Guia Micro I
Guia Micro I
Guia Micro I
MANUAL DE PRACTICAS
DEL LABORATORIO DE
MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS I
INTRODUCCIÓN
También deberá tomar las precauciones necesarias para evitar lesiones con material cortante o
punzante (trozos de vidrio, bisturí, agujas, etc.), quemaduras con objetos calientes o por la
exposición a la llama de mecheros y vapor de agua, así como a la acción de agentes químicos
tóxicos y corrosivos.
1. Será obligatorio llevar puesto un delantal largo de algodón, que deberá estar limpio, sin roturas y
correctamente abrochado. Igualmente, es obligatorio el uso de un gorro o paño que cubra
completamente el cabello.
2. Se prohíbe ingerir y/o almacenar cualquier tipo de alimento o bebida dentro del laboratorio.
3. Se prohíbe fumar y aplicarse cosméticos en el laboratorio.
4. Se deberá lavar meticulosamente las manos con agua y jabón antes de retirarse del laboratorio.
5. Es recomendable mantener las uñas limpias, cortas y sin pintar.
6. No deben substraerse cultivos de microorganismos del laboratorio.
7. Las personas con un elevado grado de sensibilidad debido a alergias, convalecencia, embarazo,
etc., deberán ponerlo en conocimiento del profesor a fin de adoptar una protección especial.
PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO
1. Al ingresar no toque o cambie de ubicación el material dispuesto en los mesones. Espere las
instrucciones del profesor o ayudante.
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2. Siempre trabaje en las proximidades de un mechero encendido, pero mantenga los productos
inflamables (etanol, isopropanol, xilol, etc), cuadernos y equipos de laboratorio a una distancia
prudente de éste. Los mecheros se deberán apagar en cuanto dejen de utilizarse y deberá
asegurarse que las llaves de paso queden bien cerradas.
3. Esterilice siempre a la llama del mechero el “asa de cultivo” y “rastrillos de vidrio”, antes y
después de usar. Las asas de cultivo se esterizan calentándolas a la llama del mechero hasta que
se pongan al rojo vivo. Los rastrillos de vidrio se sumergen en una solución de etanol al 70% y
luego se flamean a la llama del mechero.
4. No pipetear con la boca ningún tipo de cultivo microbiano, sin antes comprobar que las pipetas
están provistas de un tapón de algodón hidrófobo.
5. Los tubos que contengan medios de cultivo o cultivo de microorganismos, nunca deben abrirse
en posición vertical, sino lo más horizontalmente posible; es decir, inclinados, pero evitando
derramar su contenido. Al quitarles la tapa se mantendrán inclinados con una mano y se abrirán
con la otra, que sostendrá a su vez el asa o la pipeta y la tapa. Una vez abierto, se flamea por
algunos segundos la boca del tubo, repitiendo dicha operación una vez realizada la siembra (la
tapa nunca debe dejarse sobre el mesón).
6. Cuando manipule microorganismos evite hablar sin necesidad o llevarse las manos a la boca,
nariz, ojos, etc. Los lápices y rotuladores o cualquier otro material no beberán entrar nuca en
contacto con la boca.
7. Los medios inoculados o sembrados que se coloquen en las estufas de incubación deberán ir
adecuadamente rotulados, indicando: grupo, número de mesón, nombre del alumno, fecha y
procedencia o naturaleza de la muestra.
8. El orden y la limpieza son esenciales en todas las experiencias de laboratorio. En consecuencia,
al terminar cada práctica se procederá a limpiar cuidadosamente su lugar de trabajo. Cada grupo
de prácticas será responsable de su zona de trabajo y del material proporcionado.
9. Todo el material usado (tubos de cultivo, pipetas, placas de Petri, porta-objetos, hojas de bisturí,
etc.) se debe considerar contaminado. Por este motivo, deberán colocarse en los contenedores
adecuados al finalizar la práctica para proceder a su esterilización antes de ser desechados o
lavados. Nunca los deje tirados sobre los mesones.
10. Se deberá dar cuenta inmediatamente al profesor o ayudante de cualquier accidente tal como
quemaduras, cortes y/o derrame de cultivos.
11. En el caso de derrames de cultivos o rotura de recipientes con cultivos activos, deberá conservar
la calma y además informar al profesor o ayudante. El procedimiento a seguir es el siguiente: (i)
coloque papel absorbente sobre el material derramado para evitar su dispersión, (ii) ponga
abundante solución desinfectante sobre el papel, (iii) deje transcurrir al menos 15 minutos, retire
el papel (usando guantes) y deposítelo en el receptáculo destinado a la eliminación de material
contaminado, y (iv) vuelva a desinfectar la zona.
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MANIPULE CON CUIDADO EL MATERIAL DE LABORATORIO
1. No someta a calentamiento excesivo el material de vidrio, con ello evitará trizaduras o roturas de
los mismos.
2. Todos los instrumentos o equipos, especialmente los aparatos delicados como lupas y
microscopios, deben manipularse con cuidado evitando los golpes o el forzar sus mecanismos.
Siempre deberá dejar limpios todos los equipos utilizados, las lentes de los objetivos deberán
limpiarse sólo con los líquidos y material suministrados. Informe cualquier irregularidad en el
funcionamiento de los equipos.
3. Evite exponerse en forma directa al aire caliente del horno Pasteur, al vapor a presión del
autoclave y a la llama del mechero Bunsen o de alta caloría.
4. Manipule con extremo cuidado los reactivos inflamables (xilol, etanol, isopropanol, etc.) y los
ácidos o bases fuertes (HCl y NaOH).
ACTIVIDADES:
1. Se discutirán las principales normas de seguridad y obligaciones que deberán tener en cuenta
durante su permanencia y trabajo en el Laboratorio de Microbiología.
2. Se mostrarán los diferentes equipos, aparatos y materiales que se utilizarán en las sesiones
prácticas, destacando su funcionalidad y la forma apropiada de uso.
3. Se demostrará la forma apropiada de manipular cultivos microbianos contenidos en tubos y
placas de Petri.
4. Se discutirán los principales riesgos (biológicos, físicos y químicos) a que están expuestos sino
siguen las Normas Generales del Laboratorio de Microbiología, destacándose la forma correcta
de proceder en caso de accidentes comunes.
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PRÁCTICA Nº 2
MÉTODOS DE ESTERILIZACIÓN
(ANTISÉPTICOS Y DESINFECTANTES)
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INTRODUCCIÓN
Los procesos de esterilización y/o desinfección son diariamente llevados a cabo, no solamente en el
LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA, donde son fundamentales para evitar la contaminación
de medios de cultivos, placas, utensilios, etc., sino también en otros ámbitos tales como la
INDUSTRIA DE ALIMENTOS, donde fallas en estos procedimientos puede acarrear la
disminución de la vida útil de los alimentos debido a cambios organolépticos ocasionadas por el
desarrollo de microorganismos alterantes (sacarolíticos, pectinolíticos, proteolíticos, lipolíticos,
etc); o bien, provocar toxi-infecciones alimentarias por la presencia y/o desarrollo de
microorganismos patógenos.
DEFINICIÓN DE TÉRMINOS
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5.- Antiséptico: Es un agente químico que impide el crecimiento o la acción de los
microorganismos, ya sea destruyéndolos o inhibiendo su crecimiento y actividad. Por ser menos
tóxicos se pueden aplicar sobre tejidos vivos (piel y mucosas).
6.- Limpieza: Es el proceso de remover, por medios mecánicos y/o físicos, el polvo, la materia
orgánica y otros contaminantes de las superficies, equipos, materiales, personal, etc. Las
soluciones limpiadoras generalmente contienen agentes alcalinos o ácidos, con o sin
detergentes, por ejemplo, agentes tensioactivos no iónicos. Éstas deben ser compatibles con la
superficie que va a ser limpiada, tener buena capacidad de humectación y emulsificación,
además deben ser capaces de remover el tipo de suciedad presente sin dejar ningún tipo de
residuo.
7.- Sanitización: Es el proceso destinado a reducir el contenido de microorganismos viables
remanentes en una superficie limpia. En la industria se emplea este término cuando se tratan,
con agentes químicos o físicos, las áreas de producción y los equipos empleados en la
elaboración de productos, con el propósito de reducir el contenido microbiano hasta niveles
insignificantes.
8.- Sanitarizante: Es un agente químico que reduce la población microbiana a niveles seguros (no
peligrosos). Se aplican a objetos inanimados de uso diario en la industria de alimentos; por
ejemplo, superficies de trabajo, equipos, recipientes y utensilios.
9.- Germicida: Es un agente que mata a los microorganismos, pero no necesariamente a sus esporas.
10.- Agente bactericida: Es un agente que mata bacterias. Afecta las células vegetativas, pero no
necesariamente a sus esporas, en forma tan grave, que no pueden continuar su reproducción aún
después de retirada la sustancia.
11.- Agente bacteriostático: Es un agente que impide o inhibe la multiplicación de bacterias,
mientras permanece en contacto con ellas.
12.- Agente fungicida: Es un agente que mata hongos y sus esporas. Afectan a los hongos y sus
esporas, en forma tan grave, que no pueden continuar su reproducción aún después de retirada la
sustancia.
13.- Agente fungistático: Es un agente que inhibe el crecimiento de los hongos, mientras permanece
en contacto con ellos.
14.- Agente virucida: Es un agente que destruye o inactiva virus.
15.- Agente esporocida: Es un agente que destruye o inactiva esporas.
Los microorganismos pueden ser controlados, inhibidos o eliminados por medio de agentes físicos,
mecánicos o químicos. Existe una gran variedad de técnicas y agentes de control que actúan de
maneras diferentes y cada uno presenta sus propias limitaciones. Por ello, su elección depende del
tipo de microorganismos que se desean eliminar y de las superficies o materiales sobre los cuales se
va aplicar.
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I.- CONTROL POR MÉTODOS FÍSICOS
A. -CALOR SECO
La esterilización por calor seco puede hacerse por incineración (flameado) o mediante estufas de
aire caliente:
• Incineración (Flameado): Se emplea para esterilizar asas de siembra, pinzas, espátulas, etc.
Consiste en someter directamente a la acción de la llama del mechero Bunsen los utensilios que
se desean esterilizar. Este método es rápido y su eficacia es altísima, sin embargo no se puede
aplicar a objetos combustibles y termolábiles. En el caso del asa de siembre, el filamento de
nicrom se debe exponer a la llama hasta quedar al rojo vivo. En cambio, pinzas y espátulas
previamente deben ser sumergidas en una solución de etanol (70% v/v), escurridas y flameadas a
la llama del mechero hasta la completa combustión del etanol.
• Aire caliente (Horno Pasteur): Consiste en colocar los objetos que se van a esterilizar,
debidamente protegidos (envueltos en papel) para que no se contaminen una vez esterilizados, en
el interior de un Horno Pasteur. Este procedimiento se utiliza para esterilizar material de vidrio
(pipetas, matraces, tubos, etc.) u otros materiales termorresistentes. Las temperaturas a las que se
someten estos materiales son muy elevadas (160-180ºC durante 2 horas) con el fin de asegurar la
total eliminación de bacterias y sus esporas. Estas temperaturas no pueden utilizarse para
esterilizar preparados acuosos (como medios de cultivo: agares o caldos), ya que al llegar a los
100ºC comenzarían a hervir con la consecuente evaporación de su fracción líquida. El material
que se desea esterilizar debe estar seco, envuelto y ordenado de tal manera que el aire caliente
pueda distribuirse homogéneamente por todo el material. El tiempo de esterilización se tomará
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cuando el horno alcance la temperatura de esterilización (160-180ºC). Antes de sacar el material
del horno, éste debe dejarse enfriar para evitar que se rompa por el cambio de temperatura.
• Ebullición (Baño María): Consiste en poner el material en contacto con agua hirviendo (100ºC)
por un periodo no inferior a 10 minutos (comúnmente entre 15 a 30 minutos). Tiene una acción
limitada, pues si es aplicado durante el tiempo señalado sólo destruirá las formas vegetativas de
los microorganismos, no destruirá las esporas bacterianas que son “termorresistentes” (pueden
soportar hasta 3 horas a 100ºC). Este método tiene una acción limitada, se utiliza sólo con fines
de desinfección, cuando no se necesita alcanzar la esterilidad o cuando no se dispone de otros
métodos más eficaces. Usualmente se utiliza para la desinfección de utensilios, paños,
recipientes o medios de cultivos que no puedan esterilizarse en autoclave. También se puede
emplear en el control de microorganismos presentes en el agua de consumo.
• Vapor saturado a presión (Autoclave): Esta técnica requiere el uso del autoclave, que basa su
acción en temperaturas elevadas y presión de vapor de agua. Tal combinación permite esterilizar
con gran seguridad el material contaminado, principalmente medios de cultivos, fluidos
termoestables, material quirúrgico y alimentos enlatados. Es uno de los métodos más eficaces de
esterilización, ya que destruye todos los microorganismos, incluyendo las esporas de bacterias.
Los parámetros de esterilización más frecuentemente utilizada para esterilizar el material de
laboratorio son 121ºC//15 Lb/pulg2//15 minutos. En el caso de conservas dependerá del tipo de
producto y de su acidez; por ejemplo, para productos de baja acidez (pH >4.6) se aplica la
cocción botulina 121ºC//15 Lb/pulg.2/2.52 minutos).
1.- Verifique que el nivel de agua sea el indicado. Si falta, agregue de preferencia agua destilada.
2.- Introduzca el material que va a esterilizar en forma ordenada y espaciada para que la
distribución del vapor sea homogénea.
3.- Tape el autoclave apretando las manillas en forma cruzada.
4.- Asegúrese que la válvula superior esté abierta.
5.- Encienda el autoclave.
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6.- Al alcanzar una temperatura de 80-90 ºC cierre la válvula superior y, espere que alcance la
temperatura y presión de esterilización (121 ºC- 15 Lb/pulg.2). Una vez alcanzada la
temperatura y presión deseada tome el tiempo de esterilización (15 minutos).
7.- Al cumplir el tiempo de esterilización, apáguelo. No abra hasta que la presión en el interior del
autoclave llegue a cero.
8.- Por último, retire el material del autoclave. El material para desechar se debe vaciar en el
recipiente destinado para ese objetivo. En cambio, los medios de cultivos que se van a utilizar
deben enfriarse y guardarse en el refrigerador (2-8ºC).
2.- RADIACIONES
Estas incluyen las radiaciones beta “ß” y “X” (producidas por electrones acelerados o rayos
catódicos) y las radiaciones gamma “γ” (producidas por radioisótopos: 60Co). Estas radiaciones al
ser absorbidas por el agua y otros componentes celulares (ácidos nucleicos, enzimas y lípidos) se
ionizan, creándose radicales libres que ocasionan daños, principalmente a nivel de ADN
(mutaciones) y proteínas (enzimas), que conllevan a la muerte del microorganismo. A la
esterilización mediante radiaciones ionizantes se le denomina esterilización fría, ya que producen
relativamente poco calor en el material que se irradia.
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• Radiaciones γ (gamma): Las radiaciones gamma poseen un gran poder penetración y, por lo
tanto, posee un elevado poder de destrucción de microorganismos; sin embargo, puede ajustarse
la dosis para producir efectos pasteurizantes o esterilizantes. La principal aplicación industrial es
para la esterilización de materiales quirúrgicos y otros equipos médicos sensibles al calor y para
la preservación de ciertos productos alimenticios. Las principales ventajas de estas radiaciones
es que pueden aplicarse sobre productos envasados y a temperaturas bajas. No obstante, posee
algunas desventajas, tales como: (i) altera algunas vitaminas (C, E, A y B1), (ii) los alimentos
pueden adquirir un mal sabor debido a la generación de radicales libres a partir de lípidos
(rancidez oxidativa), (iii) no destruye virus ni toxinas, (iv) tienen un costo elevado (requieren un
riguroso control e instalaciones especiales), y (v) presenta una baja aceptación por parte de los
consumidores.
• Radiaciones ultravioleta (U.V): La luz U.V es normalmente producida por la luz solar,
pudiendo además ser obtenida por lámparas de mercurio de baja presión. El intervalo
germinicida se ubica a una longitud de onda entre 240-280 nm, pero su máximo poder letal se
manifiesta 253.7 nm. La luz U.V no produce ionización, sino que son absorbidas en forma
específica por proteínas y ácidos nucleicos, donde excitan electrones y los elevan a niveles
mayores de energía, creando diferentes especies químicas que producen alteraciones a nivel de
proteínas y ácidos nucleicos, entre ellas la formación de dímeros de pirimidina adyacentes que
inducen lecturas erróneas del código genético, produciendo mutaciones que impiden funciones
vitales de los microorganismos y, por lo tanto, la pérdida de la viabilidad de las células (muerte
celular). Este tipo de radiación tiene una aplicación limitada como método de desinfección,
debido a su bajo poder de penetración y a que las partículas circulantes en el ambiente ejercen un
efecto protector (absorben ellas mismas las radiaciones UV). Su uso está principalmente dirigido
a la desinfección ambiental (quirófanos, laboratorios, cámaras de atmósferas controladas) y a la
desinfección de superficies lisas, las que previamente deben ser tratadas con un agente químico
(etanol o isopropanol al 70% v/v). También puede ser aplicada para la desinfección
(potabilización) del agua de bebida. El tiempo de exposición no debe ser inferior a 30 minutos.
• Filtración: Consiste en el paso de un líquido, gas o aire a través de una membrana o filtros
bacteriológicos que tienen poros lo suficientemente pequeños para retener a los
microorganismos (≤0.22 µm).
o
o Filtros de membranas: Son filtros de membranas de ésteres de celulosa, que se utilizan para
esterilizar soluciones que no pueden ser tratadas por calor (es decir, termolábiles), tales como la
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urea, hidratos de carbono y antibióticos. Esta técnica se aplica a un producto antes de envasar,
por lo que es imprescindible que el recipiente en que se va a recolectar o guardar esté
previamente esterilizado. Esta operación tiene las ventajas de poder realizarse a temperatura
ambiente y ser capaz de eliminar tanto los organismos vivos como los muertos presentes en una
solución.
o
o Filtros HEPA: Son filtros de aire de gran eficiencia que forman parte de las campanas o cámaras
de flujo laminar, donde se utilizan para filtrar el aire y así obtener un ambiente libre de polvo,
bacterias y hongos (incluyendo esporas).
Existe una amplia gama de productos químicos utilizados para reducir o eliminar microorganismos,
ya sea desde superficies inanimadas (desinfectantes) o tejidos vivos (antisépticos). La acción
desinfectante o antiséptica de los agentes químicos se encuentra influenciada por los siguientes
factores:
Los alcoholes desorganizan las bicapas lipídicas penetrando en la región hidrocarbonada de los
lípidos. Éstos poseen una rápida acción bactericida, actuando sobre células vegetativas de bacterias
Gram-positivas y Gram-negativas, también actúan sobre virus con envoltura. No tienen efecto sobre
las esporas bacterianas, por lo que no son esterilizantes, sino más bien son considerados como
desinfectantes de bajo nivel. Su actividad depende de la concentración, siendo siempre más
efectivos en soluciones acuosas al 70%, ya que necesitan agua para mejorar su efectividad puesto
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que ésta le permite penetrar mejor en las células y, además retrasa la evaporación y aumenta el
tiempo de contacto, permitiendo así la desnaturalización de proteínas.
El etanol o alcohol etílico se utiliza como antiséptico de la piel (antes de inyecciones cutáneas) y en
la desinfección de termómetros clínicos. En el laboratorio de microbiología se utiliza para
desinfectar utensilios como pinzas, espátulas y asas de vidrio. Éstos se sumergen en etanol al 70% y
seguido se pasan por la llama del mechero (flamean) hasta la completa combustión del etanol.
El isopropanol (alcohol isopropílico), es menos volátil y más efectivo que el etanol. Se emplea
igualmente en la desinfección de termómetros; sin embargo, su efecto tóxico (narcótico) es mayor y
más duradero que con el etanol. En el laboratorio de microbiología se utiliza preferentemente para la
desinfección de superficies (mesones y plataforma de trabajo de la cámara de flujo laminar) y para
controlar salpicaduras o derrames de cultivos sobre superficies u objetos de trabajo.
• COMPUESTOS HALOGENADOS
Los compuestos halogenados son bactericidas muy potentes. Así por ejemplo, el yodo no tiene
parangón como antiséptico de la piel y el cloro no tiene igual en el tratamiento de aguas.
Los compuestos halogenados son agentes oxidantes que inactivan enzimas (proteínas), convirtiendo
los radicales -SH en disulfuros -S-S. Además, los más potentes también atacan radicales amino, el
grupo indol (presente en el triptófano), y la tirosina.
Yodo: Es un bactericida muy eficaz, es el único que actúa contra todos los tipos de bacterias (Gram
positivas y Gram negativas), hongos y virus; también posee cierta actividad esporocida. Es un
agente oxidante débil, pero en adición a este efecto, se combina irreversiblemente con residuos de
tirosina de las proteínas. Presentan ciertos inconvenientes, tales como: (i) precipita en presencia de
proteínas, (ii) producen manchas en la ropa y piel, (iii) es irritante y alergénico, y (iv) retarda la
cicatrización de heridas, sobre todo si se aplica en forma continuada.
Los iodóforos, son una mezcla de yodo con agentes tensioactivos (detergentes), formando así un
complejo que libera lentamente yodo orgánico cuando se diluye en agua. El yodo penetra fácilmente
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en los microorganismos a través de sus membranas celulares, destruyendo las proteínas. Son
bactericidas de potencia intermedia, su actividad es menos intensa que la de la tintura de yodo y
menos rápida, pero si se deja el tiempo suficiente afecta a formas vegetativas de bacterias, hongos,
virus y esporas en menor grado. Su actividad se reduce en presencia de sustancias alcalinas y
materia orgánica. Son corrosivos para los metales. El más conocido de los yodóforos es la povidona-
yodada (compuesto de yodo y polivinil-pirrolidona), que contiene entre un 9 y 12% de yodo
disponible. Se utilizan preferentemente como antiséptico de la piel y mucosas, y lavado de manos
antes de intervenciones quirúrgicas. También se emplean en la desinfección de instalaciones de
industrias de alimentos.
Cloro y compuestos clorados: El cloro se presenta bajos las formas de Cl2 (gaseoso), hipocloritos y
cloraminas. El efecto desinfectante se debe a la liberación de cloro libre (Cl2), que reacciona con el
agua para dar ácido hipocloroso, que a pH ácido o neutro es un oxidante fuerte.
El cloro es activo contra la mayoría de las células vegetativas de bacterias y sus esporas, virus y
hongos. Actúa por oxidación de los componentes celulares.
El cloro gaseoso, a 1-3 ppm, se usa para la potabilización de aguas para bebida y piscinas.
Los hipocloritos de sodio, de calcio o de litio se utilizan para la desinfección de frutas y hortalizas
(50-200 ppm). También se emplea como desinfectante/sanitizante (300-500 ppm) de baños, pisos,
paredes, superficies, equipos y utensilios de hospitales, laboratorios e industrias de alimentos.
Como el cloro se inactiva con la materia orgánica, primero habrá que limpiar con agua y jabón,
enjuagar abundantemente y posteriormente, desinfectar. Las superficies (excepto pisos y paredes),
equipos y utensilios tratados necesitan ser nuevamente enjuagados.
Los hipocloritos son baratos y de acción rápida. Sin embargo, se ha de tener en cuenta que son
desinfectantes que deterioran los metales (corrosivos), que se inactivan fácilmente en presencia de
materia orgánica, son relativamente inestables y su eficacia se ve afectada por el pH. Además,
interaccionan con otras sustancias químicas (soluciones ácidas y de amonio), produciendo vapores
de cloro que son muy irritantes para la piel y mucosas. No se deben utilizar en combinación con
formaldehído, ya que esta combinación es altamente carcinógena. Su ingestión provoca graves
lesiones en la mucosa esofagogástrica.
El dióxido de cloro (ClO2), es otro derivado del cloro que está siendo ampliamente utilizado en la
industria de alimentos. Éste no presenta los problemas del hipoclorito de sodio, como generar
derivados halogenados y reaccionar con compuestos nitrogenados, y en contacto con material
proteico no forma cloraminas, ni ácidos trihalometanos o haloacéticos. El tratamiento de alimentos
(frutas, hortlizas y canales de aves y animales de abasto) con dióxido de cloro aumenta su vida
media útil o comercial, sin alterar su calidad organoléptica ni nutricional. Es soluble en agua y su
acción no es afectada por valores altos de pH.
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El dióxido de cloro es un potente germicida, en comparación con el cloro acuoso posee un poder
desinfectante siete veces superior y una capacidad oxidativa 2.5 veces mayor. Debido a las ventajas
que presenta sobre los hipocloritos, en los últimos años, su uso se ha extendiendo a la industria de
alimentos. Actualmente sus aplicaciones incluyen: (i) la desinfección de superficies ambientales y
equipos, incluyendo aquellos que entran en contacto directo con el alimento procesado; (ii) lavado y
sanitizado de sistemas CIP; (iii) lavado y sanitización de frutas y verduras; (iv) tratamiento del agua
en la industria avícola; (v) fabricación de hielo para conservación de pescados y mariscos; y (vi)
sanitización de canales de pollo, cerdo, vacuno y subproductos de mataderos.
Los compuestos de amonio cuaternario (conocidos como "quats") son esencialmente sales de
amonio con algunos o todos los átomos de hidrógeno del ión (NH4)+ substituidos por grupos tipo
alquilo de complejidad variable. Son detergentes o tensioactivos catiónicos que actúan,
principalmente, a nivel de la superficie celular, donde producen la desorganizando (rotura) de las
membranas fosfolipídicas, lo que se refleja en el incremento de su permeabilidad, con la
consiguiente salida de componentes citoplasmáticos. Posteriormente, la entrada del detergente
produce un efecto secundario de desnaturalización de proteínas.
Son los detergentes más potentes en cuanto a su actividad desinfectante. El cloruro de benzalconio
fue el primer compuesto comercial de este tipo introducido en el mercado. Tiene una buena
actividad antimicrobiana contra bacterias Gram-positivas, pero es menos efectivo sobre bacterias
Gram-negativas, particularmente contra Pseudomonas, la cual incluso puede crecer en las
soluciones de estos productos. También presentan actividad fungicida y virucida sobre virus con
envoltura, pero ésta es escasa frente a virus sin envoltura y casi nula frente a esporas bacterianas,
aunque previene su germinación. Factores como la dureza del agua y restos proteicos interfieren en
su actividad y reducen su eficacia. No obstante, los amonios cuaternarios denominados de segunda
generación (por ejemplo, el cloruro de etilbenzilo) y de tercera generación (por ejemplo, el cloruro
de dodecil dimetil amonio) son compuestos que permanecen activos en presencia de agua dura.
Los compuestos de amonio cuaternario son considerados como desinfectantes de bajo nivel y
comúnmente se utilizan en la industria de alimentos para la desinfección y/o sanitización de
superficies, paredes y pisos (utilizándose a concentraciones del 0.4 a 1.6%).
La clorhexidina es uno de los antisépticos de la piel y mucosas más utilizado. Su espectro de acción
incluye bacterias Gram-positivas y Gram-negativas (pero su actividad es menor frente a bacterias
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Gram-negativas), hongos y virus con envoltura. No es esporicida, aunque inhibe la germinación de
las esporas. Su mecanismo de acción se basa en la alteración de la permeabilidad de la membrana
celular y precipitación de proteínas y ácidos nucleicos.
Posee una acción germicida rápida y una duración prolongada, gracias a que esta sustancia tiene
gran adhesividad a la piel, por lo que sus efectos antimicrobianos permanecen hasta 6 horas después
de su uso. Su actividad se reduce por alteración de pH (actividad máxima a pH 5,5-7), dilución con
agua corriente, jabones con aniones orgánicos o inorgánicos. La presentación más común contiene
un detergente como base y un 4% de clorhexidina, y se utiliza para el lavado de manos del personal
de hospitales, laboratorios de microbiología e industrias de alimentos. También está presente en
enjuagues bucales y pastas dentales.
• COMPUESTOS FENÓLICOS
• AGENTES OXIDANTES
El agua oxigenada es activa frente a bacterias vegetativas, hongos, virus y esporas bacterianas según
la concentración y condiciones de utilización. Su actividad germicida se debe a la destrucción de
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las membranas celulares, DNA y otros componentes celulares esenciales. Los preparados
comerciales suelen contener concentraciones entre el 3-6% (10-20 volúmenes). Se inactiva
rápidamente en presencia de materia orgánica, luz y contacto con el aire. La forma oxidante activa
no es el peróxido de hidrógeno como tal, sino el radical hidróxilo libre formado por su
descomposición. Las soluciones estabilizadas de agua oxigenada, del 10 al 25%, se utilizan como
agentes esporicidas en la desinfección de materiales especiales (implantes de plástico, lentes de
contacto y prótesis quirúrgicas).
Ozono (O3):
El ozono es una molécula de oxígeno triatómica altamente inestable, que es formada por la unión de
una molécula de oxígeno diatómico (O2) a un átomo de oxígeno. Este es producido por la
disociación de las moléculas de oxígeno cuando éstas son sometidas a una fuerte descarga eléctrica.
La molécula de ozono es uno de los oxidantes más poderosos que se conocen después del fluoruro,
con una velocidad de reacción tres mil veces superior a la del cloro. El ozono actúa como un agente
fuertemente oxidante, que lo hace muy efectivo para destruir microorganismos (bacterias, hongos,
virus y protozoos). Es más efectivo que el cloro, por ello su uso en soluciones acuosas está siendo
evaluado como desinfectante (sanitizante) de frutas, hortalizas, canales de pollos y animales de
abasto. Este agente posee varias ventajas, por ejemplo: (i) sólo agrega oxígeno a los compuestos
orgánicos, por lo que pocos compuestos formados se consideran dañinos para la salud; (ii) posee un
amplio espectro microbiano; (iii) elimina olores y sabores extraños del agua; (iv) no libera
compuestos tóxicos al ambiente; (v) remueve compuestos orgánicos tales como pesticidas,
detergentes y fenoles; y (vi) no se requiere de un enjuague posterior a su aplicación. No obstante,
presenta algunas desventajas, entre las que destacan: (i) su gran inestabilidad, su reacción es difícil
de predecir en presencia de materia orgánica; (ii) su efecto antimicrobiano se ve afectado a pH
básico; y (iii) es tóxico a bajas concentraciones (≥ 1 ppm), produce irritación de las vías nasales,
ojos y garganta.
La acción antimicrobiana del ozono se basa en su gran poder oxidativo, siendo la superficie celular
el primer blanco de su actividad (cambia la permeabilidad celular), provocando la lisis celular. En
segundo lugar, daña en el material genético debido a los cambios que provoca en las bases
pirimídicas.
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ACTIVIDADES:
1.- Exponga una placa de Petri con Agar Nutritivo (abierta/sin tapa) al ambiente del laboratorio
durante 30 minutos. Transcurrido este tiempo, tape la placa e incúbela a 35ºC durante 48 h.
Como control, incube una placa con el mismo medio de cultivo, pero la cual ha sido mantenida
cerrada.
2.- Coloque una placa Petri con Agar Nutritivo a una distancia aproximada de 30 cm de su boca y
estornude vigorosamente sobre ella. Tape la placa e incúbela a 35ºC durante 48 h. Como
control, repita la experiencia, pero antes cubra su boca con una mascarilla.
3.- Abra una placa de Petri con Agar Papa Dextrosa y sacuda su cabello sobre ella. Cierre la placa e
incúbela a 25ºC durante 5 días.
4.- Utilizando una tórula estéril, tome una muestra de sus fosas nasales y extiéndala sobre la
superficie de Agar Nutritivo (contenido en una placa de Petri). Incube la placa a 35ºC durante
48 h.
5.- Humedezca su dedo pulgar con una solución de suero fisiológico y frótelo con su dedo índice
durante 15 segundos. Seguido, imprima la huella de su dedo pulgar sobre la superficie de Agar
Nutritivo (contenido en una placa de Petri). Cierre la placa e incúbela a 35ºC durante 48 h.
1.- Efecto del lavado de manos con jabón que contiene triclosán como agente antiséptico
Utilizando un lápiz marcador divida en dos una placa de Petri con Agar Nutritivo. Luego,
humedezca su dedo pulgar de su mano derecha con una solución de suero fisiológico y frótelo con
su dedo índice durante 15 segundos, seguido imprima la huella de su dedo pulgar sobre una de las
mitades de la placa. Seguido, lave sus manos con jabón antiséptico (con triclosán) y enjuague con
abundante agua. Séquese las manos con papel absorbente e imprima la huella de su dedo pulgar
izquierdo sobre la otra mitad de la placa. Incube la placa a 35ºC durante 48 h.
En el laboratorio encontrará un matraz con 100 ml de leche pasterizada que ha sido inoculada con un
cultivo de bacterias coliformes. Tome una alicuota de 1 ml, dilúyala hasta 10-1 y transfiera 1 ml de
la dilución a una placa de Petri. Vierta sobre la placa 18 ml de Agar VRB fundido y atemperado a
48ºC, homogenice la mezcla mediante movimientos circulares y deje solidificar. En seguida,
introduzca el matraz en un baño termorregulable ajustado a 63ºC y a intervalos de tiempo de 3, 5, 15
17
y 30 min, tome una alícuota de 1 ml del matraz y dilúyala hasta 10-1. Repita la operación de siembra
realizada anteriormente. Espere que el agar solidifique e incube las placas a 35ºC durante 48 h.
18
PRÁCTICA Nº3
AISLAMIENTO Y OBTENCIÓN DE CULTIVOS PUROS DE MICROORGANISMOS
________________________________________________________________________________
INTRODUCCIÓN
En general, los alimentos constituyen substratos complejos que pueden contener una microflora muy
diversa, comúnmente constituida por bacterias, mohos y levaduras, pertenecientes a diferentes
taxones. Por esta razón, el estudio de su microflora, ya sea con fines cuantitativos (recuento de
microorganismos viables) o cualitativos (identificación de microorganismos patógenos o con algún
interés biotecnológico), requiere emplear técnicas que permitan obtener “cultivos puros”.
Un cultivo puro, es aquel que contiene solo un tipo de microorganismo que procede generalmente
de una o más células de una misma especie (clon).
En medios de cultivos sólidos (agares), los cultivos puros forman una masa de células visibles a
simple vista que reciben el nombre de “colonias”. No obstante, cuando se hace referencia al origen
de una colonia es más correcto denominarlas “unidades formadoras de colonias” (UFC), dado que
una colonia puede ser originada por una o más células de un microorganismo de una misma especie.
Es necesario tener en cuenta además, que los cultivos puros o colonias de una misma especie se
denominan “cepas”, puesto que entre estás pueden existir variaciones genéticas debido a
mutaciones espontáneas.
19
Este método consiste en preparar un banco de diluciones decimales de la muestra que se desea
investigar, las que posteriormente se siembran en un medio de cultivo sólido apropiado hasta
obtener colonias aisladas. La siembra se puede realizar mediante la técnica de “vertido en agar” (o
siembra en masa) o por “extensión superficial”.
TÉCNICA
1.- En forma aséptica, se toma una muestra de alimento de 10 g ó 10 ml, según sea el caso. Si el
alimentos es sólido, la muestra se deposita en una bolsa de stomacher estéril junto con 90 ml de
Agua Peptonada Tamponada (APT, 0.1 % p/v) y se homogeniza en el stomacher, durante 1
minuto a 230 rpm. Si el alimento es líquido, se vierte la muestra en un frasco que contenga 90
ml de APT y se homogeniza manualmente, agitándolo durante 15 segundos (25 veces en un arco
de 30 cm). En ambos casos se obtendrá una muestra del alimento diluida 1:10 (1/10 ó 10-1).
2.- Usando una pipeta estéril, se toma 1 ml de la dilución 1:10 y se transfiere a un tubo que
contiene 9 ml de APT, el tubo se agita en un Vortex. Así se obtendrá la segunda dilución de
1:100 (1/100 ó 10-2).
3.- A partir de la segunda dilución, se transfiere un 1 ml a otro tubo que contiene 9 ml de APT y se
agita en un Vortex, obteniendo así la tercera dilución de 1:1000 (1/1000 ó 10-3). La operación
se repite hasta obtener las diluciones necesarias, que dependerá del grado de contaminación del
producto analizado. Así, mientras más alta sea la carga o contaminación microbiana, mayor será
el número de diluciones requeridas.
1.- Se toma un volumen de 1 ml de cada una de las diluciones preparadas y se depositan en placas
de Petri estériles y vacías.
3.- Se espera que el medio solidifique y las placas se incuban en forma invertida, a la temperatura y
durante el tiempo apropiado para el tipo de microorganismo que se desea aislar. Por ejemplo:
7ºC durante 7 días, para microorganismos psicrótrofos; 30ºC durante 72h ó 35ºC durante 24h,
para microorganismos mesófilos; o 25ºC durante 3 a 5 días, para levaduras y mohos.
20
A.2.- Siembra por extensión superficial
1.- Se toma una alícuota de 0.1 ml de cada una de las diluciones apropiadas y se depositan sobre la
superficie de un agar apropiado (contenido en placas de Petri).
2.- A continuación, utilizando un asa de vidrio, previamente esterilizada con alcohol y flameada a la
llama del mechero, se extiende la alícuota por toda la superficie del agar.
3.- Las placas se incuban en forma invertida a la temperatura y durante el tiempo apropiado para el
tipo de microorganismos que se está investigando.
Tras la incubación, se obtendrán colonias aisladas que se podrán diferenciar por su morfología
(tamaño, forma, textura, pigmentación, etc), permitiendo así distinguir distintas especies
microbianas. Esto será válido para las colonias que crecen sobre la superficie del agar, ya que las
colonias que se desarrollan en el interior (bajo la superficie o masa del agar) tendrán todas una
forma lenticular, por lo cual no se podrán diferenciar aunque los microorganismos que las formen
sean de distintas especies. En ambos casos, puesto que el volumen de las diluciones sembradas es
conocido, se puede determinar el número de microorganismos viables en el producto, el que será
calculado multiplicando el número de colonias contadas en cada placa por el factor de dilución
correspondiente. La expresión de este recuento se hace en "unidades formadoras de colonias por
mililitro o gramo de muestra" (UFC/ml ó g), puesto que se desconoce el número de células de una
misma especie que han originado una colonia. A partir de las colonias aisladas, los microorganismos
pueden transferirse a otros medios de cultivo para su posterior estudio o identificación.
21
A.- Preparación de las diluciones decimales
seriadas
9 ml (APT)
22
2. - Aislamiento mediante el método de siembra de agotamiento por estrías
TÉCNICA
1.- Utilizando un asa de siembra (curva), previamente esterizada, se toma una alícuota del cultivo
de microorganismos y se extiende sobre un área pequeña de la superficie de la placa, próxima al
borde. Se extiende en forma de estrías muy juntas, pero sin hacer presión para no dañar el agar.
2.- A continuación, se flamea el asa, se enfría y después de rozar una vez con el asa las estrías
sembradas previamente, se extiende de nuevo por otra zona de la placa haciendo nuevas estrías.
3.- El asa nuevamente se flamea y enfría y se repite la operación anterior, pero en esta ocasión
rozando la segunda tanda de estrías.
4.- Se cierra la placa y se flamea el asa.
5.- Las placas se incuban a la temperatura adecuada durante 24-48 h, siempre en posición invertida.
Tras la incubación, se observan las colonias aisladas en alguna región de la placa inoculada. En las
zonas donde existen colonias aisladas se puede estudiar la morfología de las colonias. Si todas las
colonias presentan características morfológicas similares, el cultivo está puro; es decir, contiene
microorganismos de una misma especie.
23
ACTIVIDADES
1.- Obtención de colonias aisladas y recuento total de microorganismos viables a partir de una
muestra de alimento, utilizando el método de las diluciones decimales seriadas que se
sembrarán utilizando la técnica de vertido en agar y por extensión superficial:
o A cada grupo (mesón) se le proporcionará un trozo de quesillo fresco. A partir de éste, tome
una muestra de 10 g y prepare diluciones decimales seriadas (10-1 a 10-4). Siembre las
diluciones 10-2, 10-3 y 10-4 en Agar Plate Count, utilizando la técnica de vertido en agar y
extensión superficial. Incube las placas a 35ºC durante 48h. Tras el periodo incubación,
describa la morfología de los distintitos tipos de colonias que se han desarrollado en forma
aislada. Al mismo tiempo, calcule el recuento total de microorganismos viables.
2.- Obtención de cultivos puros empleando la técnica de siembra de agotamiento por estrías:
o En cada mesón encontrara tubos con Caldo Tripticasa que contienen un cultivo mixto de
bacterias. Con un asa de siembra (curva) tome una alícuota del cultivo y siémbrelo mediante el
método de agotamiento por estrías en placas de Petri que contienen Agar Tripticasa. Tras
incubar las placas a 35ºC durante 24 h, describa las características fenotípicas de las colonias
que ha logrado separar.
24
PRÁCTICA Nº 4
MEDIOS DE CULTIVO
________________________________________________________________________________
INTRODUCCIÓN
En general, los requerimientos para el crecimiento microbiano se pueden agrupar en dos categorías:
(i) físicos, donde se incluyen la temperatura, el pH y la presión osmótica y, (ii) químicos, que
comprenden los elementos nutritivos (fuentes de C y N), las sustancias minerales, el oxígeno y
determinados factores orgánicos de crecimiento (por ejemplo: vitaminas y/o aminoácidos).
25
Aunque existe una gran variedad de medios de cultivos artificiales, cuya formulación varía según su
uso, todos deben contener los siguientes nutrientes o elementos básicos:
Desde el punto de vista físico los medios de cultivos se pueden clasificar en “medios de cultivo
sólidos o agares”, “líquidos o caldos” y “semi-sólidos”. El desarrollo microbiano en un medio de
cultivo líquido se manifiesta por enturbiamiento del mismo, el que puede ser parcial, total, o
solamente estar limitado a la formación de una película membranosa superficial. En medios de
cultivo sólidos, se manifiesta por la aparición de una “colonia”, que corresponde a una formación
macroscópica no filamentosa (bacterias y levaduras) o filamentosa (mohos), que resulta de la
multiplicación de una o más células y/o esporas de una misma especie (clon).
Por otro lado, según las características nutritivas, los medios de cultivos pueden ser clasificados en
seis grupos bien definidos:
Se caracterizan por ser pobres en material nutritivo, ya que no satisfacen ninguna necesidad en
especial. Se utilizan, de preferencia, como base para la preparación de otros medios de cultivo. En
ellos crecen bacterias poco exigentes y pueden ser usados para mantener cepas bacterianas
(cepario). Ejemplos de éstos son el Agar o Caldo Nutritivo y el Agar o Caldo Tripticasa.
26
2.- MEDIOS BASICOS MEJORADOS
Son medios básicos a los cuales se les adiciona una sustancia enriquecedora como suero, sangre o
leche. El uso de estos medios es universal y está orientado a obtener un mejor desarrollo de
cualquier tipo de bacterias por exigentes que ellas sean. Por ésta razón se utilizan en primera
instancia en el aislamiento bacteriano, ya sea a partir de otros medios de cultivo, alimentos o
productos patológicos. Ejemplos de éstos son el Agar Sangre, Agar Suero, Agar Leche y el Caldo
Carne Cocida.
Son medios que contienen sustancias que impiden o limitan el crecimiento de algunas especies
microbianas y permiten el desarrollo de otras. Tienen aplicación en el diagnóstico bacteriológico,
principalmente cuando el problema consiste en aislar un germen de un producto que contiene
numerosos grupos o especies de microorganismos, a menudo sin importancia etiológica, y las
cuales en un medio de cultivo mejorado crecerían de tal forma, que dificultarían el aislamiento del
agente que se desea pesquisar. La mayoría de estos medios además incluyen algún substrato
(azúcar, aminoácido o de otra naturaleza) y un indicador de pH que permite detectar su utilización,
permitiendo así diferenciar entre grupos o especies microbianas.
27
• Agar VRBG (Agar Cristal Violeta- Rojo Neutro-Bilis-Glucosa)
28
• Agar MacConkey-Sorbitol
Test IMViC= Indol (I), Rojo Metilo (M), Vogues-Proskauer (V), i (y), Citrato (C).
29
• Agar XLD (Agar Xilosa- Lisina - Desoxicolato)
• Agar PALCAM
Medio selectivo y diferencial utilizado para el aislamiento
de Listeria spp., particularmente Listeria monocytogenes. Su
selectividad está dada por la presencia de cloruro de litio,
polimixina B, acriflavina y ceftazidima, agentes que
suprimen la flora que normalmente acompaña a Listeria spp.
El medio además contiene manitol y rojo fenol como
indicador de pH. También posee esculina y citrato de fierro
amoniacal. Listeria spp. es manitol negativo y esculina
positivo. Por lo tanto, las colonias típicas de Listeria spp.
producen a su alrededor un ennegrecimiento del medio
debido a la degradación de la esculina. La incapacidad para
fermentar el manitol se manifiesta por la manteción del color
rojo del medio. La presencia de L. monocytogenes debe ser confirmada mediante pruebas
bioquímicas y/o serológicas.
30
• Agar ALOA (Agar Listeria según Ottaviani & Agosti)
31
• Agar DRBC (Agar Dicloran- Rojo de Bengala-Cloranfenicol)
32
4.- MEDIOS ESPECIFICOS
Son medios de cultivo que por su composición nutricional y química sólo son capaces de satisfacer
los requerimientos nutricionales mínimos de una especie bacteriana determinada, solamente en ese
medio hallan las condiciones óptimas (factores de crecimiento) para su desarrollo. Ejemplos de
éstos son el Agar Chocolate para Haemophilus spp., Agar Stuart para Leptospira spp., y Agar
Loweisten-Jensen para Mycobacterium tuberculosis.
• Caldo TETRATIONATO
• Caldo RAPPAPORT-VASSILIADIS.
33
• Caldo FREASER
Se emplean para demostrar una propiedad bioquímica de la bacteria, la cual es de gran ayuda para su
identificación. Por ejemplo: degradación de hidratos de carbono (Caldo Base Rojo Fenol), hidrólisis
de la urea (Agar Urea), utilización del citrato de sodio como única fuente de carbono (Agar Citrato
de Simmon`s), etc. Como se trata de fenómenos metabólicos que tienden a la identificación de un
género o especie bacteriana, siempre se deben usar “cepas puras”.
Estos medios poseen indicadores de pH que permiten visualizar una determinada propiedad
alterando sus propiedades cromáticas. Medios de este tipo son numerosos, los más conocidos y
utilizados son aquellos que son utilizados para identificación de los especies de la Fª
Enterobacteriaceae, ya que éstos no poseen características muy distintivas en sus cultivos y
colonias.
Los más utilizados para este efecto son:
Interpretación
La degradación del citrato por los microorganismos da lugar a una
alcalinización del medio de cultivo, que se manifiesta por un viraje a azul
oscuro del indicador de pH (azul de bromotimol).
34
• Agar UREA DE CHRISTENSEN
Interpretación
En este medio se estudia: i) La fermentación de la glucosa, con o sin producción de gas; ii) la
fermentación de la lactosa y/o sacarosa; y iii) la producción de H2S. El medio se prepara en tubo
inclinado y se siembra en superficie y picadura con asa recta. Se incuba a 37ºC durante 24 h.
Interpretación
La degradación de los azúcares con formación de ácido se manifiesta por un cambio de color del
indicador rojo de fenol, que vira de rojo a amarillo. La utilización de la lactosa y/o sacarosa se
visualiza en la parte tendida del tubo, mientras que la utilización de la glucosa se observa en la parte
profunda (columna) del mismo. La formación de gas por fermentación de la glucosa se aprecia por
la aparición de burbujas o ruptura del agar en su parte profunda. Por último, la producción de H2S
se observa por la aparición de un precipitado de color negro que corresponde al súlfuro ferroso.
35
A B C D E
36
Interpretación
A B C D E F
37
• Medio MIO ( Medio Movilidad – Indol – Ornitina)
Interpretación
La movilidad se pone de manifiesto por la turbidez difusa del medio de cultivo alrededor del canal
de la picadura. La no movilidad se caracteriza por el crecimiento solamente a lo largo de dicho
canal. La demostración del indol se efectúa mediante la aplicación de un par de gotas del reactivo
de Kovac’s (p-dimetil-amino-benzaldehido), el que se deja escurrir suavemente por las paredes del
tubo; la aparición de una coloración rojo-púrpura de la capa de reactivo indica producción de indol.
La descarboxilación de la ornitina se manifiesta por la mantención o intensificación del color violeta
del medio de cultivo en la parta baja del tubo.
A B C D E F
TUBO A B C D E F
MOVILIDAD Control (+) (-) (-) (+) (+)
INDOL Control N.D N.D N.D (+) (-)
ORNITINA Control (+) (-) (-) (+) (+)
38
• Caldo MR-VP (Caldo Rojo Metilo – Voges Proskauer)
Este medio permite demostrar la producción de ácido (prueba del rojo metilo) o compuestos neutros
a partir de la glucosa (prueba de Voges-Proskauer).
39
5 Reactivo A: α- naftol al 5 % en alcohol etílico absoluto.
5 Reactivo B: Hidróxido de potasio al 40% en agua destilada conteniendo 0.3 % de creatina
(solución muy cáustica).
1.- Lea cuidadosamente las instrucciones que aparecen en la etiqueta del medio de cultivo.
2.- Ocupe un matraz cuya capacidad sea aproximadamente el doble del volumen del agua destilada
requerida para la preparación.
3.- Lave el matraz y una probeta con agua corriente y enjuáguela con agua destilada. Mida en la
probeta el volumen de agua destilada requerida y viértalo al matraz. Tape de inmediato con
papel de aluminio.
4.- Pese el medio de cultivo deshidratado sobre un papel limpio de acuerdo a la cantidad
especificada por el fabricante. Tape inmediatamente el frasco que contiene el medio de cultivo
deshidratado.
5.- Vierta el medio de cultivo pesado dentro del matraz que contiene el agua destilada. Disuelva
por medio de movimientos circulares. Evite que al agitar el medio quede cultivo seco en las
paredes del matraz.
6.- Caliente de acuerdo a las especificaciones del fabricante hasta lograr la total homogenización
del medio. Ello se aprecia por un cambio en el tono del color del medio de cultivo, éste se
vuelve translucido. Compruebe el pH y corríjalo si es necesario.
7.- Reparta el medio de cultivo en tubos o matraces de menor volumen.
8.- Esterilice el medio de acuerdo a las especificaciones que aparecen en la etiqueta del frasco
(autoclave o filtración).
9.- Si el medio fue esterilizado en autoclave espere que éste se enfríe e incúbelo a 35ºC durante 24
h para verificar su esterilidad. Se deben eliminar aquellos tubos o placas que presenten
desarrollo microbiano.
10.- Guarde los medios en el refrigerador (2-8ºC) hasta su posterior uso.
ACTIVIDADES
• SESIÓN I:
- Observación, descripción e interpretación de medios de cultivos selectivos de uso rutinario en el
laboratorio de microbiología de alimentos.
• SESIÓN II:
- Observación, descripción e interpretación de medios de cultivos diferenciales utilizados para la
identificación de especies de la Fª Enterobacteriaceae.
40
PRÁCTICA Nº 5
EXAMEN MICROSCÓPICO DE BACTERIAS
________________________________________________________________________________
INTRODUCCIÓN
Para el estudio microscópico de bacterias generalmente se usan dos técnicas: “el frotis fresco o
examen en preparaciones húmedas” y “el frotis fijo o examen en preparaciones fijas”.
FROTIS FRESCO
Movimiento de corriente: Se caracteriza porque todas las bacterias se desplazan en una misma
dirección del campo visual del microscopio. A primera vista da la impresión que las bacterias se
desplazan por su propia acción, pero no es así, sino que son arrastradas por corrientes que se
generan dentro de la preparación.
TÉCNICA
41
4.- Cubra la preparación con una lámina cubreobjetos y obsérvela en el microscopio con aumento
mayor (X40).
FROTIS FIJO
El frotis fijo, a diferencia del frotis fresco, permite solamente la observación de bacterias muertas y
es la base para realizar cualquier tinción.
TÉCNICA
TINCIONES
Las células bacterianas son prácticamente transparentes (hialinas), por esta razón es recomendable el
uso de colorantes para su observación. El empleo de colorantes biológicos permite aumentar el
contraste entre la célula y el medio que la circunda. Asimismo, el uso de algunas técnicas especiales
de tinción permite diferenciar entre grupos afines de bacterias o distinguir algunas estructuras
bacterianas (por ejemplo: flagelos, cápsula, gránulos de lípidos, gránulos metacromáticos, etc.).
Se basan en el uso de un sólo colorante, por lo que todas las células bacterianas se observan del
mismo color. Este tipo de tinciones no permite establecer ninguna diferencia entre grupos de
bacterias o diferenciar estructuras. Por esta razón, tienen escasa aplicación en microbiología, sólo se
usan para estudiar la forma, tamaño y agrupación de las células bacterianas. Las tinciones simples se
42
pueden realizar con azul de metileno, violeta de genciana, cristal violeta, rojo de metilo, safranina,
etc.
Estas tinciones permiten diferenciar grupos de bacterias de acuerdo a su afinidad por determinados
colorantes, por lo que prestan una gran utilidad para el estudio e identificación de bacterias. La más
empleada de ellas es la tinción de Gram, la cual permite separar a las bacterias en dos grandes
grupos: bacterias Gram positivas y bacterias Gram negativas.
TÉCNICA
Las bacterias que resisten la decoloración y retienen el complejo cristal violeta-yodo aparecerán de
color violeta oscuro al microscopio y se denominan Gram positivas. Aquellos que pierden el color
inicial del cristal violeta tras la decoloración, se clasifican como Gram negativas y toman el color
rosa debido al segundo colorante, la safranina. Las diferencias químicas en sus paredes celulares,
son las que permiten o no la salida del complejo cristal violeta-lugol (yodo). Las bacterias Gram
positivas tienen una pared celular gruesa, compuesta principalmente por peptidoglucano, mientras
que en Gram negativas, aunque la pared está también constituida por péptidoglucano, es más
delgada y presenta además una membrana externa con lipopolisacáridos. Las paredes de las
bacterias Gram positivas tratadas con alcohol sufren una deshidratación y sus poros se contraen,
dificultando la salida del complejo cristal violeta-yodo. En las Gram negativas, el alcohol
desorganiza la capa lipídica más externa y lava el colorante de la delgada capa de peptidoglucano.
43
3.- TINCIONES ESPECIALES O ESTRUCTURALES
Las tinciones especiales tienen por objeto destacar algunas estructuras de la célula bacteriana como
por ejemplo: endosporas, cápsula, flagelos, lípidos, etc.
La tinción especial más usada en nuestro laboratorio es la tinción de endosporas. Las endosporas
son estructuras que se forman en el interior de las células vegetativas de bacterias pertenecientes a
los géneros Bacillus (algunas especies han sido reclasificadas en los géneros Alicyclobacillus,
Brevibacillus, Geobacillus y Paenibacillus), Clostridium, Desulfotomaculum, Oscillospira y
Sporolactobacillus. A diferencia de la célula vegetativa de la que procede, las endosporas son
resistentes a factores ambientales adversos como altas temperaturas, compuestos químicos tóxicos,
radiaciones U.V y también a los colorantes. Sin embargo, existen colorantes como el verde de
malaquita que, con ayuda del calor, pueden penetrar en ella. Una vez teñidas, no pierden el colorante
al ser lavadas con agua, pero sí lo perderán las formas vegetativas, que quedarán teñidas con el
colorante de contraste. La posición y morfología de las esporas en el interior de la bacteria tiene gran
interés taxonómico, ya que es de utilidad para diferenciar especies dentro de un mismo género.
TÉCNICA
1.- Prepare un frotis fijo de la cepa bacteriana que desea estudiar. Fíjelo a la llama, pero evite no
sobrecalentar para no romper el portaobjetos.
2.- Cubra la preparación con una solución saturada de verde de malaquita (7.5%) y pásela por la
llama de un mechero hasta la emisión de vapores. Esta operación se repite durante 5 minutos,
evitando que la muestra hierva y que se evapore completamente el colorante. Si es necesario
agregue más colorante.
3.- Lave con agua corriente el exceso de colorante.
4.- Cubra la preparación con una solución acuosa de safranina al 0.25% durante 30 segundos.
5.- Lave, seque y observe la preparación con aumento de inmersión (X100).
6.- Las endosporas se observan de color verde, ya que se tiñen con el verde de malaquita; en
cambio, el cuerpo de la bacteria tiñe de color rosado por efecto del colorante de contraste
(safranina).
44
MORFOLOGIA CELULAR BACTERIANA
Las células bacterianas presentan una morfología típica que facilita su identificación. Las bacterias
se clasifican de acuerdo a esta propiedad en:
En este caso las células son esféricas o aproximadamente esféricas (arriñonada u ovoides) y reciben
el nombre de cocos. Según como se agrupen se denominan:
En este caso las células son alargadas, pudiendo presentar formas variadas como: “cocobacilos”
(Escherichia coli), “bacilos fusiformes” (Fusobacterium spp.), “filamentosos” (Actinomyces spp.),
“elipsoides” (Acetobacter spp), “curvos o vibriones” (Vibrio cholerae y Vibrio parahaemolyticus),
“espiralados o helicoidales” (Helicobacter pylori), “rectangulares” (Bacillus anthracis), etc.
Las principales agrupaciones que pueden presentar las bacterias de forma bacilar son: “diplobacilos”
(Moraxella spp.), “estreptobacilos” (Bacillus cereus), y “letra china o empalizada”
(Corynebacterium spp.).
45
A B C
D E F
46
ACTIVIDADES
A cada grupo se les proporcionará cultivos frescos de bacterias: Listeria innocua, Staphylococcus
aureus, Escherichia coli, Enterococcus sp., Bacillus sp. y Pseudomonas fluroescens.
1.- A partir de cada uno de los cultivos realice un frotis fresco y examínelo al microscopio.
Describa el tipo de movilidad que presenta.
2.- Prepare un frotis fijo de cada uno de los cultivos. A los frotis preparados con Listeria innocua,
Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Enterococcus sp. y Pseudomonas fluorescens
efectúeles la tinción de Gram, mientras que a Bacillus cereus realícele la tinción de esporas.
47
PRÁCTICA Nº6
IDENTIFICACIÓN BACTERIANA
________________________________________________________________________________
INTRODUCCIÓN
La presencia de ciertas bacterias patógenas en alimentos (por ejemplo: Salmonella spp. Escherichia
coli O157:H7, Vibrio cholerae, Vibrio parahaemolyticus, Staphylococous aureus, Listeria
monocytogenes y Bacillus cereus) constituye un serio peligro para la salud de los consumidores. Por
este motivo, su correcta detección e identificación es fundamental para determinar la aceptación o
rechazo de un producto alimenticio destinado al consumo humano.
Hoy en día, también se pueden usar técnicas moleculares de identificación, como por ejemplo la
reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Aunque este método ha sido utilizado con gran éxito
para la detección e identificación de bacterias en alimentos, su uso está restringido debido a su alto
costo. Por esta razón, la mayoría de los laboratorios siguen realizando la identificación en base a
métodos tradicionales.
1.- Siempre se debe trabajar con un cultivo puro de la colonia (cepa) que se desea identificar y la
cual ha sido aislada a partir de un medio de cultivo selectivo apropiado para Enterobacteriáceas
(por ejemplo: Agar MacConkey, Agar VRBD, Agar VRBL, Agar EMB-Levine, Agar XLD,
etc). La pureza de la colonia se debe verificar mediante el método de siembra por estrías,
utilizando un agar no selectivo (por ejemplo: Agar Nutritivo o Agar Tripticasa) incubado a 35-
37ºC durante 24 h.
48
2.- Luego, una porción de una colonia aislada se transfiere a un tubo con Agar Nutritivo
(inclinado) y se incuba por 18-24 h a 35-37ºC.
5.- Tras el periodo de incubación, se procede a la lectura y registro de las propiedades determinadas
en cada uno de los medios diferenciales utilizados. Los resultados se contrastan con los
presentados en las tablas de identificación para miembros de la Fª Enterobacteriaceae.
6.- Finalmente, si la colonia “cepa” es identificada como Salmonella o Escherchia coli, se deberían
confirmar mediante pruebas serológicas. Para Salmonella spp. se utiliza un antisuero polivante
para el antígeno somático (Ag. O) y capsular (Ag. Vi) presentes en salmonelas (Salmonella O
anti-suero poli A-I & Vi, Difco). Mientras que para Escherichia coli se utiliza el antisuero O157
(Oxoid) para determinar si trata del serogrupo O157 (E.coli enterohemorrágica o ECEE),
responsable de “la colitis hemorrágica” y del “síndrome hemolítico-urémico”.
El sistema API-20E, no es más que una tira o una galería, que contiene 20 microtubos o posillos con
distintos substratos deshidratados (Fig.1), que permiten determinar reacciones específicas de
fermentación/oxidación para determinados azúcares, así como la utilización de diferentes substratos
o la presencia de ciertas enzimas (Tabla 1).
49
A
Fig. 1. (A) Galería API-20E sin inocular, (B) Galería API-20E inoculada.
Este sistema presenta las ventajas de ser rápido, eficaz y de permitir realizar numerosas pruebas a la
vez. A partir de un cultivo puro, es posible conocer la identidad de la bacteria problema entre 18-24
h. Los resultados (+) o (-) de cada reacción son traspasados a una hoja de resultados (Fig. 2), la que
permite obtener un perfil numérico de la cepa ensayada. Este perfil numérico es introducido en un
Softoware (APILAB-PLUS), que entrega de forma inmediata la identidad de la cepa problema. No
obstante, en algunos casos puede solicitar la realización de alguna prueba adicional.
50
PROCEDIMIENTO
1.- Reúna el fondo y la tapa de una cámara de incubación y reparta aproximadamente 5 ml de agua
destilada en los alvéolos para crear una atmósfera húmeda. Anote la referencia de la cepa en la
lengüeta lateral de la cámara. Saque la galería de su envase y colóquela en la cámara de
incubación.
3.- Inocule los microtubos (posillos) de la galería, utilizando una pipeta Pasteur estéril o una
micropipeta.
4.- Cubra la cámara de incubación con su tapa e incúbela a 35-37ºC durante 18-24 h.
5.- Tras el periodo de incubación, realice la lectura de la galería para lo cual debe remitirse a la
tabla de lectura (Anexo 1). Anote en la hoja de resultados todas las reacciones espontáneas y
después revele los ensayos que necesitan la adición de reactivos:
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- Prueba de TDA: Agregue una gota del reactivo TDA, un color marrón-rojizo indica una
reacción positiva que se anotara en la hoja de resultados.
- Prueba IND: Agregue una gota del reactivo JAMES, un color rosado que se disipa en toda
la cúpula indica una reacción positiva, que se debe anotar en la hoja de resultado.
- Prueba VP: Agregue una gota del reactivo VP1 y VP2; espere un mínimo de 10 minutos, un
color rosa o rojo indica una reacción positiva que se anotara en la hoja de resultados.
6.- Con los resultados positivos (+) y negativos (-), determine el perfil numérico. En la hoja de
resultados, los ensayos están separados en grupos de tres y se indica para cada uno un valor de
1, 2 ó 4. Como la galería API-20E contiene 20 ensayos, sumando al interior de cada grupo los
valores que corresponden a reacciones positivas, se obtiene un perfil numérico de 7 cifras. Este
es el perfil numérico que debe introducir en el programa de identificación APILAB-PLUS.
Luego, presione ENTER y obtendrá la identidad de la cepa investigada o problema.
ACTIVIDADES
A cada grupo se le proporcionará un cultivo puro y fresco de una cepa aislada en agar VRBD ó
XLD, que previamente han sido confirmadas como miembros de la Fª Enterobacteriaceae, mediante
la tinción de Gram (bacilos Gram-negativos), la prueba de oxidasa (reacción negativa), y la
producción de ácido a partir de la glucosa (reacción positiva).
1.- Identifique la cepa utilizando el método tradicional. Para ello, siembre la cepa proporcionada en
los siguientes medios de cultivos diferenciales: Agar TSI, Agar LIA, Medio MIO, Agar
CITRATO, Agar UREA y Caldo RM-VP. Tras incubar durante 24 h a 35ºC, realice la lectura
de las reacciones en cada uno de los medios de cultivos sembrados y contrástelos con los
proporcionados en las tablas de identificación para Enterobacteriáceas.
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2.- Paralelamente, identifique la cepa utilizando el sistema API-20E, siguiendo el procedimiento
descrito para tal efecto. Tras incubar a 35ºC durante 24 h, proceda a la lectura de los resultados
y obtenga el perfil numérico. Finalmente, para conocer la identidad de la cepa problema,
introduzca el perfil numérico en el Software APILAB-PLUS.
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Anexo 1.- TABLA DE LECTURA DEL SISTEMA API-20E
54
PRÁCTICA Nº7
EFECTO DE LA TEMPERATURA DE INCUBACIÓN Y LA ACTIVIDAD DE AGUA DEL
MEDIO EN EL CRECIMIENTO DE BACTERIAS
______________________________________________________________________________
INTRODUCCIÓN
Los factores intrínsecos que mayor efecto ejercen sobre el comportamiento de los microorganismos
son la disponibilidad de nutrientes, la presencia de sustancias inhibitorias, el pH, el potencial óxido
reducción y la disponibilidad de agua. Entre los factores ambientales o extrínsecos destacan la
temperatura y la tensión de oxígeno.
Estos parámetros físico-químicos pueden ser manipulados con el fin de prolongar la vida útil de los
alimentos y/o controlar el desarrollo de microorganismos patógenos. No obstante, el pH, la actividad
de agua, el potencial óxido-reducción y la temperatura son quizás los que mayor efecto tienen sobre
el crecimiento microbiano, tanto en alimentos como en cultivos artificiales.
Ningún microorganismo es capaz de crecer en todo el rango de pH (1-14), sino que cada
microorganismo tiene un pH óptimo al cual su crecimiento es máximo y un pH mínimo que
corresponde a la acidez máxima que permite su crecimiento. Hay también un pH máximo que
corresponde a la alcalinidad máxima que permite su crecimiento.
La mayoría de las bacterias crecen mejor a pH próximos a la neutralidad o ligeramente alcalinos
(6.8-7.5), aunque pueden crecer entre un rango de 4,5 a 11. Evidentemente existen excepciones,
55
como las bacterias acidolácticas (Bifidobacterium spp., Lactococcus spp., Lactobacillus spp.
Lecuconostoc spp. y Pediococus spp.) y las bacterias acetogénicas (Acetobacter spp. y
Gluconobacter spp.) que toleran bien la acidez (pH 3.0-4.0). Ellas mismas generan esta condición al
producir ácidos a partir de azúcares y/o etanol y, comúnmente se les conoce como bacterias
acidofílicas o acidotolerantes. Existen pocas bacterias que prefieren condiciones netamente
alcalinas (pH 8.5-9.0), sólo algunas especies de Vibrio.
Entre las bacterias patógenas, Staphylococcus aureus presenta el intervalo más amplio de pH (4.0-
9.8). Por su importancia, Clostridium botulinum ha sido objeto de numerosos estudios y se ha
determinado que no crece por debajo de 4.8, aunque por seguridad se toma el pH de 4.5.
Los mohos y levaduras son típicamente acidotolerantes. Éstos, aunque presentan un crecimiento
óptimo a pHs próximos a la neutralidad están dotados de una apreciable capacidad para proliferar en
substratos muy ácidos (con pHs inferiores a 3.0 y hasta valores extremos de 1.5), lo que determina
que sean los principales agentes del deterioro de frutas y otros alimentos ácidos.
Los microorganismos tienen una necesidad absoluta de agua, ya que sin ésta no existe crecimiento.
La cantidad exacta de agua necesaria para el desarrollo de los distintos microorganismos es variable,
pero antes de continuar es preciso aclarar que la totalidad del agua presente en el medio o alimento
(determinada por el porcentaje de humedad) no puede ser utilizada por los microorganismos. Esto se
debe a que una parte de la misma se encuentra ligada a los componentes hidrofílicos del producto
(sales, azúcares y proteínas); solo la parte de agua total que está libre puede ser utilizada por la
célula microbiana para sus exigencias metabólicas. Entonces para determinar la posibilidad de
desarrollo microbiano en un alimento no se utiliza el porcentaje de humedad del mismo sino el
contenido en agua libre o disponible. Esta viene expresada mediante un valor denominado
“actividad agua” (aw) y que se define como la relación entre la presión del vapor de agua del
producto (P) y la presión de vapor del agua pura a la misma temperatura (Po): aw = P / Po.
El valor de aw de un producto se coloca en una escala que va del 0.0 para el aceite (ninguna
disponibilidad de agua libre) al 1.0 para el agua destilada (máxima disponibilidad de agua libre).
La mayoría de los medios de cultivos poseen una aw superior a 0.99, mientras que en los alimentos
es dependiente de su naturaleza y de los tratamientos a que han sido sometidos (deshidratación,
secado, salazón, azucarado, etc.). Así por ejemplo, la leche fresca posee una aw > 0.99; en cambio, en
la leche en polvo es de 0.20.
Cuanto menor es el valor de aw, menor es el contenido en agua libre y tanto mayor será la dificultad
para el desarrollo microbiano, siendo por lo tanto un potente factor seleccionador de la microflora
que se desarrolla sobre un determinado substrato.
56
El efecto que ejercen las altas concentraciones de solutos (azúcares o sales) sobre los
microorganismos pueden deberse a los solutos mismos o a los efectos del soluto sobre la aw. La
adición de solutos no solamente fija el agua del producto sino que además la hacen salir de las
células microbianas por osmosis.
En general las bacterias necesitan valores más elevados de aw para crecer que las levaduras y éstas, a
su vez, necesitan una mayor aw que los mohos. Entre las bacterias, las Gram negativas tienen
necesidades más elevadas en cuanto a aw que las Gram positivas. Con respecto a las bacterias
productoras de intoxicaciones alimentarias, se ha demostrado que Staphylococcus aureus crece a
una aw tan baja como 0.86, mientras que Clostridium botulinum no crece por debajo de 0.94.
La mayoría de las bacterias que alteran alimentos no pueden crecen a una actividad de agua inferior
a 0.91, excepto las bacterias halófilas (Halococcus spp. y Halobacterium spp.) que normalmente
están presenten en ecosistemas marinos. Éstas pueden crecer a una aw de 0.75, por lo que pueden
proliferar y alterar productos salados o salpresados.
La mayoría de las levaduras de importancia en los alimentos presentan una aw mínima de 0.87-0.88;
excepto las levaduras osmófilas (Zygosaccharomyces rouxii), las cuales pueden crecer a una aw de
0.60-0.65, por lo que comúnmente alteran miel, melazas y mermeladas. En cambio, la mayoría de
los mohos de importancia en los alimentos crecen a una aw mínima de 0.80; excepto los mohos
xerófilos (Aspergillus glaucus y Asperguillus echinulatus), que pueden crecer a una aw de 0.60-0.70.
Desde el punto de vista teórico se expresa mediante la ecuación de Nerst y valora la capacidad de un
substrato o alimento para captar (si es oxidante/Eh positivo) o ceder (si es reductor/Eh negativo)
electrones, es decir su capacidad para oxidar o reducir. Ese intercambio o transferencia de electrones
ocasiona una tensión, una diferencia de potencial eléctrico que se valora o se expresa en mV
(milivoltios). Su valor oscila de -420 mV a + 810 mV, pero cuando la concentración de
componentes oxidantes es igual a la de reductores no existe potencial eléctrico y, por tanto, el Eh =
0 mV.
Desde un punto de vista práctico indica las relaciones del oxígeno con los microorganismos vivos,
es decir la tensión (concentración) de O2 que se precisa para el crecimiento de un determinado
microorganismo que, a su vez, está unido al posible efecto tóxico del mismo. Desde este punto de
vista puede ser utilizado para especificar el ambiente en que un microorganismo es capaz de
multiplicarse. Así, si el Eh de un alimento es negativo se comportará como un sistema anaeróbico
(con una baja tensión de O2). En cambio, si es positivo, se comportará como un sistema aeróbico
(con una elevada tensión de O2).
En función del Eh o de las exigencias en O2 y/o toxicidad del mismo los microorganismos
tradicionalmente se dividen en 4 grupos o tipos respiratorios:
57
- Aerobios estrictos u obligados: Requieren Eh elevados o lo que es lo mismo la presencia de O2
como aceptor final de electrones (disponen de catalasa para eliminar el H2O2 que genera su
metabolismo).. En este grupo se encuentran bacterias Gram negativas como Pseudomonas spp.,
Xanthomonas spp., Flavobacterium spp., Alteromonas spp., Acinetobacter spp., Moraxella spp.,
Gluconobacter spp., Acetobacter spp., Brucella spp., Legionella spp., etc. También incluye algunas
bacterias Gram positivas como Micrococcus spp. y muchas de las especies del género Bacillus. La
mayor parte de los mohos se incluyen también en este grupo.
A pesar de que se pueden multiplicar tanto en presencia como en ausencia de O2, en igualdad de
condiciones, lo hacen con más dificultad en anaerobiosis (tiempo generacional mayor) que en
aerobiosis, ya que en el primer caso requieren una mayor cantidad de factores de crecimiento.
- Anaerobios estrictos u obligados: Solo pueden crecer en alimentos con un bajo potencial redox,
casi siempre en ausencia de O2 (es un tóxico para ellos): Poseen obligatoriamente un metabolismo
fermentativo y, además son catalasa negativos. Por las características señaladas, estos
microorganismos solo van a crecer en el interior de alimentos no procesados donde el acceso del
oxígeno está limitado como en las grandes masas musculares (de aquí el uso de un enfriamiento
rápido de las canales recién obtenidas). De igual modo, los alimentos enlatados y los envasados al
vacío o en atmósferas modificadas corren el riesgo de permitir la multiplicación de estos
microorganismos. En este grupo hay bacterias Gram positivas como Clostridium spp. (Clostridium
perfringens tolera alimentos con Eh ligeramente positivos), Bifidobacterium spp., y
58
Desulfotomaculum nigrificans. Aunque en este grupo hay bacterias Gram negativas, no tienen
mayor importancia en microbiología de alimentos.
- Microaerófilos: Crecen mejor bajo condiciones ligeramente reducidas (85% de N2, 10% de CO2 y
5% de O2) o bajo un intervalo reducido de Eh. Lactobacillus spp., Campylobacter jejuni y
Helicobacter pylori son un claro ejemplo de éstas.
Temperatura
Los microorganismos pueden crecer en un amplio rango de temperaturas. No obstante, cada especie
requiere un estrecho margen de temperaturas que está determinado por la sensibilidad al calor de sus
sistemas enzimáticos. Aí se puede hablar de:
Temperatura máxima de crecimiento: La temperatura más alta a la cual existe crecimiento. Por
encima de ella la mayoría de las enzimas se destruyen y el microorganismo muere.
Microorganismos psicrófilos: Aquellos que tienen una temperatura óptima de crecimiento de 15ºC o
más baja, comprendiendo su rango entre < 0ºC y 20ºC. Son los microorganismos dominantes en los
alimentos refrigerados: carnes, pescados, leche, verduras. Comprenden numerosos géneros,
destacando entre ellos Pseudomonas sp., Vibrio sp., Erwinia sp., Flavobacterium sp.,
Carnobacterium sp., Brochothrix sp., Lactobacillus sp. y Enterococcus sp.
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Microorganismos mesófilos: Aquellos que tienen una temperatura óptima de 20-45ºC, con un rango
comprendido entre 15ºC y 48ºC. A este grupo pertenecen la mayoría de las especies patógenas para
el hombre y los animales (como es lógico pensar), y otras muchas que alteran los alimentos
almacenados a temperatura ambiente o alimentos refrigerados cuando se ha roto la cadena del frío.
Incluye a la mayoría de las especies de la Fª Enterobacteriaceae (Escherichia coli, Salmonella spp.,
Proteus spp., etc), de los género Bacillus, Clostridium y Staphylococcus (Staphylococcus aureus).
Microorganismos termófilos: Aquellos que tienen una temperatura óptima de 50-60ºC, con un rango
de crecimiento entre 40 y 75ºC. Por ejemplo: Geobacillus stearothermophilus y
Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum. Estos microorganismos ocasionan problemas en
las conservas tropicales, puesto que en estas zonas se alcanzan temperaturas que pueden permitir su
crecimiento. En la industria conservera es una de las razones que determinan u obligan al
enfriamiento rápido de las conservas una vez han salido del autoclave o del proceso de
esterilización.
Microorganisnos hipertermófilos: Aquellos que tienen una temperatura óptima de 80ºC, pero no
crecen por debajo de 65ºC ni por encima de 110ºC. Por ejemplo: Sulfolobus sp. y Thermus sp.
Todos los factores anteriormente señalados pueden ser manejados y constituyen la base de algunos
sistemas de conservación de alimentos. Así por ejemplo, los alimentos fermentados se caracterizan
por presentar un pH bajo o una acidez elevada; los alimentos salados, confitados y deshidratados se
distinguen por su aw reducida y; los alimentos empacados en atmósferas modificadas o al vacío se
diferencian por presentan un Eh negativo (baja tensión de oxígeno). Por su parte los alimentos
refrigerados y congelados se caracterizan por estar sometidos a condiciones donde el crecimiento
microbiano está controlado por efecto de las temperaturas bajas y/o por la baja disponibilidad de
agua producto de la congelación.
ACTIVIDAD
1. Cada grupo recibirá 4 tubos con cultivos frescos de Pseudomonas fluorescens, Listeria
monocytogenes, Escherichia coli y Geobacillus stearothermophilus, más 5 placas con Agar
Tripticasa.
2. Con un lápiz marcador divida el fondo de las placas en 4 sectores y en cada uno de ellos coloque
el nombre de las especies bacterianas que se estudiarán.
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3. En cada uno de los sectores rotulados, siembre con asa curva y mediante el método de
agotamiento por estrías, una alícuota de los respectivos cultivos.
5. Tras un periodo de incubación de 5-7 días, observe y anote las variaciones que se producen en el
crecimiento de los cultivos, según la temperatura de incubación. Anote la cantidad de
crecimiento mediante los siguientes signos:
0 = Ningún crecimiento.
+ = Poco crecimiento.
++ = Crecimiento moderado.
+++ = Crecimiento muy bueno.
1. Cada grupo recibirá 4 tubos con cultivos frescos de Pseudomonas fluorescens, Listeria
monocytogenes, Escherichia coli y Staphylococcus aureus, más 4 placas con Agar Tripticasa
suplementado con NaCl al 1, 5, 10 y 15% (p/v).
2. Con un lápiz marcador divida el fondo las placas en 4 sectores y en cada uno de ellos coloque el
nombre de las especies que se estudiarán.
3. En cada uno de los sectores rotulados, siembre con asa curva y mediante el método de
agotamiento, por estrías una alícuota de los respectivos cultivos.
5. Tras el periodo de incubación observe y anote las variaciones que se producen en el crecimiento
de los cultivos, según la concentración de NaCl presente en el medio. Anote la cantidad de
crecimiento mediante los siguientes signos:
0 = Ningún crecimiento.
+ = Poco crecimiento.
++ = Crecimiento moderado.
+++ = Crecimiento muy bueno.
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PRÁCTICA Nº 8
CARACTERIZACIÓN DE HONGOS: MOHOS Y LEVADURAS
________________________________________________________________________________
INTRODUCCIÓN
Los hongos son organismos eucariotas, no fotosintéticos, que presentan paredes celulares
compuestas principalmente de quitina. Son heterótrofos, es decir obtienen sus nutrientes a partir de
compuestos orgánicos complejos que son solubilizados por sistemas enzimáticos específicos y son
absorbidos a través de su pared celular y membrana plasmática. Estos organismos pueden ser
unicelulares (levaduras) o pluricelulares “filamentosos” (mohos).
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Esporangiosporas
Conidiosporas
Esporangio
Células conidiogénicas
Esporangióforo
Conidióforo
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Los mohos y levaduras pueden estar presentes en cualquier substrato que les aporte los nutrientes
necesarios para su supervivencia o desarrollo. A diferencia de las bacterias, poseen una gran
habilidad para desarrollarse en substratos ricos en azúcares, con una reducida actividad de agua y un
pH bajo. Por esta razón, los mohos son los principales alterantes de frutas frescas y deshidratadas,
granos y productos farináceos. Las levaduras por su parte, son responsables de la alteración de salsas
para ensaladas, mayonesa, zumos de frutas y productos azucarados (mermeladas, miel, melazas,
etc).
La principal fuente de contaminación por hongos en la industria de alimentos son el aire, el suelo y
el agua. Las materias primas también son una importante fuente de contaminación, especialmente
aquellas de origen vegetal.
En la industria alimentaria, el estudio de los hongos está especialmente enfocado hacia los
responsables del deterioro de los alimentos y de aquellos productores de micotoxinas.
Entre los principales géneros de levaduras que contienen especies alterantes están: Brettanomyces,
Pichia, Saccharomyces, Hansenula, Zigosaccharomyces, Schizosaccharomyces, Kluyveromyces,
Torulopsis, Candida, Debaryomyces y Rhodotorula. Mientras que las principales especies de mohos
alterantes y/o micotoxigénicos pertenecen a los géneros: Aspergillus, Penicillium, Fusarium,
Alternaria, Cladosporium, Geotrichum, Byssochlamys, Mucor y Rhizopus (los géneros subrayados
contienen especies micortoxigénicas).
CULTIVO DE HONGOS
Para el cultivo de mohos y levaduras se utilizan medios de cultivos que se caracterizan por contener
una alta concentración de azúcares y un pH ácido. Entre los medios frecuentemente utilizados están
el Agar Papa-Glucosa, Agar Extrato de Levadura, Agar Extracto de Malta y Agar DRBC (Dicloran-
Rojo de Bangala-Cloranfenicol). La selectividad de estos medios puede ser mejorada añadiendo un
antibiótico de amplio espectro (por ejempleo, Cloranfenicol o Oxitetraciclina) o bien adicionando
ácidos orgánicos para reducir su pH (≤4.5). La temperatura óptima para el cultivo levaduras y
mohos fluctúa entre 22 y 25ºC., obteniéndose colonias bien desarrolladas entre el 3er y 5to día de
incubación.
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La identificación de mohos es más difícil y tediosa, pues se basa principalmente en el estudio de las
características morfológicas de las colonias (macro- y microscópicas) así como de los detalles de sus
estructuras reproductivas (órganos reproductores y esporas). Para ésto se requiere de una gran
experiencia y del uso de claves generales de identificación que permiten llegar hasta el nivel de
género. Si se desea identificarlos hasta el nivel de especie se deben utilizar claves específicas para
cada género.
El objetivo de esta sesión práctica es que los alumnos aprendan las técnicas de manipulación de
diferentes tipos de hongos. Así mismo, que conozcan las principales características morfológicas
(macro- y microscópicas) de los principales géneros de hongos encontrados en los alimentos.
ACTIVIDADES:
Cada grupo recibirá tres placas de Agar Extracto de Malta sembradas con Saccharomyces
cerevisiae, Debaryomyces hansenii y Rhodotorula sp.:
- A simple vista describa la forma, tamaño, aspecto, textura y color de las colonias de cada una de
las levaduras.
- Preparé un frotis fresco de cada una de las levaduras y obsérvelas en el microscopio de contraste
de fases a 400 y 100 aumentos. Detalle las características morfológicas de la célula.
Cada grupo recibirá un set de placas con Agar Extracto de Malta sembradas con Aspergillus niger,
Penicillium sp., Alternaria sp, Cladosporium sp., Fusarium spp. Mucor sp. y Rhizopus sp.
- A simple vista describa la forma, tamaño y el tipo de colonia, así como las características del
micelio (algodonoso, aterciopelado, velloso, etc.), color del micelio, producción de exudados y
cambios de color en el medio.
- Prepare un frotis fresco de cada una de las colonias de mohos:
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o agite la colonia, pues no podrá observar las complejas y delicadas estructuras,
creando así una distorsión o error en el diagnóstico.
o Cubra la preparación con una lámina cubreobjetos y obsérvala en el microscopio de
contraste fases con los objetivos de 10X y 40X.
o Ubique y describa las estructuras reproductivas (conidióforos, conidios,
esporangióforos, esperonagios, zigosporas, etc). Determine además si las hifas son
tabicadas (hongos superiores) o cenocíticas (hongos inferiores).
o Determine el género, comparando las observaciones con los esquemas de las claves
auxiliares de identificación o con los esquemas y/o figuras que se muestran a
continuación.
MOHOS
Penicillium sp.
.
Aspergillus sp.
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Fusarium sp.
Rhizopus sp.
Mucor sp.
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Alternaria sp.
Cladosporium sp.
68
LEVADURAS
Saccharomyces sp.
Debaryomyces hansenii
Rhodotorula sp.
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Alternative Proxies: