INSTITUTO TECNOLOGICO DE BOCA DEL RÍO

PRACTICA: AISLAMIENTO DE PROTEINAS

Materia: BIOQUIMICA

Profesora: LAURA MARGARITA GONZALEZ MARTINEZ

Carrera: LIC. EN BIOLOGIA

Alumno: UTRERA GRAJALES ALÍ

Semestre: 2°

Grupo: A

15 DE MARZO DEL 2018

 LABORATORIO DE BIOQUIMICA

PRACTICA

AISLAMIENTO DE PROTEÍNAS

INTRODUCCIÓN

En bioquímica es muy común aislar y purificar proteínas para estudiar su composición, su estructura y
de ser posible su función, como es este caso de las enzimas. Para dicha purificación se emplean métodos
basados en sus propiedades de solubilidad. Cada proteína tiene una composición de aminoácidos
específica que las hace diferentes unas de otras y, por lo tanto, su comportamiento en disoluciones
también es diferente. Por lo general las proteínas fibrosas son in solubles en agua y resistentes a la
degradación enzimática, sin embargo, con soluciones de cierta fuerza iónica se pueden solubilizar. Las
proteínas globulares son relativamente más solubles en agua y en soluciones de baja fuerza iónica,
aunque algunas coagulan cuando se calientan.

La composición de aminoácidos, es también responsable del comportamiento de las proteínas en

diferentes condiciones de pH. Así al acidificar o alcalinizar una determinada proteína, ésta puede llegar a
su punto isoeléctrico, es decir, alcanzar una carga neta de cero y por lo tanto precipitar. La leche es un
producto rico en proteínas, tales como las caseínas y globulinas, además de contener carbohidratos y
ácidos grasos. De la leche se puede separar la caseína por precipitación en su punto isoeléctrico (pH 4.6).
El huevo también es un producto con una buena cantidad de nutrientes, tal como la ovoalbúmina, la cual
se clasifica como fosfoglucoproteína por tener hidratos de carbono y fósforo. La precipitación de esta
proteína con una solución saturada de (NH4)2SO4 permite aislarla del resto de las proteínas que se
encuentran en la clara del huevo. Existen factores que afectan el estado nativo de las proteínas, sin
embargo, éstas pueden someterse a una purificación parcial empleando técnicas bioquímicas sencillas
como la centrifugación, diálisis y cromatografía.

OBJETIVO GENERAL Poner en práctica los métodos bioquímicos para la purificación parcial de proteínas,
basados en sus propiedades de solubilidad.

OBJETIVO PARTÍCULAR • Aislar caseína de la leche a partir de su punto isoeléctrico • Aislar la albumina
de la clara de huevo por precipitación con sulfato de amonio.

• Familiarizar al alumno con el uso de la centrífuga.

MATERIALES

1 Probeta de 100 mL

Gasa

1 Probeta de 50 mL

2 Vasos de Precipitados de 250 mL

1 Vaso de Precipitados de 100 mL

 2 Pipetas Graduadas de 5 mL

4 Tubos de Centrifuga de 50 mL

1 Centrífuga

1 Agitador de Vidrio

1 Matraz Kitazato

1 embudo buchner

1 Potenciómetro

1 pizeta

1 Parrilla eléctrica c/agitador magnético

REACTIVOS

(NH4)2SO4

Ácido Acético Glacial

Acetato de Sodio

Etanol

Acetona

Éter Etílico

ALUMNOS

4 Viales de Vidrio

120 mL de Leche Cruda de establo (no Industrializada)

2 Pipetas Pasteur

1 Huevo Fresco

1 Embudo de Vidrio

1 Palangana

Soluciones:

• Solución de HCl al 20% (v/v)

• Solución de ácido acético 1.0M

 • Solución amortiguada de (NH4)2SO4 Preparación: Agregar 780 g de (NH4)2SO4 a un litro de agua y
calentar por agitación. Adicionar 12.3 g de acetato de sodio. Enfriar y añadir 9 mL de ácido acético
glacial. Dejar que sedimenten los cristales, use solo el sobrenadante.

METODO A. Obtención de la Caseina.

1. El día anterior a la práctica, dejar enfriando la leche para que se separe la parte lipidica.

2. Al iniciar la práctica, eliminar los lípidos que se encuentran en la superficie con una pipeta Pasteur 3.
Después de haber eliminado los lípidos, tomar 3 mL de la leche y guardar en el refrigerador en un vial
previamente etiquetado.

4. Colocar 100 mL de la leche descremada en un vaso de precipitados de 250mL junto con el agitador
magnético y agitar suavemente sobre la parrilla.

5. Calibrar el potenciómetro con las soluciones patrón de pH 7 y pH 4.6

6. Introducir el electrodo en el vaso con leche, cuidando no golpearlo con el agitador magnético.

7. Adicionar lentamente, con una pipeta Pasteur, la solución de HCl al 20% hasta ajustar el pH a 4.6.

8. En el punto isoeléctrico se formará un precipitado voluminoso. En ese momento se detiene la

agitación y se deja reposar durante 10 minutos a temperatura ambiente.

9. Mezclar la suspensión por unos cuantos minutos y distribuirla en tubos de centrífuga, procurando
recuperar todo el precipitado.

10. Equilibrar los tubos por parejas y centrifugar a 2000 rpm durante diez minutos.

11. Verter el sobrenadante en una probeta y anotar el volumen total. Tomar 3 mL de éste y guardarlo en
un vial previamente etiquetado. El resto se desecha.

12. El precipitado de todos los tubos se coloca en un vaso. Agregar 20 mL de agua y agitar sobre una
parrilla con un agitador magnético, hasta obtener una suspensión homogénea. Este lavado es para
eliminar el HCl.

13. Colocar la suspensión en un solo tubo de centrífuga efectuar el proceso de centrifugación a 2000 rpm
durante diez minutos. Desechar el sobrenadante y repetir los lavados con agua dos veces más.

14. Al eliminar el agua del último lavado adicionar 10 mL de etanol al precipitado y homogeneizar con un
agitador de vidrio. Volver a centrifugar para eliminar el etanol.

15. Finalmente, lavar con acetona y éter etílico de la misma forma que se hizo con el alcohol. 16.
Recuperar el precipitado y colocarlo en papel aluminio, en forma extendida, para que se seque y forme
un polvo.

Obtención de Albúmina.

1. Colocar la clara de huevo en una probeta y medir su volumen, evitando que se rompa la yema.

2. Verter la clara en un vaso de precipitados, agregar la décima parte de su volumen de ácido acético 1.0
M y agitar.
3. Filtrar la albúmina acidificada a través de cuatro capas de gasa, agitando fuertemente con una varilla
de vidrio para acelerar el proceso.

4. Al filtrado añadir un volumen igual de la solución de sulfato de amonio amortiguado, y agitar. Dejar
reposar la solución durante 15 minutos en un baño de hielo.

5. Separar el precipitado que contiene ovoalbúmina y ovomucina centrifugando a 3000 rpm durante diez
minutos.

6. Al sobrenadante que contiene la albúmina, añadir pequeñas cantidades de la disolución de sulfato de

amonio: se notará una ligera turbidez que desaparecerá al agitar. Siga vertiendo sulfato de amonio y
agite hasta que la turbidez ya no desaparezca, agregar un poco más para permitir que la albúmina
precipite.

7. Dejar la mezcla a temperatura ambiente durante aproximadamente dos horas

8. Eliminar el sobrenadante por centrifugación.

9. Suspender la albúmina en 5 mL de acetona y recuperar filtrando en un embudo Buchner.

10. Colocar el residuo en un papel aluminio y dejar que seque completamente al aire. Guardar en un vial
etiquetado.

Las soluciones utilizadas en esta práctica pueden eliminarse en la tarja, manteniendo la llave del agua
abierta para diluir y al terminar lavar la tarja.

RESULTADOS

1. ¿Cuántos gramos de caseína obtuvo?

100ml de leche
2. ¿Qué porcentaje representa del volumen inicial?
3L=100%

100Ml=33.33%

3. ¿Cuántos gramos de albúmina obtuvo?

0.0572 miligramos de albumina.

4. ¿Qué porcentaje representa del volumen de la clara?

El porcentaje de albúmina obtenido fue de %0.16

CUESTIONARIO

1. ¿Qué volumen de leche utilizó para la extracción de caseína?

100 de leche.
2. ¿El precipitado de caseína apareció exactamente a pH 4.6 o requirió acidificar más? Explique.
El precipitado de la caseina comenzo con un pH de 6.3 a partir de este fue dependiendo hasta
alcanzar el pH de 4.6.
Estos son los pH desde el que comenzo hasta lograr tener su pH exactamente de 4.6 despues de
acidificar la leche: 6.3, 6.2, 5.8, 5.6, 5.5, 5.3, 5.2, 5.0, 4.9, 4.92, 4.84, 4.82, 4.76 y 4.69.
 3. ¿Para que tuvo que lavar la caseína con agua?
Para poder desprender los residuos de los recipientes que se quedaron adheridos a ellos.
4. ¿Los lavados con los solventes orgánicos eran necesarios? ¿Por qué?
Si, para poder desprenderlos mas facilmente de los materiales utilizados.

5. Según la literatura, ¿Cuántos gramos debía obtener? ¿Fue bueno el rendimiento?

Según la literatura de 100ml se obtienen un 7, no fue suficiente ya que no llego tan siquiera ni a
1%.

6. ¿Cuál fue el volumen total de la clara de huevo?

34 mililitros

7. ¿Cuál es la razón de agregar ácido acético y filtrar a través de gasas?

El acido acetico es empleado para que logre precipitar

Filtrar con gasas es para poder purificar lo mas posible esta sustancia.

8. Aproximadamente ¿a qué concentración de sulfato de amonio precipita la ovomucina y la

ovoglobulina, de acuerdo el volumen de sulfato de amonio que adicionó? y ¿Cuál es la concentración de
sulfato de amonio a la que precipita la albúmina?

Empezo a precipitar la ovomucianay la ovoglobulina a una concentracion de 60% y la albumina al

100%

9. De acuerdo con lo reportado en la literatura. ¿Cuánta albúmina tiene el huevo? Compárelo con su
resultado.

Ovoalbumina 60% y 65%, Ovomucina 2%, Conalbulina 14%, Ovomucoide 2%.

CUESTIONARIO

1. ¿Qué tipo de proteínas son la caseína y la albúmina estructural y funcionalmente?

CASEINA
La caseína es una proteína de la leche del tipo fosfoproteína que se separa de la leche por
acidificación y forma una masa blanca. Las fosfoproteínas son un grupo de proteínas que están
químicamente unidas a una sustancia que contiene ácido fosfórico, por lo tanto su molécula contiene
un elemento fósforo. La caseína representa cerca del 77 al 82 por ciento de las proteínas presentes
en la leche y el 2.7 por ciento en la composición de la leche líquida.

ESTRUCTURAL

Las moléculas individuales de caseína se caracterizan en general por tener un tamaño mediano (unos
200 aminoácidos, siendo algo menor la caseína κ) contar con pocos tramos con estructura secundaria
organizada, debido a la presencia de abundantes restos de prolina, y tener unidos covalentemente
grupos fosfato a algunos de los restos de serina, y muy ocasionalmente a restos de treonina. La falta de
organización de las moléculas de caseína ha hecho que hasta el momento ninguna haya podido
cristalizarse para llevar a cabo estudios detallados de su estructura secundaria y terciaria.
FUNCIONALIDAD
En la alimentación especial, la caseína sirve para la elaboración de preparados médicos y concentrados
proteicos destinados a la alimentación de los deportistas, especialmente después de su entrenamiento. Así,
se ha observado que la digestión de las caseínas es más lenta que la de las lactoproteínas solubles y, por ello,
más apropiada para reparar el anabolismo de los aminoácidos durante el período que sigue a una comida.

ALBUMINA
La albúmina es una sustancia orgánica nitrogenada, viscosa, soluble en agua, coagulable por el calor,
contenida en la clara de huevo.
La clara, también conocida como albumen, tiene un 88 por ciento de agua y el resto está constituido
básicamente por proteínas de la clara, siendo la principal la ovoalbúmina, que representa el 54 por
ciento del total proteico.
La albúmina de huevo se obtiene al separar mecánicamente la clara de la yema y posteriormente se
efectúa un deshidratado de la clara, la cual proporciona proteínas sin elevar el nivel de colesterol, debido
a que se encuentra separada de la yema (principal fuente de grasa), conteniendo la clara por si sola cerca
de uno por ciento de grasa.

ESTRUCTURAL
Es llamada fosfoglucoproteína integrada por tres fracciones, A1, A2 y A3, en una proporción de 85:12:3,
respectivamente, que se diferencian por su contenido en fósforo. Es rica en cisteína y metionina y
presenta grupos sulfhidrilos (es la única de las proteínas de huevo que posee esta característica) y se
puede decir que la presencia de estos grupos sulfhidrilos hacen una gran contribución aparte del sabor,
textura y aroma característicos del huevo.
FUNCIONALIDAD

En los casos especiales de intoxicación por metales pesados (tales como el hierro) se puede
administrar unas dosis de ovoalbúmina. La ovoalbúmina está relacionada con los metales
pesados y su misión es la de atrapar los iones de los metales pesados debido a la presencia de
las uniones sulfhídricas de la proteína. Su coagulación tras el proceso de absorción previene la
absorción de metales en el tracto gastrointestinal previniendo el envenenamiento. En algunos
casos, es utilizada para aliviar quemaduras o como regenerador de la piel.

2. ¿Qué métodos se conocen para aislar y purificar proteínas?

Centrifugacion duferencial
Cromatografia
Electroforesis
Desnaturalizacion reversible con sulfato de amonio
Dialisis
Espectroscopio Ultravioleta-visible
Ensayo enzimatico
Fraccionamiento celular
Homogenizacion
3. ¿Qué es el punto isoeléctrico de una proteína?
El pI es el pH en el que la molécula se disocia por igual en ambos sentidos, y como equidista de
los dos valores de pK
4. ¿Por qué las proteínas precipitan con altas concentraciones de sales?
Como es un fenomeno basado en las interacciones electrolito-no electrolito, que a las altas
concentraciones salinas ayuda a la precipitacion o cuagulacion de la proteina debido al aumento
de las interacciones hidrofobicas.
5. ¿Qué efecto tienen los solventes orgánicos sobre las proteínas?
Los disolventes organicos interaccionan con el interior hidrofobico de las rpoteinas y desorganiza
la estructura terciaria, provocando su desnaturalizacion y precipitacion.
6. ¿En que se basa la centrifugación para separar partículas de diferente tamaño?

Puesto que el el primer paso de aislamiento de una proteina es extraerla de la celula e incluirla
en una solucion. Se basa o se requiere de un mecanismo o ruptura para liberar su contenido.
Para lograr la lisis celular se basa en una forma de aplastar o moler seguido de una filtracion para
retirar las particulas insolubles.

7. ¿Cuántos tipos de centrífugas se conocen?

Centrifuga de rotor fijo.

Centrifuga de rotor basculante.
Centrifugas analiticas.
preparatorias.
Centrifugas de mesa.
Minicentrifugas.
Centrifugas de alta velocidad.
Ultracentrifugas.

8. ¿Todos los métodos de extracción de proteínas las desnaturalizan?

No todos los metodos de extraccion de proteinas las desnaturalizan si la proteina no ha sufrido

ningun cambio en su interaccion con el disolvente se dice que presenta una estructura nativa. Se
llama desnaturalizacion de las proteinas a la perdida de las estructuras de orden superior
(secundaria, terciaria y cuaternaria), quedando la cadena polipertidica reducida a un polimero
estadistico sin ninguna estructura.

OBJETIVOS PARTICULARES
Aislar albúmina apartir de la clara de huevo.
Familiarizar al alumno con el uso de la centrifuga.

METODOLOGIA
Primero lo que se hizo fue tomar el huevo y romper el cascaron con mucho
cuidado y verter solo la clara de huevo con mucho en la probeta.

Despues se procedio a medir que cantidad de clara de huevo se obtuvo que

en nuestro caso fue de 34 ml de clara de huevo.

De ahí se procedio a agregarle la decima parte del volumen que se obtuvo

de la clara, de acido acetico, la cual fue 3.4 ml.

Se procedio a filtrar la solucion con unas gasas que la maestra nos

proporciono, a esa gasa se le hicieron dobleses de modo que
quedaran 4 capas de gasa y se paso a filtrarlo en el embudo y moverlo
con una varilla de vidrio para acelerar el proceso de filtrado.
 La solucion que quedo filtrada se le agrego sulfato de amonio y se agito para
posteriormente dejar reposando 15 minutos en baño de hielo. Despues de
dejar reposar 15 minutos a la solucion en baño de hielo se separo el
precipitado que contiene ovoalbúmina y ovomucina centrifugando a 3000
rpm durante 10 minutos. Al sobrenadante se le agregaron pequeñas
cantidades de sulfato de amonio para que la albumina se precipitara. Se
dejo durante dos horas reposar a temperatura
ambiente

Pasadas las 2 horas se centrifugo nuevamente para eliminar el sobrenadante.

Al dia siguiente se prosiguio con la parctica ya que el tiempo se nos habia

agotado. Se prosiguio a filtrar la albumina con acetona agregando cantidades
de acetona a la albumina que se encontraba dentro del tubo de ensayo. Se
procedio vertir la albumina en el embudo filtar, que tenia dentro de el un papel
aluminio para que la proteina la cual era la albúmina se quedara en ese papel.

La proteina que quedo en el papel se dejo secar a temperatura

ambiente y luego de que se seco se hizo el peso de la albumina que
obtuvimos.
 CONCLUSION

Se cumplieron con los objetivos que era la obtencion de la proteina albúmina y caseina por medio de la
precipitacion de la clara de huevo y leche respectivamente. Se utilizaron metodos diferidos aunque se
llego al objetivo de la obtencion aunque no se obtuviera una proteína pura. Aprendiendo tambien la
impotancia de la precipitacion de las proteinas y familiarizarnos con la centrifuga.

BIBLIOGRAFIA

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2. Clark J. M. Jr 1964. Experimental Biochemistry. W. H. Freeman and Company E.U.A.

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Voet, D. y Voet, G. J. 1995 Bioquímica, Omega Ediciones, Barcelona.

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6. Mathews C. K., Van Holde K. E., Ahern K. G. 2003. Bioquímica. Addison-Wesley,