación de la cola de refractariedad. Cuando la separación es pequeña se habla de
circuitos sin gap excitable. Wiener y Rosenblueth describieron también la formación de un
circuito de reentrada en ausencia de un obstáculo anatómico (Wiener y Rosenblueth, 1946),
pero consideraron que esta sería una situación inestable y por tanto la presencia de un
obstáculo sería una condición necesaria.
A pesar de que los modelos mencionados eran capaces de explicar satisfactoriamente el
mecanismo de reentrada alrededor de un obstáculo anatómico, no podían describir
correctamente el mecanismo de reentrada funcional, es decir, aquella en el que el circuito esta
determinado por las heterogeneidades de las propiedades electrofisiológicas del tejido
involucrado (Jalife, 2010). En 1950, Gordon Moe introdujo el concepto de “reentrada por
múltiples ondas”, basándose en los resultados obtenidos mediante simulaciones
computerizadas. Según este mecanismo, toda la aurícula estaría participando en la FA debido
a la presencia de múltiples circuitos de reentrada. Esto implica un proceso dinámico en el que
los frentes de onda estarían continuamente fraccionándose y autoperpetuandose como “ondas
hijas” (Moe y Abildskov, 1959; Moe y cols., 1964). Posteriormente, en los años 70, Allessie y
cols., propusieron la hipótesis del “leading circle” o circuito guía, tras registrar, mediante
microelectrodos múltiples, la formación de pequeños circuitos de reentrada ininterrumpidos
en preparaciones auriculares de corazones de perros en ausencia de obstáculos anatómicos
(Allessie y cols., 1973). Según estos autores, en la reentrada funcional un frente de onda lineal
circula a través de tejido parcialmente refractario y alrededor de un núcleo central que se
mantiene en estado refractario al ser bombardeado constantemente por los frentes de onda
centrípetos (Figura 33B).
El circuito guía es por tanto el circuito más pequeño posible en el que un impulso puede
continuar circulando (Allessie y cols., 1976). Aunque esta idea se basa en la hipótesis de
Lewis, existen 3 diferencias significativas: (i) en teoría, la ausencia de un obstáculo
anatómico imposibilita la interrupción de la arritmia mediante un estímulo externo; (ii) el
circuito guía fuerza al frente de onda a invadir su propio periodo refractario, impidiendo la
formación de una franja totalmente excitable, haciendo la arritmia inestable y propensa a la
terminación espontánea; (iii) comparada con la reentrada anatómica, la duración del ciclo en
la reentrada funcional es mucho menor (Allessie y cols., 1976 y 1977). Posteriormente, los

93
 INTRODUCCIÓN

mismos autores demostraron que entre 4 y 6 circuitos de reentrada funcionales eran

suficientes para producir una actividad turbulenta en las aurículas, apoyando la hipótesis de
Moe (Allessie y cols., 1985).

Figura 33. Cuatro conceptos diferentes de reentrada. (A) Reentrada alrededor de un obstáculo anatómico
circular. La reentrada ocurre cuando la longitud de onda (en negro) es más pequeña que el circuito permitiendo
una franja excitable (en blanco). (B) Hipótesis del circuito guía. El frente solapa con la cola gracias a una franja
excitable parcial. La hipótesis sugiere que los frentes de onda que invaden el centro provocan un estado
refractario. (C) Onda espiral bidimensional rotando en sentido anti-horario alrededor de un núcleo no excitado
pero excitable (punto rojo) en una monocapa de miocitos ventriculares de ratas neonatales. (D) Simulación por
ordenador de un rotor en tres dimensiones rotando en sentido anti-horario. [Adaptada de Jalife, 2009]

Sin embargo, aunque esta hipótesis prevaleció durante 20 años, era insuficiente para
explicar la dinámica de la FA y la FV (Davidenko y cols., 1990, Jalife y cols., 1998). El
principal problema es que el circuito guía implica, por definición, un estado refractario del
centro de rotación. Por lo tanto, fija la onda circulante en un punto estable e impide que el
centro de rotación migre (Allessie y cols., 1977). Pero, como diversos estudios han
comprobado, el desplazamiento y la migración de las ondas circulantes son características
muy importantes de la reentrada funcional, particularmente cuando el sustrato es heterogéneo
(Jalife y Gray, 1996; Jalife y Pandit, 2005; Mansour y cols., 2001).

94
 INTRODUCCIÓN

En paralelo con las investigaciones mencionadas se fue desarrollando el concepto de la

formación de ondas espirales debido a la presencia de “rotores” en el tejido cardiaco (Krinsky,
1966; Winfree, 1987). El músculo cardiaco, como medio excitable que es, comparte muchas
características con otros medios excitables como las reacciones químicas autocatalíticas, las
ondas de Ca2+ en las células cardiacas, el cerebro, la retina, etc. (Winfree, 1972 y 1989; Gray
y cols., 1998). Una de las propiedades de estos medios es la formación de ondas en forma de
vórtices alrededor de una “singularidad de fase” (como los observados en los torbellinos o los
huracanes). Estas singularidades de fase o pivotes se crean tras la rotura de un frente de onda
al encontrarse en su propagación con tejido refractario o con un obstáculo anatómico. En ese
punto de ruptura, el frente de onda se curva y enlentece hasta llegar a converger con su propia
cola de refractariedad, creándose un rotor (Figura 33C). Cuando un rotor está estacionario,
pivota alrededor de la singularidad de fase en una trayectoria circular que forma el núcleo de
la onda espiral. Sin embargo, cuando el rotor migra, su trayectoria puede tener distintas
formas, dependiendo de la excitabilidad del tejido. Se propuso que estos rotores podrían
existir en el corazón y que serían el verdadero mecanismo de reentrada funcional. El
equivalente de una onda espiral en 3 dimensiones se denomina “scroll wave” (Figura 33D)
(Winfree, 1973). La primera demostración experimental de una onda espiral en el corazón fue
hecha en cortes ventriculares de corazones de oveja por Davidenko y cols., en 1990
(Davidenko y cols., 1990). Esto fue posible gracias al uso de colorantes potenciométricos que
permitieron el mapeo de alta resolución de la actividad eléctrica cardiaca (Salama y Morad,
1976). En las siguientes dos décadas se ha ampliado el conocimiento sobre la dinámica,
formación, mantenimiento y fragmentación de las ondas espirales y de los rotores (Jalife y
cols., 1998; Taberaux y cols., 2009; Jalife, 2011; Pandit y Jalife, 2013). Aunque aún existe un
debate sobre los mecanismos precisos de la fibrilación (esto es, si se debe a un pequeño
número de rotores o a múltiples ondas), la teoría de los rotores se ha convertido en una
importante explicación mecanística de las arritmias fibrilatorias (Voigt y cols., 2010; Skanes,
2009; Jalife, 2011; Narayan y cols., 2012; Pandit y Jalife, 2013).

4.2. Dinámica de los rotores

La excitabilidad y refractariedad del medio determinan la dinámica de los rotores (Zykov,

1980). La excitabilidad condiciona la velocidad de conducción del frente en su propagación
alrededor del núcleo y, con ella, la frecuencia de rotación. Asimismo, determina el radio del
núcleo al condicionar el valor crítico de curvatura del vértice de la espiral e impedir la
propagación hacia su interior. Esta bien establecido que los frentes de onda cóncavos se

95
 INTRODUCCIÓN

propagan más rápidos que los frentes de onda planos y estos a su vez, se propagan más rápido
que los frentes de onda convexos (Fast y Kléber, 1997). Los frentes de ondas de un rotor tiene
una curvatura convexa creciente hacia el núcleo, lo que provoca una disminución de la
velocidad de conducción hacia el centro de rotación (Figura 34A). En el perímetro del núcleo
la curvatura alcanza un valor crítico que provoca una desproporción entre la corriente
despolarizante que genera el frente de onda (la INa, principalmente) y la corriente electrotónica
necesaria para despolarizar las células en estado de reposo del núcleo (controlada por la IK1).
Por otra parte, la refractariedad total en el vértice de la reentrada está definida por la suma
de la DPA de las células recién despolarizadas, o refractariedad absoluta, más la franja de baja
excitabilidad que la secunda, o refractariedad relativa. Ambas establecen el estado del tejido
que precede al frente de onda reentrante en las inmediaciones del núcleo. Así, la
refractariedad también modula la excitabilidad del tejido en el vértice de la espiral,
condicionando la frecuencia y el tamaño del núcleo del rotor (Zykov, 1980; Pertsov y cols.,
1981).
Cabe estacar las importantes diferencias entre la dinámica de los rotores y la de los
circuitos guía. Primero, el circuito guía considera el frente de onda lineal, por lo que la
velocidad de conducción es la misma en cualquier punto del frente (Fast y Kléber, 1997). Sin
embargo, en un frente espiral, la velocidad de conducción depende de la curvatura y por lo
tanto disminuye progresivamente hacia el centro del rotor. La segunda diferencia es que la
hipótesis el circuito guía asume que en el núcleo existe una refractariedad total, debido a la
invasión continua de las ondas centrípetas, impidiendo al circuito de reentrada migrar a través
del tejido cardiaco (Figura 33B). Por el contrario, los rotores son capaces de desplazarse y
migrar dado que pivotan alrededor de tejido no excitado pero excitable (Gray y cols., 1995).
Por lo tanto, el mecanismo de rotación no depende de la refractariedad del núcleo, sino de
cuán acusada sea la curvatura cerca del punto de singularidad, que es el factor que enlentece
la conducción hasta el punto crítico en el que el frente de onda es incapaz de invadir el núcleo
(Jalife, 2009). Por último, en la teoría de rotores, la longitud de onda tampoco es fija, sino que
se acorta progresivamente conforme uno se acerca al punto de singularidad (Figura 34B),
debido al los gradientes electrotónicos que se establecen entre las células del núcleo y las
células vecinas (Jalife, 2009). Esto tendrá importantes implicaciones a la hora de modular el
PA mediante fármacos dado que no existe una DPA única en los rotores, sino multitud de
valores distintos dependiendo de su posición en el frente espiral (Jalife, 2009 y 2010; Pandit y
Jalife, 2013).

96
 INTRODUCCIÓN

Figura 34. Dinámica, formación y fragmentación de los rotores. (A y B) Representación tridimensional de la

velocidad de conducción (A) y de la longitud de onda (B) en un rotor obtenida por mapeo óptico de una
monocapa de miocitos ventriculares neonatales de rata. La velocidad de conducción disminuye al aumentar la
curvatura del rotor. La longitud de onda sigue los cambios de la velocidad de conducción y la DPA. (C)
Formación de un rotor. Una onda alcanza un obstáculo funcional (i) y empieza a circunvalarlo (ii). Si las
condiciones de excitabilidad son las adecuadas, 2 ondas hijas se separan del obstáculo, generando una
singularidad de fase (SF) en cada extremo roto (iii). Las ondas formadas se curvan alrededor del las
singularidades y empiezan a rotar (iv). (D) Modelo por ordenador de un rotor a altas frecuencias en una capa de
miocitos ventriculares. Se aprecia como las ondas que emanan del rotor se fragmentan, iniciando una
conducción fibrilatoria. Los números bajo cada fotograma indican milisegundos [Adaptada de Vaquero y cols.,
2008 y Jalife, 2009]

4.3. Formación de los rotores

Las ondas de reentrada pueden iniciarse como consecuencia de la interacción de un frente

de onda con un obstáculo apropiado que se interpone en su camino (Pertsov y cols., 1993).
Dependiendo de la excitabilidad del tejido, esto puede dar lugar a una reentrada funcional. Por
ejemplo, si la excitabilidad del tejido es alta, el frente de onda circunvala al obstáculo, sin
separarse de él, sus dos extremos se reencuentran, se fusionan, recuperan su forma primitiva y
continúan su camino. Si la excitabilidad es menor (o con frecuencia de excitación más alta),

97
 INTRODUCCIÓN

los extremos rotos no convergen, sino que se separan del obstáculo, moviéndose en
direcciones opuestas, de forma que el frente de onda se fragmenta en dos ondas hijas, cada
una flanqueada por una singularidad de fase y un borde del tejido. Cada frente de onda se
curva sobre su pivote e inicia un movimiento de reentrada funcional en figura de ocho (Figura
34C). Cuando la excitabilidad es aún más baja, el frente de onda también se rompe en dos,
pero las ondas hijas resultantes se encogen gradualmente hasta desaparecer; es decir, sufren
“conducción decremental”. De acuerdo con la teoría de los sistemas excitables, para que el
frente de onda se divida en dos, el tamaño del obstáculo ha de ser similar al de la anchura del
frente de onda (Pertsov y cols., 1990). Como la anchura del frente de onda en el músculo
cardíaco normal es de 1 mm aproximadamente (Spach y cols.,1989a y 1989b), sólo los
obstáculos ≥ 1 mm pueden fragmentar los frentes de onda (Figura 34D).
Este fenómeno se denomina vortex shedding (literalmente, “vertiente de vórtices”) (Cabo
y cols., 1996) y requiere que se cumplan 2 condiciones: a) que tanto la estructura anatómica
como las propiedades electrofisiológicas del músculo cardíaco sean heterogéneas (Zipes y
Wellens, 1998), y b) que en algún lugar del corazón se favorezca la formación de un foco
ectópico cuya frecuencia de activación sea tan alta que los frentes de onda que genere
choquen con las colas refractarias de ondas previas.
La complicada estructura anatómica del corazón normal y la variabilidad intrínseca de las
propiedades electrofisiológicas genera gradientes espaciales de períodos refractarios lo que
constituye una fuente de obstáculos que puede llevar al establecimiento de arritmias de
reentrada (Laurita y cols., 1996). No obstante, habitualmente no hay arritmias sostenidas ya
que sólo pueden inducirse mediante estímulos de alta frecuencia o muy prematuros, y/o en
presencia de isquemia, fármacos o anormalidades genéticas. De hecho, este tipo de arritmias
son más frecuentes en pacientes que presentan arterioesclerosis coronaria, alteraciones
fibróticas miocárdicas difusas o ambas. Hoy día existe un acuerdo general en que la
heterogeneidad eléctrica que lleva al establecimiento de gradientes refractarios es el factor
más importante causante de la iniciación de la FV (Zipes y Wellens, 1996).

4.4. Papel de la IK1 en el mantenimiento de los rotores

La IK1 juega un papel fundamental en la fase final de la repolarización del PA (es decir, la
fase 3). De hecho, el aumento en la densidad de la IK1 acorta la DPA, mientras que su
disminución tiene el efecto contrario (Lopatin y Nichols, 2001).

98
 INTRODUCCIÓN

Figura 35. Bloqueo de la IK1 y dinámica de la FV. (A) Rectificación de IK1 en los miocitos del ventrículo
izquierdo de cobaya tras perfusión con 2 dosis de Ba2+. (B) Mapas promedio de las frecuencias dominantes que
muestran cómo la heterogénea distribución en el control se homogeniza tras el Ba2+ después de la importante
disminución de la frecuencia del rotor principal situado en ventrículo izquierdo. (C) Electrocardiograma y sus
transformadas de Fourier en situación de control y tras el Ba2+, antes y después de la conversión de la FV en una
arritmia polimórfica más lenta. [Adaptada de Warren cols., 2003]

El papel de la IK1 en el comportamiento de los rotores ha sido investigado tanto con

simulaciones por ordenador como experimentalmente. Mediante cartografía óptica en
corazones de cobayo se observó que la FV presenta frecuencias dominantes
significativamente mayores en ventrículo izquierdo (32 Hz) que en el derecho (14 Hz) (Samie
y cols., 2001).
Al registrar la IK1 en miocitos de ambas cámaras se observó que la rectificación de la IK1
es menor en las células del ventrículo izquierdo que en las del derecho. Esta diferencia en la
intensidad de la rectificación de IK1, fue posteriormente atribuida a una mayor presencia de
canales Kir2.1 en el ventrículo izquierdo (Warren y cols., 2003). La menor rectificación
implica una mayor cantidad de corriente repolarizante durante la fase 3 del PA y, por tanto,
una menor duración de los PAs en el ventrículo izquierdo que en el derecho. La menor DPA
permite la estabilización del rotor en el ventrículo izquierdo. Esto desestabiliza el rotor,

99
 INTRODUCCIÓN

evitando así que el ventrículo derecho sea capaz de mantener espirales estables a tan altas
frecuencias (Samie y cols., 2001).
Para confirmar la hipótesis del papel de la amplitud del componente de salida de la IK1 en
la estabilización de los rotores en el ventrículo izquierdo, Warren y cols. (2003) utilizaron
diversas concentraciones de Ba2+ (1-50 µM) (Kubo y cols., 1993a) para inhibir de manera
selectiva la IK1 (Figura 35A) (Warren y cols., 2003). Demostraron que la inhibición de la IK1
disminuye las frecuencias de excitación del ventrículo izquierdo (Figura 35B) y aumentan la
organización de la FV (Figura 35C) transformándola en taquicardia ventricular con una
frecuencia mucho menor (Dorian y cols., 1996; Warren y cols., 2003).
La sobreexpresión de IK1 en corazones de un modelo transgénico de ratón acelera la fase
final de la repolarización del PA, acortando la DPA y el intervalo QT (Li y cols., 2004;
Noujaim y cols., 2007). Durante la reentrada, esto provoca una longitud de onda menor y una
hiperpolarización de la membrana, lo que contribuye a una mayor disponibilidad de canales
de Na+ durante el periodo excitable, y por tanto un aumento de la excitabilidad. Además, la
sobreexpresión de IK1 aumenta el gradiente de voltaje entre las células en reposo del centro
del rotor y las células activas adyacentes. Estos efectos ayudan a potenciar las corrientes
electrotónicas que fluyen continuamente entre las células en reposo y las células activas, lo
que contribuye a acelerar la repolarización de las células activas (Beaumont y cols., 1998;
Noujaim y cols., 2007). El resultado final es un rotor más rápido y estable en los corazones
transgénicos que en los corazones de ratones WT. Además, durante la reentrada, en los
corazones transgénicos que sobreexpresan IK1, las células no excitadas en el centro del rotor,
tienen una conductancia de salida mayor, lo que disminuye la probabilidad de ser excitadas
por la influencia despolarizadora de las células adyacentes, ayudando a reducir el tamaño del
centro del rotor y su desplazamiento, y por tanto estabilizándolo. En el modelo matemático de
FA diseñado por Courtemanche, la sobreexpresión de IK1, también aceleraba y estabilizaba la
actividad del rotor, en consonancia con lo descrito anteriormente (Pandit y cols., 2005). En el
mismo modelo se estudiaron los efectos de la reducción de la conductancia y del grado de
rectificación de la IK1. La reducción en un 20% de la conductancia de IK1 enlenteció pero no
terminó con la actividad del rotor. Sin embargo, la modificación de los perfiles de
rectificación de la IK1, tanto reduciendo el pico máximo de la corriente de salida, como
aumentando el grado de rectificación provocaba el enlentecimiento e incluso terminación del
rotor (Pandit y cols., 2005).
Por tanto, todos estos experimentos apoyan el hecho que la IK1 es un estabilizador de la
reentrada, dada su capacidad de acortar la DPA y reducir la velocidad de conducción cerca del
centro del rotor (Beaumont y cols., 1998; Samie y cols., 2001; Noujaim y cols., 2007; Grzeda

100
 INTRODUCCIÓN

y cols., 2009). Un aumento en la IK1, previene las interacciones entre el frente de onda y la
cola de refreactariedad, y por tanto evita la desestabilización del rotor y su fraccionamiento
(Samie y cols., 2001). Además, la relación entre la IK1 y la INa, es un factor muy importante en
el control de la excitabilidad cardiaca, y por consiguiente de la estabilidad y frecuencia de la
reentrada (Noujaim y cols., 2007). Por lo tanto, esto convierte a la IK1 en una diana para el
desarrollo de los nuevos fármacos antiarrítmicos para el tratamiento de las arritmias
fibrilatorias. Dado que la FA es la arritmia más frecuente afectando a más del 1% de la
población general, lo óptimo sería el desarrollo de un fármaco que disminuyera la IK1
auricular sin modificar las corrientes ventriculares. Para ello el primer requisito es que la
composición de los canales que generan la IK1 auricular y ventricular fueran diferentes.

5. FÁRMACOS ANTIARRÍTMICOS

Los fármacos antiarrítmicos (FAA) son un grupo muy heterogéneo de sustancias que
suprimen y/o previenen las alteraciones del ritmo cardíaco. El tratamiento antiarrítmico tiene
dos objetivos: a) aliviar los síntomas del paciente (palpitaciones, fatiga, síncope) o sus
complicaciones (tromboembolismos, insuficiencia cardiaca), lo que se puede conseguir, tanto
por suprimir o reducir la frecuencia de la arritmia, como por prevenir su recurrencia; y b)
prolongar la supervivencia y reducir el riesgo de muerte súbita. Sin embargo, los ensayos
clínicos controlados han demostrado que los fármacos antiarrítmicos no sólo son poco
efectivos para controlar las arritmias cardiacas, sino que pueden producir importantes
reacciones adversas, cardiacas y extracardiacas y, paradójicamente, pueden inducir y/o
perpetuar las arritmias del paciente (efectos proarrítmicos de los FAA). Si a todo lo anterior
añadimos que en la mayoría de los casos desconocemos los mecanismos implicados en la
génesis y/o mantenimiento de la arritmia, es evidente que el tratamiento antiarrítmico es en
muchos casos empírico, basándose la selección del fármaco antiarrítmico en la las
características de la arritmia, la comorbilidad del paciente y, sobre todo, en el perfil de
seguridad del fármaco seleccionado.
A pesar de todo lo anterior, los fármacos antiarrítmicos continúan siendo el tratamiento de
elección en la mayoría de los pacientes con arritmias, aunque las estrategias no-
farmacológicas (desfibriladores implantables, marcapasos, ablación con catéter) y quirúrgicas
de las arritmias pueden ser el tratamiento de elección en determinados grupos de pacientes. Es
más, incluso los pacientes sometidos a ablación y los portadores de un desfibrilador
implantable requieren, con frecuencia, la administración de fármaco antiarrítmico para
controlar las arritmias sintomáticas (Tamargo y Valenzuela, 2008).

101
 INTRODUCCIÓN

5.1. Clasificación

La clasificación de FAAs en cuatro grupos propuesta por Vaughan-Williams es la que más

frecuentemente se utiliza a pesar de sus limitaciones (Vaughan-Williams, 1970):

• Grupo I: Bloqueantes de los canales de Na+ dependientes del voltaje.

• Grupo II: Antagonistas de receptores β-adrenérgicos.

• Grupo III: Fármacos que prolongan la DPA y el periodo refractario cardíaco a

concentraciones a las que no modifican la velocidad de conducción
intracardiaca.

• Grupo IV: Fármacos bloqueantes de los canales de Ca2+ dependientes del

voltaje tipo L.

Sin embargo, esta clasificación no incluye diversos fármacos antiarrítmicos y asume que
el mecanismo de acción de los fármacos pertenecientes a un mismo grupo está únicamente
relacionado con el descrito en la clasificación; no obstante, la mayoría de los fármacos
antiarrítmicos presentan más de un mecanismo de acción antiarrítmico. Esto explica por qué,
en contra de lo que se podría esperar, fármacos de un mismo grupo pueden presentar
propiedades y aplicaciones clínicas muy dispares (Tamargo y Valenzuela, 2008).

5.2. Farmacología de los FAA del grupo I

Estos fármacos bloquean los canales de Na+ lo que disminuye la entrada de Na+ durante la
fase 0 y, con ello, la amplitud de los PAs generados. Como consecuencia, la diferencia de
potencial entre la célula excitada y las adyacentes es menor, y el circuito local de corriente
que permite la excitación de las células contiguas puede no ser suficiente para conseguir la
progresión del frente de activación. Los FAAs del grupo I deprimen la excitabilidad y la
velocidad de conducción del impulso en el circuito de reentrada siendo este efecto más
marcado en las áreas donde la conducción estaba más deprimida. Como se ha mencionado
antes, la depresión de la excitabilidad disminuye la frecuencia de rotación de los rotores
porque amplía su radio de giro, obligándolos a invadir un área miocárdica mayor y
disminuyendo la probabilidad de su mantenimiento. Sin embargo, la disminución de la
excitabilidad también puede hacer que un frente de activación se fragmente y si esta

102
 INTRODUCCIÓN

disminución no es homogénea, hará que el frente gire en torno a las zonas en las que la
depresión es mayor y se genere un nuevo circuito reentrante (Delpón y cols., 2008b).

5.2.1. Mecanismo general de acción

Los FAA del grupo I se unen en un sitio receptor localizado en la región del poro de la
subunidad α1 del canal de Na+ cardiaco. Para acceder a este receptor atraviesan por difusión
pasiva la membrana celular y penetran en el poro desde la cara citoplasmática. Todos los FAA
del grupo I son bases débiles que a pH fisiológico coexisten en forma catiónica y neutra,
predominando la catiónica. Es la forma neutra (F) la que puede atravesar la membrana, pero
es la catiónica (FH+) la que se une al receptor. El sitio receptor para FAA del grupo I está
localizado en el S6 del dominio IV (IVS6) siendo críticos para la unión los residuos Y1771 y
F1764, aunque están involucrados otros residuos localizados en el S6 del dominio III. La
conformación del receptor probablemente cambia en cada uno de los 3 estados en los que
puede estar el canal de Na+ (es decir, abierto, inactivo y cerrado), lo que explicaría por qué la
afinidad de los FAA por el receptor no es constante, sino que está modulada por el estado en
el cual se encuentra el canal (hipótesis del receptor modulado). La afinidad de los FAA del
grupo I por el canal en estado cerrado es muy baja, pero es alta en estado abierto y/o inactivo.
Todos los FAA del grupo I prolongan el tiempo necesario para la reactivación del canal de
Na+ desde ≈20 ms hasta incluso varios segundos. Esta prolongación del tiempo de
reactivación es responsable del bloqueo de la conducción durante una taquicardia rápida,
cuando el intervalo diastólico se abrevia tanto que no permite que se complete la reactivación
(Delpón y cols., 2008b).
Los FAA del grupo I presentan importantes diferencias farmacológicas entre si que no se
limitan al tipo de bloqueo del canal de Na+ que producen. Prácticamente todos ellos bloquean
en mayor o menor medida alguno/s de los canales de K+ y/o de Ca2+. Muchos de ellos son
también antagonistas de receptores adrenérgicos y/o muscarínicos. Son fármacos por tanto
con multiplicidad de acciones que modulan los efectos electrofisiológicos finales que se
observan en la clínica. Utilizando como criterio cuánto prolongan la reactivación del canal de
Na+ se han subclasificado en tres subgrupos:

• Subgrupo Ia: retrasan la reactivación del canal de Na+ llegando a ser necesarios ≈5 s
para que ésta se complete. Todos ellos bloquean diversos canales de K+, pero es el
bloqueo de la corriente IKr el principal responsable de la prolongación de la DPA y del

103
 INTRODUCCIÓN

intervalo QT que producen. Como consecuencia de la prolongación de la DPA y de la

reactivación, prolongan el periodo refractario. Presentan una potencia de bloqueo del
canal de Na+ entre moderada y marcada, deprimiendo la velocidad de conducción
intracardíaca y prolongando el intervalo QRS cuando el paciente está en ritmo sinusal.

• Subgrupo Ib: son los que menos retrasan la reactivación del canal de Na+ (200-500
ms), y no bloquean canales de K+, por lo que acortan la DPA por disminuir la entrada
de Na+ durante la fase 2. Por tanto sus efectos sobre el complejo QRS y el QT son
mínimos. Son muy eficaces para prevenir extrasístoles precoces o taquicardias con una
frecuencia rápida y sus efectos se potencian en células parcialmente despolarizadas
(isquemia, intoxicación digitálica). Sin embargo, no bloquean la conducción intra-
cardiaca cuando el paciente está en ritmo sinusal, puesto que el intervalo diastólico es
lo suficientemente prolongado (≈800 ms) como para permitir la reactivación del canal.

• Subgrupo Ic: son los que más retrasan la reactivación del canal llegando hasta ≈12 s.
Por ello deprimen la velocidad de conducción intracardíaca y prolongan el intervalo
QRS cuando el paciente está en ritmo sinusal. Prolongan la repolarización en el tejido
auricular de modo dependiente de la frecuencia pero apenas si modifican la
ventricular.

Dado que el tiempo que tardan los fármacos de los grupos Ia y Ic en disociarse del canal
es mucho mayor que el intervalo entre dos latidos cardiacos normales, estos fármacos
deprimen la velocidad de conducción intraauricular e intraventricular (prolongan el QRS)
incluso en pacientes en ritmo sinusal. Esta depresión facilitaría la aparición de bloqueos
intracardiacos y arritmias por reentrada, particularmente en pacientes con cardiopatías
estructurales (cardiopatía isquémica, hipertrofia o insuficiencia cardiaca) (Delpón y cols.,
2008b).

5.2.2. FAA del grupo Ic

Flecainida y propafenona (Figura 36) presentan una elevada afinidad por el estado
activo del canal de Na+ y prolongan de forma marcada su reactivación, siendo los fármacos
que más deprimen la INa y los que mayor incidencia de efectos arritmogénicos producen.

104
 INTRODUCCIÓN

5.2.2.a. Acciones farmacológicas

A concentraciones terapéuticas, son los fármacos antiarrítmicos que más deprimen la

velocidad de conducción intraauricular e intraventricular (ensanchan el QRS). Ello explica
por qué pueden facilitar la aparición de bloqueos intracardiacos y arritmias por reentrada,
particularmente en pacientes con alteraciones previas de la conducción ventricular (p.ej.
postinfarto de miocardio, insuficiencia cardiaca, miocardiopatías). Aunque no modifican la
DPA ventricular (no prolongan el QT), sí prolongan el periodo refractario ventricular al
retrasar de forma marcada la reactivación del canal de Na+. Sin embargo, flecainida y
propafenona prolongan la DPA y de los periodos refractarios auriculares, siendo este efecto
más marcado a frecuencias auriculares rápidas, lo que explica su efectividad para convertir la
fibrilación auricular a ritmo sinusal. También deprimen la velocidad de conducción y
prolongan el periodo refractario del nódulo AV y de las vías accesorias AV. Flecainida y
propafenona modifican poco la frecuencia sinusal, pero suprimen el automatismo del sistema
de His-Purkinje, el automatismo anormal y la actividad desencadenada por pospotenciales
tempranos o tardíos (Tamargo y Valenzuela, 2008).
La flecainida o la propafenona apenas si modifican la contractilidad cardiaca, la presión
arterial o el volumen minuto cardiaco, pero cuando se administran por vía intravenosa o en
pacientes con insuficiencia cardiaca reducen la contractilidad, pudiendo desencadenar o
agravar la insuficiencia cardiaca.

5.2.2.b. Características farmacocinéticas

La flecainida se absorbe muy bien por vía oral (biodisponibilidad 95%) y alcanza su Cmax
al cabo de 1-2 h. Se une a proteínas plasmáticas en un 40% y se biotransforma en un 75% en
el hígado, formándose metabolitos conjugados inactivos que se eliminan junto con el fármaco
no biotransformado por vía renal. Su semivida es de unas 8-14 h y aumenta (19-50 h) en
pacientes con insuficiencia cardiaca, arritmias ventriculares o insuficiencia renal.
La propafenona se absorbe bien por vía oral, pero su biodisponibilidad es baja (5-30%) ya
que sufre un importante efecto de primer paso hepático. Su acción aparece al cabo de 30 min,
alcanza su Cmax al cabo de 2-4 h y se prolonga durante 8 h. Por vía intravenosa, su efecto es
inmediato y se prolonga durante 2 h. Se une a la α1-glucoproteína ácida (95%), se distribuye
ampliamente y se biotransforma por el CYP2D6 en diversos metabolitos, de los que la 5-
hidroxipropafenona es más potente que la propia propafenona para inhibir la INa. En los
metabolizadores rápidos (90% de la población) su semivida es de 5-8 h y en los lentos de 15-

105
 INTRODUCCIÓN

17 h. La propafenona y sus metabolitos se eliminan conjugados por vía renal (Tamargo y

Valenzuela, 2008).

Figura 36. Estructuras químicas de la flecainida y la propafenona.

5.2.2.c. Aplicaciones terapéuticas

Los fármacos del grupo Ic son de elección para revertir la fibrilación auricular a ritmo
sinusal en las primeras 48 horas de su aparición y para prevenir las recurrencias en pacientes
sin cardiopatía estructural. Recientemente, se ha acuñado el término “píldora en el bolsillo”,
que consiste en que el paciente se auto-administre un fármaco del grupo Ic tan pronto como
aparecen los síntomas de fibrilación auricular con el fin de revertir la arritmia lo más
rápidamente posible a ritmo sinusal. Sin embargo, antes es necesario probar en medio
hospitalario que el paciente tolera estos fármacos y descartar la existencia de disfunción de los
nódulos SA o AV, bloqueo de rama, cardiopatía estructural o un síndrome de Brugada.
También son efectivos en la profilaxis y tratamiento de taquicardias por reentrada intranodal,
y, por deprimir la conducción anterógrada y retrógrada a través del nódulo AV y de las vías
accesorias, en taquiarrimitas asociadas al síndrome de Wolff-Parkinson-White.
Sin embargo, la flecainida y la propafenona están contraindicados en el tratamiento de
extrasístoles ventriculares y taquicardias ventriculares en pacientes con cardiopatía estructural
(infarto de miocardio, insuficiencia cardiaca) ya que aumentan 2-3 veces la mortalidad total y

106
 INTRODUCCIÓN

arritmogénica. Ello es debido a que deprimirían aún más la excitabilidad y la velocidad de

conducción, facilitando la aparición de nuevas áreas de bloqueo y de taquiarritmias
ventriculares por reentrada. Es decir, que la flecainida podría los convertir episodios
isquémicos no fatales en fatales. Por tanto, sólo se utilizarán en pacientes con taquicardias
ventriculares sin cardiopatía estructural o en taquicardias ventriculares recurrentes en
pacientes portadores desfibrilador automático (Tamargo y Valenzuela, 2008).

5.2.2.d. Reacciones adversas e interacciones

Las más frecuentes son digestivas (estreñimiento, náuseas, vómitos, anorexia, molestias
abdominales, disguesia, ictericia colestásica) y neurológicas (mareos, fatiga, parestesias,
cefaleas, alteraciones del gusto, visión borrosa, diplopía), pero las más graves son las
cardiovasculares (depresión de la contractilidad, hipotensión, bradicardia, bloqueos AV e
intraventriculares y taquiarritmias ventriculares) (Tamargo y Valenzuela, 2008).
Una de las reacciones adversas más peligrosas es el agravamiento de la arritmia original o
la inducción de nuevas arritmias que pueden ser incluso mortales (Echt y cols., 1991). Se han
descrito dos tipos de efectos proarrítmicos; uno relacionado con el bloqueo de los canales de
Na+ y otro con la prolongación excesiva de la DPA, debido al bloqueo de canales de K+
cardiacos. La depresión de la excitabilidad constituye, simultáneamente, el origen de los
efectos anti y proarrítmicos, y por lo tanto, cuanto más deprimen la excitabilidad y más
potentes efectos antiarrítmicos producen, más riesgo conllevan. Sus acciones proarrítmicas
son más frecuentes en pacientes con insuficiencia cardiaca, trastornos previos de la
conducción intraventricular, cardiopatía isquémica o cardiopatías estructurales (Delpón y
cols., 2008b). En un 1-2% de los pacientes flecainida y propafenona pueden convertir la
fibrilación auricular en un “flutter” con conducción AV 1:1, aumentando la frecuencia
ventricular hasta 160-180 latidos/min; para evitarlo, es necesario administrar previamente un
fármaco que deprima la conducción AV (digoxina, β-bloqueantes, verapamilo o diltiazem)
(Tamargo y Valenzuela, 2008). Las principales interacciones farmacológicas se muestran en
la Tabla 16.
La flecainida y la propafenona están contraindicadas en pacientes con hipotensión arterial,
infarto de miocardio, insuficiencia cardiaca, enfermedad del seno, bradicardia o bloqueos AV
o intraventriculares (a menos que se haya implantado un marcapaso). La propafenona, por su
acción β-bloqueante, podría estar contraindicada en metabolizadores lentos asmáticos
(Tamargo y Valenzuela, 2008).

107
 INTRODUCCIÓN

Fármaco Interacción con Resultado

Flecainida Amiodarona Aumentan las Cp de flecainida
Digoxina Mayor riesgo de bradicardia y bloqueo AV
FAA del grupo Ia Mayor riesgo de IC y de bloqueos intracardiacos
β-bloqueantes, Mayor riesgo bradicardia, bloqueo AV e IC
diltiazem, verapamilo
Inhibidores de CYP2D6 Aumentan las Cp de flecainida
(quinidina y fluoxetinal)
Propafenona Digoxina Mayor riesgo de bradicardia y bloqueo AV
FAA del grupo Ia Mayor riesgo de insuficiencia cardiaca y de
bloqueos intracardiacos
Tabla 16. Interacciones medicamentosas de los FAA de clase Ic. AV: aurículo-
ventricular. Cp: concentraciones plasmáticas. FAA: fármacos antiarrítmicos. IC: insuficiencia
cardiaca

5.2.2.e. Efectos sobre las corrientes cardiacas

• Efecto sobre la INa

La flecainida inhibe la INa a concentraciones terapéuticas (IC50 = 1.2 µM) (Anno y
Hondeghem, 1990; Follmer y Colatsky, 1990). A concentraciones supraterapéuticas (IC50 =
19 µM), inhibe la entrada de Na+ que se produce durante la fase de meseta del potencial de
acción (INa,L). Como cosnecuencia, la flecainida disminuye la velocidad máxima de
despolarización (Vmax,, un índice indirecto de la INa) de los potenciales de acción registrados
en células musculares auriculares y ventriculares y en el sistema His-Purkinje (Roden y
Woosley, 1986; Tamargo y cols., 2011; Alliot y cols., 2011; Tamargo y cols., 2012).
La flecainida presenta una alta afinidad por el estado activo-abierto de los canales de Na+
y prolonga marcadamente el tiempo de reactivación de los mismos durante la diástole
(constante de tiempo de reactivación > 6 s) (Holmes y Heel, 1986; Tamargo y cols., 2012).
Esta marcada prolongación de la reactivación explica por qué la flecainida disminuye la
excitabilidad y la velocidad de conducción intra-auricular e intra-ventricular (prolongan el
periodo refractario y el QRS del ECG) incluso cuando el paciente está en ritmo sinusal, y por
qué prolonga el PRE auricular y ventricular más de lo que dura el PA (PRE/DPA >1) (Alliot y
cols., 2011; Tamargo y cols., 2012). Como consecuencia, el bloqueo de la INa producido por

108
 INTRODUCCIÓN

la flecainida aumenta (Campbell y Vaughan Williams, 1983; Follmer y Colatsky, 1990;

Tamargo y cols., 1992): 1) a frecuencias rápidas de estimulación ("bloqueo frecuencia-
dependiente"), ya que en estas circunstancias aumenta el tiempo que los canales de Na+ pasan
en estado activo y/o inactivo y se acorta la diástole (durante el cual se produce la reactivación
del canal), por lo que el siguiente latido de la taquicardia aparece antes de que los canales se
hayan reactivado y, por tanto, no se conduce. 2) En células cardiacas parcialmente
despolarizadas (isquemia, hiperpotasemia), ya que en estas circunstancias se retrasa aún más
la reactivación del canal Na+ ("bloqueo voltaje-dependiente"). Sin embargo, este marcado
bloqueo de los canales de Na+ es responsable de los efectos proarritmogénicos de la
flecainida, ya que la depresión de la excitabilidad y de la velocidad de conducción que
produce, facilita la aparición de bloqueos intracardiacos y de arritmias por reentrada,
particularmente en pacientes con cardiopatías estructurales (cardiopatía isquémica, hipertrofia
o insuficiencia cardiaca) o alteraciones previas de la conducción ventricular (bloqueos de
rama).
La propafenona también inhibe la INa a concentraciones terapéuticas (IC50 = 1.5 µM), por
lo que deprime la excitabilidad y disminuye la Vmax auricular y ventricular sin producir
cambios en la amplitud o el PR (Dukes y Vaugham Williams, 1984; Delgado y cols., 1984;
Calleja y cols., 1985, Delgado y cols., 1985). La propafenona prolonga marcadamente la
reactivación de los canales de Na+ (constante de tiempo de reactivación > 6 s) motivo por el
que se le considera un fármaco del grupo Ic, y prolonga también el PRE (Kohlhardt y Seifert,
1980; Kohlhardt y cols., 1983; Delgado y cols., 1985). La propafenona, al igual que la
flecainida, inhibe la INa tanto de forma tónica como frecuencia-dependiente. Las cinéticas de
aparición y recuperación del bloqueo frecuencia-dependiente producido por propafenona son
extremadamente lentas, lo que provoca un considerable grado de bloqueo incluso a bajas
frecuencias de estimulación (Kohlhardt, 1984; Kohlhardt y Fitchner, 1988). Además de este
bloqueo frecuencia-dependiente, también se ha observado un bloqueo voltaje-dependiente,
pues la despolarización del potencial de reposo aumenta la inhibición producida por
propafenona en un 60% (Kohlhardt y cols., 1983; Kohlhardt, 1984).
Al igual que la flecainida, la propafenona también acorta la DPA en las fibras de Purkinje,
lo que indica una posible inhibición de la INa,L (Ledda y cols., 1981).

• Efecto sobre la ICa

La flecainida produce un bloqueo tónico de la ICa registrada en miocitos ventriculares de
rana (Scamps y cols., 1989), aunque la sensibilidad de esta corriente al fármaco (IC50 = 20
µM) es mucho menor que la sensibilidad de la INa al mismo. La flecainida no parece producir

109
 INTRODUCCIÓN

un bloqueo dependiente del uso evidente, lo que implica una asociación muy rápida con el
estado abierto del canal (Scamps y cols., 1989). Por el contrario, la propafenona produce muy
poca o ninguna inhibición tónica sobre la ICa registrada en miocitos ventriculares de cobayo,
aunque sí produce una marcada inhibición dependiente de voltaje y de la frecuencia de
estimulación (IC50 = 5 µM) (Delgado y cols., 1993). La propafenona desplaza la curva de
inactivación hacia potenciales más negativos, evidenciando una mayor afinidad por el estado
inactivo del canal. Esta mayor afinidad por el estado inactivo retrasa la recuperación de la
inactivación, lo que explica también la dependencia de uso del bloqueo (Delgado y cols.,
1993; Hancox y cols., 1997).

• Efecto sobre la Ito

Se ha descrito que la flecainida inhibe la Ito (IC50 = 2.5 µM) tanto en miocitos auriculares
como ventriculares humanos a concentraciones terapéuticamente relevantes (Wang y cols.,
1995b; Radicke y cols., 2008) debido al bloqueo de los estados abierto e inactivo de los
canales Kv4 (Wang y cols., 1995b; Yeola y Snyders, 1997). De hecho, la elevada afinidad de
este fármaco por el estado inactivo desplaza la curva de inactivación del canal hacia
potenciales más negativos (Wang y cols., 1995b). Aunque la interacción con las distintas
subunidades β que interaccionan con el canal Kv4.3 no modifica la potencia de bloqueo de la
flecainida (Radicke y cols., 2008) si se ha observado una disminución del bloqueo al
aumentar la acidosis extracelular (Singarayar y cols., 2003). La corriente generada
exclusivamente por canales Kv4.2 (que presentan la misma distribución que la Ito ventricular
en ratas) también es inhibida por flecainida (IC50 = 23.6 µM). En estos canales, la flecainida
se une sólo al estado inactivo, y en la interacción están implicadas la V402 y la V404, dado
que sustitución de estos residuos por Ile, elimina la dependencia de voltaje del bloqueo
inducido por flecainida (Caballero y cols., 2003).
La inhibición de la Ito inducida por propafenona en miocitos auriculares humanos también
aparece a concentraciones clínicamente relevantes (IC50 = 4.9 µM) (Seki y cols., 1999). La
propafenona requiere que el canal esté en estado abierto para producir el bloqueo, dado que
éste fármaco acelera la constante de inactivación de forma dependiente de concentración y el
bloqueo aumenta al aumentar el tiempo de la despolarización, coincidiendo con la apertura de
los canales. Sin embargo, la propafenona no produce ningún efecto evidente sobre el estado
inactivo del canal, ni sobre su reactivación (Duan y cols., 1993; Seki y cols., 1999).

110
 INTRODUCCIÓN

• Efecto sobre la IKur

La flecainida no ejerce ningún efecto sobre la IKur registrada en miocitos auriculares
humanos (Wang y cols., 1995b). Sorprendentemente, éste fármaco sí que inhibe la IKur
registrada en miocitos auriculares de perro (IC50 = 3 µM), al unirse preferentemente al estado
abierto del canal (Yue y cols., 2000). Herrera y cols., estudiaron la unión de la flecainida
sobre diversos canales Kv, para intentar determinar las bases moleculares de la distinta
sensibilidad de los canales Kv a la flecainida. Mediante mutagénesis dirigida, los autores
observaron que la sustitución I502L en el dominio transmembrana S6 del canal Kv1.5
humano, aumenta marcadamente la sensibilidad de los canales humanos a la flecainida de la
corriente generada por estos canales (Herrera y cols., 2005), mientras que la mutación inversa,
L392I, en los canales Kv4.2 los hace insensibles a la acción de éste fármaco (Herrera y cols.,
2005). Recientemente, se ha descrito mediante un modelado molecular, una probable
conformación dentro del poro de los canales Kv1.5, donde el grupo cargado de la flecainida se
sitúa en una región cargada negativamente, mientras que un grupo trifluorometilo interacciona
directamente con la I502. Presumiblemente, la presencia de una Leu en esta posición hace
más fuerte esta interacción, bloqueando el canal Kv1.5 (Tikhonov y Zhorov, 2014).
En miocitos auriculares humanos se ha descrito que la propafenona inhibe la IKur (IC50 =
8.6 µM) de forma independiente de voltaje y uso (Seki y cols., 1999). Sin embargo, mediante
el registro de la corriente generada por canales Kv1.5 humanos expresados de forma estable
en células Ltk-, se ha observado que tanto la propafenona, como su principal metabolito, la 5-
OH-propafenona, bloquean estos canales de forma dependiente de voltaje (Franqueza y cols.,
1998). Ambos compuestos aceleran la activación e inducen una rápida disminución de la
corriente durante la despolarización que se superpone a la lenta inactivación que caracteriza a
estos canales. Por lo tanto, esto indica que la propafenona se une a los canales Kv1.5
preferentemente en estado abierto. Además, el cálculo del valor de la distancia eléctrica
fraccional (es decir, la fracción del campo eléctrico percibida por una sola carga en el sitio de
unión), indica que tanto la propafenona como su metabolito comparten el mismo sito de unión
que el de los anestésicos locales, antihistamínicos y otros antiarrítmicos (Franqueza y cols.,
1998).

• Efecto sobre la IKr

El componente rápido de la corriente rectificadora tardía es inhibido a concentraciones
clínicamente relevantes tanto por la flecainida como por la propafenona, siendo más sensible
a la propafenona (IC50 = 3.91 µM y IC50 = 0.44 µM respectivamente, medido en la corriente

111
 INTRODUCCIÓN

generada por canales Kv11.1 expresados en células HEK) (Follmer y cols., 1992; Duan y
cols., 1993; Delpón y cols., 1995; Wang y cols., 1996b; Mergenthaler y cols., 2001; Paul y
cols., 2002). Ambos compuestos producen un bloqueo dependiente de voltaje y tiempo, lo que
implica una unión preferente al estado abierto del canal (Paul y cols., 2002; Arias y cols.,
2003). La propafenona, además, también tiene afinidad por el estado inactivo del canal, lo que
acelera la cinética de inactivación de Kv11.1. Los metabolitos de la propafenona poseen unas
características de bloqueo similares a los de la propafenona (Arias y cols., 2003; Cahill y
Gross, 2004), aunque la 5-OH-propafenona tiene una mayor afinidad por el estado abierto que
el compuesto padre (Arias y cols., 2003). Además, tanto la propafenona como su metabolito
principal podrían interaccionar con el estado cerrado del canal, lo que explicaría el bloqueo
instantáneo que aparece al inicio de los pulsos despolarizantes (Arias y cols., 2003). El
modelo propuesto para el bloqueo inducido por propafenona de los canales Kv11.1 implica
una fuerte interacción con el anillo aromático de la F565 y una interacción más débil con la
Y652 situadas en el dominio transmembrana S6 (Witchel y cols., 2004). Según este modelo,
tras el cierre del canal, el fármaco quedaría atrapado en el sitio de unión del canal.
Posteriormente, el fármaco se liberaría de su unión con la F565, posicionándose en la cavidad
interna. Por último, la reactivación del canal permitiría la salida del fármaco del la cavidad
interna (Witchel y cols., 2004). En este modelo no sería necesario una interacción con el
estado inactivo del canal, aunque ésta sería posible en tanto que la afinidad por el estado
inactivo es equivalente a la del estado abierto (Witchel y cols., 2004). Los resultados
demuestran que la fracción de campo eléctrico trnasmembrana sensado por la forma cargada
de la propafenona (forma activa) cuando está unida a si receptor en el por es de 0.2. Dicha
forma cagada accede al receptor entrando por la boca intracelular del poro del canal
(Mergenthaler y cols., 2001; Witchel y cols., 2004).

• Efecto sobre la IKs

El componente lento de la corriente rectificadora tardía, o IKs, no es inhibido por la
flecainida (Wang y cols., 1996b). Sin embargo, la propafenona sí que inhibe esta corriente,
aunque en menor grado que la IKr (Delpón y cols., 1995). Este bloqueo parece estar asociado
con la apertura del canal y aumenta al aumentar la frecuencia de estimulación. La
propafenona ejerce un bloqueo tanto tónico como dependiente del uso que se desarrolla más
rápidamente que la propia activación del canal (Delpón y cols., 1995). Por todo ello se
concluye que la propafenona bloquea el canal preferentemente cuando éste transita desde el
estado cerrado al estado abierto.

112
 INTRODUCCIÓN

• Efecto sobre las corrientes rectificadoras internas

Solamente la corriente de salida de la IK,ATP registrada en miocitos ventriculares de cobayo
es inhibida por la flecainida (IC50 = 17.3 µM) de forma dependiente de la concentración
(Wang y cols., 1995c). Por ello, se ha propuesto que la flecainida podría bloquear los canales
Kir6.2 de forma parecida a como lo hacen los cationes divalentes en el mecanismo de
rectificación interna (Wang y cols., 1995c). Sin embargo, el efecto de la flecainida sobre la
misma corriente registrada en miocitos uretrales de cerdo, es distinto, ya que inhibe tanto la
corriente de salida como de entrada (Yunoki y cols., 2001). La disminución del pH, hace que
la IK,ATP sea menos sensible a la inhibición inducida por flecainida (Wang y cols., 1995c;
Yunoki y cols., 2001). La IK,ACh es inhibida tanto por la flecainida como por la propafenona
(IC50 = 3.6 µM e IC50 = 0.3 µM respectivamente, en miocitos ventriculares de cobayo). Se ha
propuesto que ambos fármacos reducen la IK,ACh bloqueando directamente el estado abierto de
los canales de K+ muscarínicos (Inomata y cols., 1993; Walsh, 2010).
Los estudios previos no han observado ningún efecto de la flecainida sobre la IK1, aunque
las dosis usadas siempre han sido mayores o mucho mayores de 1 µM, por lo que se
desconoce su efecto a concentraciones del rango terapéutico (Follmer y Colatsky, 1990;
Yamashita y cols., 1995). Por otra parte, Duan y cols. (1993), estudiaron el efecto de la
propafenona sobre la IK1 registrada en miocitos auriculares de conejo y observaron que éste
fármaco inhibe el 30, 45 y 55% de la corriente medida a -110 mV a concentraciones de 1, 5 y
10 µM, respectivamente. Sin embargo, los autores no profundizaron en el mecanismo
responsable del efecto debido al “complejo comportamiento de la IK1” (Duan y cols., 1993).

113
II. JUSTIFICACIÓN Y OBJETIVOS
  
 JUSTIFICACIÓN Y OBJETIVOS

La IK1 cardiaca humana es la corriente que determina que el potencial de reposo de los
miocitos se estabilice cerca del potencial de inversión del K+. Además determina la fase final
de repolarización del PA (fase 3), por lo que es una corriente que determina de forma crítica
el periodo refractario. Los canales que generan esta corriente (Kir2.1, Kir2.2 y Kir2.3) se
pueden ensamblar en forma de homo o heterotetrámeros, modificando las características de la
IK1. Se ha descrito que en humanos, Kir2.1 es la isoforma predominante en el tejido
ventricular, mientras que a nivel auricular la expresión de Kir2.2 y Kir2.3 es importante.
Los canales Kir2.x están implicados en la perpetuación de taquiarritmias reentrantes tanto
en humanos como en modelos experimentales. Además mutantes tanto de pérdida como de
ganancia de función del gen que codifica a Kir2.1 que provocan una disminución o un
aumento de IK1 respectivamente, están asociados a arritmias ventriculares. De hecho, las
mutaciones que aumentan el componente de salida del IK1 provocan un síndrome de QT corto
tipo 3 y arritmias ventriculares severas, mientras que aquellas mutaciones que lo disminuyen
causan una prolongación del QT y también generan arritmias ventriculares (Síndrome de
Andersen-Tawil). Además, se ha descrito que un aumento de la IK1 podría ser el origen de la
fibrilación auricular y ventricular. Este tipo de arritmias se caracterizan por una actividad
eléctrica rápida y turbulenta que da lugar a la perdida de función contráctil por parte del
miocardio. Está ampliamente aceptado que las arritmias fibrilatorias se generan por la
“reentrada” de impulso cardiaco en forma de rotores y se ha descrito que el aumento en la
amplitud de IK1 es un factor crítico que incide en el aumento en la frecuencia y la estabilidad
de estos rotores. Se ha propuesto que la modulación selectiva de los canales Kir2.x, para
conseguir un bloqueo de IK1 a nivel auricular pero no a nivel ventricular, podría ser una
estrategia eficaz para el tratamiento la fibrilación auricular.
En la actualidad, hay una enorme cantidad de información sobre la farmacología de las
corrientes cardiacas humanas de K+ voltaje-dependientes. Se sabe, por ejemplo que mientras
las toxinas se unen a la boca extracelular del poro, los fármacos que bloquean estos canales,
se unen al estado abierto del canal en sitios de unión que con topología similar situados en la
luz del poro. Sin embargo, la farmacología de los canales Kir2.x está en un estado de
incipiente desarrollo. Se ha descrito que la cloroquina inhibe IK1 de forma dependiende de
voltaje al unirse a distintos residuos del poro citoplasmasmático de Kir2.1 y que están
implicados en la unión a poliaminas. Otros fármacos, como el tamoxifeno, la mefloquina y el
carvedilol inhiben la IK1 al unirse a PIP2, impidiendo la interacción crítica y necesaria entre el
canal y este mediador.
La flecainida y la propafenona actúan como fármacos antiarrítmicos de clase Ic,
bloqueando los canales de Na+. Debido a esta característica son usados como fármacos de

117
 JUSTIFICACIÓN Y OBJETIVOS

elección para el tratamiento agudo de la FA de reciente comienzo (menos de 48 horas),

consiguiendo cardioversión a RS en un elevado porcentaje de los casos. Sin embargo, los
antiarrítmicos de clase Ic se han asociado con un marcado aumento del riesgo de arritmias
ventriculares. De hecho, se ha descrito que tanto flecainida como la propafenona aumentan la
DPA y el periodo refractario a nivel auricular pero no ventricular, diferencias no explicables
por sus efectos sobre los canales de Na+ y de K+ voltaje-dependientes. Por otra parte, se ha
descrito que la propafenona es capaz de bloquear la IK1 en miocitos de conejo. Sin embargo,
hoy en día se desconocen los determinantes moleculares de la modulación que ejercen la
flecainida y la propafenona sobre los canales que generan la IK1 humana.
Nuestra hipótesis de partida es que éstos fármacos antiarrítmicos de clase Ic modulan los
canales que generan la IK1 humana y además, que producen efectos distintos sobre cada uno
de los canales Kir2.x que justificarían sus acciones antiarrítmicas auriculares y proarrítmicas
ventriculares.

Por todo ello los OBJETIVOS de la presente TESIS DOCTORAL fueron:

1. Analizar los efectos producidos por la flecainida sobre la sobre las corrientes generadas
por los canales Kir2.1, Kir2.2 y Kir2.3 humanos registrados en sistemas de expresión
heterólogos y sobre la IK1 auricular humana.

2. Identificar el/los sitios de unión de la flecainida al canal y describir el mecanismo

mediante el cual dicha unión provoca los efectos observados.

3. Analizar los efectos producidos por la propafenona sobre las corrientes generadas por
los canales Kir2.1, Kir2.2 y Kir2.3 humanos registrados en un sistemas de expresión
heterólogos y sobre la IK1 auricular humana.

4. Identificar el/los sitios de unión de la propafenona al canal y describir el mecanismo

mediante el cuales dicha unión provoca los efectos producidos.

118
III. RESULTADOS
  
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
1. Flecainide increases Kir2.1 currents by interacting
with cysteine 311, decreasing the polyamine-induced
rectification

Caballero R, Dolz-Gaitón P, Gómez R, Amorós I, Barana A, González de

la Fuente M, Osuna L, Duarte J, López-Izquierdo A, Moraleda I, Gálvez E,
Sánchez-Chapula JA, Tamargo J, Delpón E. Proc Natl Acad Sci USA.
2010;107:15631-15636
  
 RESULTADOS

Flecainide increases Kir2.1 currents by interacting

with cysteine 311, decreasing the polyamine-
induced rectification
Ricardo Caballeroa,1, Pablo Dolz-Gaitóna,1, Ricardo Gómeza,2, Irene Amorósa, Adriana Baranaa, Marta González de la
Fuentea, Lourdes Osunaa, Juan Duarteb, Angelica López–Izquierdoc, Ignacio Moraledad, Enrique Gálvezd,
José Antonio Sánchez–Chapulac, Juan Tamargoa, and Eva Delpóna
a
Department of Pharmacology, School of Medicine, Universidad Complutense, 28040 Madrid, Spain; bDepartment of Pharmacology, School of Pharmacy,
Universidad de Granada, 18071 Granada, Spain; cUnidad de Investigación Carlos Méndez, Centro Universitario de Investigaciones Biomédicas, Universidad de
Colima, 28045 Colima, Mexico; and dDepartment of Organic Chemistry, School of Pharmacy, Universidad de Alcalá, 28871 Alcalá de Henares, Spain

Edited by Lily Yeh Jan, University of California, San Francisco, CA, and approved July 23, 2010 (received for review March 25, 2010)

Both increase and decrease of cardiac inward rectifier current (IK1) are in patients with coronary artery disease and/or heart failure. Con-
associated with severe cardiac arrhythmias. Flecainide, a widely used versely, in a limited number of patients, it has been reported that
antiarrhythmic drug, exhibits ventricular proarrhythmic effects while flecainide is effective in controlling ventricular tachycardia associ-
effectively controlling ventricular arrhythmias associated with muta- ated with the autosomal dominant trait Andersen syndrome (AS),
tions in the gene encoding Kir2.1 channels that decrease IK1 (Andersen which is produced by loss-of-function mutations in KCNJ2 (9, 10).
syndrome). Here we characterize the electrophysiological and molec- We hypothesized that a putative differential flecainide effect on
ular basis of the flecainide-induced increase of the current generated atrial and ventricular IK1 (blockade of atrial and increase of ven-
by Kir2.1 channels (IKir2.1) and IK1 recorded in ventricular myocytes. tricular IK1) can account for the selective prolongation of the atrial
Flecainide increases outward IKir2.1 generated by homotetrameric APD, the ventricular proarrhythmic effects, and the antiarrhyth-
Kir2.1 channels by decreasing their affinity for intracellular poly- mic effects in the AS patients. Therefore, we have analyzed the
amines, which reduces the inward rectification of the current. Flecai- flecainide effects on the currents generated by human WT and
nide interacts with the HI loop of the cytoplasmic domain of the mutated Kir2.1, Kir2.2, and Kir2.3 channels (IKir2.x) and compared
channel, Cys311 being critical for the effect. This explains why flecai- its effects on atrial and ventricular IK1. Acutely applied flecainide
nide does not increase IKir2.2 and IKir2.3, because Kir2.2 and Kir2.3 chan- selectively increased ventricular IK1 and IKir2.1, an effect deter-
nels do not exhibit a Cys residue at the equivalent position. We mined by the presence of Cys311 at the cytoplasmic domain of

PHARMACOLOGY
further show that incubation with flecainide increases expression of Kir2.1 channels. Binding of flecainide reduced the Kir2.1 poly-
functional Kir2.1 channels in the membrane, an effect also determined amine blockade, thus reducing the inward rectification. Addition-
by Cys311. Indeed, flecainide pharmacologically rescues R67W, but ally, incubation with flecainide increased functional ion channel
not R218W, channel mutations found in Andersen syndrome patients. density, an effect also determined by Cys311. Overall, the findings
Moreover, our findings provide noteworthy clues about the structural show that Kir2.1 channels can be affected through the pharma-
determinants of the C terminus cytoplasmic domain of Kir2.1 channels cological modulation of their polyamine blockade by a therapeu-
involved in the control of gating and rectification. tically used drug.

Results
|
cardiac IK1 Kir2.2 channel | Kir2.3 channel | Andersen mutations | inward Flecainide Increases Kir2.1 Currents. Figure 1A shows IKir2.1 traces
rectifying channel
recorded in transiently transfected Chinese hamster ovary (CHO)
+ cells by applying 250-ms pulses from −60 mV to potentials ranging
T he cardiac inwardly rectifying K current (IK1) stabilizes resting
membrane potential (RMP) close to the reversal potential of K+
(EK) and shapes the final repolarization phase of the action po-
−120 and +20 mV in the absence and presence of 1 μM flecainide.
Flecainide increased IKir2.1 at voltages negative (16.5 ± 2.4% at
−120 mV) and, more importantly, at voltages positive to EK (45.8 ±
tential (AP) (1). Three inwardly rectifying channels (Kir2.1, Kir2.2, 9.8% at −50 mV, n = 8, P < 0.05; Fig. 1 A and B). These effects
and Kir2.3) contribute to IK1 in the human heart assembled as were completely reversible upon washout (Fig. S1). The concen-
homo- and/or heterotetramers (2). Experimental data suggest that tration that produces the half-maximum effect (EC50) and the
in humans, Kir2.1 is the major isoform underlying ventricular IK1, maximum effect (Emax) were calculated by fitting the Hill equation
whereas its relative contribution to atrial IK1 seems to be lower (3).
to the increase produced by different flecainide concentrations and
The strong inward rectification of Kir2.x channels, i.e., the prefer-
averaged 0.8 ± 0.01 μM (nH= 1.6 ± 0.4) and 22 ± 1.9% at −120 mV,
ential conduction of inward compared with outward current, de-
respectively (Fig. S1). At −50 mV, the EC50 and the Emax averaged
pends on the binding of intracellular Mg2+ and polyamines to the
0.4 ± 0.01 μM (nH = 2.2 ± 0.2) and 53.9 ± 3.6%, respectively (Fig.
cytoplasmic pore and to the inner vestibule of the channel (4).
Gain- and loss-of-function mutations in the gene that encodes S1). Therefore, flecainide preferentially increased the outward
Kir2.1 (KCNJ2) have been reported, and both the IK1 increase and IKir2.1 generated at physiological potentials.
decrease produced by these mutations are associated with severe
ventricular arrhythmias (1). Furthermore, experimental data showed
that as the amplitude of the outward component of the IK1 increases, Author contributions: R.C., J.T., and E.D. designed research; R.C., P.D.-G., R.G., I.A., A.B.,
M.G.d.l.F., L.O., J.D., A.L.-I., I.M., E.G., and J.A.S.-C. performed research; R.C., P.D.-G., R.G.,
the frequency of the fast and stable reentry of spiral waves (rotors) I.A., A.B., M.G.d.l.F., and J.A.S.-C. analyzed data; and J.T. and E.D. wrote the paper.
increases. Indeed, the importance of IK1 in the establishment of
The authors declare no conflict of interest.
rotors and ventricular fibrillation dynamics has been shown (5).
Flecainide is a class I antiarrhythmic drug that, besides its Na+ This article is a PNAS Direct Submission.

channel-blocking properties, exhibits class III antiarrhythmic effects Freely available online through the PNAS open access option.
1
[i.e., prolongs AP duration (APD) and refractoriness] at the atrial R.C. and P.D.-G. contributed equally to this work.
but not at the ventricular level (6, 7). Flecainide is widely used to 2
To whom correspondence should be addressed. E-mail: ricardo.gomez@med.ucm.es.
suppress recent onset atrial fibrillation (AF) (8), though it is asso- This article contains supporting information online at www.pnas.org/lookup/suppl/doi:10.
ciated with an increased risk of ventricular proarrhythmia, especially 1073/pnas.1004021107/-/DCSupplemental.

123
www.pnas.org/cgi/doi/10.1073/pnas.1004021107 PNAS | August 31, 2010 | vol. 107 | no. 35 | 15631–15636
 RESULTADOS

A -60 mV
+20 mV
A 0 mV
B Membrane potential (mV)
2
50 ms -120 mV

Human atrial IK1 (pA/pF)

Control

2 pA/pF
-110 -90 -70 -50 -30
Fleca 1 μM
1 nA

20 mV -2

-4
-40 mV
Control
Control -40 mV -6
Flecainide 1 μM -120 mV Fleca 1 μM
-8
Membrane potential (mV)
B
*** C 50 ms
50 ms
Control D Membrane potential (mV)

10 pA/pF
10

Guinea-pig atrial IK1 (pA/pF)

-140 -60 20

IKir2.1 (nA)
-0.5
* * * 0.3
-1
* 0.2 -1.5 -130 -110 -90 -70 -50 -30
**
0.1
Flecainide 1 μM
50 ms
-2
** -80 -60 -40 -20 -10
-0.1 -2.5
** -0.2

Control Fleca 1 μM Control -20

70
Fleca 1 μM
C
Flecainide-induced

-30
60
change (% )

50 Vm= -50 mV
50
50ms
40
E ms
Control
F Membrane potential (mV)

20 pA / pF
30

Guinea-pig ventricular IK1 (pA/pF)

20
* * 10
10
* *
0
*
-10
.1 .2 .3 -130 -110 -90 -70 -50 -30
r2 r2 r2 2.2 2.3
Ki Ki Ki .1+ .1+ -10
r2 r2 50 ms
Flecainide 1 μM
Ki Ki
-20
*
Fig. 1. Flecainide increases IKir2.1. (A) IKir2.1 traces recorded by applying the
* -30
protocol shown in the absence and presence of flecainide. (B) I–V curves for Control
currents measured at the end of the pulses. (Inset) Data at potentials positive * -40
to EK in an expanded scale. *P < 0.05 and **P < 0.01 vs. control. (C) Flecainide- * Fleca 1 μM
-50
induced change on the current recorded at −50 mV in cells expressing homo-
tetramers of Kir2.1, Kir2.2, or Kir2.3 channels or heterotetramers of Kir2.1 +
Kir2.2 and Kir2.1 + Kir2.3. *P < 0.05 vs. Kir2.1. Each point/bar represents the G Membrane potential (mV)
H
Guinea-pig ventricular IK1 (pA/pF)
mean ± SEM of five or more experiments. * 10 Atria Ventricles
-130 -110 -90 -70 -30

er
bp 1 3 .1 .3

.2

.2
2. 2.

k
r2 r2

r2

r2
r

ar
r
Ki Ki Ki Ki

Ki

Ki
1000
To determine the effect of flecainide in a physiologically relevant -10
GAPDH
setting, we used an epicardial AP voltage-clamp protocol (Fig. S2). * -20 600

Under these conditions, flecainide increased the charge crossing the * 2+

Ba sens Control -30
membrane estimated from the integral of the current traces, * Ba2+ sens Fleca 300 Kir2.x

reaching 137 ± 28% at 1 μM (n = 8; Fig. S2). * Ba2+ insens Control -40

Ba2+ insens Fleca -50 1 2 3 4 5 6 7

Flecainide Does Not Modify Kir2.2 and Kir2.3 Currents. Because

Kir2.2 and Kir2.3 proteins also contribute to cardiac IK1, the effects Fig. 2. Flecainide increases ventricular but not atrial IK1. Voltage ramp (800 ms)
of flecainide on these channels were studied. The findings showed from −100 to −10 mV (A) and I–V curves (B) for human atrial IK1 in the absence
that flecainide failed to modify IKir2.2 and IKir2.3 (P > 0.05 vs. control, and presence of flecainide. Representative IK1 traces recorded in guinea-pig atrial
(C) or ventricular (E) myocytes by applying the protocol shown. I–V curves for
n = 10; Fig. 1C and Fig. S3). We also studied the flecainide effects
guinea-pig atrial (D) or ventricular (F) IK1. (G) I–V of the Ba2+-sensitive and Ba2
on cells cotransfected (1:1 ratio) with both Kir2.1 and Kir2.2 (Kir2.1/ +
-insensitive currents recorded in ventricular myocytes before and after appli-
Kir2.2) and with Kir2.1 and Kir2.3 (Kir2.1/Kir2.3). Kir2.1/Kir2.2 and cation of flecainide. (H) mRNA expression level of Kir2.x channels in guinea-pig
Kir2.1/Kir2.3 currents displayed activation kinetics significantly atrial and ventricular samples. First lane shows molecular weight marker (1,000–
different from those of the respective homotetrameric channels 100 bp). Lanes 2–4 and 5–7 show Kir2.1 (325 bp), Kir2.2 (291 bp), and Kir2.3 (303
(Fig. S4), demonstrating the heterotetrameric nature of the chan- bp) mRNA expression in atrial and ventricular tissue, respectively. GAPDH gene
nels. Under these conditions, flecainide failed to increase inward was used as internal standard. Each point represents the mean ± SEM of four
and outward currents (P > 0.05 vs. control, n = 10; Fig. 1C and Fig. experiments in each group. *P < 0.05 vs. control.
S4), demonstrating that its effects were only apparent in channels
composed of four Kir2.1 subunits.
Because human ventricular myocytes were not available, we
Flecainide Increases IK1 in Ventricular but Not in Atrial Myocytes. compared the effects of flecainide on the IK1 recorded in guinea-pig
Considering that flecainide selectively increases IKir2.1, we sur- atrial and ventricular myocytes (Fig. 2 C–F). As in humans, in
mised that flecainide will differentially affect atrial and ventricular guinea-pig ventricles, Kir2.1 expression is higher than in the atria
IK1. Figure 2 A and B show original recordings and mean I–V (1, 11, 12). In ventricular myocytes, 1 μM flecainide significantly
relationships for IK1 obtained in isolated human atrial myocytes increased both the inward (19.5 ± 3.2% at −120 mV) and outward
by applying a voltage ramp from −100 to −10 mV in the absence (38.0 ± 9.5% at −40 mV) current (P < 0.05, n = 4) without modi-
and presence of flecainide (1 μM). Flecainide did not modify either fying atrial IK1 (P > 0.05, n = 4; Fig. 2 C–F). All these experiments
the inward (−5.5 ± 1.2 vs. −5.6 ± 1.2 pA/pF at −100 mV; P > 0.05, were performed in the presence of atropine (1 μM) and glibencla-
n = 5) or outward (0.5 ± 0.1 vs. 0.6 ± 0.1 pA/pF at −10 mV; P > mide (10 μM) to block the acetylcholine-activated component
0.05) current. (IKACh) and the ATP-sensitive (IKATP) inward rectifier currents,

124
15632 | www.pnas.org/cgi/doi/10.1073/pnas.1004021107 Caballero et al.
 RESULTADOS

respectively. Identical findings were obtained when the ventricular a significant increase in the Po (Fig. 3E). Figure 3F compares the
IK1 was measured as the Ba2+-sensitive current (Fig. 2G). voltage dependence of the Po (Po–V curves) in control conditions
A previous report proposed that Kir2.1 is the only Kir2.x channel and in the presence of flecainide. As described, Po decreased as the
expressed in guinea-pig atria (11). Conversely, our findings sug- membrane potential became more negative (1, 13). Flecainide
gested that guinea-pig ventricular IK1 is mainly carried by Kir2.1 shifted the midpoint of the curve to more negative potentials (from
homotetramers, whereas Kir2.x heterotetramers generate atrial IK1. −55.3 ± 1.8 to −71.1 ± 2.4 mV; P < 0.05) without modifying the
For testing whether Kir2.1 is the only Kir2.x channel present in the slope. In Fig. 3G, the voltage dependence of the single-channel
atria, we analyzed the mRNA expression of Kir2.x in guinea-pig current amplitude is depicted. Flecainide did not modify the slope
atria and ventricles. In agreement with another report (12), we could conductance values (γ = 34.7 ± 1.7 pS) yielded by the fit of a linear
detect Kir2.1, Kir2.2, and Kir2.3 mRNA in both the atria and the function to the data. All of these effects resemble those produced
ventricles (Fig. 2H). by PIP2 (14), suggesting that flecainide potentiates the activating
PIP2 effects on the channel. To test this hypothesis, we studied the
Flecainide Increases Open Probability of Kir2.1 Channels. Figure 3A effects of flecainide on L222I Kir2.1 channels, a mutation that
shows single-channel recordings in a CHO cell expressing Kir2.1 decreases the channel affinity for PIP2 but renders functional
channels by applying 10-s pulses to −80 mV from a holding po- channels (14). Fig. S5 shows that the decrease of the channel af-
tential of 0 mV in the absence and presence of 1 μM flecainide. In finity for PIP2 suppressed the flecainide IKir2.1- increasing effects at
control conditions, Kir2.1 channel activity was characterized by few potentials negative to the EK, whereas increasing effects at positive
and long events, leading to an opening frequency (fo) of 2.0 ± 0.1 potentials were still apparent.
Hz and a mean open probability (Po) of 0.27 ± 0.01 (n = 6; Fig. 3 D
and E). Flecainide did not modify unitary current amplitude (Fig. Flecainide Increases Kir2.1 Currents by Decreasing the Polyamine
3B) but changed channel gating by significantly increasing the mean Blockade. Figure 4A illustrates the I–V curve normalized to the
open time and fo (Fig. 3 C and D), which eventually resulted in amplitudes at −120 mV in control conditions and in the presence
of 1 μM flecainide at potentials positive to EK. As can be observed,
flecainide induced a marked increase of the outward IKir2.1 and
shifted the potential at which the outward current peaks, sug-
A Control Fleca 1 μM gesting that it decreased the channel rectification.
C C The degree of rectification of Kir2.1 channels was estimated as
O O
C C
the relative chord conductance (Gc; Fig. 4B) in control conditions
O O and in the presence of flecainide. Flecainide shifted the midpoint of
C C
O
the curves to more positive potentials (from −91.9 ± 1.8 to −87.1 ±
1.8 and −80.5 ± 1.4 mV at 1 and 10 μM flecainide, respectively; P <
O
C C
5 pA

O O 0.05) and decreased the steepness of rectification, reflected by

a lower z value in the presence of flecainide (2.4 ± 0.3 and 1.6 ± 0.6

PHARMACOLOGY
0.5 s

for 1 and 10 μM flecainide, respectively) than in control conditions

400
B 4 C ** (3.0 ± 0.5; Fig. 4B).
Mean open time (ms)

300
Because the strong rectification of Kir2.1 channels is explained by
Amplitude (pA)

3
the voltage-dependent block produced by intracellular polyamines
200 (4), our findings suggested that flecainide decreases the affinity of the
2
channel for polyamines. Therefore, flecainide effects were further
1 100 tested in excised inside-out macropatches in the presence of in-
creasing concentrations of spermine (Spm, 1 nM–10 μM). Figure 4C
0 0
Control Fleca
shows that in control conditions, Spm produced a concentration-
Control Fleca dependent block of the outward current at +70 mV. The concen-
tration that produces the half-maximum inhibition (IC50) was 1.5 ±
D 4 ** E 0.5 * 0.1 nM (Fig. 4D; n = 8). In the presence of flecainide (1 μM),
3
0.4 blockade produced by all of the Spm concentrations tested was de-
0.3
creased, an effect that shifted rightward (29.0 ± 2.1 nM, n = 8) the
fo (Hz)

concentration-effect curve of Spm (Fig. 4D). Importantly, in the

Po

2
0.2 presence of flecainide, Emax produced by Spm reached saturation at
1
0.1
82.1 ± 5.5%.
Finally, we analyzed the effects of flecainide on E224A, D259A,
0
Control Fleca
0.0
Control Fleca
and E299A Kir2.1 channels, three cytoplasmic residues that are
important in determining the extent of Kir2.1 inward rectification
Control (15). Figure 4E shows the E224A I–V relationship in the absence
F 1.0 G -100 Membrane potential (mV)
-80 -60 -40 -20 0 and presence of flecainide. The mutation disrupted the rectifica-
Fleca * *
0.8
*
* tion mechanism of the channel and completely abolished the fle-
0.6 -1
cainide increase at potentials positive to the EK. Identical findings
Po

iKir2.1 (pA)

*
0.4 *
Control
-2 were obtained when analyzing the effects of flecainide on D259A
0.2
Fleca -3 and E299A Kir2.1 channels (Fig. 4F).
0.0
-120 -100 -80 -60 -40 -20 -4
Membrane potential (mV) Cys311 Is Critical for the Flecainide-Induced Increase of IKir2.1. To
explore the putative binding site of flecainide within Kir2.1 chan-
Fig. 3. Flecainide 1 μM increases mean open time, fo, and Po, of Kir2.1
channels. (A) Single-channel recordings under control conditions and after
nels, a molecular model was developed. A blind docking for fle-
perfusion with flecainide. Closed- and open-channel levels are indicated by C
cainide with a full-length channel composed of the crystal structure
and O, respectively. Unitary current amplitude (B), mean open time (C), fo of one cytoplasmic domain of Kir2.1 (15) and a modeled trans-
(D), and Po (E) in the absence and presence of flecainide. (F) Po–V in control membrane domain based on KirBac1.1 crystal structure was per-
conditions and in the presence of flecainide. Solid lines represent the fit of formed. The findings showed that the most practical binding site on
a Boltzmann function to the data. (G) Single-channel current-voltage rela- Kir2.1 channels was located on the βI strand within the C terminus
tionships in the absence and presence of flecainide. Solid lines represent the of the cytoplasmic domain (Fig. S6 and Table S1). In contrast,
fit of a linear function to the data. Each point/bar represents the mean ± when blind docking was performed on Kir2.2 and Kir2.3, none of
SEM of six experiments. *P < 0.05 and **P < 0.01 vs. control. the conformations obtained were located on the βI (Fig. S7).

125
Caballero et al. PNAS | August 31, 2010 | vol. 107 | no. 35 | 15633
 RESULTADOS

A C +70 mV E M embrane po tential (mV)

0.12 * -70 mV -80 mV

Normalized IKir2.1
* Co ntro l
Fleca 1 μM S pm 1 nM 800
0.08 * S pm 10 nM

IKir2.1 E224A (pA)

Control Spm 30 nM 400
0.04 Fleca 1 μM

0.2 nA

0.2 nA
0.00 -130 -90 -50 -10 20
-100 -75 -50 -25 0 25
-400
M embrane po tential (mV) Kir2.1 E224A
2 00 m s 200 m s *
Fleca 1 μM -800
*

3
B D F

Normalized IKir2.1
Kir2.1
Predicted non 2
rectifying current
1
1.2 100 V m = -5 0 m V

IKir2.1 block (%)

Flecainide-induced
-140 -60 20 60
1.0 80
Relative Gc

increase (%)
-1
0.8 60 40
0.6 Co ntro l
40 Control
0.4 Fleca 1 μM 20

0.2 Fleca 10 μM 20 Fleca 1 μM *

0 * *
0.0 0
0.01 1 100 10000 T A A
-150 -100 -50 0 50 W 2 4A 99 59
.1 E2 D2
M embrane po tential (mV) [Sperm ine] (nM) r2 E2
Ki

Fig. 4. Flecainide decreases polyamine blockade. (A) IKir2.1 normalized to the amplitudes at −120 mV at potentials positive to EK in control conditions and in
the presence of flecainide. (B) Mean relative Gc in control conditions and in the presence of flecainide. Solid lines represent the fit of a Boltzmann function to
the data. (Inset) Mean I–V curve and the current predicted, assuming a linear unblocked current in control conditions. (C) Current traces recorded at +70 mV in
excised inside-out patches from HEK-293 cells expressing Kir2.1 channels in control conditions and after cytoplasmic surface application of Spm in the absence
and presence of flecainide. Dashed lines represent the zero current level. (D) Percentage of current inhibition at +70 mV in excised inside-out patches as
a function of Spm concentrations in the absence and presence of flecainide. (E) I–V curves for E224A Kir2.1 channels in the absence and presence of flecainide.
(F) Flecainide-induced change on the current recorded at −50 mV in CHO cells expressing WT, E224A, E299A, and D259A Kir2.1 channels. *P < 0.05 vs. control.
Each point/bar represents the mean ± SEM of five or more experiments.

Thereafter, flecainide was manually docked into the Kir2.1 βI sensitive current (Fig. S8) that was significantly greater than the
strand. In the lowest-energy pose (−11.3 kcal/mol), flecainide was current generated by nonincubated cells (Fig. 6E; n = 21, P <
predicted to bind strongly to Cys311 by forming three hydrogen 0.01). Loss of function of R67W and R218W channels has been
bridge bonds (one between the carbonyl oxygen atom of flecainide
and the thiol group of the Cys residue, and two between the car-
bonyl oxygen atom of the amino acid and the nitrogen atoms of the A Membrane potential (mV)
B Membrane potential (mV)

amide and of the piperidine groups of flecainide (Fig. S6). In- **

terestingly, the βI strand is highly conserved among Kir2.x chan-

IKir2.2 A312C (nA)

IKir2.1 C311A (nA)
-140 -80 -20 40
-120 -80 -40 40
nels, Cys311 being the only different residue between Kir2.1 and * -0.4
0.2 -1 *
* 0.1
Kir2.2 and Kir2.3 (Fig. S6). 0.1
-2
*
-0.8
When Cys311 was substituted by Ala (C311A), the residue -50 -30 -10 10 30
-0.1 *
-90 -70 -50 -30 -10 10

present in Kir2.2 and Kir2.3 channels at equivalent position (312 -0.2 -3 -0.1
-1.2
and 303, respectively), the flecainide-induced increase was abolished Kir2.1 C311A Fleca 1 μM
*
Kir2.2 A312C Fleca 1 μM
at potentials negative and positive to EK (Fig. 5 A and D). Similar
findings were obtained when it was substituted by Ser (C311S) (Fig. C 50 ms

5D). Flecainide also failed to increase IKir2.1 generated in cells +20 mV

50 0 p A

-60 mV
cotransfected with both WT and C311A Kir2.1 channels (Fig. 5D). -120 mV
As the Cys-to-Ala substitution abrogates flecainide sensitivity of
Kir2.1, a reverse mutation in Kir2.2 and Kir2.3 ought to have the
opposite effect. Here we show that this is indeed the case. Flecainide
significantly increased the inward and the outward A312C IKir2.2 Kir2.2 A312C
(Fig. 5 B and C; n = 5) and A303C IKir2.3 (Fig. 5D; n = 5). These Flecainide 1 μM
findings verify and underscore the importance and specificity of the
Cys residue for flecainide sensitivity of Kir2.1 channels.
Flecainide-induced

D 80
increase (%)

Flecainide Increases Functional Kir2.1 Channel Density. To test 60

whether flecainide could also increase the current generated by 40

Kir2.1 channels with AS mutations, we tested the effects of fle- 20 * *
cainide in R67W and R218W channels—two mutations found in *
AS patients (16). Flecainide did not increase R67W or R218W 0
T A 1S 1A 2C 3C
currents, which were almost undetectable (Fig. 6 A and B). R67W .1
W 311
C C 31 C31 A31 A30
IKir2.1 markedly increased when increasing the [K+]o to 140 mM Ki
r2
r2
. 1 +
r2. 2
r2 . 3
Ki Ki Ki
(Fig. S8; n = 5, P < 0.001), suggesting that channels were present in
the plasma membrane. Conversely, R218W channels did not gen- Fig. 5. Cys311 is critical for the flecainide-induced increase of IKir2.1. The I–V
erate any current at 140 mM [K+]o (Fig. S8), even when it has been curves for currents recorded in cells expressing C311A Kir2.1 (A) and A312C Kir2.2
described that the channels are able to reach the cell membrane (B) channels in the absence and presence of flecainide. (C) Current traces recorded
(17). Next we tested the effects produced by the incubation of in a cell expressing A312C Kir2.2 channels in control conditions and in the pres-
R67W and R218W Kir2.1 transiently transfected cells with flecai- ence of flecainide. (D) Flecainide-induced change on the current recorded at 40
nide (1 μM) for 24 h (Fig. 6 C and D). R67W, but not R218W, mV positive to EK in cells expressing WT or mutant Kir2.x channels. *P < 0.05 vs.
flecainide-incubated cells generated a small but detectable BaCl2- control. Each point/bar represents the mean ± SEM of five or more experiments.

126
15634 | www.pnas.org/cgi/doi/10.1073/pnas.1004021107 Caballero et al.
 RESULTADOS

attributed to a decreased affinity of the channels for PIP2 (17); A303C Kir2.3 (Fig. S9). Kir2.1/Kir2.2 and Kir2.1/Kir2.3 densities
therefore, we also tested the effects of the 24-h incubation with were also not modified with the flecainide incubation (Fig. S9).
flecainide on L222I channels. Figure 6F shows that flecainide also
significantly increased L222I IKir2.1 density. Discussion
These findings suggested that flecainide increased the functional Our findings show that flecainide acutely increased human IKir2.1
ion channel density. To test this hypothesis, we incubated Kir2.1 WT mainly by reducing the polyamine blockade of the channel. Addi-
transfected cells with flecainide, which significantly increased IKir2.1 tionally, incubation with flecainide increased functional Kir2.1
density (Fig. 6G). Importantly, acute addition of flecainide in- channel density. Flecainide did not modify either IKir2.2 and IKir2.3 or
creased IKir2.1 generated by the incubated cells, producing the same Kir2.2 and Kir2.3 channel density. This selectivity could be attrib-
increase as in nonincubated cells (42.7 ± 9.5% at −50 mV, n = 4, P < uted to the specific presence of Cys311 on the C terminus of the
0.05). This suggests that acute effects of flecainide are additive to its cytoplasmic region of Kir2.1 channels.
effects on channel density. Conversely, incubation with flecainide
Flecainide Increases IKir2.1 but Not IKir2.2 and IKir2.3. Acutely applied
did not increase C311A Kir2.1 channel density (Fig. 6H), indicating
flecainide increased IKir2.1, and this effect was only apparent in
that the presence of Cys311 is also critical for this effect. Indeed, Kir2.1 homotetrameric channels. Therefore, flecainide-increasing
incubation with flecainide failed to increase density of Kir2.2 and effects would be apparent only in those species and tissues in which
Kir2.3 channels, whereas it increased those of A312C Kir2.2 and IK1 is mainly generated by homotetrameric Kir2.1 channels. Thus,
our pharmacological findings suggested that guinea-pig ventricular
IK1 is mainly generated by homotetrameric Kir2.1 channels. Recent
+20 mV data showed that Kir2.1 is the major isoform underlying human
R67W -60 mV R218W ventricular IK1, whereas its relative contribution to atrial IK1 seems
-120 mV to be lower (3). This could explain why flecainide did not increase
human atrial IK1.
A Control B Control Flecainide preferentially increased the outward IKir2.1 generated
at potentials positive to the EK, which influences cardiac RMP,
excitability, and APD. Our findings suggested that flecainide de-
Fleca 1 μM Fleca 1 μM creased polyamines’ affinity for the channel in a dose-dependent
200 pA
200 pA

manner, thus reducing the strength of rectification. Furthermore,

the effects of flecainide on the concentration dependence of the
100 ms 100 ms Spm-induced block suggested that it decreases the Spm block by
a “noncompetitive” mechanism. Indeed, in the presence of flecai-
Incubated with Incubated with
C Fleca 1 μM
D Fleca 1 μM nide, Emax produced by Spm reached saturation at ≈82%. This
finding suggests that flecainide does not compete with Spm for the

PHARMACOLOGY
same binding site at the channel level, but that interaction of fle-
cainide to its own receptor site allosterically reduces the binding of
polyamines. Previous studies demonstrated that the Glu224,
20 pA

20 pA

Asp259, and Glu299 cytoplasmic residues help to maximize the rate

100 ms 100 ms of polyamine channel block (4, 15). Thus, we tested whether mu-
tation of these residues decreased the outward IKir2.1 flecainide in-
E Membrane potential (mV)
F Membrane potential (mV) crease. The findings show that in E224A, D259A, and E299A
nonrectifying channels, flecainide did not increase the IKir2.1. It
IKir2.1 R67W density (pA/pF)

5 * **
IKir2.1 L222I density (pA/pF)

*3 could be possible that flecainide interaction to the Cys311 at the βI

* -140 -60 -20
* ** -20 strand modifies the position of the rings of negatively charged amino
1 *
acids that create a complimentary electrostatic match for the bind-
* *
*
10
5 -60
-140 -60 20
* -100 -60 -20
ing of positively charged polyamines (4, 18). Therefore, this shows
* ** -3
-5
-10 -100 that a therapeutically used drug can affect Kir2.1 channels by
* * -15
modulating their interaction with polyamines.
Kir2.1 R67W -5 Kir2.1 L222I
* -140 Our findings strongly suggest that Cys311 located in the βI strand
Kir2.1 R67W (inc) Kir2.1 L222I (inc)
of the C terminus cytoplasmic domain of the Kir2.1 channel
determines the flecainide binding. Furthermore, the presence of this
Cys is critical for the increasing effects absent in Kir2.2 and Kir2.3
Membrane potential (mV)
G φ
H Membrane potential (mV) channels that do not exhibit a Cys residue at the equivalent position.
IKir2.1 C311A density (pA/pF)

* * φ
φ 50 The βI and βH strands form the HI loop or G loop (residues 300–
IKir2.1 density (pA/pF)

* 315) (15). Mutations in the HI loop disrupted gating and affected

-120 -40 40 inward rectification of Kir2.1 channels (15), and thus it seems rea-
-140 -60 -20 20
60 -20
sonable to assume that binding of flecainide to this region can
φ 10
* * φ 40
-50 5
* φ

* φ
* 20
-100 -80 -40
-40 produce the observed effects. Moreover, the HI loop is structurally
-5
* φ -100 -60 -20
-20 -10 -60 distinct from but functionally coupled to the PIP2 binding site (13–
-150
* φ
Kir2.1 WT
15). Indeed, the adjacent residue to Cys311 within the βI strand
Kir2.1 C311A -80
φ
Kir2.1 C311A (inc)
(Arg312 in Kir2.1 channels) modulates the PIP2-channel inter-
Kir2.1 WT (inc)
actions (14, 18). Furthermore, it has been previously shown that
Kir2.1 WT (inc) + Fleca 1 μM substitution of Cys311 by polar residues strongly modifies the Kir2.1
Fig. 6. Effects of flecainide on Kir2.1 channel density. Current traces recorded
channel kinetic properties, producing long-lasting closed-time
in a cell expressing R67W (A) and R218W (B) Kir2.1 in the absence and presence
intervals that decreased the channel Po—effects that were attributed
of flecainide. Current traces recorded in cells expressing R67W (C) and R218W to a destabilization of PIP2-Kir2.1 interaction (13). Therefore, we
(D) Kir2.1 channels incubated with flecainide for 24 h. The I–V curves for cur- surmised that flecainide interaction with Cys311 could increase the
rents recorded in cells expressing R67W (E), L222I (F), WT (G), and C311A (H) channel-activating PIP2 effects. Our findings demonstrated that
Kir2.1 channels in control conditions and after incubation with flecainide. In G, flecainide increased the Po of the channel by shifting the Po–V re-
squares represent acute effects of flecainide produced in cells incubated with lationship to more negative potentials. Moreover, it did not modify
flecainide. *P < 0.01 vs. control. ΦP < 0.05 vs. incubated cells. Each point rep- the unitary current amplitude or the single-channel conductance,
resents the mean ± SEM of eight experiments. but augmented the mean open time and the fo of the channel. All

127
Caballero et al. PNAS | August 31, 2010 | vol. 107 | no. 35 | 15635
 RESULTADOS

these effects resemble those produced by PIP2 (14). Finally, the produced by the simultaneous blockade of other Kv channels.
L222I mutation, which decreased Kir2.1 affinity for PIP2, sup- However, in the atrial tissue, in which flecainide did not increase
pressed the flecainide-increasing effects at potentials negative to the the IK1, the APD prolongation produced by the blockade of Kv
EK, leaving increasing effects at positive potentials unaltered. channels will be apparent. Furthermore, the ventricular IK1 in-
Overall, these findings suggest that flecainide also potentiates the crease could contribute to the ventricular proarrhythmic effects of
activating PIP2 actions on the channel, which contributes to its in- flecainide. The importance of IK1 in the establishment and main-
creasing effects—particularly at potentials negative to EK. tenance of the stability of rotors and ventricular fibrillation dy-
namics has been demonstrated (5). The prediction is that an IK1
Flecainide Increases Kir2.1 Channel Density. Incubation for 24 h with increase accelerates and stabilizes the reentry (5).
flecainide increased functional Kir2.1 channel density. This effect was Finally, it is noteworthy that the flecainide effects here de-
also dependent on the presence of Cys311 and, importantly, was scribed were produced at concentrations that are therapeutically
additive to the acute flecainide-increasing effects. Therefore, flecai- relevant, because peak plasma concentrations after administra-
nide would substantially increase homotetrameric Kir2.1 IK1 by two tion of therapeutic doses are between 0.4 and 2.2 μM (22).
mechanisms. To test whether flecainide increases the current and the
functional density of AS-mutated channels, we tested its effects on Conclusions
R67W and R218W channels. As expected, acutely applied flecainide Overall, our findings show that Kir2.1 channels can be positively
did not increase either R67W or R218W IKir2.1, because both chan- modulated through the decrease of their polyamine blockade by
nels do not exhibit affinity for PIP2. However, incubation with fle- a therapeutically used drug. Moreover, flecainide increases the
cainide for 24 h significantly increased R67W and L222I but not density of Kir2.1 channels, an effect that could produce the phar-
R218W IKir2.1 densities. Therefore, these preliminary findings sug- macological rescue of functional AS-mutated channels. Both
gest that in AS patients who carry mutations that produce functional effects were based on the presence of a Cys residue at position 311
channels, flecainide would increase IKir2.1 generated by WT and within the βI strand, which further stresses the role of the cyto-
mutated channels by increasing their membrane density (i.e., flecai- plasmic domain and Cys residues of Kir2.x channels in controlling
nide would pharmacologically rescue some AS mutations). gating and rectification.
Growing evidence suggests that ion-channel density can be mod-
ified pharmacologically. It has been described that two therapeuti- Methods
cally used drugs that acutely block Kir2.1 also modify the expression This study was approved by the Investigation Committee of the Hospital Uni-
of the channels in the membrane, i.e., incubation with chloroquine versitario Gregorio Marañón (CNIC-13) and conforms to the principles outlined in
increases, and with pentamidine decreases, the IKir2.1 density of the Declaration of Helsinki. Human atrial myocytes were enzimatically isolated
transfected cells (19). Further studies are needed to elucidate from right atrial appendages obtained from patients that underwent cardiac
whether flecainide increases the anterograde delivery to or decreases surgery (Table S2) (12). Guinea-pig cardiomyocytes were also enzimatically iso-
the endocytosis of channel protein from the membrane. lated (23). Reverse transcription-PCR analysis of Kir2.x channels was developed
with the primers depicted in Table S3. WT and mutated human Kir2.1, Kir2.2, and
Therapeutic Implications. Flecainide is a potent Na+ channel Kir2.3 channels were transiently transfected in CHO cells (24). Macroscopic and
blocker that also blocks several voltage-dependent K+ channels single-channel currents were recorded using the whole-cell and cell-attached
(Kv). Indeed, flecainide inhibits the Ca2+-independent transient patch-clamp configurations, respectively. Inside-out recordings of IKir2.1 were
outward K+ current (Ito1) and the rapid component of the delayed developed in transiently transfected HEK-293 cells. All I–V curves were corrected
rectifier current (IKr) at concentrations close to those needed for according to the calculated liquid junction potential. Blind and manual dockings
blocking Na+ channels (20, 21). Flecainide frequency-dependently of flecainide on a modeled Kir2.1 channel were performed with AutoDock 4.0
increases the human atrial APD and refractoriness (6) without and QUANTA/CHARMm software, respectively (23). Detailed SI Methods are
available online.
modifying human ventricular APD, as measured from the QT in-
terval of the electrocardiogram (7). The selective increase of the
ACKNOWLEDGMENTS. This work was supported by Ministerio de Educación y
ventricular IK1 could account for this differential effect on atrial Ciencia Grant SAF2008-04903; Ministerio de Sanidad y Consumo, Instituto de
and ventricular APD. Indeed, because IK1 plays a critical role in the Salud Carlos III Grants Red HERACLES RD06/0009 and PI080665; Universidad
final phase of repolarization, it could be speculated that the ven- Complutense de Madrid (4195); Fundación LILLY; and Centro Nacional de
tricular IK1 increase overcomes the putative APD prolongation Investigaciones Cardiovasculares (CNIC-13).

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128
15636 | www.pnas.org/cgi/doi/10.1073/pnas.1004021107 Caballero et al.
 RESULTADOS

Supporting Information
Caballero et al. 10.1073/pnas.1004021107
SI Methods mutations were made using the QuikChange Site-Directed Mu-
Human Atrial Myocyte Isolation. This study was approved by the tagenesis Kit (Stratagene). All mutations were confirmed by direct
Investigation Committee of the Hospital Universitario Gregorio DNA sequencing. CHO cells were cultured and transfected as
Marañón (CNIC-13) and conforms to the principles outlined in the previously described (1–8). Cells were grown in Ham-F12 medium
Declaration of Helsinki. Each patient gave written informed con- supplemented with 10% FBS, 100 U/mL penicillin, and 100 μg/mL
sent. Data regarding age, sex, type of surgery, and pharmacological streptomycin. The cultures were passaged every 4–5 d using a brief
treatment of the patients are provided in Table S2. Human right trypsin treatment. CHO cells were transiently transfected with the
atrial specimens were obtained from patients (n = 3) that un- cDNA encoding WT or mutated Kir2.x channels (1.6 μg) together
derwent cardiac surgery. Atrial myocytes were enzimatically iso- with the cDNA encoding the CD8 antigen (0.5 μg) by using FU-
lated following previously described methods (1, 2). In brief, GENE6 (Roche Diagnostics) following manufacturer instructions.
samples were immediately placed into chilled Ca2+-free Tyrode’s For culture and transfections, 60-mm culture dishes were used.
solution containing (in mM): NaCl 100, KCl 10, KH2PO4 1.2, After 48 h, cells were incubated with polystyrene microbeads
MgSO4 5, taurine 50, MOPS 5, and glucose 20 (pH 7.0 with precoated with anti-CD8 antibody (Dynabeads M450; Dynal).
NaOH) and supplemented with 2,3-butanedione monoxime Most of the cells that were beaded also had channel expression.
(BDM, 30 mM), chopped into small pieces (≈1 mm3), and washed The cells were removed from the dish with a cell scraper, and the
3× for 3 min with Ca2+-free Tyrode’s solution. Tissue pieces were cell suspension was stored at room temperature and used within
then changed to Ca2+-free solution containing 254 U/mL colla- 12 h for electrophysiological experiments.
genase type I (Worthington) and 0.5 mg/mL protease type XXIV
(Sigma) and gently stirred for 15 min. Afterward, the Ca2+ con- Recording Techniques. Macroscopic current recordings. A small aliquot
centration was raised to 0.2 mM, and the tissue was stirred for 30 of cell suspension was placed in a 0.5-mL chamber mounted on
min more. Stirring was continued with Tyrode’s solution (0.2 mM the stage of an inverted microscope (Nikon TMS, Nikon). After
Ca2+) containing only collagenase until rod-shaped striated my- settling to the bottom of the chamber, cells were perfused at 1 mL/
ocytes were seen (≈35 min). During all these steps, the solutions min with external solution (see composition below). Macroscopic
were continuously oxygenated with 100% O2 at 37 °C. Myocytes currents were recorded at room temperature (21–23 °C) using the
were kept until use in a storage solution containing (in mM): KCl whole-cell patch-clamp technique using an Axopatch-200B
20, KH2PO4 10, glucose 10, K-glutamate 70, β-hidroxybutyrate 10, patch-clamp amplifier (Molecular Devices) (1–8). Recording
taurine 10, EGTA 10, and albumin 1 (pH 7.4 with KOH). My- pipettes were pulled from 1.0-mm OD borosilicate capillary
ocytes were used for electrophysiological recordings within 8 h. tubes (GD1; Narishige) using a programmable patch micropi-
pette puller (model P-2000 Brown-Flaming; Sutter Instruments)
Guinea-Pig Atrial and Ventricular Myocyte Isolation. Single ventric- and heat-polished with a microforge (model MF-83; Narishige).
ular myocytes were isolated from hearts of male guinea pigs (250– Micropipette resistance was <3.5 MΩ when filled with the in-
300 g) by enzymatic dissociation following a procedure previously ternal solution and immersed in the external solution. The ca-
described in detail (3, 4). Hearts were removed and rapidly pacitive transients elicited by symmetrical 10-mV steps from
mounted via the aorta on the cannula of a Langendorff perfusion 0 mV were recorded at 50 kHz (filtered at 10 kHz) for sub-
system and initially perfused for 1–2 min with a modified Tyrode’s sequent calculation of capacitative surface area, access re-
solution containing 1.8 mM CaCl2. The perfusate was oxygenated sistance, and input impedance. In all of the experiments, series
(95% O2/5% CO2) and maintained at 37 °C. Then the hearts were resistance was compensated manually by using the series re-
perfused for 5 min at 10–15 mL/min with a Ca2+-free Tyrode’s sistance compensation unit of the Axopatch amplifier, and ≥80%
solution, followed by a 4-min perfusion with the same solution compensation was achieved. In CHO cells, uncompensated
supplemented with 0.12 mg/mL collagenase type II (Worthington) access resistance and cell capacitance were 1.4 ± 0.3 MΩ, and
and 0.03 mg/mL protease type XIV (Sigma). The hearts were then 13.6 ± 0.8 pF, respectively (n = 34), whereas mean maximum
washed with a high-K+ low-Cl− solution or “KB solution” for 4 min. Kir2.1, Kir2.2, and Kir2.3 current (IKir2.1, IKir2.2, and IKir2.3)
Afterward, hearts were removed from the Langendorff apparatus, amplitudes at −120 mV were −2.2 ± 0.2 (n = 25), −1.0 ± 0.1
and atria and ventricles were dissected and cut in small pieces, (n = 4), and −0.9 ± 0.3 nA (n = 5), respectively. In human atrial
which were placed in a beaker containing KB solution and gently myocytes, mean maximum IK1 amplitude at −100 mV, un-
shaken to disperse the cells. The resulting cell pellets were stored in compensated access resistance, and capacitance averaged −0.4 ±
KB medium for 1–2 h before beginning the experiments. The 0.06 nA, 2.9 ± 0.6 MΩ, and 84.6 ± 17.8 pF (n = 4), respectively.
composition of the Tyrode’s solution was as follows (in mM): NaCl In guinea-pig atrial and ventricular myocytes, IK1 amplitude at −120
114, KCl 5.4, CaCl2 1.8, MgCl2 1.0, taurine 20, glucose 10, NaHCO3 mV, uncompensated access resistance, and capacitance aver-
24, and NaH2PO4 0.42 (pH 7.4 with NaOH). The KB solution aged −0.9 ± 0.2 and −1.8 ± 0.2 nA, 3.9 ± 0.9 and 3.7 ± 1.3 MΩ,
contained the following (in mM): glutamic acid 70, taurine 10, KCl and 35.2 ± 4.4 and 46.2 ± 2.9 pF (n = 4 and 5), respectively.
20, KH2PO4 10, MgCl2 1.0, succinic acid 5.0, creatine 5.7, glucose Thus, under our experimental conditions, no significant voltage
10, EGTA 0.2, and Hepes 10 (pH 7.4 with KOH). errors (<5 mV) due to series resistance were expected with the
micropipettes used. The current recordings were sampled at 4
Kir2.1 Constructs and Cell Transfection. Human Kir2.1 WT and L222I kHz, filtered at half the sampling frequency, and stored on the
cDNA were kindly provided by J. Jalife (University of Michigan, hard disk of a computer for subsequent analysis. To record hu-
Ann Arbor, MI) and I. Levitan (Columbia University, New York), man atrial IK1, the external solution contained (in mM): NaCl
respectively. Human Kir2.1, Kir2.2, and Kir2.3 were subcloned into 120, KCl 20, CaCl2 1, MgCl2 1, Hepes 10, 4-aminopyridine 1,
pcDNA3.1 plasmid (Invitrogen). C311A and C311S Kir2.1 mutants nifedipine (1 μM), glucose 10, atropine (1 μM), and glibencla-
subcloned into pMT21 plasmid were kindly provided by R. Sauvé mide (10 μM) (pH 7.4 with NaOH). The liquid junction potential
(University of Montreal, Montreal). E224A, D259A, E299A, (LJP) between the pipette and external solution was −12.1 mV.
R218W, and R67W Kir2.1, A312C Kir2.2, and A303C Kir2.3 Guinea-pig myocytes were perfused with an external solution

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containing (in mM): NaCl 140, KCl 4, CaCl2 1, MgCl2 1, glucose in an isolated dog epicardial ventricular myocyte as the com-
10, Hepes 10, 4-aminopyridine 1, nifedipine (1 μM), atropine mand signal. The protocol to obtain IKir2.2 and IKir2.3 I–V curves
(1 μM), and glibenclamide (10 μM) (pH 7.4 with NaOH). Under consisted of 250-ms pulses in 10-mV increments from –60 mV to
these conditions, the calculated LJP was −11.7 mV. In some potentials between −120 and +20 mV. The current amplitude
experiments, the Ba2+-sensitive current was measured. In these was measured at the end of the pulse.
experiments, guinea-pig myocytes were first perfused with con- To obtain the EC50 (concentration that produces the half max-
trol external solution followed by external solution containing imum response), the IC50 (concentration that produces the half
1 μM flecainide (Sigma), and finally with external solution con- maximum inhibition), and the Hill coefficient (nH), the increase
taining flecainide and BaCl2 (100 μM). Ba2+-sensitive currents produced by flecainide and the blockade produced by spermine at
were obtained by digital subtraction of current traces. Recording various concentrations [D] were fitted to the equation:
pipettes were filled with an internal solution containing (in mM): .n o
K-aspartate 80, KCl 42, KH2PO4 10, MgATP 5, phosphocreatine f ¼ Emin þ ðEmax-EminÞ 1 þ ðEC50 =½DÞnH :
3, Hepes 5, and EGTA 5 (pH 7.2 with KOH). To record IKir2.1,
IKir2.2, and IKir2.3, CHO cells were perfused with an external The degree of rectification for Kir2.1 channels was estimated
solution containing (in mM): NaCl 136, KCl 4, CaCl2 1.8, MgCl2 from the relative chord conductance (Gc), i.e., the conductance
1, Hepes 10, and glucose 10 (pH 7.4 with NaOH; LJP = −13.2 relative to that expected for an nonrectifying current (13). Gc
mV). Under these conditions, current amplitudes were stable was calculated as the ratio of the actual current and current
during the time of recordings (Fig. S1). C311A IKir2.1 and C311S predicted by assuming a linear unblocked current (data for Gc
IKir2.1 were recorded at 20 mM extracellular K+ concentration near the reversal potential were discarded from analysis because
([K+]o), the calculated LJP being −12.1 mV. To obtain 20- and the current ratio approaches “0/0” at voltage near this potential).
140-mM [K+]o solutions, equimolar substitution between KCl Gc relationships in control conditions and in the presence of
and NaCl was used. The internal solution used for whole-cell flecainide were fitted by a single Boltzmann equation:
current recordings in CHO cells was the same as described for
recording native IK1 (see above). All of the current-voltage (I–V) y ¼ ½1=f1 þ expð-λðV − VhÞÞg;
curves were corrected according to the calculated LJP (2, 9). where V is the membrane potential, Vh represents the mid-
Single-channel recordings. Single-channel currents were recorded at
point of the curve, and λ = zF/RT, where z stands for the effective
room temperature using the cell-attached patch-clamp configu- valency or steepness of rectification, F is Faraday’s constant, R is
ration (Axopatch-200B patch-clamp amplifier) (2). Cells were the gas constant, and T is the absolute temperature.
suspended in bath solution (in mM) [KCl 140, CaCl2 1.8, MgCl2 Single-channel currents were recorded by applying 10-s pulses
1, Hepes 10, and glucose 10 (pH 7.4 with KOH)]. Patch pipettes from a holding potential of 0 mV to potentials between −110
were pulled from 1.5-mm OD borosilicate capillary tubes (Har-
and −20 mV (2), amplified, digitized at 10 kHz, and stored on
vard Apparatus), coated at the tip with Sylgard (Dow Corning),
the hard disk of a computer for subsequent analysis. The re-
and fire-polished with a microforge. When filled with pipette
cordings were filtered at 1 kHz. Data were analyzed using
solution (in mM) [KCl 140 and Hepes 10 (pH 7.4 with KOH)],
pCLAMP software. Open probability (Po) was calculated in each
tip resistances were between 5 and 10 MΩ. Patches with more
experiment by dividing the time that the channel remains in the
than one channel were discarded.
open state by the total recording time. In some experiments, Po
Inside-out recordings. In some experiments, currents were recorded
values at each potential (Po–V curves) were obtained, and
at room temperature from excised inside-out macropatches from
a Boltzmann function was fitted to the data:
HEK-293 cells using an Axopatch 200B patch-clamp amplifier
(10, 11). Recordings were made by using a fluoride, vanadate, Po ¼ ðPomin -Pomax Þ=½1 þ expðV-Vh Þ=k þ Pomax ;
and pyrophosphate (FVPP)-potassium solution on both sides of
the patch containing (in mM): KCl 123, K2EDTA 5, K2HPO4 where Pomin and Pomax represent the minimum and maximum Po,
7.2, KH2PO4 8, Na3VO4 0.1, KF 5, K4HP2O7 10 (pH 7.2 with V is the membrane potential, Vh is the membrane potential at
KOH) to prevent current rundown (10, 11). This solution was which Po reaches its half-maximum value, and k is the slope factor.
Mg2+- and spermine-free. A solution adjusted to pH 5.0 was The opening frequency (fo) was calculated for each experiment
used to abolish any detectable currents through Kir channels, as the inverse of the closed time between events. Amplitude of
and offline subtraction of the currents recorded when perfusing unitary currents in control conditions and in the presence of 1 μM
with the solution at pH = 5 was used to subtract endogenous flecainide were calculated for each experiment from a Gaussian
currents. Patch pipettes were pulled from 1.5-mm OD borosili- distribution fit to amplitude histograms that were constructed by
cate capillary tubes (World Precision Instruments). When filled plotting amplitude data as a function of the number of events per
with FPVV solution, tip resistances were between 1.0 and 1.5 bin (bin width = 0.05 pA). To calculate the slope conductance, the
MΩ. These experiments were conducted in a chamber that al- single-channel current amplitude was plotted as a function of the
lowed the solution bathing the exposed surface of the isolated membrane potential, and a linear function was fitted to the data.
patch to be changed rapidly (Fast-Step SF-77B perfusion system; Mean open-time was calculated by dividing the total time that the
Warner Instruments). channel remains in the open state by the total number of openings.
Inside-out recordings were performed by applying 500-ms pulses
Pulse Protocols and Analysis. The protocol to record human atrial from a holding potential of −70 mV to +70 mV, followed by
IK1 consisted of 50-ms steps from −80 mV to −100 mV followed a second 500-ms pulse to −80 mV. Currents were digitized at 2
by depolarizing ramps to −10 mV (800 ms) (2). To record kHz and stored on the hard disk of a computer for subsequent
guinea-pig atrial and ventricular IK1, 250-ms pulses from analysis by using pCLAMP software. The recordings were filtered
a holding potential of −40 mV to potentials ranging from −120 at 1 kHz. Spermine-induced block was measured as the reduction
to −40 mV were applied (12). For macroscopic IKir2.1 recorded of the total charge crossing the membrane (calculated as current-
in the presence of 4 mM [K+]o, the protocol to obtain I–V curves time integrals at +70 mV).
consisted of 250-ms pulses in 10-mV increments from –60 mV to
potentials between −120 and +20 mV (2). At 140 mM [K+]o, Molecular Modeling and Ligand Docking. Molecular modeling was
IKir2.1 was recorded by applying 250 ms-pulses from +10 mV to performed to obtain the lowest energy-minimized blind docking for
potentials ranging –60 and +90 mV. In some experiments, IKir2.1 flecainide with a full-length channel composed of the crystal
was recorded in CHO cells by using an action potential recorded structure of one cytoplasmic domain of Kir2.1 (PDB ID code 1U4F)

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 RESULTADOS

and a modeled transmembrane domain based on KirBac1.1 crystal samples were snap-frozen in liquid nitrogen and stored at −80 °C
structure (PDB ID code 1P7B). Kir2.2 and Kir2.3 cytoplasmic until further processing. Total RNA was purified from the ho-
domains were modeled using an alignment between this region of mogenized tissue samples (homogenizer Ultra Turrax T18 IKA)
Kir2.1 and the corresponding region of Kir2.2 and Kir2.3 channels. with RNeasy midi kit (Qiagen) according to the manufacturer’s
The structural model of flecainide was retrieved from DrugBank instructions. RNA was quantified by photometry (λ = 260 nm),
(http://www.drugbank.ca/), and its ionization was adjusted for a pKa and the purity of the samples was verified by the 260/280 ratio by
of 9.3. The blind docking was performed with the AutoDock 4.0 Nano-Drop 2000 (Thermo Scientific).
program using the Lamarckian genetic algorithm. When there is no Reverse transcription–PCR analyses. Reverse transcription–PCR (RT-
prior knowledge of the binding site for small molecules on a target PCR) was performed using the One-Step RT-PCR Kit (Qiagen).
protein, a blind-docking study is a useful method to identify some Target gene-specific oligonucleotide primer pairs (forward and
possible complexes based on an evaluation of binding-free energies reverse) were designed for guinea-pig Kir2.1, Kir2.2, Kir2.3, and
(ΔGs). The efficiency of a blind-docking study using the AutoDock glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) gene se-
program has been shown in previous reports (14, 15). The graphical quences obtained from GenBank DNA sequences database
user interface program “Autodock Tools” was used to prepare, run, (Table S3). Primers were synthesized by Roche Diagnostics via
and analyze the docking simulations. Default parameters were TIB-MOLBIOL and supplied in lyophilised form. The melting
used, except for the number of generations, energy evaluations, and temperature (Tm) for each primer target gene used in the PCR
docking runs, which were set to 1,000, 2.5 million, and 100, re- reactions is indicated in Table S3. RT-PCR was performed on
spectively. Affinity grid fields were generated using the auxiliary 0.25 μg of total RNA, and the reactions were repeated at least 3×
program AutoGrid. Docking was performed in a 65 × 65 × 65 for each sample. RT-PCR was performed using the thermocycler
Å volume centered at the middle of the channel protein, with grid Mastercycler Pro (Eppendorf) using the following thermal cycler
spacing of 0.375 Å. The modeled channels were held rigid, and all conditions: one step for reverse transcription (50 °C 30 min) and
of the torsional bonds of flecainide were taken as being free during initial PCR activation step (95 °C 15 min). Kir2.1, Kir2.2, and
docking calculations. Based on the RMSD cluster tolerance (2 Å), Kir2.3 amplification involved 35 cycles of 1 min of DNA de-
the complexes between the modeled channel and flecainide mol- naturalization at 94 °C, 1 min of primer annealing (at optimized
ecules were sorted into clusters, i.e., a mass of unless two con- annealing temperature; Table S3), and 1.5 min of primer elon-
formations having RMSD less than 2 Å. The cluster ranks based on gation at 72 °C. The final extension step was performed for 10
ΔGs, and the number of conformations during 100 runs are sum- min at 72 °C. The amplification products were run on 1.8%
marized in Table S1. The cluster with the lowest ΔG was selected, agarose gel containing ethidium bromide (0.5 ng/mL) and visu-
and flecainide was manually docked into the cytoplasmic domain by alized under UV light. Molecular-weight markers (Sigma) were
using QUANTA/CHARMm software (Accelrys). Energy minimi- added to one lane to estimate the size of the amplification
zation was performed to eliminate close contacts. Flecainide was products. The housekeeping gene GAPDH was used as internal
assembled within QUANTA using standard bond lengths and standard. None of the Kir2.x channel-specific primers cross-
angles. Mechanics energy minimization was done using the reacted with the GAPDH primer after 35 cycles of PCR.
CHARMm force field. The Kir2.1 channel-flecainide complexes
obtained were minimized with a Newton Raphson method, con- Statistical Methods. Results are expressed as mean ± SEM. Paired
sidering the structures as fully optimized when the energy changes or unpaired t test or one-way ANOVA followed by Newman–Keuls
between two successive iterations were less than 0.01 kcal/mol (1 test were used to assess statistical significance where appropriate.
kcal = 4.18 kJ) (16). To make comparisons between two different concentration-
A blind docking for flecainide with the cytoplasmic domain response curves, an F test was used. A value of P < 0.05 was con-
formed by the four Kir2.1 subunits (PDB ID code 1U4F) was also sidered significant.
performed. Default parameters were used, except for the number
of generations, energy evaluations, and docking runs, which were SI Results
set to 27,000, 2.5 million, and 150, respectively. Docking was Time- and Concentration-Dependent Effects of Flecainide on Kir2.1
performed in a 47 × 65 × 65 Å volume centered at the middle of Channels. As seen in Fig. S1, amplitude of IKir2.1 recorded at −120
the channel protein, with grid spacing of 0.531 Å. mV (Fig. S1A) and −50 mV (Fig. S1B) was stable during control
recordings. Afterward, when the perfusion with the flecainide-
Drugs. Flecainide (Sigma) was initially dissolved in methanol to containing solution was initiated, steady-state effects were reached
yield 10-mM stock solutions. Drug solutions were prepared after ≈3 min. Finally, the IKir2.1 increase produced by flecainide was
freshly for each experiment. Glibenclamide, atropine, nifedipine, completely reversible after 2–3 min of perfusion with drug-free so-
and spermine were purchased from Sigma as a powder and lution. In Fig. S1 C and D, the IKir2.1 increase measured at the end of
dissolved as appropriate to yield 0.01-M stock solutions. Further pulses to −120 and −50 mV, respectively, was represented as
dilutions were carried out in external solution to obtain the de- a function of the flecainide concentration. The Hill equation was
sired final concentration. Control solutions always contained the used to fit the concentration dependence of the increase, and the
same solvent concentrations as the test solution. In some concentration that produces the half-maximum effect (EC50) and
experiments, CHO cells expressing WT, C311A, L222I, R218W, the maximum effect (Emax) obtained at −120 mV were 0.8 ± 0.01
R67W Kir2.1, as well as WT or A312C Kir2.2 and WT or A303C μM (nH = 1.6 ± 0.4) and 22 ± 1.9%, respectively (Fig. S1C). At −50
Kir2.3 channels were cultured (as described previously) in the mV, the EC50 and the Emax averaged 0.4 ± 0.01 μM (nH = 2.2 ± 0.2)
presence of 1 μM flecainide for 24 h. The final concentration of and 53.9 ± 3.6%, respectively (Fig. S1D). This finding showed that
flecainide was made by adding the stock solution to the culture flecainide preferentially increased the outward IKir2.1 generated at
medium. Simultaneously, another batch of transfected cells was physiological potentials.
cultured in the presence of the same methanol concentration as
in the flecainide-incubated cells. Drug or solvent were removed Flecainide Increases IKir2.1 Recorded by Applying an AP Voltage-Clamp
by culturing cells for 1 h in drug-free medium at 37 °C before Protocol. To determine the effect of flecainide in a physiologically
electrophysiological recordings. relevant setting, we used an epicardial AP voltage-clamp protocol
(Fig. S2). In control conditions, IKir2.1 was small during the plateau
Analysis of the mRNA Expression of Kir2.x Channels (17). Tissue and phase of the AP, rapidly increased during the terminal phase of the
RNA preparation. Total RNA was isolated from guinea-pig atrial and repolarization, and declined in early diastole. Flecainide induced
ventricular samples (n = 6). Immediately after the excision, tissue the appearance of a peak coinciding with the notch of the AP and

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 RESULTADOS

increased the peak outward current at the end of the repolarization formed. The analysis of the most favorable conformations resulting
in a concentration-dependent manner (Fig. S2A). As a conse- from a study involving 100 runs showed that none of these confor-
quence, flecainide increased the charge crossing the membrane es- mations corresponded to the most favorable poses in Kir2.1 (Fig. S7).
timated from the integral of the current traces reaching a 137 ± 28% In the cytoplasmic domain, N and C terminus of adjacent Kir2.1
at a concentration of 1 μM (Fig. S2B). subunits interact to form a complex structure (19). Thus, a blind
docking for flecainide on the cytoplasmic domain formed by the
Flecainide Does Not Modify Kir2.2 and Kir2.3 Currents. Because four subunits was also developed. The findings showed that fle-
Kir2.2 and Kir2.3 proteins also contribute to cardiac IK1, the effects cainide did not bind to the interface of neighboring subunits. In this
of flecainide on these channels were studied (Fig. S3). In both cases, case, the results predicted interactions of flecainide with the βI
under control conditions, hyperpolarizing pulses elicited large in- strand and the cytoplasmic pore. However, the presence of fle-
ward currents, whereas depolarizing pulses elicited small outward cainide into the pore did not seem compatible with an increase of
currents, with inward IKir2.3 activation kinetics being slower than the K+ flux through it. Therefore, these findings were discarded.
those of IKir2.1 and IKir2.2 (Fig. S4). Flecainide failed to modify IKir2.2 The flecainide conformations with the lowest binding-free en-
and IKir2.3 at potentials both negative and positive to EK (P > 0.05 ergy (ΔG; Table S1), located on the βI strand, were defined as the
vs. control, n = 10; Fig. S3 A–D). most practical binding site on Kir2.1 channels, and then the drug
was manually docked into it (Fig. S6 B and C). In the lowest-
Effects of Flecainide on Heterotetrameric Kir2.× Channels. To de- energy pose (−11.3 kcal/mol), flecainide was predicted to bind
termine flecainide actions on heterotetramers of Kir2.1, Kir2.2, and strongly to Cys311 by forming three hydrogen bridge bonds (one
Kir2.3 subunits, we studied the effects of flecainide on cells between the carbonyl oxygen atom of flecainide and the thiol
cotransfected (ratio 1:1) with both Kir2.1 and Kir2.2 (Kir2.1/Kir2.2) group of the Cys residue, and two between the carbonyl oxygen
and with Kir2.1 and Kir2.3 (Kir2.1/Kir2.3; Fig. S4). The time course
atom of the amino acid and the nitrogen atoms of the amide and of
of Kir2.1 activation was slower than that of Kir2.2 but much faster
the piperidine groups of flecainide; Fig. S6B). Moreover, flecai-
than that of Kir2.3 channels. Kir2.1/Kir2.2 and Kir2.1/Kir2.3 cur-
nide would establish single hydrogen-bridge bonds with Val296,
rents displayed activation kinetics significantly different from those
Ile297, and Ser313 residues (Fig. S6 B and C). This region is highly
of the homotetrameric channels, demonstrating the hetero-
conserved among Kir2.x channels, Cys311 being the only different
tetrameric nature of the channels. Under these conditions, flecai-
residue between Kir2.1 and Kir2.2 and Kir2.3 (Fig. S6D). Thus,
nide failed to increase inward and outward current (P > 0.05 vs.
control, n ≥ 4), suggesting that the increasing effects are only ap- we surmised that Cys311 can determine the selective flecainide
parent in channels composed of four Kir2.1 subunits. binding to Kir2.1 channels.

Electrophysiological Characterization of R67W and R218W Kir2.1

Effects of Flecainide on L222I Kir2.1 Channels. To determine whether
Channels. To evaluate whether R67W and R218W channels are
flecainide effects could be due to an increase of the activating effects
on the channel induced by PIP2, we tested the effects of flecainide functionally present in the plasma membrane, currents generated by
on L222I Kir2.1 channels, a mutation that decreases the channel these channels were recorded at [K+]o = 140 mM. Both in cells
affinity for PIP2 but that renders functional channels (18) (Fig. S5). incubated with flecainide and those that were not, the current
As can be observed, current density of L222I (−74.2 ± 14.9 pA/pF generated by R67W channels markedly increased when increasing
at −120 mV) is significantly lower than that of WT channels the [K+]o to 140 mM, suggesting that the channels present in the
(−115.5 ± 15.2 pA/pF; Fig. S5A), in accordance with previous re- plasma membrane were functional (Fig. S8 A and C). It is in-
ports indicating that strong channel–PIP2 interactions produce teresting to note that the amplitude of the currents recorded in
larger currents than do weak interactions (18). Moreover, it is cells incubated with the drug were significantly larger than those
shown that the decrease of the channel affinity for PIP2 suppressed recorded in nonincubated cells (−20.8 ± 12.4 vs. −57.8 ± 15.7 pA/
the flecainide IKir2.1, increasing effects at potentials negative to the pF at −60 mV, P < 0.05, n = 6; Fig. S8C). Conversely, R218W
EK, while increasing effects at positive potentials were still appar- channels did not generate measurable currents at [K+]o = 140 mM
ent (37.4 ± 4.5% of increase at −50 mV, compared with the 45.8 ± (Fig. S8B; n = 8), suggesting that R218W channels were non-
9.8% increase in WT channels, P < 0.05; Fig. S5B). Overall, these functional even when it has been described that they are able to
findings suggest that flecainide also potentiates the activating PIP2 reach the cell membrane (20). However, the fact that the current
effects on the channel, an effect that contributes to its increasing recorded in R67W transfected cells incubated with flecainide for
effects, particularly at potentials negative to the EK. 24 h was completely inhibited by BaCl2, strongly suggested that the
current is carried by Kir2.1 channels (Fig. S8 D and E).
Flecainide Binds to the C Terminus Cytoplasmic Domain of Kir2.1
Channels. To explore the putative binding site of flecainide within Effects of the Incubation with Flecainide on Kir2.x Channels Depends
Kir2.1 channels, a molecular model was developed. A blind docking on the Presence of Cys311. To further confirm that the presence of
for flecainide with a full-length channel composed of the crystal Cys311 is also critical for the increasing effect induced by 24-h
structure of one cytoplasmic domain of Kir2.1 (19) and a modeled incubation with flecainide, we tested the effects of the incubation of
transmembrane domain based on KirBac1.1 crystal structure was cells transfected with homotetrameric WT Kir2.2 and Kir2.3, het-
performed. As a result of a study involving 100 runs, 40 flecainide erotetrameric Kir2.1/Kir2.2 and Kir2.1/Kir2.3, as well as in A312C
conformations were obtained (Fig. S6A). Twenty of 40 con- Kir2.2 and A303C Kir2.3 channels (Fig. S9). As can be observed,
formations (yellow) are located on the βI strand within the Kir2.1 incubation with flecainide does not significantly modify the current
cytoplasmic domain (Fig. S6A). These 20 conformations were density of homotetrameric Kir2.2 and Kir2.3 and heterotetrameric
clustered (RMSD < 2 Å), and six clusters were obtained (Table Kir2.1/Kir2.2 and Kir2.1/Kir2.3 channels, but increases current
S1). Interestingly, the conformations with the lowest energy (cor- density of A312C Kir2.2 and A303C Kir2.3 channels. These find-
responding to clusters 1 and 2) were very close (<3 Å) to Cys311. ings show that the flecainide effect on Kir2.1 current density is only
A blind-docking study of flecainide within the cytoplasmic do- apparent in homotetrameric Kir2.1 channels, and that the presence
main of Kir2.2 (Fig. S7A) and Kir2.3 (Fig. S7B) channels was per- of a Cys residue at position 311 is also critical for it.

1. Gómez R, et al. (2008) Nitric oxide inhibits Kv4.3 and human cardiac transient 2. Gómez R, et al. (2009) Nitric oxide increases cardiac IK1 by nitrosylation of cysteine 76
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9. Neher E (1992) Correction for liquid junction potentials in patch clamp experiments. differentially on each atria and increases the slow component of the delayed rectifier
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heart. J Physiol 563:713–724.

A -120 mV B -50 mV
1.3 2.0
Normalized IKir2.1

Normalized IKir2.1
1.1 1.5

0.9 1.0

0.7 Fleca 1 µM Washout 0.5

Fleca 1 µM Washout
0.5 0.0
0 10 20 30 0 10 20 30
Time (min) Time (min)

C 30 -120 mV D 80 -50 mV
IKir2.1 increase (%)

IKir2.1 increase (%)

60
20
40
10
20

0 0
0.01 0.1 1 10 0.01 0.1 1 10
[Flecainide] (µM) [Flecainide] (µM)

Fig. S1. Time- and concentration-dependent effects of flecainide on Kir2.1 channels. Open circles represent normalized IKir2.1 recorded at −120 mV (A) and
at −50 mV (B) during control recordings, after beginning the flecainide (1 μM) perfusion and, finally, following the washout of the drug with drug-free
solution. The arrows represent the beginning and the end of perfusion with flecainide-containing solution. Percentage of IKir2.1 increase at −120 mV (C) and at
−50 mV (D) as a function of flecainide concentrations. Continuous lines represent the fit of a Hill equation to the data. Each point represents the mean ± SEM
of four or more experiments.

133
Caballero et al. www.pnas.org/cgi/content/short/1004021107 5 of 10
 RESULTADOS

A B

Kir2.1 charge increase (%)

0 mV
250
200
900
Co ntro l

IKir2.1 (pA)
150
600 Fleca 0.5 µM
Fleca 1 µM
100
300
Fleca 5 µM 50
0 0
0 100 200 300 400 0.1 0.5 1 5
Tim e (m s) [Flecainide] (µM)

Fig. S2. Flecainide increases IKir2.1 recorded by applying an AP voltage-clamp protocol. (A) IKir2.1 traces elicited by AP command signals (Top) as voltage
protocol under control conditions and in the presence of increasing concentrations of flecainide. (B) Bar graph showing the percentage of flecainide-induced
increase of the charge crossing the membrane through Kir2.1 channels as a function of the concentration. Each bar represents the mean ± SEM of at least four
experiments with each flecainide concentration.

A 50 ms Kir2.2 B 50 ms Kir2.3
0.5 nA

0.2 nA
+20 mV Control
Control -60 mV
-120 mV

Flecainide 1 M
Flecainide 1 M

C D
Membrane po tential (mV) Membrane po tential (mV)

-130 -90 -50 -10 -120 -80 -40 20 IKir2.3 (nA)

IKir2.2 (nA)

0.10 0.2
-0.4
0.05 0.1 -0.5
0 -0.8 0
-100 -80 -60 -40 -20 -80 -60 -40 -20
-0.05 -0.1
Co ntro l Co ntrol -1.0
-1.2
Fleca 1 M Fleca 1 M

Fig. S3. Flecainide does not modify IKir2.2 and IKir2.3. IKir2.2 (A) and IKir2.3 (B) traces recorded by applying the protocol shown in the absence and presence of
flecainide. I–V curves for IKir2.2 (C) and IKir2.3 (D). (Insets) Data at potentials positive to EK in an expanded scale. Each point represents the mean ± SEM of at least
four experiments.

A Kir2.1/Kir2.2 B Kir2.1/Kir2.3
Membrane po tential (mV) Membrane po tential (mV)
400 200

-140 -60 -20 -140 -60 -20

IKir2 (pA)

IKir2 (pA)

-400 -200

Co ntrol -800 Co ntro l -400

Fleca 1 M Fleca 1 M
-1200 -600

20
C 15
*
CON (ms)

10 *
5
2 *
act

*
1

0
.2
.1

.3

.2

.3
r2

r2

r2

/2

/2
.1

.1
Ki

Ki

Ki

r2

r2
Ki

Ki

Fig. S4. Effects of flecainide on heterotetrameric Kir2.x channels. Mean I–V curves for currents recorded on cells cotransfected (ratio 1:1) with both Kir2.1 and
Kir2.2 (Kir2.1/Kir2.2) (A) and with Kir2.1 and Kir2.3 (Kir2.1/Kir2.3) (B) in the absence and presence of 1 μM flecainide. (C) Bar graph showing the time constant
of activation at −120 mV obtained by fitting a monoexponential function to the current traces. In the I–V relationships, the voltage was adjusted to the liquid
junction potential of −13.2 mV.

134
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 RESULTADOS

A Membrane potential (mV) B Membrane potential (mV)

***
* ***
-130 -90 -50 -10

IKir2.1 L222I (nA)

-140 -60 20

IKir2.1 (pA/pF)
25
* * * * 0.1 -0.5
* * 15
* -60 0.05
* * 5
-1
-80 -60 -40 -20 -5 -80 -60 -40 -20
* -15
-120 -1.5
*
Kir2.1WT Kir2.1 L222I Kir2.1 L222I Fleca 1 mM

Fig. S5. Effects of flecainide on L222I Kir2.1 channels. (A) Mean current density curves for currents recorded in CHO cells transfected with WT or L222I Kir2.1
channels. *P < 0.05 vs. WT. (B) Mean I–V curves for currents recorded in CHO cells expressing L222I Kir2.1 channels in the absence and presence of 1 μM
flecainide. *P < 0.05 vs. control. Each point represents the mean ± SEM of five experiments.

A B C
FLECAINIDE
FLECAINIDE
G-loop
bI G-loop

Cys311
Ser313

bI

G-loop

Val296
Ile297 bH
bH

D G-loop
bH bI
Kir2.1 293 EIVVILEGMVEATAMTTQ CRSSYLA
Kir2.2 294 EIVVILEGMVEATAMTTQARSSYLA
Kir2.3 285 EIVVILEGMVEATAMTTQARSSYLA

Fig. S6. Molecular model of flecainide within Kir2.1 channels. (A) Results of the blind-docking study of flecainide within the full Kir2.1 channel. (B and C)
Predicted bonds between flecainide and the amino acids located in the binding site within the cytoplasmic domain. (D) Amino acid sequence alignments of the
βH–βI region of Kir2.1–3 channels.

135
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 RESULTADOS

A. Kir2.2 Cytoplasmic domain

B. Kir2.3 Cytoplasmic domain

Fig. S7. Blind docking of flecainide on Kir2.2 and Kir2.3 channels. Results of the blind-docking study of flecainide within the cytoplasmic domain of Kir2.2 (A)
and Kir2.3 (B) channels. The structure of Kir2.2 and Kir2.3 cytoplasmic domains were constructed by using the crystallized Kir2.1 cytoplasmic domain retrieved
from the Protein Data Bank (PDB ID code 1U4F) as a template. Only the most favorable conformations resulting from a study involving 100 runs are depicted in
the figure.

+90 mV
+10 mV R67W; [K+]o= 140 mM
-60 mV
Membrane potential (mV)
A B C *

IKir2.1 R67W (pA/pF)

R67W R218W 200
*
[K+]o= 140 mM [K+]o= 140 mM *
100
*
*
-60 *
20 40 60
*
500 pA

500 pA

*
* * -100
Kir2.1 R67W
100 ms 100 ms
Kir2.1 R67W (inc)

R67W (inc)
D [K+]o= 4 mM
E
R67W (inc); [K+]o= 4 mM
-60 mV -60 mV -40 mV
Membrane potential (mV)
IKir2.1 R67W (pA/pF)

-120 mV 6
* 4
*
**
Kir2.1 R67W (inc)
2

+BaCl2 1 mM BaCl2 1 mM -140 -60 -20 20

* -2
10 pA

*
**
20 pA

-4
*
Kir2.1 R67W (inc) -6
100 ms Kir2.1 R67W (inc)
100 ms +BaCl2 1 mM

Fig. S8. Electrophysiological characterization of R67W and R218W Kir2.1 channels. Current traces recorded at [K+]o = 140 mM by applying 250 ms pulses
from +10 mV to potentials ranging from −60 to +90 mV in CHO cells expressing R67W (A) or R218W (B) under control conditions. (C) Mean current density
curves for currents recorded in CHO cells expressing R67W Kir2.1 channels incubated or not with 1 μM flecainide for 24 h. *P < 0.05 vs. data from nonincubated
cells. (D) Current traces recorded at −120 mV (Left) or at −40 mV (Right) in a CHO cell expressing R67W Kir2.1 channels incubated with flecainide (1 μM) for 24 h
([K+]o = 4 mM) in control conditions and after perfusion with an external solution containing BaCl2 (1 mM). (E) Mean current density curves for currents
recorded in cells expressing R67W Kir2.1 channels after incubation with flecainide in the absence and presence of BaCl2. *P < 0.01 vs. data in the presence of
BaCl2. Each point represents the mean ± SEM of five experiments in each group.

136
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 RESULTADOS

A Membrane potential (mV) B Membrane potential (mV)

30 20

IKir2.3 density (pA/pF)

IKir2.2 density (pA/pF)
-140 -60 -20 -10 20
-140 -60 -20 20
15
-50 3
-20
10
5 1
-100 -60 -20 -90 -40
-5 -100 -60 -20 -1
-10
-130 -3 -60
Kir2.2 WT Kir2.3 WT
Kir2.2 WT (inc) Kir2.3 WT (inc)

C Membrane potential (mV)

D Membrane potential (mV)
30 20

Current density
Current density
-140 -60 -20 -10 20
-140 -60 -20 20

(pA/pF)
(pA/pF)
15
-50 -20
10
3
5

-100 -60 -20

-90 1 -40
-5 -100 -60 -20 -1
-10
-130 -3 -60

Kir2.1+Kir2.2 Kir2.1+Kir2.3
Kir2.1+Kir2.2 (inc) Kir2.1+Kir2.3 (inc)

E F
Membrane potential (mV) Membrane potential (mV)
10 5
***

IKir2.3 A303C density

IKir2.2 A312C density

-140 -60 -20 20 -140 -60 -20 20

(pA/pF)
-5
(pA/pF)

1.5
3 -20 * * *
* 1.0
0.5
-10
1 -30
-100 -60 -20 -1 * -100 -60 -20
-0.5 -15
* -40 -1.0
-3
-50 -20
* * Kir2.3 A303C
Kir2.2 A312C Kir2.3 A303C (inc)
Kir2.2 A312C (inc)
Fig. S9. Effects of the incubation with flecainide on Kir2.x channels depends on the presence of Cys311. Mean I–V curves for currents recorded in CHO cells
transfected with Kir2.2 WT (A), Kir2.3 WT (B), Kir2.1 + Kir2.2 (C), Kir2.1 + Kir2.3 (D), A312C Kir2.2 (E), and A303C Kir2.3 (F) channels incubated or not with 1 μM
flecainide for 24 h. *P < 0.05 vs. currents recorded in CHO cells not incubated with flecainide. Each point represents the mean ± SEM of eight or more ex-
periments in each group.

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 RESULTADOS

Table S1. Results of the blind-docking study of flecainide on

Kir2.1 channels
No. of conformations
Cluster rank ΔG, kcal/mol in cluster

1 −7.460 3
2 −7.515 2
3 −6.935 2
4 −6.885 2
5 −6.430 3
6 −6.295 2

Table S2. Patient characteristics (mean age 75 ± 3 y)

Characteristics No./total

Female 1/3
Surgery
Valve surgery 2/3
CABG surgery 3/3
Treatment
Beta blockers 1/3
ACE inhibitors/angiotensin receptor blockers 3/3
Statins 2/3
Acetylsalicylic acid 2/3

ACE, angiotensin converting enzyme; CABG, coronary artery bypass grafting.

Table S3. Sequence of primers used in study

Optimal annealing
Protein Primers Tm, °C temperature, °C

Kir2.1 F 5′-CCTCCCATTTCCACTGCGTGTGTCC-3′ 69.3 69.9

R 5′-GCCAACTTCATGCCGTCCTCTTCC-3′ 66.8
Kir2.2 F 5′-GCCACTGACCAAGGATCTGCGGGTG-3′ 71.2 69.9
R 5′-GCACCCGACATGGTGACCAAGTGCAG-3′ 71.9
Kir2.3 F 5′-CTTCTTCGGCCTCCTCTTCT-3′ 56.7 63
R 5′-CCGATCATGAAGGAGTCGAT-3′ 54.7
a
GAPDH F 5′-TCCCGTGCAGTGCCAGCCGCAACCCGA-3′ 81.9
R 5′-GGGCAGCGCCACGGCCATCACGCCACA-3′ 83.5

Tm, theoretical primer melting temperature.

a
The annealing temperature of the internal standard corresponded to that of the mRNA problem in each case.

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2. Propafenone blocks human cardiac Kir2.x channels
by decreasing the negative electrostatic charge in the
cytoplasmic pore

Amorós I, Dolz-Gaitón P, Gómez R, Matamoros M, Barana A, de la

Fuente MG, Núñez M, Pérez-Hernández M, Moraleda I, Gálvez E, Iriepa I,
Tamargo J, Caballero R, Delpón E. Biochem Pharmacol. 2013;86:267-278.
 RESULTADOS
Biochemical Pharmacology 86 (2013) 267–278

Contents lists available at SciVerse ScienceDirect

Biochemical Pharmacology
journal homepage: www.elsevier.com/locate/biochempharm

Propafenone blocks human cardiac Kir2.x channels by decreasing the

negative electrostatic charge in the cytoplasmic pore
Irene Amorós a,b,1, Pablo Dolz-Gaitón a,b,1, Ricardo Gómez a,c, Marcos Matamoros a,b,
Adriana Barana a,c, Marta González de la Fuente a,c, Mercedes Núñez a,b,
Marta Pérez-Hernández a,c, Ignacio Moraleda d, Enrique Gálvez d,
Isabel Iriepa d, Juan Tamargo a,c, Ricardo Caballero a,b,*, Eva Delpón a,b
a
Department of Pharmacology, School of Medicine, Universidad Complutense, 28040 Madrid, Spain
b
Instituto de Investigación Sanitaria Gregorio Marañón, School of Medicine, Universidad Complutense, 28040 Madrid, Spain
c
Instituto de Investigación Sanitaria Hospital Clı´nico San Carlos, School of Medicine, Universidad Complutense, 28040 Madrid, Spain
d
Department of Organic Chemistry, School of Pharmacy, Universidad de Alcalá, 28871 Madrid, Spain

A R T I C L E I N F O A B S T R A C T

Article history: Human cardiac inward rectifier current (IK1) is generated by Kir2.x channels. Inhibition of IK1 could offer
Received 18 January 2013 a useful antiarrhythmic strategy against fibrillatory arrhythmias. Therefore, elucidation of Kir2.x
Accepted 25 April 2013 channels pharmacology, which still remains elusive, is mandatory. We characterized the electrophysio-
Available online 3 May 2013
logical and molecular basis of the inhibition produced by the antiarrhythmic propafenone of the current
generated by Kir2.x channels (IKir2.x) and the IK1 recorded in human atrial myocytes. Wild type and
Keywords: mutated human Kir2.x channels were transiently transfected in CHO and HEK-293 cells. Macroscopic
Propafenone
and single-channel currents were recorded using the patch-clamp technique. At concentrations >1 mM
Human atrial myocytes
IK1
propafenone inhibited IKir2.x the order of potency being Kir2.3  IK1 > Kir2.2 > Kir2.1 channels. Blockade
PIP2 was irrespective of the extracellular K+ concentration whereas markedly increased when the
Rectification intracellular K+ concentration was decreased. Propafenone decreased inward rectification since at
Inward rectifier channels potentials positive to the K+ equilibrium potential propafenone-induced block decreased in a voltage-
dependent manner. Importantly, propafenone favored the occurrence of subconductance levels in Kir2.x
channels and decreased phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PIP2)-channel affinity. Blind docking
and site-directed mutagenesis experiments demonstrated that propafenone bound Kir2.x channels at
the cytoplasmic domain, close to, but not in the pore itself, the binding site involving two conserved Arg
residues (residues 228 and 260 in Kir2.1). Our results suggested that propafenone incorporated into the
cytoplasmic domain of the channel in such a way that it decreased the net negative charge sensed by K+
ions and polyamines which, in turn, promotes the appearance of subconductance levels and the decrease
of PIP2 affinity of the channels.
ß 2013 Elsevier Inc. All rights reserved.

1. Introduction functions of strong inwardly rectifying channels are related to their

unique inward rectification, which allows K+ influx but limits K+
Human Kir2.x channels generate the inward rectifier current efflux [1,4]. The prevalent mechanism underlying this property is
(IK1) present in both atrial and ventricular myocytes [1]. Several the voltage-dependent block caused by intracellular Mg2+ and
data suggest that ventricular IK1 is mainly carried by Kir2.1 polyamines interacting with acidic residues lining the transmem-
homotetramers while the relative importance of Kir2.2 and 2.3 brane (D172) and cytoplasmic pore (E224, E229, D255, and D259
subunits is greater at the atrial level [1–3]. The physiological residues in Kir2.1) [4]. IK1 is thus critical for the maintenance of the
resting membrane potential near the K+ equilibrium potential (EK)
and for the control of the duration of the final phase of cardiac
action potential repolarization and refractoriness [1].
* Corresponding author at: Department of Pharmacology, School of Medicine, Inward rectifier channels have been implicated in the
Universidad Complutense de Madrid, 28040 Madrid, Spain. Tel.: +34 91 394 14 74;
perpetuation of reentrant tachyarrhythmias in both humans and
fax: +34 91 394 14 70.
E-mail address: rcaballero@med.ucm.es (R. Caballero).
experimental models [5,6]. Gain- and loss-of-function mutations
1
Both authors contributed equally. in the gene that encodes Kir2.1 (KCNJ2) have been reported, and

0006-2952/$ – see front matter ß 2013 Elsevier Inc. All rights reserved.
http://dx.doi.org/10.1016/j.bcp.2013.04.023

141
 RESULTADOS
268 I. Amorós et al. / Biochemical Pharmacology 86 (2013) 267–278

both the IK1 increase and decrease produced by these mutations Table 1
Patient characteristics.
are associated with ventricular arrhythmias [3,7]. Indeed, muta-
tions that increase the outward component of IK1 lead to short QT Patients (n) 5
Mean age (years) 65  4
syndrome type 3 and severe ventricular arrhythmias, whereas
Male/Female (n) 4 (80%)/1 (20%)
those that decrease the current cause mild QT prolongation yet a Cardiopathy
burden of ventricular arrhythmias (Andersen–Tawil Syndrome) Valvular (n) 3 (60%)
[3,5,7]. Additionally, atrial fibrillation, the most common arrhyth- Ischemic (n) 1 (20%)
mia, produces an IK1 up-regulation, an increase that is considered Combined (n) 1 (20%)
Hypertension (n) 5 (100%)
critical for the stabilization of the arrhythmia [8,9]. Altogether the Diabetes mellitus (n) 2 (40%)
results suggested that inhibition of IK1 could offer a potentially Dyslipidemia (n) 3 (60%)
useful antiarrhythmic strategy against fibrillatory arrhythmias Ejection fraction (%) 58.8  1.1
[5,6]. Moreover, since Kir2.2 and Kir2.3 seem to be the main atrial NYHA functional class
I (n) 1 (20%)
Kir2.x isoforms, the selective modulation of Kir2.2–2.3 channels as
II (n) 4 (80%)
an atrial selective target for the design of new antiarrhythmic III (n) 0 (0%)
agents could be proposed [10]. IV (n) 0 (0%)
Nowadays there is a huge amount of information on the Creatinine (mg/dL) 0.9  0.2
pharmacology of human cardiac voltage-dependent K+ (Kv) Pulmonar systolic pressure (mm Hg) 46.3  5.6
Treatment
channels. Aside toxins, which bind the extracellular mouth of the ACE inhibitors/ARBs (n) 4 (80%)
pore, blocking drugs act as open channel blockers by binding to Statins (n) 3 (60%)
receptor sites that share a similar topology among the different Acetylsalicylic acid (n) 3 (60%)
cardiac Kv channels and that are located in the lumen of the aqueous Beta blockers (n) 2 (40%)
Calcium antagonists (n) 0 (0%)
pore of the channel [11]. Conversely, pharmacology of Kir2.x
channels remains elusive. It has been described that chloroquine ACE, angiotensin converting enzyme; ARBs, angiotensin II type 1 receptor blockers;
inhibits IK1 in a voltage-dependent manner by binding to Kir2.1 CABG, coronary artery bypass grafting. NYHA: New York Heart Association.

residues located in the cytoplasmic pore and implicated in the

polyamines binding [12]. Other drugs, such as tamoxifen, meflo-
quine and carvedilol, inhibit IK1 by binding phosphatidylinositol 4,5- Levitan (Columbia University, USA), respectively. D172A, E224A,
bisphosphate (PIP2) avoiding the critical interaction of the channel D259A, E299A Kir2.1, WT Kir2.2, WT and I213L Kir2.3 cDNA were
with this mediator [13–15]. Recently, it has been demonstrated that provided by Dr. J. Sánchez-Chapula (Colima University, Mexico).
flecainide, a class Ic antiarrhythmic drug, selectively increases the IK1 Kir2.1, Kir2.2 and Kir2.3 were subcloned into pcDNA3.1 plasmid
generated by homotetramers of Kir2.1 channels (IKir2.1) by binding to (Invitrogen, USA). D255R, R228A, R228Q, R260A, R260Q Kir2.1,
C311, a residue located at the cytoplasmic domain of the channel [2]. R229A, R229Q Kir2.2, and R220Q, R252Q Kir2.3 mutants were
Therefore, even when the information is extremely limited, it is made by using the QuikChange Site-Directed Mutagenesis kit
suspected that Kir2.x pharmacological modulation mechanism is (Stratagene, USA) [2,18]. All mutations were confirmed by direct
more diverse than those of Kv channels. DNA sequencing. CHO cells, cultured as previously described
Here we analyzed the effects of propafenone, another class Ic [2,17,18], were transiently transfected with the cDNA encoding
antiarrhythmic drug [16], to take a step forward in our knowledge WT or mutated Kir2.x channels (1.6 mg) together with the cDNA
of the pharmacological modulation of Kir2.x channels. The results encoding the CD8 antigen (0.5 mg) by using FUGENE XtremeGENE
suggested that propafenone blocks Kir2.x channels by binding to (Roche Diagnostics, Switzerland) following manufacturer instruc-
the cytoplasmic domain at a site located at the interface of tions. Coexpression experiments (Kir2.1/Kir2.2, Kir2.1/Kir2.3,
subunits. Binding of propafenone promotes the occurrence of Kir2.2/Kir2.3) were performed using an 1:1 ratio. Activation
subconductance levels in the channel gating due to the decrease of kinetics of the heterotetramers were significantly different from
the K+ concentration in the pore and of the affinity of the channel those of the respective homotetrameric channels, demonstrating
for PIP2. Therefore, the present results provide evidence for a novel the heterotetrameric nature of the channels [2].
mechanism of Kir channels drug blockade that could be of 48 h after transfection, cells were incubated with polystyrene
potential therapeutic interest. microbeads precoated with anti-CD8 antibody (Dynabeads M450;
Life Technologies, United Kingdom). Most of the cells that were
2. Materials and methods beaded also had channel expression.

2.1. Human atrial myocyte isolation 2.3. Macroscopic current recordings

The study was approved by the Investigation Committee of the Macroscopic currents were recorded at room temperature (21–
Hospital Universitario Gregorio Marañón (CNIC-13) and conforms 23 8C) using the whole cell patch-clamp technique using an
to the principles outlined in the Declaration of Helsinki. Each Axopatch-200B patch clamp amplifier (Molecular Devices, USA)
patient gave written informed consent. Data regarding age, sex, [2,17–19]. Recording pipettes were pulled from 1.0 mm o.d.
type of surgery, and pharmacological treatment of the patients are borosilicate capillary tubes (GD1, Narishige Co., Ltd, Japan) using
included in Table 1. Human right atrial samples were obtained a programmable patch micropipette puller (Model P-2000 Brown-
from patients (n = 5) that underwent cardiac surgery. Atrial Flaming, Sutter Instruments Co., USA). Micropipette resistance was
myocytes were isolated by using collagenase type I (Worthington, kept below 3.5 MV when filled with the internal solution and
USA) and protease type XXIV (Sigma Chemical Co., United immersed in the external solution. In all experiments series
Kingdom) following previously described methods [17]. resistance was compensated manually and 80% compensation
was achieved. In CHO cells, uncompensated access resistance and
2.2. Kir2.x constructs and cell transfection cell capacitance were 2.7  0.2 MV, and 11.3  0.8 pF, respectively
(n = 75), whereas mean maximum Kir2.1, Kir2.2, and Kir2.3 currents
Human Kir2.1 wild type (WT) and L222I Kir2.1 cDNA were (IKir2.1, IKir2.2, and IKir2.3) amplitudes at 120 mV were 2.0  0.2
kindly provided by Dr. J. Jalife (Michigan University, USA) and Dr. I. (n = 36), 1.0  0.1 (n = 18), and 0.5  0.1 nA (n = 21), respectively.

142
 RESULTADOS
I. Amorós et al. / Biochemical Pharmacology 86 (2013) 267–278 269

In human atrial myocytes mean maximum IK1 amplitude at 100 mV, [K+]o, IKir2.1 was recorded by applying 250 ms-pulses from +10 mV
uncompensated access resistance, and capacitance averaged to potentials ranging 60 and +90 mV. In all cases, the current
679  108 pA, 2.6  0.8 MV, and 77.1  9.8 pF (n = 24), respective- amplitude was measured at the end of the pulse. Current
ly. Thus, under our experimental conditions no significant voltage recordings were sampled at 4 kHz and filtered at half the sampling
errors (<5 mV) due to series resistance were expected with the frequency.
micropipettes used. To record human atrial IK1, the external solution To obtain the EC50 (concentration that produces the half
contained (mM): NaCl 120, KCl 20, CaCl2 1, MgCl2 1, HEPES 10, 4- maximum effect) and the IC50 (concentration that produces the
aminopyridine 1, glucose 10, nifedipine (1 mM), atropine (1 mM), and half maximum inhibition) and the Hill coefficient (nH), the
glibenclamide (10 mM) (pH 7.4 with NaOH). Recording pipettes were blockade produced by propafenone or the increase produced by
filled with an internal solution containing (mM): K-aspartate 80, KCl PIP2 at various concentrations [D] were fitted to the Hill equation.
42, KH2PO4 10, MgATP 5, phosphocreatine 3, HEPES 5, and EGTA 5 (pH Single channel currents were recorded by applying 10-s pulses
7.2 with KOH). To record IKir2.1, IKir2.2, and IKir2.3 CHO cells were from a holding potential of 0 mV to 80 mV [2,18], digitized at
perfused with an external solution containing (mM): NaCl 136, KCl 4, 10 kHz and filtered at 1 kHz. Data were analyzed using pCLAMP
CaCl2 1.8, MgCl2 1, HEPES 10, and glucose 10 (pH 7.4 with NaOH). The software (Molecular Devices, USA). Open probability (Po) was
liquid junction potential (LJP) between the pipette and external calculated in each experiment by dividing the time that the
solution was 13.2 mV. In some experiments, IKir2.1 were recorded at channel remains in the open state by the total recording time. The
100 (LJP = 9.4 mV), or 140 (LJP = 8.0 mV) mM extracellular K+ opening frequency (fo) was calculated for each experiment as the
concentration ([K+]o). R228A, R228Q, R260A, R260Q IKir2.1, R229A, inverse of the closed time between events. Amplitude of unitary
R229Q IKir2.2, and R220Q, R252Q IKir2.3 were recorded at 140 mM currents in control conditions and in the presence of propafenone
[K+]o. To obtain 100 and 140 mM [K+]o solutions, equimolar were calculated for each experiment from a Gaussian distribution
substitution between KCl and NaCl was used. The internal solution fit to amplitude histograms that were constructed by plotting
used for whole-cell current recordings in CHO cells was the same as amplitude data as a function of the number of events per bin (bin
described for recording native IK1 (see above). In some experiments width = 0.05 pA). Open- and closed-time constants (to and tc) were
the total intracellular K+ concentration ([K+]i) was lowered to 25% by calculated for each experiment from the Gaussian distribution fit
the equimolar substitution of K-aspartate and KCl by TrisCl to dwell-time histograms that were constructed by plotting log of
(LJP = 2.4 mV) [19]. All current–voltage (I–V) curves were corrected the dwell-time data as a function of the number of events per bin.
according to the calculated LJP [2,18]. Mean open time (MOT) was calculated by dividing the total open
dwell-time by the number of openings.
2.4. Single channel recordings Inside-out recordings were performed by applying 500-ms
pulses from a holding potential of 70 mV to potentials ranging
Single channel currents were recorded at room temperature 90 and +50 mV, followed by a second 500-ms pulse to 80 mV.
using the cell-attached patch-clamp configuration [2,18]. Cells Currents were digitized at 2 kHz and filtered at 1 kHz. Spermine-
were suspended in bath solution (in mM: KCl 140, CaCl2 1.8, MgCl2 induced block was measured as the reduction of the total charge
1, HEPES 10, and glucose 10; pH 7.4 with KOH). Patch pipettes were crossing the membrane (calculated as current-time integrals at
pulled from 1.5 mm o.d. borosilicate capillary tubes (Harvard +50 mV).
Apparatus Ltd, USA), coated at the tip with Sylgard (Dow Corning,
USA), and fire-polished with a microforge (MF130-Narishige, 2.7. Blind docking of propafenone on Kir2.2
Japan). When filled with pipette solution (in mM: KCl 140 and
HEPES 10; pH 7.4 with KOH), tip resistances were between 5 and Propafenone was assembled as hydrochloride within Discovery
10 MV. Patches with more than one channel were discarded. Studio (version 2.1 software package; Accelrys Software Inc., USA)
using standard bond lengths and bond angles. With the CHARMm
2.5. Inside-out recordings (Accelrys Software Inc.) force field [20] and partial atomic charges,
the molecular geometry of propafenone was energy-minimized
In some experiments, currents were recorded at room using the adopted-based Newton–Raphson algorithm. Structure
temperature from excised inside-out macropatches from HEK- was considered fully optimized when the energy changes between
293 cells [2]. Recordings were made by using a fluoride, vanadate, iterations were less than 0.01 kcal/mol [21]. Crystal structure of
and pyrophosphate (FVPP)-potassium solution on both sides of the Kir2.2 channel from chicken (PDB ID: 3JYC) was used for the
patch containing (in mM): KCl 123, K2EDTA 5, K2HPO4 7.2, KH2PO4 molecular modeling [22]. The software PISA (http://pdbe.org/pisa/
8, Na3VO4 0.1, KF 5, K4HP2O7 10 (pH 7.2 with KOH) to prevent ) predicts that the crystal form of Kir2.2 may form a tetramer. For
current rundown [2]. This solution was Mg2+- and spermine-free. A docking studies, initial protein was prepared by removing
solution adjusted to pH 5.0 was used to abolish any detectable heteroatoms (K+). Proper bonds, bond orders, hybridization, and
currents through Kir channels. Off-line subtraction of the currents charges were assigned using protein model tool in Discovery
recorded when perfusing with this solution was used to subtract Studio. CHARMm force field was applied using the receptor–ligand
endogenous currents. Patch pipettes were pulled from 1.0 mm o.d. interactions tool in Discovery Studio.
borosilicate capillary tubes (GD1, Narishige Co., Ltd, Japan). When The binding sites of propafenone within Kir2.2 were identified
filled with FPVV solution, tip resistances were between 1.0 and by automated ligand docking (‘‘blind docking’’) using the program
1.5 MV. Autodock Vina (MGL Tools, USA) [23]. AutoDockTools software
(ADT; version 1.5.4) was used to add hydrogens and partial charges
2.6. Pulse protocols and analysis for proteins and ligands using Gasteiger charges. All rotational
bonds in ligand were set to free, while the protein side chains
The protocol to record human atrial IK1 consisted of 50-ms steps remain fixed. A grid box of 60  60  72 with grid points separated
from 80 to 100 mV followed by depolarizing ramps to 10 mV 1 Å, was positioned at the middle of the protein. Default
(800 ms) [2,18]. For macroscopic IKir2.1, IKir2.2, and IKir2.3 recorded in parameters were used except number of modes, which was set
the presence of 4 mM [K+]o, the protocol to obtain I–V curves to 40. Fifty independent docking runs were carried out for
consisted of 250-ms pulses in 10 mV increments from 60 mV to propafenone. According to Vina best scored poses, the most stable
potentials between 120 and +20 mV [2,18]. At 100 and 140 mM complex configurations were considered.

143
 RESULTADOS
270 I. Amorós et al. / Biochemical Pharmacology 86 (2013) 267–278

2.8. Drugs Surprisingly, in the presence of propafenone, current generated at

potentials positive to the EK was a linear function of the voltage (inset
Propafenone (Sigma) was initially dissolved in methanol to in Fig. 1B). Indeed, at potentials positive to the EK the propafenone-
yield 10 mM stock solutions. Drug solutions were prepared freshly induced block decreased in a voltage-dependent manner. To quantify
for each experiment. Glibenclamide, atropine, nifedipine, PIP2 this phenomenon the IKir2.1 rectification index was calculated by
sodium salt, and spermine were purchased from Sigma as a powder dividing the current amplitude generated by the most depolarized
and dissolved as appropriate to yield 10 mM stock solutions. pulse by the current amplitude generated by the most hyperpolarized
Further dilutions were carried out in external solution to obtain the pulse. Fig. 1C demonstrated that propafenone decreased the inward
desired final concentration. Control solutions always contained the rectification.
same solvent concentrations as the test solution. We also tested the propafenone blocking effects in the presence
of different [K+]o and when [K+]i was decreased by 75%.
2.9. Statistical methods Interestingly, the degree of block of both outward and inward
current was irrespective of the [K+]o, while the blockade
Results are expressed as mean  SEM. Paired or unpaired t test or significantly increased when [K+]i was reduced by 75% (Fig. 1D/
one-way ANOVA followed by Newman–Keuls test were used to assess E). Furthermore, the propafenone-induced decrease of current
statistical significance where appropriate. To make comparisons rectification resulted to be more marked at low than at high [K+]o
between two different concentration–response curves, an F-test was (Fig. 1C).
used. A value of P < 0.05 was considered significant. Fig. 2A and C shows IKir2.2 and IKir2.3 records while panels B and
D show their respective IV curves. The results demonstrated that
3. Results propafenone also inhibited inward and outward currents generat-
ed by Kir2.2 and Kir2.3 homotetramers. Furthermore, we also
Fig. 1A shows IKir2.1 traces recorded in a CHO cell transiently tested the effects produced by propafenone on cells cotransfected
transfected with Kir2.1 channels by applying 250-ms pulses from a (1:1 ratio) with both Kir2.1 and Kir2.2 (Kir2.1/2.2), with Kir2.1 and
holding potential of 60 mV to potentials ranging 120 and Kir2.3 (Kir2.1/2.3), and with Kir2.2 and Kir2.3 (Kir2.2/2.3). Fig. 2E
+20 mV under control conditions and in the presence of 50 mM shows the percentage of 50 mM propafenone-induced inhibition
propafenone. Propafenone significantly decreased both inward on the currents recorded at 40 mV positive to the EK demonstrating
(42.4  6.9% at 120 mV) and outward IKir2.1 (55.3  7.4% at 50 mV, that propafenone also inhibited IKir2.x generated by heterotetra-
n = 7, P < 0.01 vs control) (Fig. 1A), an effect completely reversible mers. Accordingly with this result, propafenone also inhibited both
upon washout. Fig. 1B shows the current–voltage (I–V) relationship inward and outward IK1 recorded in human atrial myocytes
obtained in the absence and presence of propafenone 50 mM. (P < 0.05, n = 6) which is probably generated by Kir2.x

+20 mV
A -60 mV B Membrane potential (mV)

-120 mV ** **
50 ms
50 ms
-140 -60 20

IKir2.1 (nA)
* * *
0.6
-1
*
1 nA

0.4
* *
* -2
0.2

-3
-80 -60 -40 -20 0 20
Propa 50 µM -4
Control Propa 50 µM
Control
Vm= EK -30 mV Vm= EK +40 mV
C D E
[K+]o (mM) [K+]o (mM)
Control 4 100 140 4 4 100 140 4
Propa 0 0
Rectification index

IKir2.1 inhibition (%)

0.2
*
-25 -25
*
0.1 -50 -50
*
-75 -75
0.0 *
4 100 140 [K+]i= 25 %
-100 -100
[K+]o (mM) *
[K+]i = 25%

Fig. 1. Propafenone inhibits IKir2.1. A and B, IKir2.1 traces recorded by applying the protocol shown at the top (A) and I–V curves for currents measured at the end of the pulses (B)
in the absence and presence of 50 mM propafenone. Inset in B shows data at potentials positive to EK on an expanded scale. *P < 0.05 vs control. C, Rectification index
calculated at 4, 100, and 140 mM [K+]o in control conditions and in the presence of 50 mM propafenone. *P < 0.05 vs control. D and E, Percentage of inhibition induced by
50 mM propafenone on the IKir2.1 recorded at 30 mV negative (D) or at 40 mV positive (E) to the EK at different [K+]o and when the [K+]i was reduced to 25% (35 mM). *P < 0.05
vs inhibition of currents recorded at 140 mM [K+]i.

144
 RESULTADOS
I. Amorós et al. / Biochemical Pharmacology 86 (2013) 267–278 271

Fig. 2. Propafenone inhibits IKir2.x. A and C, IKir2.2 and IKir2.3 traces recorded by applying the protocol shown at the top. B and D, I–V curves for IKir2.2 and IKir2.3 measured at the
end of the pulses in the absence and presence of 50 mM propafenone. Insets show data at potentials positive to EK on an expanded scale. *P < 0.05 vs control. E, Percentage of
50 mM propafenone-induced inhibition on the currents recorded at 40 mV positive to EK. *P < 0.05 vs Kir2.1. F, Percentage of IKir2.1, IKir2.2, IKir2.3, and human atrial IK1 inhibition
at 30 mV negative to EK as a function of the different concentrations of propafenone tested. In B and D–F, each point/bar represents the mean  SEM of 5 experiments.

heterotetramers (Fig. 2E). Native IK1 was recorded in the presence (Fig. 3B). Remarkably, propafenone induced a significant change in
of atropine and glibenclamide to block the acetylcholine-activated channel gating characterized by the occurrence of subconductance
component (IKACh) and the ATP-sensitive (IKATP) inward rectifier levels (Fig. 3A). In the presence of drug, amplitude histograms
currents, respectively. (Fig. 3C) showed peaks corresponding to sublevels with mean
Fig. 2F shows the concentration–response curves constructed amplitudes of 1/4 (O0), 1/2 (O1), and 3/4 (O2) of the fully open
by plotting the propafenone-induced inhibition of inward IKir2.1, level (O3). Interestingly, mean amplitude of the fully open level was
IKir2.2, IKir2.3, and human atrial IK1 at 30 mV negative to the EK as a similar to that of control conditions (Fig. 3D). The most frequently
function of the propafenone concentration tested. The IC50 and the observed sublevel was O2 (Fig. 3C) with a Po of 0.26  0.1 and a MOT
nH were calculated by fitting the Hill equation to the data. of 295  119 ms (Fig. 4A and B). Open- and closed-time constants (to
Interestingly, the IC50 for IKir2.1 (51.8  6.2 mM) was significantly and tc) were calculated for each experiment from the Gaussian
higher than those obtained for IKir2.2 (29.1  3.4 mM), IKir2.3 distribution fit to histograms that were constructed by plotting log of
(14.7  3.1 mM), and human atrial IK1 (16.8  6.1 mM). It should be dwell-time data as a function of the number of events per bin. Fig. 4C
noted that human atrial IK1 sensitivity was similar to that of Kir2.3 shows that mean to values for O0 and O2 were significantly lower than
channels, which further supported the predominant role of these those of O1 and O3 while propafenone did not significantly modify tc
channels over Kir2.1 in generating this current [2]. (Fig. 4D). It has been described that the disruption of PIP2-channel
interaction favors the occurrence of subconductance levels in Kir2.x
3.1. Propafenone decreases PIP2-channel interactions channels [24]. Thus, these results also suggested that a PIP2-related
mechanism was responsible for the effects of propafenone.
Propafenone-induced block showed an inverse correlation to Fig. 5A shows IKir2.1 traces recorded in excised inside-out
the strength of channel-PIP2 interaction (greater for Kir2.1 than for macropatches by applying 500-ms pulses from 70 mV to
Kir2.3 channels). Thus, we next studied the effects of propafenone potentials ranging 90 and +50 mV in the absence and presence
on L222I Kir2.1 and in I213L Kir2.3 channels, mutations that of 50 mM propafenone. Application of propafenone at the internal
decrease and increase, respectively, the Kir2.1 and Kir2.3 channel side of the membrane significantly inhibited the current at
affinity for PIP2 [1,4]. Strikingly, propafenone-induced block was potentials negative (43.8  5.2% at 90 mV) and positive
not different to that observed in their respective WT channels (56.9  7.3% at +50 mV) to the EK (Fig. 5A and B). Interestingly,
(Fig. 2E). steady-state block was reached after 12 min of drug perfusion, a
To analyze the effects of blocking propafenone concentrations slow onset block time course similar to that observed when the drug
at the single channel level we decided to use Kir2.1 channels, since was perfused extracellularly under whole-cell configuration (Fig. 5C).
their gating properties have been extensively studied. Fig. 3A These results suggested that IKir2.1 inhibition was not due to Kir2.1
shows single channel currents recorded by applying 10-s pulses pore block.
from 0 to 80 mV in CHO cells transiently transfected with Kir2.1 Neomycin is a polycationic aminoglycoside antibiotic that
channels in the presence and absence of 50 mM propafenone. reduces Kir channel activity by screening PIP2 molecules. Analysis
Under control conditions, channels exhibited a Po of 0.69  0.05, of the kinetics of inhibition by neomycin has been previously used
with a fo value of 2.4  0.2 Hz (n = 8). Moreover, the fit of a Gaussian as a reliable measurement of the strength of the channel-PIP2
distribution to amplitude histograms yielded discrete peaks at interaction [24]. Indeed, the stronger the channel-PIP2 interaction,
0.01  0.001 pA (closed channels) and 2.0  0.1 pA (open channels) the slower the inhibition. Thus, we measured the rate of current

145
 RESULTADOS
272 I. Amorós et al. / Biochemical Pharmacology 86 (2013) 267–278

Fig. 3. Propafenone induces subconductance levels in Kir2.1. A, Single channel recordings at 80 mV under control conditions and after perfusion with 50 mM propafenone.
Closed and open channel levels are indicated by C and O, respectively. B and C, Amplitude histograms at 80 mV in the absence (B) and presence (C) of propafenone
constructed by plotting amplitude data from 6 experiments as a function of the number of events per bin (bin width = 0.05 pA) together with the fit of a Gaussian function. The
fit to the open channel data in the presence of propafenone required a four component Gaussian equation. D, Mean unitary current amplitude under control conditions and in
the presence of propafenone. Each bar represents the mean  SEM of 6 experiments.

inhibition produced by 1 mM neomycin as the time required for current amplitude was fully recovered. In the presence of
the current to decrease by 50% (T50) (Fig. 5D). In the absence of propafenone, PIP2 failed to recover the current amplitude since
propafenone, neomycin decreased IKir2.1 with a T50 of 5.2  1.0 min. its activating effects were markedly reduced (Fig. 6B). Fig. 6C
In the presence of propafenone, the T50 of neomycin-induced shows the concentration dependence of the PIP2 increasing effects.
rundown was significantly reduced (1.1  0.1 min), suggesting that As can be observed, propafenone significantly increased the EC50
the channel-PIP2 interaction is weaker in the presence of propafe- (from 1.6  0.4 to 6.0  0.4 mM) and decreased the maximum effect
none. (Emax) (from 88.0  11.0% to 46.0  7.7%), suggesting that propafe-
We further examined the effects of propafenone on the none antagonizes the Kir2.1 channels activating effect of PIP2.
channel-PIP2 interaction by applying different PIP2 concentrations It has been proposed that long polyamines strengthen the
to inside-out macropatches as previously described [24,25]. channel-PIP2 interaction by acting as co-factors in PIP2 regulation
Immediately after patch-excision, 1 mM neomycin was applied of channel activity [26]. In fact, mutant channels that exhibit low
until the complete rundown of the current (20 min) (Fig. 6A). polyamines affinity also exhibit low PIP2 affinity [26]. Therefore,
Afterwards, increasing concentrations of PIP2 were applied until we next assessed the effects of propafenone on D172A, E224A,

146
 RESULTADOS
I. Amorós et al. / Biochemical Pharmacology 86 (2013) 267–278 273

Fig. 4. Effects of propafenone on channel gating. Mean Po (A), open time (B), to (C) and tc (D) in the absence and presence of propafenone. Each bar represents the mean  SEM
of 6 experiments. *P < 0.05 vs O1 and O3.

+50 mV

A -70 mV -80 mV
B Membrane potential (mV)
-90 mV
Control Propa 50 µM
1

**** IKir2.1 (nA)

-100 -50 0 50 100
-1
1 nA

**
100 ms ** -2
** Control
Propa 50 µM -3
Propa (50 µM)
C D
1.0
1.0
Normalized IKir2.1
IPROPA/ICON

0.8 Neomycin 1 mM
0.8
0.6 Neo+Propa 50 µM
0.6
0.4 0.4
Inside-out (at -80 mV)
0.2 0.2
Whole-Cell (at -120 mV)
0.0 0.0
0 5 10 15 20 0 10 20 30
Time (min) Time (min)
Fig. 5. Effects of propafenone on IKir2.1 recorded in excised inside-out patches. A, Current traces recorded by applying the protocol shown at the top in excised inside-out
patches from HEK-293 cells expressing Kir2.1 channels in control conditions and after cytoplasmic surface application of 50 mM propafenone. Horizontal lines represent the
zero current level. B, I–V curves for IKir2.1 recorded in inside-out patches in the absence and presence of propafenone. *P < 0.05 vs control. C, Time course of propafenone-
induced block of IKir2.1 recorded under the whole-cell configuration or in excised inside-out patches. D, Time course of neomycin-induced block of IKir2.1 recorded in excised
inside-out patches in the absence and presence of 50 mM propafenone. Each point represents the mean  SEM of 6 experiments.

147
 RESULTADOS
274 I. Amorós et al. / Biochemical Pharmacology 86 (2013) 267–278

A B C
Control
PIP2 1.0
1.0 100 µM 1.0 PIP2 + Propa (50 µM)
0.8
Propa 50 µM 0.8
0.8 10 µM
I/Imax

I/Imax
I/Imax
0.6 0.6
0.6 100 µM
1 µM 10 µM 0.4
*
0.4 0.4 1 µM *
0.2 0.2 0.2
*
0.0 0.0 0.0
0 10 20 30 0 10 20 30 0.01 0.1 1 10 100
Time (min) Time (min) [PIP2] (µM)

D 2A A A A R E 2A A A A R
T 7 24 299 259 255 T 7 24 299 259 255
W D1 E2 E D D W D1 E2 E D D
0 0

IKir2.1 inhibition (%)

IKir2.1 inhibition (%)

-25 -25

-50 -50

-75 * -75
* * * *
* *
-100 -100
Vm= -50 mV *
Vm= -120 mV
Fig. 6. Propafenone decreases channel affinity for PIP2. Normalized IKir2.1 as a function of time in the presence of neomycin and increasing concentrations of PIP2 in the absence
(A) or presence (B) of propafenone. C, Normalized current increase at 80 mV in excised inside-out patches as a function of PIP2 concentrations in the absence (control) and
presence of propafenone. Continuous lines represent the fit of the Hill equation to the data. *P < 0.05 vs control. D and E, Percentage of propafenone-induced inhibition of
IKir2.1 recorded at 120 mV (D) or at 50 mV (E) in CHO cells expressing WT, D172A, E224A, E299A, D259A, and D255R channels. Each point/bar represents the mean  SEM of
6 experiments.

D255R, D259A, and E299A channels by using the whole-cell respectively. These interactions could promote the binding
configuration (Fig. 6D and E). The results demonstrated that in all orientation of the alkylamino tail in order to interact with R229
these mutants, except D259A, propafenone-induced block was or R261 side chains.
significantly greater than in Kir2.1 WT channels. Since the carbonyl and amino groups of Q231 and D250 cannot
be substituted by performing site directed mutagenesis, their
3.2. Binding site of propafenone within Kir2.x channels putative involvement in the propafenone-induced block was not
further examined. Thus, we focused on the analysis of the
To explore the binding site responsible for the blocking effect relevance of R229 and R261 (Kir2.2 numeration), which are
of propafenone, we performed a blind docking for propafenone conserved among Kir2.x channels. To this end, these residues were
with a full-length channel composed by the crystal structure of substituted by electrostatically neutral but same-sized residues
tetrameric Kir2.2 channels. Kir2.2 channels were selected (R ! Q). Furthermore, we also would have liked to test the effects
because they were the first full-length eukaryotic Kir channels of their substitution by Ala. Therefore, Kir2.1 mutants constructed
crystallized [22]. The docking analysis of propafenone within the and tested were: R228Q, R228A, R260Q, and R260A. Kir2.2 mutants
transmembrane and cytoplasmic domains of Kir2.2 revealed that studied were R229A and R229Q. Unfortunately, neither R261A nor
it bound more effectively to the cytoplasmic domain (Fig. 7A). R261Q were obtained because the primers folded in a 7 base-
There were four propafenone-binding pockets, located at the hairpin loop, which comprises the mutation. Finally, Kir2.3
region between two subunits and out of the ion-conduction mutants R220Q and R252Q were successfully constructed and
pathway (Fig. 7B). The docking results predicted that, due to its tested, while R220A and R252A mutants did not generate any
flexible structure, propafenone had two major predicted binding current even when they were expressed in the cell membrane (not
modes, both located in an overlapping region (Fig. 7 and Fig. 8). In shown). Nevertheless, all the mutant channels studied (Fig. 9C)
mode I (Fig. 7C), propafenone adopted a folded conformation in generated small currents that exhibited a tendency to rapidly
which its hydroxyl group formed hydrogen bonds with the rundown. Thus, experiments were performed at 140 mM [K+]o.
carbonyl oxygen atom of Q231 and with the guanidinium group Additionally, some mutants generated currents that weakly
of R229. There was also a hydrophobic interaction between rectified (Fig. 9B) or that did not rectify at all (Fig. 9A). All these
propafenone phenyl-ring and I270 and L271 side chains (Fig. 8A). features of the mutants underscore the importance of these
In mode II (Fig. 8B), the hydroxyl group of propafenone formed a residues in channel function. Fig. 9A and B demonstrates that
hydrogen bond with the amino group of D250 (Fig. 7D). propafenone-induced block, at voltages negative and positive to
Additionally, the positively charged alkylamino nitrogen made the EK, was significantly decreased in Kir2.3 R220Q and R252Q
a hydrogen bond with R261, which is located in the adjacent channels. Substitution of the equivalent residues in Kir2.1 channels
subunit. Therefore, the phenyl ring and the hydroxyl group act as significantly reduced propafenone-induced block (Fig. 9C). Finally,
molecular harpoons establishing a network of hydrophobic mutation of R229 in Kir2.2 channels also significantly decreased
interactions with I270 and L271 and a hydrogen bond with Q231, the blockade. Overall, these results suggested that these two Arg

148
 RESULTADOS
I. Amorós et al. / Biochemical Pharmacology 86 (2013) 267–278 275

Fig. 7. Molecular model of propafenone within Kir2.2 channels. Results of the blind docking study of propafenone within the full Kir2.2 channel (PDB ID code 3JYC). Ribbon
structure of each monomer of Kir2.2 is shown in green, orange, blue and red colors, with propafenone as purple sticks. Longitudinal view (A) and bird’s eye view (B) from the
cytoplasm of the images showing models of the lowest energy bindings of propafenone to Kir2.2. C and D, Predicted bonds between propafenone and some amino acids
located within the cytoplasmic domain. Images correspond to the first (Mode I: binding affinity = 6.7 kcal/mol) (C) and the second (Mode II: binding affinity = 6.5 kcal/
mol) (D) of 20 binding modes. Propafenone and residues implicated in the binding are rendered as sticks. Dashed black lines represent hydrogen bonds.

residues were important in determining the propafenone-induced plasma concentrations (1 mM) [16]. Therefore, it seems unlikely
blockade of Kir2.x channels. that atrial IK1 propafenone inhibitory effect participates in the
atrial antiarrhythmic effects of the drug, i.e., cardioversion of
4. Discussion recent onset AF (5 mM propafenone only inhibits atrial IK1 by
20%). Furthermore, since propafenone concentrations needed to
The present results demonstrated that propafenone at con- inhibit Kir2.1 channels, which probably underlie ventricular IK1,
centrations >1 mM inhibited IK1 generated by Kir2.x homo and are even higher, it seems reasonable to propose that Kir2.1
heterotetramers by means of a mechanism that, to the best of our blockade is not the main responsible for the propafenone
knowledge, has never been described before. Analysis of the ventricular proarrhythmic effects.
concentration dependence of the blockade demonstrated that the It has been proposed that simultaneous IK1 and INa blockade
order of potency was Kir2.3 > Kir2.2 > Kir2.1. Furthermore, would be the optimal combination for an antifibrillatory drug [27].
propafenone also inhibited human atrial IK1, the IC50 for this Our results demonstrated that propafenone’s potency for Kir2.x
effect being one order of magnitude higher than the therapeutic channels blockade is low and similar to that exhibited by

149
 RESULTADOS
276 I. Amorós et al. / Biochemical Pharmacology 86 (2013) 267–278

Fig. 8. Predicted binding modes and orientations of propafenone on the cytoplasmic domain of Kir2.2 channels. (A) First (Mode I) (binding affinity = 6.7 kcal/mol) and (B) second
(Mode II) (binding affinity = 6.5 kcal/mol) of the most favorable 20 binding modes of propafenone (in purple and blue) on two adjacent subunits of Kir2.2 (yellow and red).

amiodarone (IC50 = 10–20 mM) [28]. Conversely, IK1 is not inhib- As mentioned, propafenone-induced block showed an inverse
ited by quinidine, disopyramide, procainamide, and flecainide correlation to the strength of channel-PIP2 interaction. Moreover,
[2,29], which suggests that pharmacological sensitivity of cardiac propafenone exhibited a slow inhibition time course that was
inward rectifier channels to drugs, that otherwise block many independent of whether the drug was externally (whole-cell) or
voltage-dependent K+ channels, is low. Therefore, the finding of an internally (excised inside-out) applied. Therefore, the results
IK1 and INa inhibitor remains elusive. However, the importance of pointed to an interaction of propafenone with PIP2 in such a
the present results does not lie on their therapeutic application but way that it decreased PIP2 activating effects. In fact, there are
on the fact that they imply the description of a mechanism for ionic previous data suggesting that cationic highly lipophilic drugs such
channels blockade, which is unusual and unprecedented and that as tamoxifen, mefloquine and carvedilol decrease IKir2.x by binding
could give new clues for the development of an IK1 inhibitor. PIP2 thus preventing its interaction with Kir2.x channels [13–15].

A B
Membrane potential (mV) Membrane potential (mV)
0.4 1 IKir2.3 R252Q (nA)
IKir2.3 R220Q (nA)

-60 20 100
-1
-60 20 100
-0.2 -2

-0.4 -3
Kir2.3 R220Q Propa 50 µM Kir2.3 R252Q Propa 50 µM
Kir2.2 WT

Kir2.3 WT
Kir2.1WT

C
R228Q

R260Q

R229Q

R220Q
R252Q
R228A

R260A

R229A

0
**
IKir2.x blockade (%)

-10 ** **
-20 **
-30 **
-40 ** ** **
-50
-60
-70
-80

Kir2.1 Kir2.2 Kir2.3

Fig. 9. The presence of two Arg residues in the cytoplasmic domain is critical for the propafenone-induced block of Kir2.x channels. I–V curves for currents recorded in cells
expressing R220Q (A) and R252Q (B) Kir2.3 channels in the absence and presence of 50 mM propafenone. C, Percentage of propafenone-induced block on the current recorded
at 30 mV negative to EK in cells expressing WT or mutant Kir2.x channels. **P < 0.01 vs their respective WT. Each point/bar represents the mean  SEM of 5 experiments.

150
 RESULTADOS
I. Amorós et al. / Biochemical Pharmacology 86 (2013) 267–278 277

According to this hypothesis, propafenone shifted rightwards charges in the cytoplasmic pore are critical to enhance both K+
the concentration dependence of PIP2-increasing effects on permeation and rectification [32–35]. It has been extensively
Kir2.1 channels, and accelerated the time course of current demonstrated that the electrostatic negativity provided by
rundown in inside-out macropatches exposed to neomycin. residues E224, E299, D255, and D259 determines the binding of
More innovative were the results obtained when assessing polyamines to their low-affinity binding site, and thus, the
propafenone Kir2.1 blocking effects at the single channel level. extent of Kir2.1 inward rectification [22,30,31]. E224 and E299
As described, in the presence of propafenone sublevels of create a charged ring located at the top of the cytoplasmic pore,
conductance were apparent. Indeed, in the presence of propa- whereas the negatively charged ring created by D259 is located
fenone amplitude histograms showed peaks corresponding to below the former and that of D255 much farther below.
sublevels with mean amplitudes of 1/4, 1/2, and 3/4 of the Additionally, two overlapped positively charged rings composed
fully open level. Thus, the results suggested that propafenone of R228 and R260 are located between the E244-E299 and D259
decreased IKir2.x by an uncommon mechanism, i.e., by enhancing rings [30].
the appearance of low conductance channel states. Most channel Moreover, negative electrostatic potential at and around
blockers bind to the pore itself, which physically obstruct the ion residue E224 in the cytoplasmic pore is important to ensure a
flow and/or act by an allosteric mechanism stabilizing closed smooth and large conductance of Kir2.1 channels [33]. Indeed, it
conformational states of the pore so that opening is less likely has been demonstrated that neutralization of the negative
[11]. The fact that the propafenone-induced block was irrespec- charge at position 224 and/or increase in the number of positive
tive of the [K+]o was the first piece of evidence suggesting that the charges in this region of the cytoplasmic pore render channels
drug binding site was not located at the pore level. Moreover, it that display open-channel fluctuations and low conductance
has been described that reducing Kir2.1 channel interaction with [32,33,35]. Under these conditions, subconducting states
PIP2 by a variety of interventions renders channels that resulted from the collapse of the ion–ion interacting permeation
frequently visit subconductance levels [24]. Conversely, the caused by the lack of specific K+ coordination within the
progressive increase of PIP2-channel interaction exerts strong selectivity filter [36] and the channel, therefore, fluctuated
positive cooperativity in both converting the channels from the between a high conductance state (main open state with K+
unavailable to the available mode and in promoting the fully occupancy in the cytoplasmic pore) and a low conductance state
open state over sublevels [24]. (substate, no K+ occupancy). According to this hypothesis,
It has been proposed that polyamines act as cofactors in PIP2 incorporation of a positive charge at the level of the R228 and
activation of Kir2.1 channels [26]. Indeed, spermine is able to R260 rings provided by propafenone would decrease K+
stabilize the channels in an open configuration, enabling an concentration on the cytoplasmic pore, which in turn, would
apparent increase of channel-PIP 2 binding affinity [26]. Accord- not supply enough K+ ions to the transmembrane region avoiding
ing to this, we surmised that propafenone-induced block would the full coordination of K+ ions within the selectivity filter. This
be greater in channels in which polyamines affinity is decreased would explain the occurrence of subconductance levels in the
by substituting the negatively charged residues that determine presence of propafenone. Moreover, it also accounted for the fact
polyamine binding located either in the transmembrane or the that decreasing K+ efflux by decreasing [K+]i significantly
cytoplasmic pore. Indeed, our results demonstrated that increased the propafenone inhibition of outward current.
propafenone blockade was significantly higher in D172A, Furthermore, decrease of the negative electrostatic potential
E224A, E299A, and D255R channels than in WT. Therefore, all at and around residue E224 produced by propafenone binding
these results suggested that propafenone inhibited Kir2.x would decrease the polyamines concentration in the pore. This
currents by decreasing the PIP2 activating effects on inward would produce two effects simultaneously. First, it would
rectifier channels. decrease the strength of rectification [4]. Indeed, our results
However, some results pointed to alternative mechanisms demonstrated that in the presence of propafenone outward
that are not mutually exclusive. First, effects produced by Kir2.x currents were small and a linear function of voltage.
propafenone on L222I Kir2.1 and I213L Kir2.3 channels were Second, this would decrease the PIP2-channel affinity [26],
identical to those obtained in WT Kir2.1 and Kir2.3 channels, therefore explaining why maneuvers that decreased PIP2
respectively. It was counterintuitive that substitution of the availability or the degree of channel-PIP2 interaction increased
residue that differentiates Kir2.1 and Kir2.3 channels in terms of propafenone blocking potency.
their PIP2 channel affinity [4] did not modify propafenone block In conclusion, here we demonstrated that propafenone inhibits
in the expected direction. Second, and more importantly, the the current generated by the three human cardiac Kir2.x isoforms
results of the blind docking, thereafter confirmed by site- and their combinations by a novel mechanism not described until
directed mutagenesis analysis, suggested that the most practical now with any other drug. We propose that propafenone
propafenone binding site on Kir2.x channels was not located in incorporates into the cytoplasmic domain of the channel in such
the pore lumen but on the interface between subunits compris- a way that it decreases the net negative charge sensed by K+ ions
ing positively charged residues (R228 and R260 in Kir2.1 and polyamines which, in turn, promotes the appearance of
channels). Importantly, charge neutralization of R228 affects subconductance levels and the decrease of PIP2 affinity of the
channel PIP2 interaction a result that has been interpreted channels.
considering that R228 might form part of a ‘‘binding pocket’’ for
PIP2 [25]. Blind docking results imply that up to four positively Acknowledgements
charged propafenone molecules (propafenone is a base with a
pKa = 9 that at the physiological pH predominates in its cationic We thank Sandra Sacristán and Paloma Vaquero for her
form) could bind to the channel, thus decreasing the net negative invaluable technical assistance. This work was supported by
charge of the cytoplasmic pore. According to the structures of K+ Ministerio de Ciencia e Innovación [SAF2011-30088, and SAF2011-
channels [22,30], the cytoplasmic pore is outside the electrical 30112], Instituto de Salud Carlos III [Red HERACLES RD06/0009,
field. A negative electrostatic potential in this region is critical in and PI11/01030], Centro Nacional de Investigaciones Cardiovas-
accumulating both K+ and polyamines from the internal side, culares [CNIC-13, CNIC-08-2009], Comunidad Autónoma de
which subsequently facilitates their entry into the transmem- Madrid (S2012/BMD-2374), and Sociedad Española de Cardiologı́a
brane pore upon depolarization [22,30,31]. Therefore, negative grants.

151
 RESULTADOS
278 I. Amorós et al. / Biochemical Pharmacology 86 (2013) 267–278

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152
 RESULTADOS
SUPPLEMENTAL MATERIAL

Table S1. Patient characteristics.

Patients (n) 5

Mean age (years) 65±4

Male/Female (n) 4 (80%) / 1 (20%)
Cardiopathy
Valvular (n) 3 (60%)
Ischemic (n) 1 (20%)
Combined (n) 1 (20%)
Hypertension (n) 5 (100%)
Diabetes mellitus (n) 2 (40%)
Dyslipidemia (n) 3 (60%)
Ejection fraction (%) 58.8±1.1
NYHA functional class
I (n) 1 (20%)
II (n) 4 (80%)
III (n) 0 (0%)
IV (n) 0 (0%)
Creatinine (mg/dL) 0.9±0.2
Pulmonar systolic pressure (mm Hg) 46.3±5.6
Treatment
ACE inhibitors/ARBs (n) 4 (80%)
Statins (n) 3 (60%)
Acetylsalicylic acid (n) 3 (60%)
Beta blockers (n) 2 (40%)
Calcium antagonists (n) 0 (0%)

ACE, angiotensin converting enzyme; ARBs, angiotensin II type 1 receptor blockers; CABG,
coronary artery bypass grafting. NYHA: New York Heart Association.

153
IV. DISCUSIÓN
  
 DISCUSIÓN
En la presente Tesis Doctoral hemos estudiado los efectos de dos fármacos antiarrítmicos
del grupo Ic, flecainida y propafenona, sobre los canales Kir2.x que generan la corriente IK1
cardiaca humana. Asimismo, hemos estudiado los efectos de ambos fármacos sobre la IK1
generada en miocitos auriculares humanos. Los resultados han podido demostrar que ambos
fármacos a concentraciones equivalentes a las concentraciones plasmáticas tras la
administración de dosis terapéuticas aumentan la IK1 generada por homotetrámeros de canales
Kir2.1. Además la propafenona, pero no la flecainida, a concentraciones altas inhibe la
corriente generada por canales Kir2.x siendo de mas potentes para inhibir la corriente
generada por canales Kir2.3.

1. Efectos de la flecainida sobre canales Kir2.x

Los resultados demuestran que la flecainida aumenta la IKir2.1 fundamentalmente por

reducir el bloqueo del canal producido por las polimainas intracelulares disminuyendo la
afinidad de las mismas por su sitio de unión en el canal. Adicionalmente, la incubación
durante al menos 24 horas con flecainida es capaz de aumentar la densidad de canales Kir2.1
expresados en la membrana. Por el contrario, la flecainida no modifica la IKir2.2 ni la IKir2.3 ni
tampoco aumenta la expresión de canales Kir2.2 o Kir2.3 en la membrana. La selectividad de
los efectos de flecainida sobre canales Kir2.1 se debe a la presencia de un residuo Cys311 en
el dominio citoplasmático, que en los canales Kir2.2 y Kir2.3 es una Ala.

1.1. La flecainida aumenta la IKir2.1 pero no la IKir2.2 o la IKir2.3

La flecainida aumenta la IKir2.1 generada por canales tetraméricos Kir2.1. La presencia de

subunidades Kir2.2 o Kir2.3 en los canales hace que la flecainida sea incapaz de aumentar la
corriente. Por tanto la flecainida aumentará la IK1 nativa en los miocitos de aquellas especies
en los que la corriente es generada por homotetrámeros de canales Kir2.1. Nuestros resultados
demuestran que la flecainida aumenta la IK1 registrada en miocitos ventriculares de cobayo
mientras que no modifica la IK1 auricular de cobayo, ni la registrada en miocitos auriculares
humanos. Estos datos sugieren que en cobayo la IK1 auricular es generad por heterotetrámeros
de canales Kir2.x mientras que en los miocitos ventriculares por homotetrameros Kir2.1.
Diversos datos electrofisiológicos y moleculares sugieren que los canales Kir2.3 son muy
abundantes en la aurícula humana (Gaborit y cols., 2007). Por desgracia, por limitaciones
éticas no hemos podido disponer de preparaciones ventriculares humanas y no hemos podido
corroborar nuestros datos. Sin embargo, los datos moleculares sugieren que los canales Kir2.1

157
 DISCUSIÓN
son críticos para generar la IK1 en el ventrículo humano, al igual que en el cobayo. Si esto
fuera así, la flecainida, a concentraciones plasmáticas terapéuticas aumentaría la IK1. Las
implicaciones arritmogénicas que tiene este resultado se discutirán más adelante.
Dada una concentración, la flecainida aumenta más la IKir2.1 generada a potenciales
positivos al EK que la generada a potenciales negativos del EK. Es decir, aumenta más la
conductancia de la IKir2.1 a los potenciales relevantes desde el punto de vista fisiológico.
Nuestros resultados demuestran que la flecainida reduce la intensidad de la rectificación de la
corriente. La rectificación de la IKir2.x (disminución de la conductancia a potenciales positivos
al EK) se debe, fundamentalmente, al bloqueo voltaje-dependiente del canal por parte de las
poliaminas intracelulares, cargadas positivamente, que con la despolarización, son repelidas
del citoplasma penetrando por el poro del canal. Los resultados demuestran que la flecainida
disminuye la afinidad del canal por las poliaminas de forma concentración-dependiente. Más
aún, los resultados sugieren que se trata de un mecanismo no competitivo, puesto que en
presencia de flecainida el efecto máximo producido por la máxima concentración de
poliaminas no supera el 82%. Este dato implica que la flecainida no compite con las
poliaminas por su sitio de unión en el poro del canal, sino que la unión de flecainida a su
propio sito receptor reduce alostéricamente la afinidad de las poliaminas por sus sitios de
unión.
Es sabido que la unión transitoria de las poliaminas a los residuos citoplásmicos Glu224,
Asp259, y Glu299 citoplásmico contribuye a la fijación de las poliaminas a su sitio en el poro
citoplásmico acelerando el bloqueo (Lu, 2004; Pegan y cols., 2005). Por tanto comprobamos
si la mutación de estos residuos disminuía el aumento de la corriente de salida por parte de
flecainida. Los resultados confirmaron que la flecainida no modifica la IKir2.1 generada por los
canales E224A, D259A, y E299A, que, por otra parte, y como era de esperar, no rectifica a
potenciales positivos. La hipótesis es que la unión de la flecainida a la lámina βI modifica la
posición de los anillos de cargas negativas formados por los aminoácidos ácidos del poro
citoplasmático antes mencionados de modo que disminuye la afinidad de las poliaminas por
estos sitios de unión transitoria (Lu, 2004; Bichet y cols., 2003). Estos resultados son la
primera demostración de que un fármaco, utilizado en la terapéutica es capaz de afectar los
canales Kir2.1 cardiacos humanos modulando su interacción con las poliaminas.
Nuestros resultados demuestran que la Cys311 localizada en la lámina βI en el dominio
citoplasmático C-terminal del canal Kir2.1 determina la unión de la flecainida. De hecho, la
ausencia de efectos de la flecainida en canales Kir2.2 y Kir2.3 se explica porque estos canales
presentan en la posición equivalente (en una región altamente conservada) un residuo Ala.
Las láminas βI y βH forman el denominado lazo HI o lazo G (residuos 300-315) (Pegan y

158
 DISCUSIÓN
cols., 2005). Las mutaciones en esta región alteran los mecanismos de apertura y cierre de los
canales Kir2.1 (gating) así como la rectificación (Pegan y cols., 2005). Por tanto, parece
razonable proponer que la unión de la flecainida a esta región produzca los efectos observados.
Además el lazo HI es estructuralmente diferente pero está acoplado funcionalmente al sitio de
unión del PIP2. (Garneau y cols., 2003; Pegan y cols., 2005; Logothetis y cols., 2007). De
hecho, el residuo adyacente a la Cys311, la Arg312 (posición en los canales Kir2.1) modula la
interacción canal-PIP2 (Bichet y cols., 2003; Logothetis y cols., 2007). Más aún, se ha
demostrado previamente que la sustitución de la Cys311 por residuos polares modifica las
propiedades cinéticas de los canales Kir2.1 favoreciendo la aparición de intervalos de larga
duración en los que el canal permanece cerrado lo que disminuye la Po. Estos efectos fueron
atribuidos a una desestabilización de la interacción PIP2-canal (Garneau y cols., 2003). Por
consiguiente, sospechamos que la interacción de la flecainida con la Cys311 podría aumentar
los efectos activadores del canal del PIP2. Nuestros resultados demostraron que la flecainida
aumenta la Po del canal desplazando la curva Po-V hacia potenciales más negativos. Más aún,
la flecainida no modificó la amplitud de la corriente unitaria, o la conductancia del canal, pero
aumentó el tiempo medio de apertura y la fo. Todos estos efectos son idénticos a los
producidos por el PIP2 (Logothetis y cols., 2007). Por último, significar que la mutación
L222I, que da lugar a canales Kir2.1 funcionales pero con una menor afinidad por el PIP2
suprime el aumento de la corriente a potenciales negativos sin modificar el aumento que
produce la flecainida a potenciales positivos del EK.

1.2. La flecainida aumenta la densidad de canales Kir2.1 en la membrana.

La incubación de las células transfectadas durante 24 h con flecainida (1 µM) aumenta la

densidad de canales Kir2.1 en la membrana. Este efecto también depende de la presencia de la
Cys311. Si tras la incubación con flecainida ésta se añade de forma aguda, también se observa
el aumento de la IKir2.1. Es decir, que ambos efectos se suman. Por tanto, la flecainida
aumentará la IK1 generada por homotetrámeros de canales Kir2.1 por dos mecanismos
simultáneamente. Para comprobar si la flecainida aumenta la corriente generada por canales
Kir2.1 con mutaciones responsables de la aparición del SAT, estudiamos sus efectos sobre
canales R67W y R218W. Como era de esperar, la perfusión con flecainida no aumenta la
corriente generada por estos canales que es extremadamente pequeña puesto que ambos
carecen de afinidad por el PIP2. Sin embargo la incubación con flecainida durante 24 de
células transfectadas aumenta la densidad de canales R67W, pero no la de R218W. También
comprobamos que la incubación con flecainida aumenta la densidad de canales L222I. Estos

159
 DISCUSIÓN
resultados preliminares sugieren que en pacientes del SAT portadores de mutaciones que
generan canales funcionales la flecainida aumentaría la densidad en la membrana tanto de los
canales nativos (codificados por el alelo sano) como los mutados. Es decir, que la flecainida
produce un “rescate farmacológico” de ciertas mutaciones responsables del SAT.
Existen evidencias previas que demuestran que la densidad en la membrana de algunos
canales puede ser modulada farmacológicamente. De hecho, se ha descrito que la incubación
con cloroquina o con pentamidina aumenta y disminuye la densidad de canales Kir2.1,
respectivamente (de Boer y cols., 2010). Serán necesarios estudios complementarios para
identificar si el aumento de la densidad de canales Kir2.1 en la membrana se debe a que ésta
aumenta el tráfico anterógrado o, por el contrario, disminuye la endocitosis de la proteína del
canal desde la membrana.

2. Implicaciones terapéuticas.

La flecainida es un potente bloqueante de los canales de Na+ que también bloquea

diversos canales de K+. Como se ha mencionado en la introducción la flecainida inhibe las
corrientes Ito e IKr a concentraciones similares a las necesarias para inhibir la INa (Wang y cols.,
1995; Follmer y cols., 1990). La flecainida prolonga de forma dependiente de la frecuencia la
DPA y el periodo refractario del tejido auricular humano sin apenas modificar la DPA del
tejido ventricular (la flecainida apenas modifica el QT) (Wang y cols., 1990; Katritsis y cols.,
1995). El aumento selectivo de la IK1 ventricular (generada por homotetrámeros de canales
Kir2.1) puede explicar la diferencia de efectos de flecainida sobre la DPA auricular y
ventricular. Dado que la IK1 determina de forma crítica la fase final de repolarización (fase 3)
se puede anticipar que el aumento de la IK1 ventricular contrarrestará la prolongación de la
DPA producido por el bloqueo de canales de K+ dependientes de voltaje. Por el contrario, en
el tejido auricular en el cual la flecainida no aumenta la IK1 (generada por heterotetrámeros de
Kir2.x), la prolongación de la DPA producida por el bloqueo de canales de K+ se hará
evidente.
Por otra parte el aumento de la IK1 ventricular podría participar en los efectos
proarrítmicos ventriculares de la flecainida. Como se ha mencionado en la introducción
diversos estudios han demostrado la importancia de la IK1 en el mantenimiento y la estabilidad
de los rotores y en la dinámica de la fibrilación ventricular. La predicción es que el aumento
de la IK1 acelera y estabiliza la reentrada de los frentes espirales.

160
 DISCUSIÓN
3. Efectos de la propafenona sobre canales Kir2.x

Los resultados de la presente Tesis Doctoral demuestran que la propafenona, a

concentraciones >1 µM, inhibe la IK1 generada por homo- y heterotetrámeros de canales
Kir2.x mediante un mecanismo, que hasta donde sabemos, no ha sido descrito previamente
con ningún otro fármaco. El análisis de la dependencia de dosis de los efectos demuestran que
la potencia de bloqueo tiene el orden: Kir2.3>Kir2.2>Kir2.1. Más aún, la propafenona
también inhibe la IK1 registrada en miocitos auriculares humanos, siendo la CI50 de este efecto
un orden de magnitud mayor que las concentraciones plasmáticas alcanzadas tras la
administración de dosis terapéuticas (1 µM) (Bryson y cols., 1993). Por tanto parece
improbable que la inhibición de la IK1 auricular participe en los efectos antiarrítmicos de la
propafenona, esto es en la cardioversión de la fibrilación de reciente comienzo (Propafenona 5
µM sólo inhibe la IK1 en un 20%). Por otra parte, dado que las concentraciones de
propafenona necesarias para inhibir la corriente generada por homotetrámeros de Kir2.1, que
probablemente generan la IK1, ventricular son incluso mayores, parece razonable afirmar que
el bloqueo de canales Kir2.1 no es responsable de los efectos proarrítmicos ventriculares de la
propafenona.
Se ha propuesto que la inhibición simultanea de la IK1 y la INa sería la combinación óptima
para un fármaco con propiedades antifibrilatorias (Pandit y Jalife, 2013). Nuestros resultados
demuestran que la potencia de la propafenona para bloquear canales Kir2.x es baja, y similar a
la exhibida por amiodarona (CI50 = 10-20 µM) (Sato y cols., 1994). La quinidina, la
disopiramida, y la flecainida, por el contrario no inhiben la IK1 (Iost y cols., 2003). Estos
resultados sugieren que la sensibilidad de los canales Kir2.x a los fármacos que bloquean
canales de K+ dependientes de voltaje es baja. Por tanto, parece difícil, de momento,
identificar un fármacos que inhiba a concentraciones terapéuticas tanto la INa como la IK1
auricular.
El bloqueo de canales Kir2.x muestra una correlación inversa con al afinidad del canal por
el PIP2 (a mayor afinidad menor sensibilidad a la propafenona). El curso temporal de
aparición del bloqueo producido por la propafenona es muy lento y es independiente de si el
fármaco se aplica por la cara intracelular (en parches escindidos inside-out) o extracelular (en
la configuración de célula entera) de la membrana. Estos resultados apuntaban a que la
propafenona modulaba la interacción del PIP2 con el canal disminuyendo sus efectos
activadores. De hecho, existen datos previos que demuestran que otros fármacos catiónicos
altamente liposolubles como el tamoxifeno, la mefloquina, y el carvedilol disminuyen la IKir2.x
uniéndose al PIP2 e impidiendo su interacción con el con los canales Kir2.x (Ferrer y cols.,

161
 DISCUSIÓN
2011; López-Izquierdo, 2011; Ponce-Balbuena, 2009). Algunos de los datos experimentales
reforzarían esta hipótesis. En primer lugar, la propafenona desplaza hacia la derecha la curva
de concentración-respuesta de los efectos activadores del PIP2 y, en segundo lugar, acelera el
curso temporal de la disminución de la corriente producida por neomicina en parches
escindidos. La neomicina (un compuesto policatiónico) interacciona con el PIP2
(polianiónico) de manera que “secuestra” el PIP2 impidiendo su interacción con el canal. La
aplicación de neomicina en parches escindidos en su cara intracelular produce una
disminución gradual de la corriente Kir2.1 hasta abolirse. Por tanto, cuanto más intensa sea la
interacción del PIP2 con el canal más tiempo tarda la neomicina en reducir la corriente IKir2.1
al 50% de su valor inicial (τ50) (Xie y cols., 2008). En condiciones control la τ50 era de unos 5
min, mientras que en presencia de propafenona la τ50 disminuía hasta aproximadamente 1 min.
Este resultado sugería que la propafenona disminuía la afinidad del canal por el PIP2.
Los resultados demostraron que en presencia de propafenona aparecen subniveles de
conductancia. Este dato indica que el fármaco está cambiando de forma radical la
conductancia del canal por un mecanismo que no había sido descrito con anterioridad con
ningún fármaco estudiado. Efectivamente, en presencia de propafenona los histogramas de
amplitud mostraban picos correspondientes a subniveles con amplitudes de ≈¼, ≈½, ≈¾ de la
conductancia del estado completamente abierto. De estos resultados se deduce que la
propafenone disminuye la IKir2.x por un mecanismo único: induciendo la aparición de estados
de baja conductancia.
La mayor parte de los bloqueantes de canales se unen en algún punto del poro hidrófilo
impidiendo el flujo iónico a su través. En otras ocasiones la unión del fármaco induce por un
mecanismo alostérico la estabilización de algún estado cerrado de manera que disminuye la
probabilidad de apertura del poro. En otras ocasiones se combinan ambos mecanismos
(Tamargo y cols., 2004). El hecho de que el bloqueo producido por propafenona fuera
independiente de la intensidad del flujo de K+ a través del poro (que fue variada cambiando la
[K]o), fue el primer resultado que sugería que el sitio de unión del fármaco no estaba
localizado en el poro del canal. Más aún, se ha descrito previamente que la disminución de la
interacción con el PIP2 de lugar a canales que visitan con frecuencia niveles subconductores
(Xie y cols., 2008). Por el contrario, el aumento progresivo de la concentración de PIP2
produce “cooperatividad positiva” favoreciendo la aparición del estado de máxima
conductancia frente a los estados subconductores (Xie y cols., 2008).
Se ha propuesto que las poliaminas actúan como cofactores positivos de la unión del PIP2
a los canales Kir2.1 (Xie y cols., 2005). De hecho, la espermina (la poliamina más potente) es
capaz de estabilizar los canales Kir2.1 en un estado abierto permitiendo un aumento aparente

162
 DISCUSIÓN
de la afinidad del canal por el PIP2 (Xie y cols., 2005). De acuerdo con esta hipótesis, el
bloqueo de la propafenona debía ser mayor en aquellos canales con poca afinidad por las
poliaminas, es decir, en aquellos canales en los que se han mutado los residuos cargados
negativamente localizados en el poro citoplasmático o transmembrana (D172) con los que
interaccionan las poliaminas. En efecto, los resultados demostraron que el bloqueo producido
por la propafenona era significativamente mayor en canales D172A, E224A, E299A, y
D255R que en canales Kir2.1 nativos. Por todo lo mencionado anteriormente se podría
concluir que el mecanismo por el cual la propafenona inhibía la IKir2.x era disminuyendo la
afinidad de los canales Kir2.x por su activador endógeno, el PIP2.
Sin embargo, había otros datos que sugerían que la anterior propuesta podría ser una
versión algo reduccionista de los hechos experimentales y sugerían la existencia de
mecanismos alternativos que no tenían por qué ser mutuamente excluyentes.
En primer lugar, los efectos de la propafenone en canales L222I Kir2.1 y I213L Kir2.3
eran idénticos a los producidos en los canales nativos Kir2.1 y Kir2.3, respectivamente.
Parece contradecir lo esperado que la sustitución del residuo responsable de la diferencia de
afinidad por el PIP2 de canales Kir2.1 y Kir2.3 (Hibino y cols., 2010) no tuviera un efecto en
la dirección esperada en cuanto a modificación del bloqueo. En segundo lugar, y más
importante, los experimentos de “docking ciego” sugerían la existencia de un sitio de unión
para la propafenona situado en la interfaz entre subunidades contiguas. Es decir, que habría 4
sitios de unión para propafenona por canal, sitios que fueron confirmados mediante
experimentos de mutagénesis dirigida. Los sitios de unión no estaban localizados en la luz del
poro y estaban determinados de forma crítica por dos aminoácidos cargados positivamente
(R228 y R260 en la secuencia de Kir2.1). Estos sitios estaban, por supuesto, conservados en
canales Kir2.2 y Kir2.3. Es importante reseñar que se había descrito previamente que la
neutralización de la carga R228 disminuye la afinidad del canal Kir2.1 por el PIP2, por lo que
se consideró que dicho residuo formaba parte del “bolsillo de unión del PIP2” (Lopes y cols.,
2002). Datos estructurales recientes y nuestros propios resultados, apuntan a que el
mecanismo por el cual la desaparición de la carga positiva disminuye la afinidad por el PIP2
no es porque el PIP2 se una directamente a dicho residuo (ver más adelante).
Los resultados de “docking ciego” sugieren que al canal se pueden unir hasta cuatro
moléculas de propafenona en su forma catiónica (la propafenona es una base débil con un
pKa=9, que a pH fisiológico predomina en su forma catiónica) por lo que con su unión
disminuyen la “carga neta negativa” del dominio citoplasmático del canal (Figura 37). De
acuerdo con lo descrito mediante difracción con rayos X (Pegan y cols., 2005; Tao y cols.,
2009) el poro citoplasmático está fuera del campo eléctrico transmembrana. Por tanto, una

163
 DISCUSIÓN
carga neta negativa en esta parte de la proteína es crítica para acumular tanto el K+ como las
poliaminas. Esta acumulación en la cara intracelular facilita su entrada en el poro
transmembrana con la despolarización (Pegan y cols., 2005; Kurata y cols., 2007; Tao y cols.,
2009). Por tanto, la presencia de cargas negativas en el poro citoplasmático es necesaria para
mantener la conductancia y la rectificación (Xie y cols., 2002; Yeh y cols., 2005; Fujiwara y
Kubo, 2006; Chang y cols., 2007). Se ha demostrado ampliamente que la carga negativa
proporcionada por los residuos E224, E299, D255 y D259 determina la unión de las
poliaminas a sus sitios de baja afinidad, y, por tanto, el grado de rectificación (Pegan y cols.,
2005; Kurata y cols., 2007; Tao y cols., 2009). Los residuos E224 y E299, de las cuatro
subunidades (8 residuos en total), forman un anillo de carga negativa localizado en la parte
alta del poro citoplasmático, mientras que el anillo creado por los residuos D259 queda por
debajo del formado por los residuos D255. A la vez, dos anillos superpuestos de cargas
positivas formados por los residuos R228 y R260 quedan en una posición intermedia entre los
anillos formados por E224-E229 y D259 (Pegan y cols., 2005). Más aún, el potencial
electrostático negativo alrededor del residuo E224 en el poro citoplasmático es indispensable
para garantizar una conductancia continua y alta de los canales Kir2.1 (Fujiwara y cols., 2006).
De hecho, se ha demostrado que la neutralización de la carga en la posición 224 y/o el
aumento del número de cargas positivas en esta región, da lugar a canales que presentan baja
conductancia y fluctuaciones en el estado abierto (Yeh y cols., 2005; Fujiwara y cols., 2006;
Chang y cols., 2007). En estas condiciones, los subestados de conductancia aparecen como
consecuencia del colapso de las interacciones ion-ion y consecuencia, a su vez, de la falta de
coordinación de iones K+ en el filtro de selectividad (Lu y cols., 2001). Al no estar saturados
todos los sitios de coordinación con el K+ en el filtro de selectividad el canal fluctúa entre un
estado de alta conductancia, cuando el filtro está ocupado, y otro de baja conductancia
(subestado), cuando en el filtro no todos los sitios están ocupados por el K+ (Lu y cols., 2001).
De acuerdo con este modelo, la incorporación de moléculas de propafenona cargadas
positivamente a la altura de los anillos formados por R228 y R260, disminuirá la
concentración de K+ en el poro, lo cual, por su parte, hará que el aporte de K+ hacia el poro
transmembrana disminuya, evitando la completa coordinación de iones K+ con el filtro de
selectividad. Esto, explicaría la aparición de subestados de conductancia observados en
presencia de propafenona. Más aún, también explicaría el aumento de bloqueo observado al
disminuir la salida de K+ a través del canal producido disminuyendo la [K+]i.

164
 DISCUSIÓN

Figura 37. Representación esquemática del mecanismo propuesto para bloqueo de los canales Kir2.x por
propafenona. Se observa como la presencia de la propafenona cerca del poro citoplasmático disminuye la
concentración de iones K+ y poliaminas en el poro, y la afinidad del canal por el PIP2. SF: Filtro de selectividad.
PA+: poliamina. Pr+: propafenona. [Adaptada de Amorós y cols., 2013]

La disminución del potencial electrostático negativo en, y alrededor del residuo E224,
producido por la unión de propafenona también disminuiría la concentración de poliaminas en
el poro. Esto daría lugar a dos efectos simultáneamente (Figura 37). En primer lugar,
disminuirá la intensidad de la rectificación (Hibino y cols., 2010), explicando por qué en
presencia de propafenona la corriente de salida a potenciales de membrana positivos la EK es
pequeña y prácticamente una función lineal del voltaje. Es decir, en presencia de propafenona
el canal no rectifica. En segundo lugar, disminuiría la afinidad del canal por el PIP2, lo que
explicaría por qué las maniobras experimentales que disminuyen la biodisponibilidad del PIP2
o el grado de interacción PIP2-canal aumentaban la potencia de bloqueo de la propafenona.

4. Conclusiones.

En la presente Tesis Doctoral hemos estudiado los efectos de flecainida y propafenona,

dos antiarrítmicos del grupo Ic, sobre los canales Kir2.x que generan la corriente IK1 humana.
Los resultados demuestran que la flecainida, a concentraciones terapéuticas, aumenta la
corriente ventricular sin modificar la auricular lo cual podría contribuir a sus efectos
proarrítmicos. La selectividad de los efectos de la flecainida se debe a que se une a un residuo
(Cys311) sólo presente en los canales Kir2.1 (ventriculares) pero no en los Kir2.2 o Kir2.3.
La unión de la flecainida disminuye la rectificación de la corriente aumentando la salida de K+.
La propafenona por su parte, bloquea a concentraciones supra-terapéuticas los canales
Kir2.x siendo más potente para bloquear los Kir2.3 (auriculares) que los Kir2.1 (auriculares).
La propafenona se incorpora a sitios específicos de unión en el poro citoplasmático
disminuyendo la carga neta negativa percibida por los iones K+ y las poliaminas lo cual
promueve la aparición de estados subconductores y disminuye la afinidad del canal por el
PIP2.

165
 DISCUSIÓN
El mecanismo responsable del aumento y el bloqueo producido por la flecainida y la
propafenona, respectivamente, es inédito, lo que le da un gran valor conceptual y permitirá
avanzar en el conocimiento de la farmacología de los canales Kir2.x, conocimiento que hasta
la fecha está en un estado de desarrollo muy incipiente.

166
V. CONCLUSIONES
  
 CONCLUSIONES

En la presente Tesis Doctoral hemos analizado los efectos de la flecainida y la

propafenona sobre los canales Kir2.1, Kir2.2 y Kir2.3 expresados en células CHO y sobre la
corriente nativa IK1 registrada en miocitos auriculares humanos y en miocitos ventriculares de
cobayo. Además hemos realizado modelados moleculares para predecir los sitios de unión
más probables de éstos fármacos a la familia de canales Kir2.x, y comprobado la implicación
de los mismos en los efectos observados mediante mutagénesis dirigidas. De los resultados
obtenidos se pueden extraer las siguientes conclusiones:

1) La flecainida, un fármaco antiarrítmico del grupo Ic, a concentraciones plasmáticas

terapéuticas, aumenta la IK1 generada por homotetrámeros de canales Kir2.1 pero no modifica
la generada por homo o heterotetrámeros en los que participan los canales Kir2.2 y Kir2.3. En
consecuencia, la flecainida no modifica la IK1 auricular pero sí aumenta la IK1 ventricular en el
corazón de cobayo. Más aún, la flecainida tampoco modifica la IK1 auricular humana.

2) El aumento de la corriente IKir2.1 se produce como consecuencia de la unión de la

flecainida mediante puente de hidrógeno a la Cys311 localizada en la banda βI del dominio
citoplasmático del canal.

3) La unión de la flecainida a su sitio receptor disminuye de forma alostérica la afinidad

del canal por las poliaminas intracelulares, lo que disminuye la rectificación interna de la
corriente, aumentando la salida de K+ a potenciales positivos al EK.

4) La unión de la flecainida aumenta la afinidad del canal por el PIP2 con lo que aumenta
la Po del canal a todos los potenciales de membrana.

5) La unión de la flecainida al residuo Cys311 aumenta la expresión de canales Kir2.1

nativos y mutados en la membrana citoplasmática lo que aumenta la densidad de la corriente
generada en el caso de que éstos sean funcionales.

6) La propafenona, un fármaco antiarrítmico del grupo Ic, a concentraciones supra-

terapéuticas inhibe la IK1 generada por homo- y heterotetrámeros de canales Kir2.x, siendo los
canales más sensibles los Kir2.3, seguidos de los Kir2.2, y por último los Kir2.1. La
sensibilidad de la IK1 auricular humana es muy similar a la de la IKir2.3, lo que confirma el
importante papel de los canales Kir2.3 en esta corriente cardiaca.

169
 CONCLUSIONES

7) La unión de la propafenona a los canales Kir2.x disminuye su afinidad por el PIP2. Este
efecto justifica que cuanto menor es la afinidad del canal Kir2.x por el PIP2 mayor sea su
sensibilidad a la propafenona.

8) La propafenona disminuye también la afinidad del canal por las poliaminas

intracelulares lo que hace desaparecer la rectificación interna de la corriente.

9) La propafenona se une a las Arg228 y Arg260 (en canales Kir2.1) disminuyendo la

carga neta negativa del poro citoplasmático. Esto, a su vez, disminuye la concentración de K+
y poliaminas en el poro conductor.

10) La disminución de la concentración de K+ provoca el colapso de las interacciones ion-

ion, impidiendo la coordinación del K+ con el filtro de selectividad lo que, a su vez, da lugar a
la aparición de estados subconductores.

11) La disminución de la concentración de poliaminas a nivel del poro conductor, abole la

rectificación interna y disminuye la afinidad del canal por el PIP2.

170
Bibliografía
  
 BIBLIOGRAFÍA

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