Microsatellites For Ecologists ES

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Ecology Letters, (2006) 9:615–629 doi: 10.1111/j.1461-0248.2006.00889.x
REVISIONES A ND
SÍNTESIS
Microsatélites para ecologistas: una guía práctica de
utilización y evaluación de marcadores de
microsatélites
Resumen
Kimberly A. Selkoe1,2* y Robert Las recientes mejoras en el análisis genético y los métodos de genotipado han dado
J. Toonen2 1Departamento de lugar a una rápida expansión del poder de los marcadores moleculares para abordar
Ecología, cuestiones ecológicas. Los microsatélites han surgido como el tipo de marcador más
Evolution and Marine Biology, popular y versátil para aplicaciones ecológicas. El aumento de los servicios comerciales
University of California, Santa
que pueden aislar microsatélites para nuevas especies de estudio y muestras de
Barbara, CA 93106, USA
2University
genotipos a precios razonables ofrece a los ecologistas la capacidad sin precedentes de
of Hawai'i at Manoa,
emplear enfoques genéticos sin grandes inversiones en equipo especializado. Sin
School of Ocean & Earth
Science & Technology, Hawai'i
embargo, la falta de información accesible y sintetizada sobre los aspectos prácticos y
Institute of Marine Biology, los riesgos de la utilización de herramientas genéticas impide a los ecologistas tomar
Coconut Island, PO Box 1346, decisiones informadas sobre la utilización de enfoques moleculares y crea el riesgo de
Kane'ohe, Hawai'i 96744 que algunos utilicen microsatélites sin comprender los pasos necesarios para evaluar la
*Correspondencia: Correo calidad de un conjunto de datos genéticos. El primer objetivo de esta síntesis es
electrónico: proporcionar una visión general de los puntos fuertes y las limitaciones de los
selkoe@nceas.ucsb.edu marcadores de microsatélites, así como de los riesgos, los costes y los plazos de
aislamiento y utilización de los microsatélites con la ayuda de los servicios comerciales.
El segundo objetivo es fomentar el uso y la presentación de informes coherentes de un
cribado exhaustivo de los marcadores para garantizar unos datos de alta calidad. Para
ello, presentamos un proceso de selección de varios pasos para evaluar los loci
candidatos para su inclusión en un estudio genético que está ampliamente dirigido tanto
a genetistas principiantes como a genetistas experimentados por igual.
Palabras clave
Homoplastia, acoplamiento, aislamiento de marcadores, herencia mendeliana,
microsatélites, ecología molecular, neutralidad, alelos nulos, genética de poblaciones,
repeticiones de secuencias simples.
Cartas ecológicas (2006) 9: 615-629
(véase el Cuadro 1). Los microsatélites han surgido como una

IN T R OD U C TI ÓN de las opciones más populares para estos estudios, en parte
En la última década, los enfoques genéticos para responder porque tienen el potencial de proporcionar estimaciones
a las preguntas ecológicas se han vuelto más eficientes, contemporáneas de la migración, tienen el poder de
poderosos y flexibles, y por lo tanto más extendidos. Los resolución para distinguir tasas relativamente altas de
marcadores genéticos como las alozimas, los microsatélites migración de la panmixia y pueden estimar la relación de los
y las secuencias de ADN mitocondrial y nuclear pueden individuos. Varias revisiones recientes detallan la miríada de
utilizarse para estimar muchos parámetros de interés para técnicas de análisis genético ahora disponibles y las cuestiones
los ecologistas, como las tasas de migración, el tamaño de la ecológicas que pueden abordar (Bossart & Prowell
población, los cuellos de botella, el parentesco y otros
2006 Blackwell Publishing Ltd/CNRS
1998; Cruzan 1998; Davies et al. 1999; Luikart & England
1999; Shoemaker et al. 1999; Sunnucks 2000; Manel et al.
2003, 2005; Beaumont & Rannala 2004; Pearse & Crandall
2004). Estas revisiones animan a los ecologistas a utilizar
enfoques genéticos, pero todavía no hay textos o manuales
publicados que guíen a los recién llegados en la parte más
práctica de la adopción y aplicación de estas técnicas. Esta
síntesis pretende ser una pieza complementaria a estas
revisiones para ayudar a aplanar la curva de aprendizaje de
la genética aplicada a las poblaciones. Sin embargo,
aquellos que intentan usar microsatélites por primera vez
necesitarán también leer muchos de los documentos más
técnicos citados aquí y buscar la orientación de un
genetista de poblaciones experimentado.
Hay dos factores distintos que contribuyen a los
recientes avances técnicos de la ecología molecular. En
primer lugar, las técnicas de laboratorio se han
racionalizado y son menos costosas, lo que permite el uso
de un gran número de muestras y muchos loci. En
segundo lugar, las mejoras en la tecnología informática

616 K. A. Selkoe y R. J. Toonen
Tabla 1 Breve resumen de algunas cuestiones ecológicas que pueden abordarse utilizando marcadores genéticos neutros, ordenados por tipo
de datos requeridos
Requiere datos de frecuencia de alelos multilocales*
¿De qué población se originaron estos individuos?
¿Cuántas poblaciones hay?
Requiere una secuencia altamente polimórfica o microsatélite
data†
¿Se expandió o contrajo la población en el pasado
reciente? ¿Las poblaciones difieren en tamaño pasado y
presente ?
Requiere genotipo multilocus identification‡
¿Cuáles son las relaciones genéticas de los individuos?
¿Qué personas se han mudado? (es decir, marcar/recapturar marcas
naturales) ¿Qué individuos son clones?
Funciona con muchos marcadores types†
¿Cuál es la distancia media de dispersión de la descendencia (o
gametos)? ¿Cuáles son las relaciones fuente-fregadero entre las
poblaciones?
¿Cómo afectan las características del paisaje a la estructura de la población y
a la migración? ¿Cuál es la dinámica de extinción/recolonización de la
metapoblación? ¿Cambió la estructura o conectividad de la población en el
pasado reciente ?
Ver Pearse & Crandall (2004) y otras referencias en el texto para más detalles.
*Estos análisis podrían requerir >10 microsatélites - el número está inversamente correlacionado con el grado de diferenciación genética
entre las poblaciones. Las especies con bajas tasas de migración y/o poblaciones pequeñas requerirán menos loci.
†Using >1 locus atenuará sustancialmente el error de muestreo del interlocus.
‡Often requiere microsatélites, pero también es posible con técnicas de huellas dactilares de AFLP y RAPD - ver Sunnucks 2000 para la
comparación de marcadores. RAPD, ADN polimórfico amplificado aleatoriamente; AFLP, polimorfismo de longitud de fragmento
amplificado.
han inspirado el uso de enfoques estadísticos intensivos cualquier especie, y muchas otras empresas e instalaciones
tales como la teoría de la probabilidad bayesiana y la universitarias centralizadas que extraerán y genotiparán ADN
simulación de la cadena de Monte Carlo Markov. Estas de una colección de muestras de tejido y enviarán un
nuevas aprobaciones utilizan más información en un conjunto completo de datos en cuestión de semanas por un
conjunto de datos que las estadísticas resumidas de los precio razonable. Estos servicios y sus costos relativamente
enfoques tradicionales (por ejemplo, FST, una medida de bajos son el resultado directo del uso ubicuo del aislamiento
las diferencias de frecuencia de alelos entre poblaciones), y de marcadores y el genotipado en las ciencias médicas para
porque el conjunto de datos típico hoy en día contiene 102- aplicaciones tales como el mapeo de la vinculación de
103 enfermedades.
de los individuos muestreados en muchos loci, hay más
poder para describir la demografía y la historia de las
poblaciones y las relaciones de los individuos de una
manera detallada. Estos avances permiten que muchas
cuestiones ecológicas básicas sean abordadas con
herramientas genéticas por primera vez o de nuevas
maneras (Tabla 1). En los últimos 5-10 años, se han
desarrollado docenas de programas de software que utilizan
las herramientas estadísticas mencionadas anteriormente
para abordar estas líneas de interrogatorio (ver Pearse &
Crandall 2 0 0 4 ).
Muchos ecologistas aún no son conscientes de que, en
muchos casos, el uso de herramientas genéticas ya no
requiere inversiones en equipos costosos y en técnicas de
laboratorio. Ahora hay servicios comerciales que
desarrollarán nuevos marcadores para prácticamente
Con el fin de facilitar el uso exitoso de los microsatélites
por parte de los recién llegados a la ecología molecular,
nuestro primer objetivo en esta síntesis es proporcionar
una visión general de los pros y contras del empleo de los
microsatélites. Aunque el aislamiento con marcadores de
microsatélites sigue siendo problemático en algunos
taxones, el nuevo aislamiento con marcadores y el
genotipado se ha convertido en una práctica habitual en
una amplia gama de taxones (incluidos la mayoría de los
vertebrados, muchos insectos y algunas plantas), lo que
permite su uso sin necesidad de un laboratorio propio.
Nuestro segundo objetivo es esbozar el proceso de llevar a
cabo el aislamiento de nuevos marcadores de
microsatélites y sus costes asociados, con el fin de
proporcionar a los ecologistas y a los recién llegados a la
genética de poblaciones la información necesaria para
decidir si invierten en el uso de herramientas genéticas.
Nuestro tercer objetivo es fomentar la realización de
pruebas de calidad de los conjuntos de datos genéticos
mediante la presentación de un protocolo de selección de
microsatélites de seis etapas. Un recién llegado al campo es
especialmente vulnerable a omitir uno o más de estos
pasos importantes porque no se ha establecido un
protocolo formal en la literatura. Es importante destacar
que esperamos que nuestro protocolo de evaluación anime
a todos los eco-genéticos, principiantes y experimentados,
a adoptar un informe más consistente y completo de estos
importantes pasos.
PARTE I: EVALUACIÓN DE LOS M ICROSATÉLITES
¿Qué son los microsatélites?

Los microsatélites son repeticiones en tándem de 1-6
nucleótidos que se encuentran a alta frecuencia en los
genomas nucleares de la mayoría de los taxones. Como

Microsatélites para ecologistas 617
También se conocen como repeticiones secuenciales (entre 10)2 y 10)6 mutaciones por locus por
simples (SSR), repeticiones tándem de número variable y en promedio 5 - 10)4) que generan los altos niveles de
(VNTR) y repeticiones tándem cortas (STR). Como diversidad alélica necesarios para los estudios genéticos
resultado del uso generalizado de microsatélites, nuestra de
comprensión de su comportamiento mutacional - violeta, procesos que actúan en escalas de tiempo ecológicas
función, evolución y distribución en el genoma y entre (Schlo¨tterer 2000).
taxones - está aumentando rápidamente (Li et al. 2002;
Ellegren 2004). Un locus de microsatélites suele tener una ¿Por qué elegir microsatélites?
longitud de entre 5 y 40 repeticiones, pero es posible que se
produzcan secuencias de repeticiones más largas. Las Existen varios tipos de marcadores ampliamente utilizados en
repeticiones de dinucleótidos, trinucleótidos y los estudios de ecología molecular, y muchas preguntas
tetranucleótidos son las opciones más comunes para los pueden ser respondidas con más de un tipo de marcador
estudios de genética molecular. Las repeticiones de (Tabla 1). Se ofrece una revisión exhaustiva de los diferentes
dinucleótidos representan la mayoría de los microsatélites tipos de marcadores.
de muchas especies (Li et al. 2002). Las repeticiones de
trinucleótidos y hexanucleótidos son las clases de repetición
más probables que aparecen en las regiones de codificación
porque no causan un desplazamiento de fotogramas (Toth
et al. 2000). Las repeticiones de mononucleótidos son
menos confiables debido a los problemas con la
amplificación; los tipos de repeticiones más largas son
menos comunes, y existen menos datos para examinar su
evolución (Li et al. 2002).
El ADN que rodea al locus de un microsatélite se
denomina región de flanqueo. Dado que las secuencias de
las regiones adyacentes se conservan generalmente (es decir,
son idénticas) en individuos de la misma especie y, a veces,
de especies diferentes, un locus microsatélite determinado
puede identificarse a menudo por sus secuencias
adyacentes. Se pueden diseñar pequeñas extensiones de
ADN, llamadas oligonucleótidos o primers, para que se
unan a la región lateral y guíen la amplificación de un locus
microsatélite con reacción en cadena de la polimerasa
(PCR). Un par específico de cebadores PCR es el producto
tangible del aislamiento de marcadores de microsatélites
(elaborado más adelante; véase el Apéndice S1 en Material
de Suplemento). La amplia disponibilidad de
oligonucleótidos de los servicios comerciales hace que sea
sencillo pedir cualquier secuencia de imprimación no
etiquetada y que se la entreguen dentro de los plazos
establecidos.
días por £ 20 USD (se necesitan imprimaciones etiquetadas
fluorescentemente para
en un secuenciador de ADN son actualmente ‡ USD 80).
A diferencia de las regiones laterales, las secuencias de
repetición microsatélites mutan con frecuencia por errores
de deslizamiento y de corrección durante la replicación del
ADN que cambian principalmente el número de
repeticiones y, por lo tanto, la longitud de la cadena de
repetición (Eisen 1999). Debido a que los alelos difieren en
longitud, pueden distinguirse por la electroforesis en gel de
alta resolución, que permite un genotipado rápido de
muchos individuos en muchos loci por una fracción del
precio de la secuenciación del ADN. Muchos microsatélites
tienen una alta mutación
ded en otros lugares (Avise 1994; Sunnucks 2000; Zhang comparación con las técnicas que emplean cebadores
& Hewitt 2003; Schlo¨tterer 2004) y está fuera del alcance universales (es decir, cebadores que amplifican el ADN de
de este estudio. Los microsatélites son de particular interés cualquier especie), como el AFLP. Esta característica es de
para los ecologistas porque son uno de los pocos particular importancia cuando se trabaja con muestras
marcadores moleculares que permiten a los investigadores fecales o especies, como los corales escleractínidos, en los
comprender las cuestiones ecológicas a gran escala. que la con-aminación endosimbiontes es prácticamente
Imagínese, por ejemplo, un ecologista de plantas inevitable.
estudiando el tiempo de floración. Utilizando marcadores
de microsatélites, nuestro investigador pudo responder a
una variedad de preguntas interesantes, como por
ejemplo: ¿Son los individuos o poblaciones que florecen
temprano genéticamente distintos de los que florecen
tarde? ¿Tienden los inmigrantes a florecer en sintonía con
sus vecinos o con su población natal? ¿Existe una relación
entre las medidas de aptitud (tiempo de floración, número
de flores, conjunto de semillas, etc.) y la identidad
genotípica? ¿Los mejores resultados (en términos de esas
medidas de aptitud física) en un año en particular son
parientes?
Independientemente de la pregunta, un marcador
molecular debe ser fundamentalmente neutro y seguir la
herencia mendeliana para ser utilizado como herramienta
para detectar patrones demográficos, y estos rasgos deben
ser siempre confirmados para cualquier tipo de marcador
(ver Parte III: A Protocolo de Cribado de Microsatélites).
A continuación se describen los rasgos deseables de los
microsatélites en comparación con otros tipos de
marcadores como las alozimas, los polimorfismos de
longitud de fragmentos amplificados (AFLP), los loci
secuenciados y los polimorfismos nucleares simples
(SNP), centrados tanto en aspectos prácticos como en
consideraciones ecológicas.
Fácil preparación de muestras

Un marcador ideal permite el uso de pequeñas muestras
de tejido que se conservan fácilmente para su uso futuro.
A diferencia de los métodos alogénicos, las técnicas
basadas en el ADN, como los microsatélites, utilizan la
PCR para amplificar el marcador de interés a partir de una
muestra de tejido diminuta. La estabilidad del ADN en
comparación con las enzimas permite el uso de
conservantes de tejidos simples (como el 95% de etanol)
para el almacenamiento. Además, debido a que las élites
de microsatélites son generalmente más cortas en longitud
que los loci secuenciados (100- 300 vs. 500-1500 pb),
pueden ser amplificadas con PCR a pesar de cierta
degradación del ADN (Taberlet et al. 1999). A medida que
el ADN se degrada, se rompe en trozos más pequeños y la
posibilidad de amplificar con éxito un segmento largo es
proporcional a su longitud (Frantzen et al. 1998). Este
rasgo permite que las élites de microsatélites se utilicen
con métodos de extracción de ADN rápidos y baratos,
con ADN antiguo, o ADN de muestras de pelo y heces
utilizadas en muestras no invasivas (Taberlet et al. 1999).
Además, debido a que los microsatélites son específicos
para cada especie, la contaminación cruzada por
organismos no objetivo es mucho menos problemática en
Alto contenido de información con tasas mutacionales más altas son preferibles. Las
Cada locus de marcadores puede considerarse una muestra cuestiones de paternidad o de estructura clonal se abordan
del genoma. Debido a la recombinación, selección y deriva mejor utilizando microsatélites con la mayor diversidad
genética, diferentes genes y diferentes regiones del genoma alélica, que pueden proporcionar a cada individuo un
tienen historias genealógicas ligeramente diferentes. Confiar genotipo único 'etiqueta de identificación' utilizando sólo
en un solo lugar para estimar los rasgos ecológicos a partir unos pocos loci (Queller et al. 1993). Del mismo modo, para
de los datos genéticos crea una alta tasa de error de los estudios de la estructura de la población y la
muestreo. Por lo tanto, tomar múltiples muestras del migración que emplean alelos de población
genoma combinando los resultados de muchos loci
proporciona una forma más precisa y estadísticamente
poderosa de comparar poblaciones e individuos. Además,
los enfoques estacionales de las cuestiones de mayor interés
para los ecologistas a menudo requieren múltiples loci
comparables (ver Tabla 1 y Pearse & Crandall 2004).
Aunque el AFLP, las alozimas y las técnicas de ADN
polimórfico amplificado aleatoriamente (RAPD) también
son multilocus, ninguno de ellos tiene la resolución y el
poder de un estudio microsatélite multilocus (pero por
razones distintas; ver Sunnucks 2000). Mientras que los
marcadores AFLP pueden ser una buena alternativa a los
microsatélites (Bensch & Akesson 2005). Gerber et al (2000)
mostraron que 159 loci de AFLP proporcionaron un poder
ligeramente menor para determinar la paternidad que seis
marcadores microsatélites polimórficos. La tecnología de
secuenciación ha avanzado rápidamente, pero su coste sigue
prohibiendo la duplicación o triplicación de la carga de
trabajo mediante el uso de múltiples secuencias de genes
independientes en paralelo (Zhang & Hewitt 2003). Los
marcadores de SNP son muy prometedores para estudios
futuros, pero su uso en organismos no modelo es todavía
incipiente (Morin et al. 2004). Los microsatélites se han
vuelto tan populares porque son marcadores de locus único
y codominantes, por lo que muchos loci pueden combinarse
eficazmente en el proceso de genotipado para proporcionar
un muestreo replicado del genoma rápido y económico.
Los marcadores de microsatélites generalmente tienen
altas tasas de mutación, lo que resulta en una alta diversidad
alélica. En especies para las que las poblaciones son
pequeñas o que han sufrido un cuello de botella
recientemente, los marcadores con tasas de mutación más
bajas, como las alozimas, pueden ser en gran medida
invariables y es probable que sólo los loci con las tasas de
mutación más altas sean informativos (Hedrick 1999). Un
proceso mutacional lento permite que la firma de eventos
en el pasado lejano persista por más tiempo. Por lo tanto, la
selección de los loci con alta o baja diversidad alélica
dependerá de la cuestión de interés. Por ejemplo, si uno está
interesado en una barrera histórica potencial para el flujo de
genes o en rastrear la recolonización del territorio desde la
última edad de hielo, es probable que los marcadores con
tasas de mutación más bajas sean los más informativos. En
contraste, si uno está interesado en la demografía actual o
en los patrones de conectividad, o en detectar cambios en el
pasado reciente (10-100 generaciones), los microsatélites

los numerosos alelos de los microsatélites de alta microsatélites pueden ser complejos (Schlo¨tterer 2000;
diversidad actúan como réplicas estadísticas para dar más Beck et al. 2003; Ellegren 2004). Para la mayoría de las
poder para distinguir poblaciones (Kalinowski 2002; aplicaciones ecológicas, no es importante conocer el
Wilson & Rannala 2003). mecanismo mutacional exacto de cada locus, ya que los
análisis más relevantes son insensibles al mecanismo
mutacional (Neigel 1997). Sin embargo, varias estadísticas
¿Cuáles son los inconvenientes de los marcadores de basadas en estimaciones de las frecuencias de los alelos (por
microsatélites? ejemplo, FST y RST) se basan en
A pesar de sus muchas ventajas, los marcadores de
microsatélites también tienen varios desafíos y trampas
que, en el mejor de los casos, complican el análisis de los
datos y, en el peor, limitan en gran medida su utilidad y
confunden su análisis. Sin embargo, todos los tipos de
marcadores tienen algunos inconvenientes, y la versatilidad
de los microsatélites para abordar muchos tipos de
cuestiones ecológicas supera sus inconvenientes para
muchas aplicaciones. Afortunadamente, muchas de las
trampas comunes a los marcadores de microsatélites
pueden evitarse mediante una cuidadosa selección de loci
durante el proceso de aislamiento .
Aislamiento de marcadores específicos de cada especie

El análisis de marcadores basado en la PCR requiere
secuencias de primer que apuntan a las regiones
marcadoras para su amplificación. Para utilizar la misma
secuencia de cebado para amplificar el mismo objetivo de
muchos individuos, la región donde el cebado se une debe
ser idéntica, con pocas o ninguna mutación que cause
diferencias interindividuales. Para las regiones genéticas
comúnmente utilizadas como marcadores secuenciales, las
regiones de cebado están altamente conservadas, de tal
manera que son invariables dentro de las especies y a veces
incluso a través de amplios grupos taxonómicos. Esta
conservación de la secuencia requiere sólo un trabajo
menor para optimizar un juego de cebadores para una
nueva especie. En contraste, un par dado de primers de
microsatélites rara vez funciona en grupos taxonómicos
amplios, por lo que los primers se desarrollan de nuevo
para cada especie (Glenn & Schable 2005). Sin embargo, el
proceso de aislamiento de nuevos marcadores
microsatélites se ha vuelto más rápido y menos costoso, lo
que reduce sustancialmente la tasa de fallos y/o el coste
del aislamiento de nuevos marcadores en muchos casos
(Glenn & Schable 2005). Además, muchos laboratorios
comerciales y académicos pueden proporcionar un
conjunto de loci microsatélites polimórficos para una
nueva especie a un coste razonable en 3-6 meses (véase la
Parte II: Adquisición de microsatélites). Sin embargo, hay
algunos taxones para los cuales el nuevo aislamiento de
marcadores todavía está plagado de una tasa de fracaso
considerable, como algunos invertebrados marinos (por
ejemplo, Cruz et al. 2005), lepidópteros (Meglecz et al.
2004) y aves (Primmer et al. 1997).
Mecanismos mutacionales poco claros

Uno de los retos a los que se enfrentan actualmente los
genetistas es que los procesos mutacionales de los
explícitamente en un modelo de mutación. tamaño de un alelo sin cambios, y las inserciones o

Tradicionalmente, el modelo de alelo infinito (IAM), en el supresiones en la región de los flancos podrían crear un
que cada evento de mutación crea un nuevo alelo (cuyo nuevo alelo con el mismo tamaño que un alelo existente. La
tamaño es independiente del alelo progenitor) ha sido el homoplastia detectable parece afectar sólo una fracción de los
modelo de elección para el análisis genético de la población, genotipos en una fracción de los loci, y este sesgo parece ser
y debido a que es el modelo más simple y general, sigue marginal en la mayoría de los casos (Viard et al. 1998; Adams
siendo ampliamente utilizado por defecto. et al. 2004; Curtu et al. 2004).
Un modelo específico para microsatélites, el modelo
mutacional escalonado (SMM), añade o resta una o más
unidades de repetición de la cadena de repeticiones a un
ritmo constante para imitar el proceso de errores durante la
replicación del ADN que genera mutaciones, creando una
distribución de frecuencia de alelos en forma gaussiana
(Ellegren 2004). Sin embargo, también se sabe que ocurren
procesos de mutación no escalonados, incluyendo
mutaciones puntuales y eventos de recombinación como el
cruce desigual y la conversión de genes (Richard & Paques
2000). Mientras continúa el debate sobre la prevalencia de la
mutación no escalonada para los microsatélites, el consenso
actual es que la frecuencia y los efectos son generalmente
bajos, y la mutación escalonada parece ser la fuerza
dominante que crea nuevos alelos en los pocos organismos
modelo estudiados hasta la fecha (Eisen 1999; Ellegren
2004). Sin embargo, las métricas que emplean el SMM
tienden a ser muy sensibles a las violaciones de este modelo
mutacional (por ejemplo, los loci con mutaciones no
escalonadas o limitaciones en el tamaño de los alelos) y, por
lo tanto, las métricas que utilizan el IAM suelen ser más
robustas y fiables (Ruzzante 1998; Balloux y Lugon-Moulin
2002; Landry et al. 2002). Los modelos mutacionales más
complejos y realistas que añaden la probabilidad de
mutación no gradual al SMM están empezando a sustituir al
SMM en los análisis genéticos comunes, y ya están
disponibles en varios paquetes estadísticos (por ejemplo,
Piry et al. 1999; Van Oosterhout et al . 2004).
Diversidad alélica oculta

La identificación de alelos basada en el tamaño (es decir,
electroforesis en gel - véase el Apéndice S2 en el Material
Complementario) reduce en gran medida el tiempo y los
gastos del genotipado de microsatélites en comparación con
la secuenciación de cada alelo en cada individuo. Sin
embargo, este atajo requiere la suposición de que todos los
alelos difieren en longitud. De hecho, los alelos del mismo
tamaño pero de diferentes linajes pueden ser bastante
comunes, un fenómeno llamado"homoplastia". La
homoplastia amortigua la diversidad alélica visible de las
poblaciones y puede inflar las estimaciones del flujo
genético cuando la tasa de mutación es alta (Garza &
Freimer 1996; Rousset 1996; Viard et al. 1998; Blankenship
et al. 2002; Epperson 2005). Hay dos tipos distintos de
homoplastia, `detectable' e `indetectable'. La homoplastia
detectable puede revelarse mediante la secuenciación de
alelos. Por ejemplo, las mutaciones puntuales dejarán el

Adams et al (2004) encontraron que la homoplastia sólo planea este desgaste de los marcadores en el aislamiento
era común para las repeticiones compuestas y/o inicial de los marcadores de microsatélites, la probabilidad
interrumpidas. Las estimaciones empíricas de la de que los problemas de amplificación arruinen un estudio
homoplastia detectable informaron sólo una ligera es mínima. Sin embargo, varios taxones parecen estar más
subestimación (1-2%) de la diferenciación genética afectados por problemas de amplificación que otros, en
(Adams et al. 2004; Curtu et al. 2004). particular, los bivalvos, los corales y algunos otros taxones
La homoplastia indetectable ocurre cuando dos alelos invertebrados (por ejemplo, Hedgecock et al. 2004). Una
son idénticos en secuencia pero no por descendencia (es baja tasa de alelos nulos
decir, tienen historias genealógicas diferentes). Esta falta
de identidad se produce por el comportamiento aleatorio
del proceso de mutación por pasos cuando hay una "retro-
mutación" a un tamaño previamente existente (por
ejemplo, un alelo muta de 5 a 6 repeticiones y luego una
copia de este alelo muta de 6 a 5 repeticiones) o cuando
dos alelos no relacionados convergen en secuencia
cambiando el número de repeticiones en dos lugares
diferentes de la secuencia. Como el SMM predice un 50%
de probabilidad de retro-mutación, la homoplastia
indetectable puede ser extensa cuando la tasa de mutación
es alta, pero puede ser considerada en los análisis (Slatkin
1995; Estoup & Cornuet 1999).
En general, la homoplastia es a menudo una fuente
mínima de sesgo para los estudios de genética poblacional
limitados a poblaciones con un historial"poco profundo"
o con un tamaño de población efectiva moderado, ya que
la probabilidad de una homoplasia es proporcional a la
distancia genética de dos individuos o poblaciones
(Estoup et al. 2002). Sin embargo, cuando se utiliza para
grupos muy divergentes, como para la reconstrucción
filogenética, los loci de alta tasa de mutación pueden ser
problemáticos (Estoup et al. 1995). Es importante tener en
cuenta que la homoplastia no detectada afecta a todos los
tipos de marcadores. Cuando sea apropiado, hay varios
métodos que pueden emplearse para evaluar la
homoplastia detectable (ver Parte III: Un Protocolo de
Cribado de Microsatélites).
Problemas con la amplificación

Para encontrar un locus útil de marcadores de ADN es
necesario identificar una región del genoma con una tasa
de mutación lo suficientemente alta como para que existan
múltiples versiones (alelos) en una población determinada,
y que también se encuentre adyacente a un tramo de ADN
de baja tasa de mutación que se unirá a los primers de la
RCP en la gran mayoría (casi el 100%) de los individuos
de la especie. Si las mutaciones ocurren en la región del
primer, algunos individuos tendrán sólo un alelo
amplificado, o fallarán en amplificar en absoluto (Paetkau
& Strobeck 1995). Además, los cebadores deben unirse
bajo condiciones de PCR repetibles para que el
genotipado pueda realizarse en serie, por diferentes
trabajadores y por diferentes laboratorios. La
amplificación consistente a través de todas las muestras
sólo puede ser asegurada por ensayo y error, de tal manera
que en la mitad o al final del genotipado de todas las
muestras en un estudio, algunos loci tendrán que ser
descartados debido a problemas de amplificación. Si se
puede tener un impacto insignificante en muchos tipos de La tasa de éxito de los cebadores puede disminuir
análisis, aunque para algunos tipos de análisis de parentesco proporcionalmente a la distancia genética entre la especie
puede ser sustancial (Dakin & Avise 2004). focal y la especie de origen (Primmer et al. 1996; Wright et al.
2004). Además, la diversidad alélica a menudo disminuye
cuando los cebadores se utilizan en especies que no son
PARTE I I I : UN MICROSATÉLITE CURIOSO fuente (Primmer et al. 1996; Ellegren et al. 1997; Neff &
Gross 2001; Wright et al. 2004), un tipo de"sesgo de
Paso 1: Búsqueda de marcadores microsatélites determinación" que puede ser explicado si es necesario
existentes (Petit et al. 2005). En general,
El primer paso para considerar un estudio de marcadores de
microsatélites es buscar en la literatura publicada cualquier
primers de microsatélites existente para la especie objetivo y
especies estrechamente relacionadas. La disponibilidad de
marcadores de microsatélites para una especie determinada
será una combinación del interés pasado en esa especie (y
especies relacionadas) y la tasa inherente de éxito del
desarrollo de microsatélites para ese taxón. Existen claras
diferencias en la frecuencia de las regiones de microsatélites
en los genomas de plantas, animales, hongos y procariotas
(Toth et al. 2000), y la tasa de éxito del aislamiento de los
marcadores de microsatélites suele escalar con su frecuencia
en el genoma (Zane et al. 2002). Por ejemplo, los
microsatélites tienden a ser relativamente raros en
lepidópteros, aves, murciélagos y procariotas, mientras que
los peces y la mayoría de los mamíferos tienden a tener una
alta frecuencia de repetición de motivos (Neff & Gross
2001). Además, las especies con altas tasas de endogamia,
bajos tamaños de población y cuellos de botella frecuentes
o severos suelen tener un polimorfismo y heterocigosidad
promedio bajos, y microsatélites más cortos en promedio
(DeWoody & Avise 2000; Neff & Gross 2001).
Actualmente, la mayoría de los marcadores de
microsatélites se reportan en"notas de fondo" en las Notas
de Ecología Molecular. Existe una base de datos en línea en la
que se pueden realizar búsquedas de cualquier primers de
microsatélites publicados en esta revista
(http://tomato.bio.trinity.edu/). Las secuencias en sí
mismas se archivan en GenBank y a menudo se presentan
mucho antes de que su uso aparezca en estudios publicados.
Se puede buscar en GenBank con un motor basado en la
web administrado por el National Center for Biotechnology
Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) escribiendo la
especie, el género o el nombre de la familia, el
término"microsatélite" y seleccionando la base de datos de
nucleótidos.
A veces las regiones adyacentes están muy conservadas a
través de los taxones, lo que permite la amplificación entre
especies de loci microsatélites a partir de cebadores
desarrollados a partir de otras especies del mismo género o
incluso de la misma familia, especialmente para vertebrados
tales como peces, reptiles y mamíferos (Rico et al. 1996;
Peakall et al. 1998). Por lo tanto, es útil buscar en las bases
de datos anteriores los cebadores desarrollados para
parientes congéneres y confamiliares de la especie objetivo.

intentar amplificar los cebadores existentes de especies consideración más crítica del control de calidad de los
relacionadas es menos costoso y lleva menos tiempo que marcadores, presentamos aquí una guía detallada para
aislar nuevos cebadores (Squirrell et al. 2003), y cualquier evaluar los loci para su inclusión en un estudio genético de
éxito ahorrará dinero incluso si se necesitan marcadores poblaciones. Como más detalles
adicionales para aumentar estos apropiados.
Paso 2: Aislar nuevos marcadores

En la última década, el proceso de aislamiento de nuevas
elites de microsatélites ha sido racionalizado con avances
tecnológicos y optimización de protocolos para hacer el
proceso más barato, eficiente y exitoso (Zane et al. 2002;
Glenn & Schable 2005). Véase el Apéndice S1 para un
esquema conceptual de un proceso de aislamiento de locus
de microsatélites. Una búsqueda rápida en la web
utilizando términos de búsqueda apropiados, tales
como"servicio de aislamiento de élite microsat", producirá
una larga lista de proveedores en lugares de todo el
mundo. Algunos servicios se especializan en ciertos
taxones, como plantas o mamíferos, y generalmente
trabajan con usted para adaptar el producto a sus
necesidades. Estos laboratorios suelen necesitar de 2 a 6
meses para desarrollar marcadores, y la mayoría cuestan
menos de 1.500 dólares por locus, o de 10 a 15 loci por
aproximadamente 10.000 dólares. Aunque este gasto no es
trivial, es aproximadamente el costo de una máquina de
PCR, y es mucho menos costoso que equipar un
laboratorio molecular completo si no se tiene acceso a
uno. El costo y el tiempo de entrega también dependen de
si los loci se someten a pruebas de calidad y si los
protocolos de amplificación se optimizan como parte del
servicio de aislamiento. Algunos servicios incluso escriben
una publicación de notas iniciales con autoría compartida.
Muchos de los laboratorios que ofrecen aislamiento de
microsatélites también ofrecen servicios de genotipado, y
pueden llevarlo de principio a fin para todo su estudio.
Como alternativa al envío de muestras, también es posible
establecer una colaboración con un laboratorio académico
con los conocimientos técnicos y el equipo necesarios, o
en muchas universidades, trabajar en estrecha
colaboración con una instalación central de secuenciación.
PARTE II I: A M ICROSATELLI T E S CREENING

PROTOCOL
Aunque cualquiera puede enviar muestras de tejido a un

servicio comercial y recibir un conjunto completo de
marcadores microsatélites en cuestión de meses, no es
trivial desarrollar un conjunto óptimo de loci que
proporcione resultados fiables. Existen varios supuestos
básicos detrás de los análisis que se aplican comúnmente a
los datos de microsatélites y cada uno de ellos debe
abordarse explícitamente (Cuadro 2).
Los loci que se incluyen en los análisis a pesar de las
graves violaciones de estas suposiciones o de las altas tasas
de error podrían conducir a estimaciones genéticas
inexactas y sesgadas. Con la esperanza de motivar una
Tabla 2 Summary of the quality control screening protocol with checklist of suggested tests
Assumption Pruebas sugeridas para el control
deSummary of the quality control screening protocol with checklist of suggested tests
Assumption calidad del locus
1. Puntuación precisagenotypes Vuelva a puntuar un subconjunto de genotipos y calcule la tasa degenotypes error.
2. Amplificación de todas lasalleles pruebas de patrones de exceso de homocigotos consistentes con alelos nulos ( MICRO-
CHECKER);
calcular la frecuencia de las muestras que no amplifican ningún alelo en un solo lugar
3. Enlaceequilibrium Utilice una prueba exacta para buscar correlaciones entre alelos en diferentes lugares
(disponible en muchos programas)
4. neutrality Prueba selectivaneutrality de conformidad con la distribución de muestreo de
Ewens (ENUMERATE o PYPOP), prueba de loci atípicos (FDIST2, DETSEL)
5. Mendelianoinheritance Realizar cruces definidos cuando sea posible*; descartar los loci con casos de >2 alelos
por d i p l o i d e .
individuo
6. Cada alelo difiere enlength Secuencia un subconjunto de alelos o emplea SSCP - si existe una buena razón para creer
que
la homoplastia es un problema
importante*
*Estas pruebas están actualmente más allá de las normas requeridas para la mayoría de los usos ecológicos de los microsatélites y deben
considerarse opcionales (véase el texto para más detalles).
sobre el comportamiento de las mutaciones de los deberán repetirse los análisis de las pruebas en el proceso de
microsatélites, los mecanismos de herencia y la distribución cribado y los resultados se comunicarán en cualquier
a través de los cromosomas, es probable que la lista de publicación posterior. Los pasos recomendados en el proceso
pruebas sugeridas evolucione. de selección se describen a continuación (con referencias que
Aunque no se puede saber si la mayoría de los estudios proporcionan una visión más amplia de estos temas), y en la
emplean o no tales medidas de control de calidad, la Tabla 2 se presenta una lista de comprobación de las pruebas
mayoría de las publicaciones no informan los resultados de necesarias. Observamos aquí que algunos análisis estadísticos
la mayoría de estas pruebas (Tabla 3). En nuestra encuesta especializados hacen otras suposiciones críticas, como la
de 50 estudios recientes de microsatélites, el 28% de los conformidad con un modelo mutacional específico, el
estudios mencionan la importancia del control de calidad, tamaño constante de la población o el equilibrio entre
pero no informan los resultados de las pruebas estadísticas. migración y deriva, que se consideran fuera del alcance de
Además, la mayoría de las pruebas se llevaron a cabo de esta revisión.
forma post hoc y se basaron en gran medida en las pruebas de
Hardy-Weinberg Equilibrium (HWE). La Tabla 3 muestra
que aproximadamente el doble de la tasa de fracaso se
detecta con pruebas explícitas de alelos nulos, herencia y
neutralidad en comparación con las inferencias indirectas
basadas en pruebas de HWE. Si bien la tendencia continua
de acortar los manuscritos hace más difícil la presentación
de informes exhaustivos de las pruebas de control de
calidad, el uso de repositorios de datos basados en la web,
que suelen estar vinculados a los manuscritos impresos,
sería una solución fácil a este problema, y facilitaría la
comparación y el metanálisis de los conjuntos de datos.
Una vez que se hayan desarrollado los cebadores de
trabajo (véase el Apéndice S1), se pueden genotipar de 20 a
30 individuos de cada una de las 3 a 5 poblaciones
ampliamente distribuidas (véase el Apéndice S2) para el
cribado preliminar que se describe a continuación. Cuando
toda la colección de muestras del estudio esté genotipada,
Error de puntuación de alelos
Hay muchos pasos entre la extracción de ADN y la
introducción de un genotipo en una base de datos, y en
cada punto pueden surgir una variedad de errores. Una
tasa de error de genotipado de hasta el 1% (es decir, el 1%
de los alelos de un conjunto de datos completo están mal
identificados), que es un valor extraordinariamente bueno
para la mayoría de los estudios, puede conducir a un
número sustancial de genotipos multilocales incorrectos
en un gran conjunto de datos (Hoffman & Amos 2005).
Las fuentes de error incluyen una amplificación deficiente,
errores de impresión (es decir, interpretación errónea de
un pico/banda de un artefacto como un verdadero alelo
microsatélite y su inclusión en el genotipo), interpretación
incorrecta de patrones de tartamudeo o picos de artefactos
(véase el Apéndice S2), contaminación, errores de
etiquetado o de introducción de datos (Bonin et al. 2004).
En muchos casos, conocer las fuentes de error en los
datos del genotipo puede permitir corregirlo, como por
ejemplo, volver a genotipar a los individuos
homocigóticos para capturar alelos de amplificación
deficiente.
Un conjunto de datos genéticos de alta calidad
comienza con una buena conservación de las muestras. La
preservación adecuada de las muestras puede reducir
sustancialmente las dificultades técnicas de la
amplificación en la línea, por lo que debe planificarse
cuidadosamente (Dawson et al. 1998). Nótese que aunque
el muestreo no invasivo (basado en muestras de piel, pelo
o heces) suele ser útil, a menudo requiere un protocolo
más intensivo para el genotipado y conduce a una tasa de
error más alta que cuando se utilizan muestras de tejido
adecuadamente conservadas (revisado por Taberlet et al.
1999; Piggott & Taylor 2 0 0 3 ).
Para asegurar que la amplificación de los alelos sea
consistente a lo largo de la duración de un estudio, se debe
realizar un control positivo con cada lote de PCR,
especialmente cada vez que se utilicen secuenciadores
múltiples para el genotipado en un solo estudio, o se
utilicen nuevos lotes de cebadores (Delmotte et al. 2001).
Se debe prestar atención a las señales de alerta
reextrayendo y reamplificando genotipos cuestionables
(por ejemplo, heterocigotos con alelos de gran tamaño,
alelos débiles; véanse los ejemplos de genotipos difíciles
de llamar en el Apéndice S2). Si es necesario, todo el
conjunto de datos

Tabla 3 Estudio de control de calidad de los

Frecuencia Resultado loci de microsatélites reportado en 25
Paso de selección de control de de la estudios de microsatélites recientemente
de calidad presentación encuesta
Tasa de error en la puntuación del genotipo 10 2.1 ± 2.4 publicados en cada una de las revistas
de informes (%) Evolution and Molecular Ecology
Pruebas indirectas de alelos nulos* 84
(%) 13.6 ± 25.2
Pruebas explícitas de alelos nulos 36 34.6 ± 33.5
Evidencia para el equilibrio del varillaje 78 10.8 ± 24.2
Evidencia de la vinculación sexual 12 5.3 ± 7.7
Evidencia indirecta para desviarse de las expectativas 26 1.6 ± 5.8
neutrales*
Pruebas explícitas de conformidad con las expectativas 8 5.3 ± 10.5
neutrales
Signos encontrados en el conjunto de datos consistentes con 34 1.8 ± 7.8
Herencia'no mendeliana'*
Pruebas explícitas para la herencia"no mendeliana" 16 4.7 ± 11.2
con cruces o pedigríes definidos.
Incidencia de alelos homoplásicos segúnlocus 4 1.4 ± 1.9
La frecuencia de reporte indica el porcentaje de los 50 estudios que realizaron cada prueba.
Los valores de los resultados de la encuesta son el porcentaje medio de loci que no pasaron
la prueba ± 1 SD. Presentamos tanto los valores de aquellos estudios que se probaron
explícitamente para cada paso de control de calidad, como aquellos que dedujeron una
violación post hoc después de detectar una desviación inesperada del Equilibrio Hardy-
Weinberg (HWE; anotado por asterisco). Se excluyeron los estudios que utilizaron
marcadores de microsatélites tomados de estudios de investigación previamente publicados
para minimizar la posibilidad de que las pruebas de suposiciones se llevaran a cabo
previamente y, por lo tanto, no se informaran en el estudio actual. En el Apéndice S3 del
Material Complementario se incluye una lista de las referencias de los 50 estudios.
*Incluye pruebas de desviación de HWE.
puede ser genotipado por duplicado (o más), como en el ejemplo, una tasa de error por locus del 5% en un conjunto
caso de la filiación humana o la medicina forense. de datos de tres locus resulta en una precisión del 95% en la
La tasa de error puede calcularse repitiendo la estimación de la frecuencia de alelos, pero significa que sólo
amplificación de marcadores en un subconjunto aleatorio el 85% de los individuos fueron genotipados correctamente
del 10-15% del número total de muestras, y contando el en los tres loci. Algunos
número de genotipos de carpas inconsistentes entre el
primer y el segundo intento. La tasa de error se expresa
entonces como el número de genotipos incorrectos dividido
por el número de reacciones repetidas, o el número de
alelos incorrectos dividido por el número total de alelos
(Hoffman & Amos 2005). Al examinar las fuentes de cada
error, es posible determinar si la mayoría de los errores
están ampliamente distribuidos (como los errores
tipográficos), o si están sesgados hacia algún subconjunto
de los datos (como los homocigotos en el caso de los alelos
nulos). La información sobre el tipo de error y la frecuencia
permite estimar los efectos del error en los resultados (por
ejemplo, homocigosidad inflada, estimaciones de parentesco
reducido, etc.; Bonin et al. 2004). El efecto del error en las
medidas de la estructura genética puede estimarse usando
una técnica de bootstrapping desarrollada por Adams et al.
(2004), y el programa de parentesco CERVUS puede estimar la
tasa de error mientras que también toma en cuenta la
mutación (Marshall et al. 1998). Los análisis basados en
genotipos multilocales individuales son más sensibles al
error que los basados en frecuencias medias de alelos. Por
La cantidad de error es inevitable, pero argumentamos que
la tasa de error dentro de cada estudio debe ser
cuantificada y reportada. En algunos casos, la eliminación
de los loci con las tasas de error más altas de los análisis
puede mejorar la potencia estadística.
Equilibrio Hardy-Weinberg y alelos nulos

La prueba de loci más comúnmente reportada es la
conformidad con la HWE, en la cual las frecuencias
observadas del genotipo son comparadas con las
frecuencias esperadas para una población ideal
(apareamiento aleatorio, sin mutación, sin deriva, sin
migración). Un"exceso de heterocigotos" (también
conocido como"déficit de homocigotos") ocurre cuando el
conjunto de datos contiene menos homocigotos de los
esperados bajo HWE, y un"déficit de heterocigotos"
(también conocido como"exceso de homocigotos") ocurre
cuando hay más homocigotos de los esperados bajo
HWE. Actualmente, las pruebas utilizadas para determinar
la desviación estadísticamente significativa del HWE
tienen baja potencia cuando la diversidad alélica es alta y
los tamaños de la muestra son moderados (Guo &
Thompson 1992). Sin embargo, no cumplir con HWE no
es típicamente motivo para descartar un locus.
El déficit de heterocigotos, la dirección más común de
la desviación de HWE, puede deberse a realidades
biológicas que violan los criterios de una población ideal,
como una fuerte endogamia o selección a favor o en
contra de un determinado alelo. Alternativamente, cuando
dos grupos genéticamente distintos son agrupados
inadvertidamente en una sola unidad de muestreo, ya sea

debido a que ocurren conjuntamente pero rara vez se loci con fuerte evidencia de alelos nulos.
cruzan (sin que el muestreador lo sepa), o debido a que la La"gran pérdida de alelos" es otra forma en que los alelos
escala espacial elegida para el muestreo de un sitio es mayor pueden ser
que la escala real de una población, habrá más homocigotos perdido - el alelo más largo en un heterocigoto no se
de los que se esperan bajo HWE. Este fenómeno se amplifica tan bien como el más corto y parece demasiado
denomina efecto Wahlund y puede ser una causa común de débil para ser detectado en el proceso de puntuación del
déficit de heterocigotos en estudios genéticos de genotipo (Wattier et al. 1998). La gran pérdida de alelos
poblaciones (Johnson & Black 1984; Nielsen et al. 2003). ocurre debido a que la replicación
Ambas causas del déficit de heterocigotos deberían afectar a
todos los loci, en lugar de sólo a uno o a unos pocos.
Otra causa común del déficit de heterocigotos es la
insuficiencia de amplificación de ciertos alelos en un solo
lugar. Los'alelos nulos' son aquellos que no se amplifican en
una PCR, ya sea porque las condiciones de la PCR no son
las ideales o porque la región de unión de la imprimación
contiene mutaciones que inhiben la unión. Como resultado,
algunos heterocigotos son genotipados como homocigotos
y algunos individuos pueden no amplificar ningún alelo. A
menudo, las mutaciones que causan los alelos nulos sólo se
producen en una o unas pocas poblaciones, por lo que un
déficit de heterocigotos podría no ser aparente en todas las
poblaciones.
Una manera sencilla de identificar un problema de alelo
nulo es determinar si algún individuo falla repetidamente en
amplificar cualquier alelo en un solo lugar, mientras que
todos los demás loci se amplifican normalmente (lo que
sugiere que el problema no es simplemente ADN de baja
calidad). Si la reextracción y la amplificación aún no logran
producir ningún alelo en ese lugar, es probable que el
individuo sea homocigótico para un alelo nulo. Además, un
enfoque estadístico para identificar los alelos nulos puede
hacer coincidir el patrón de exceso de homocigotos (alelos
grandes, distribución aleatoria de alelos, etc.) con las firmas
esperadas de varias causas diferentes de exceso de
homocigotos y estimar la frecuencia de los alelos nulos para
cada lugar. El programa de software MICRO- CHECKER está
diseñado para este fin (Van Oosterhout et al. 2004). Una
forma más técnica de detectar los alelos nulos es examinar
los patrones de herencia en un pedigrí (por ejemplo,
Paetkau & Strobeck 1995).
Rediseñar los cebadores para unirlos a una región
diferente de la secuencia de flanqueo, o ajustar las
condiciones de la PCR puede a menudo mejorar los
problemas de alelos nulos (Callen et al. 1993; Pember- ton et
al. 1995). Muchos investigadores utilizan rápidamente
condiciones de PCR muy estrictas sin tener en cuenta el
inconveniente de que inflan las posibilidades de que se
produzcan alelos nulos. Una baja incidencia de alelos nulos
suele ser sólo una fuente menor de error para la mayoría de
los tipos de análisis. Sin embargo, el efecto de los alelos
nulos en las estimaciones de la diferenciación genética sigue
sin evaluarse hasta la fecha. Además, para ciertos análisis
que requieren una alta precisión en el genotipado, como el
análisis de parentesco, incluso los alelos nulos raros pueden
confundir los resultados, por lo que debe excluirse cualquier
en la PCR es más eficaz para secuencias más cortas que del ADN de los microsatélites (como la organización de la
para secuencias más largas, por lo que será más cromatina y la regulación de la actividad y recombinación de
pronunciado cuando los alelos en un heterocigogoto sean los genes), demostrando que los propios litro-microsatélites
muy diferentes en tamaño. Una manera de combatir esta pueden estar bajo selección. Además, varias enfermedades
fuente de error de genotipado es reamplificar el humanas hereditarias, como la enfermedad de Huntington,
homocigoto de los individuos para obtener pequeños son causadas directamente por mutaciones en los loci
alelos y aumentar la concentración de la muestra en el microsatélites (Ranum &
secuenciador de ADN.
Desquilibrio cinético
Cuando dos loci están muy juntos en un cromosoma, es
posible que no se clasifiquen de forma independiente y se
transmitan a la descendencia como un par. Incluso si los
loci no están ligados físicamente en un cromosoma,
pueden estar funcionalmente relacionados o bajo selección
para ser transmitidos como un par (de ahí que el término
más preciso de desequilibrio cinético esté comenzando a
reemplazar el término"desequilibrio de ligamiento").
Mientras que la conexión funcional sería inusual para los
loci de microsatélites, los microsatélites pueden agruparse
en el genoma (Bachtrog 1999) y el desequilibrio gametico
siempre debe ser probado.
El desequilibrio cinético crea una pseudo-replicación
para los análisis en los que se supone que los loci son
muestras independientes del genoma. Para evitar un
mayor error de tipo I, se debe descartar un locus de la
pareja si se encuentra un desequilibrio significativo de
forma consistente entre los loci. Al igual que las pruebas
de HWE, las pruebas de desequilibrio cinético tienen baja
potencia para loci altamente polimórficos, por lo que se
recomienda examinar los intervalos de confianza en las
estimaciones. Varios programas de software fáciles de
usar, como ARLEQUIN (Schneider et al. 2000), FSTAT (Goudet
1995), GENEPOP (Raymond & Rousset 1 9 9 5 ),
GENETIX (Belkhir et al. 1998) y MICROSATELLITE ANALYZER
(Dieringer & Schlo¨tterer 2003), incluyen pruebas de
desequilibrio cinético mediante la búsqueda de
correlaciones entre alelos en diferentes loci. Un tipo de
vinculación que esta prueba no detectará es la vinculación
sexual; sin embargo, la vinculación sexual producirá un
aparente déficit heterocigótico que se asemeja a un
problema de alelo nulo. La prueba de la conexión sexual
es razonablemente sencilla cuando se dispone de muestras
de individuos de sexo conocido: cuando un sexo es
consistentemente homocigótico en un lugar, se indica la
conexión sexual (Wilson et al. 1997). Por último, hay
muchas cuestiones ecológicas que pueden beneficiarse del
estudio de los loci vinculados (Gupta et al. 2005). Por
ejemplo, la variación de la interpoblación en la vinculación
puede correlacionarse con el historial de cuellos de botella
(Tishkoff et al. 1996).
Neutralidad selectiva
Las revisiones de Kashi & Soller (1999) y Li et al. (2002)
detallan una serie de funciones supuestamente funcionales
Día 2002). Alternativamente, un microsatélite puede estar subpoblaciones. Cualquier locus que no supere una prueba
junto a un gen en selección y no parecer neutral debido a de selección debe ser excluido de los análisis basados en
que hace autostop. El uso de microsatélites para construir supuestos neutrales, tales como inferencias de conectividad,
mapas de vinculación de enfermedades sugiere que muchos tasa de migración, FST, RST, etc. Sin embargo, los loci bajo
de ellos pueden estar estrechamente relacionados con los selección pueden resultar extremadamente interesantes por sí
genes que se están seleccionando. Estos ejemplos indican mismos cuando se examinan los patrones biológicos.
que la neutralidad de los marcadores de microsatélites no
debe darse por sentada, sino que debe probarse e
informarse en estudios publicados. Las pruebas de
neutralidad existentes adoptan varios enfoques diferentes,
pero todas carecen del poder para detectar cualquier cosa
menos las firmas más fuertes de selección (Ford 2002). En
muchos casos, esta baja potencia no es un problema grave,
porque los métodos más comunes para estimar el nivel
promedio de flujo genético entre las poblaciones (por
ejemplo, FST, alelos raros y máxima probabilidad) son
relativamente robustos a la selección débil (Slatkin & Barton
1989). Incluir múltiples loci ayuda a promediar la selección,
porque no se espera que la selección fije las similitudes
mutacionales a través de muchos genes independientes en
diferentes poblaciones (Lewontin & Krakauer 1973). Las
estimaciones de la estructura genética de Jackknifing
multilocus pueden revelar la influencia de cada locus en el
patrón; el programa FSTAT
proporciona esta prueba.
Se pueden aplicar pruebas explícitas de neutralidad a cada
lugar individualmente. La prueba de Ewens-Watterson se
basa en la premisa de que un locus libre de fuerzas de
selección debe tener una distribución de frecuencias alélicas
que coincida con la distribución estadística de muestreo de
Ewens, pero sólo se detecta una fuerte desviación (Slatkin
1994). Además de la selección, los cambios anteriores en el
tamaño de la población, la subdivisión de la población y la
desviación de un IAM (probablemente para muchos
microsatélites - véase Schlo¨tterer et al. 2004) pueden causar
desviación de la distribución de Ewens, por lo que también
puede parecer que un locus está siendo seleccionado si viola
gravemente las suposiciones del modelo.
Un enfoque diferente para detectar la selección se basa
en la premisa de que la selección no debe afectar a muchos
genes independientes de manera similar; por lo tanto, una
forma de probar la neutralidad es evaluar la varianza en las
frecuencias alélicas (estimadas con FST) entre muchos loci.
Los loci atípicos se consideran sospechosos y pueden
eliminarse de los conjuntos de datos si se justifica
(Lewontin & Krakauer 1973). Dos paquetes de software
utilizan este enfoque para evaluar la neutralidad, pero hacen
un esfuerzo por reducir los supuestos poco realistas por los
que el método Lewontin & Krakauer (1973) fue criticado
originalmente. FDIST2 considera el número total de
subpoblaciones en su prueba de valores atípicos en la
relación entre FST y heterocigosidad (Beaumont & Nichols
1996). DETSEL (Vitalis et al. 2001) modifica este enfoque
considerando parejas de poblaciones individualmente,
eliminando la necesidad de conocer el número exacto de
Homoplastia
herencia mendeliana
La simple suposición de que cada alelo puede ser
La herencia mendeliana de alelos es un requisito para casi identificado inequívocamente por su tamaño probablemente
todos los análisis genéticos de poblaciones y la primera no es satisfecha por muchos loci
revisión importante de los estudios de herencia
microsatélites encontró que la herencia mendeliana casi
nunca fue rechazada para las especies de vertebrados
diploides (Jarne & Lagoda 1996; Dakin & Avise 2004). Sin
embargo, cada vez hay más informes de lo que parecen ser
patrones"no mendelianos" de herencia de microsatélites
(Smith et al. 2000; Dobrowolski et al. 2002). Siempre que
sea posible, la herencia debe ser evaluada e informada.
Realizar cruces definidos es la única manera de probar
explícitamente la herencia mendeliana. Debido a que
relativamente pocos estudios reportan pruebas para la
herencia mendeliana, todavía no está claro qué tan común
es la herencia no mendeliana en los taxones. Sin embargo,
nuestra encuesta de 50 estudios recientes encontró que, en
promedio, más de un locus de cada 15 parecía violar la
herencia mendeliana cuando se examinaba explícitamente
(Tabla 3). Una gran fracción de las proporciones de
alelos'no Mendelianos' en la descendencia de cruces
definidos es aparentemente causada por alelos nulos. En
este caso, el patrón de herencia"no mendeliano" es
simplemente un artefacto técnico; el lugar sigue las leyes
de Mendel, pero los alelos invisibles enmascaran este
hecho. Las causas potenciales del verdadero
comportamiento no mendeliano son la vinculación sexual,
la asociación física con genes bajo fuerte selección, los
centros de recombinación, los elementos transponibles o
los procesos durante la meiosis, como la no conjunción o
el impulso meiótico (distorsión de la segregación). Estos
procesos pueden tener efectos graves, como la transmisión
de un solo alelo parental a toda la descendencia.
La realización de cruces definidos y el genotipado de un
gran número de crías puede ser bastante difícil o poco
práctico en algunas especies, y directo en otras, como las
que crían a sus crías. Los loci microsatélites en cualquier
especie de poliploide tienen una alta probabilidad de
ocurrir múltiples veces a lo largo del genoma y esto
confundirá el análisis, por lo que en particular la herencia
debe examinarse siempre en busca de poliploides (Ardren
et al. 1999). Incluso en especies diploides o haploides, la
duplicación de loci puede ser común y potencialmente
problemática. Cualquier caso de un locus que muestre más
de dos alelos por individuo (que no pueda rastrearse hasta
la contaminación cruzada de las muestras) deberá
descartarse de la mayoría de los análisis. Es importante
tener en cuenta que los secuenciadores automáticos están
configurados por defecto para llamar sólo a dos alelos por
locus, y devolverán llamadas de alelos aparentemente
válidas independientemente del número real de productos
de amplificación producidos; por esta razón, la llamada de
alelos del secuenciador automático siempre debe ser
verificada por un operador experimentado.

(Estoup et al. 2002). La homoplastia se vuelve más número de loci necesarios para las pruebas estadísticas
pronunciada cuando se comparan individuos o grupos muy deseadas. EASYPOP es un programa gratuito que permite la
distantes genealógicamente (y a menudo geográficamente simulación de conjuntos de datos para el análisis de potencia
distantes), ya que uno o ambos linajes deben haber (Balloux 2001). En muchos casos, el poder puede ser
experimentado dos eventos de mutación después de su incrementado igualmente (1) añadiendo individuos de la
divergencia para crear un par de alelos homoplásicos población muestreada, (2) añadiendo loci, o (3) seleccionando
(Angers et al. 2000). Por lo tanto, se espera que la loci con más alelos sobre loci con pocos alelos. Sin embargo,
homoplastia sea más problemática para aplicaciones en las el efecto de la
que las poblaciones están distantemente relacionadas, pero
también puede ser problemática para especies con tamaños
de población muy grandes o para loci con fuertes
limitaciones de tamaño de alelos y alta tasa de mutación
(Estoup et al. 2002). En particular, las aplicaciones
filogenéticas en las que las poblaciones son en realidad
especies distintas son particularmente propensas a sufrir
sesgos a causa de la homoplasia con marcadores. Debido a
que se espera que el sesgo introducido por la homoplastia
sea leve, la estimación cuantitativa de la tasa de homoplasia
mediante las técnicas descritas a continuación sólo se
justifica en casos especiales.
La homoplastia'detectable' puede ser evaluada mediante
la secuenciación de una
alelo de cierto tamaño de varios individuos y buscando
diferencias en la secuencia. La elección de individuos de
diferentes poblaciones puede aumentar la probabilidad de
detectar alelos homoplásicos, ya que es menos probable que
ocurra un evento de mutación homoplásica en el tiempo
transcurrido desde que se formó una sola población
(Estoup et al. 2002). Un método más eficiente que la
secuenciación es emplear el polimorfismo conformacional
de una sola hebra (SSCP; Angers et al. 2000), que utiliza
electroforesis en gel para separar alelos de la misma longitud
pero diferente secuencia (Sunnucks et al. 2000).
Elección de un conjunto final de loci

El consenso general en el campo de la ecología molecular es
que en la mayoría de los casos, cuantos más loci se incluyan
en un estudio, más fiable será el conjunto de datos
resultante. Sin embargo, la inclusión de los loci que no
pasan el proceso de cribado anterior puede disminuir tanto
la precisión como la exactitud de las estimaciones genéticas.
Por lo tanto, el uso de sólo los mejores resultados de este
proceso de selección debería minimizar los errores que
surgen de las fuentes discutidas anteriormente. Al mismo
tiempo, la reducción del número de loci también reduce el
poder estadístico y la disminución del muestreo en todo el
genoma. Es evidente que existe una compensación entre
estas fuentes de sesgo, y se aconseja a los recién llegados
que consulten a un estadístico o genetista experimentado
para llevar a cabo este proceso.
La simulación de conjuntos de datos con niveles similares
de diferenciación de frecuencia de alelos entre las
poblaciones que se observan en los datos preliminares
puede ayudar a determinar el tamaño de la muestra y el
la adición de individuos satura más rápidamente que las (Tabla 3), argumentamos que cualquier estudio publicado
otras dos opciones para las estimaciones de FST debe esforzarse por probar y presentar esta información. El
(Kalinowski 2005). Las dos últimas opciones, añadiendo aumento de la información sobre las características de los
alelos mediante la adición de más loci y utilizando loci con nuevos loci acelerará nuestra comprensión del
mayor polimorfismo, producen un efecto similar. La comportamiento de este marcador.
adición de loci reducirá la varianza en las estimaciones
genéticas causadas por fenómenos específicos del locus,
como la deriva genética o la selección débil, porque cada
locus es una muestra independiente del genoma
(Kalinowski 2002). Además, el uso de loci con mayor
polimorfismo puede inflar el error en las estimaciones de
la frecuencia de alelos a menos que el tamaño de la
muestra también aumente simultáneamente (Ruzzante
1998; Gomez-Uchida & Banks 2005; Kalinowski 2005).
Los microsatélites altamente variables (por ejemplo, los
loci con >25 alelos o un 85% de heterocigosidad) tienen
un conjunto distinto de pros y contras. El error de
puntuación del genotipo puede aumentar debido al
aumento del abandono de los alelos grandes (Buchnan et
al. 2005) y al aumento de la tartamudez (Hoffman &
Amos 2005). Las altas tasas de homoplasia asociadas con
altas tasas de mutación (la causa típica de la alta diversidad
alélica) pueden introducir sesgos en las estimaciones de la
frecuencia de los alelos, atenuando las estimaciones de
FST y provocando una inflación sustancial de las
estimaciones del flujo genético (Jin & Chakraborty 1995;
Slatkin 1995; Gaggiotti et al. 1999; Epperson 2005). Una
correlación negativa entre heterocigosidad y FST puede
ocurrir aparentemente en loci de alta tasa de mutación
(O'Reilly et al. 2004; Olsen et al. 2004), pero puede
explicarse dividiendo los loci en subgrupos para el análisis,
o usando modificadores que hacen que los loci sean más
comparables (Buonaccorsi et al. 2002; Olsen et al. 2004;
Hedrick 2005). Por otro lado, los loci altamente variables
tienen mayor poder para estimar la estructura genética
(Epperson 2004), distinguir parientes cercanos por
parentesco (Queller et al. 1993) y asignar individuos a la
población fuente correcta (Wilson & Rannala 2003).
CONCLUSIÓN Y N EXT S TEPS
Gran parte de las dudas de los investigadores sobre el uso

de marcadores de microsatélites en ecología se deben al
hecho de que los estudios detallados o metaanálisis de los
microsatélites y sus comportamientos mutacionales y de
amplificación siguen siendo en gran medida competencia
de los organismos modelo y de la genética humana.
Aunque los microsatélites siempre requieren una
evaluación cuidadosa, problemas tales como un
mecanismo mutacional poco claro, alelos nulos y
homoplasia son a menudo intrascendentes para las
mediciones ecológicas. Sin embargo, siempre es
importante examinar explícitamente los supuestos detrás
de los datos, incluso cuando son difíciles de verificar, y
siempre que sea posible abordar las fuentes de error y
sesgo en los estudios moleculares. Aunque todavía no es la
norma en el campo realizar y reportar todas estas pruebas
Los países en vías de desarrollo deben ser capaces de Estudio Interdisciplinario de los Océanos Costeros (PISCO),
escribir y mejorar los enfoques existentes para hacer frente financiada por la Fundación David y Lucile Packard y la
a sus problemas. Del mismo modo, la mayor disponibilidad Fundación Gordon y Betty Moore (KAS) y el Programa
de estas potentes herramientas moleculares para un grupo Nacional de Santuarios Marinos, NMSP MOA 2005-
más amplio acelerará la nueva aplicación de los marcadores 008/66832 (KAS y RJT). Esta es la publicación de PISCO
de microsatélites, los enfoques conceptuales para la No. 202, contribución No. 1221 del Hawaii Institute of
resolución de problemas y el análisis de datos, y la Marine Biology y SOEST No. 6729.
disponibilidad de marcadores, muestras y conjuntos de
datos.
Aunque un estudio de marcadores de microsatélites
puede realizarse hoy en día en menos tiempo, por menos
dinero y con menos conocimientos técnicos que antes, el
uso adecuado de los datos de los micro satélites requiere
una formación adecuada, así como un conocimiento
exhaustivo de los principios de la genética de las
poblaciones y de la evolución molecular. Incluso cuando los
loci son cuidadosamente examinados y seleccionados,
interpretar el significado ecológico de los análisis genéticos -
incluso los análisis de parentesco más simples o las
estimaciones del flujo genético- puede ser delicado.
Aquellos que intentan utilizar microsatélites por primera vez
necesitarán una lectura en profundidad sobre la evolución
de los microsatélites y el análisis genético estadístico,
muchos de los cuales se citan a lo largo de este estudio.
Varias otras revisiones especializadas en microsatélites que
recomendamos como punto de partida son Estoup &
Angers (1998), Chambers & MacAvoy (2000), Schlo¨tterer
(2000), Sunnucks (2000) y muchos de los capítulos de
Goldstein & Schlo¨tterer (1999). Además, varios volúmenes
sobre el análisis estadístico de los datos genéticos presentan
la base de los enfoques estadísticos para evaluar los datos de
los marcadores genéticos, entre ellos Nei (1987), Weir
(1996) y Balding y otros (2003). Sin embargo, muchos
detalles técnicos importantes sobre el uso adecuado de los
marcadores genéticos todavía están mal descritos en la
literatura. Aunque los apéndices incluidos aquí tienen por
objeto proporcionar una visión general conceptual de
algunos de los aspectos prácticos de la utilización de
microsatélites, no son en absoluto exhaustivos. Buscar la
colaboración de un ecólogo molecular que tenga un historial
comprobado con las técnicas y análisis de interés (no
necesariamente los taxones de interés) al principio del
diseño de un experimento es un imperativo para los recién
llegados y sin duda hará que el proceso de aprendizaje sea
más eficiente y exitoso.
RECONOCIMIENTOS
Este estudio se benefició de la crítica constructiva y las

sugerencias editoriales de Brian Bowen, Rob Cowie, Ross
Crozier, Arnold Estoup, Brant Faircloth, Steve Gaines, Rick
Grosberg, Steve Karl, Joe Neigel, Paul Sunnucks, Andrea
Taylor, Neil Tsutsui, Alex Wilson y dos árbitros anónimos.
Este estudio contó con el apoyo de la Asociación para el
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heterocigoto

Apéndice S1. Diagrama de flujo conceptual para el desarrollo de nuevos marcadores microsatélites
basados en la técnica de enriquecimiento (uno de los muchos métodos que se utilizan - véase Zane et
al. 2004 y Glenn 2005), y pasos de optimización de la imprimación.
A. Extraer ADN de una sola muestra de tejido.
B. Cree una biblioteca de ADN:

1. Corte el genoma en fragmentos de 500 pb con un digerido de enzimas de restricción.
2. Adjuntar ADN'linker' a los extremos de cada fragmento - el ADN del linker tiene una
secuencia conocida para que los primers puedan ser diseñados para unirse a ellos.
3. Amplificar los fragmentos de ADN utilizando cebadores para los extremos del enlazador con
PCR.
C. Separe los fragmentos con secuencias repetidas:

1. Mezcle los fragmentos de ADN con una sonda microsatélite (un oligonucleótido hecho
de una secuencia de repetición de su elección) que pueda recuperarse
magnéticamente.
2. Promover la hibridación de las sondas a cualquier secuencia de repetición
complementaria en los fragmentos de ADN mediante el calentamiento para
desnaturalizar el ADN y el enfriamiento lento.
3. Sostenga un imán en el tubo para atraer las sondas (ahora unidas al ADN) y lave el resto
del ADN no unido con una serie de enjuagues.
D. Secuencia los fragmentos para encontrar loci microsatélites:

1. Usando cebadores para el ADN del enlazador, amplifique el ADN con PCR para concentrarlo.
2. Clonar el ADN para prepararlo para la secuenciación - insertarlo en un plásmido, inocular
bacterias con el plásmido, cultivar las bacterias para replicar el ADN.
3. Aislar el ADN de las bacterias.
4. Secuenciar el ADN microsatélite en el plásmido con cebadores dirigidos a los puntos de
inserción en el plásmido.
E. Examine las secuencias para encontrar repeticiones de microsatélites.
F. Diseñe cebadores para la región de flanqueo de los microsatélites (con la ayuda de un programa de
selección de cebadores como Primer3, que selecciona los sitios óptimos de cebadores) y hágalos
fabricar.
G. Intentar amplificar los loci con los nuevos primers. Utilice un gradiente de condiciones de PCR
en el que las temperaturas, tiempos, concentraciones de magnesio e imprimación varían para
encontrar las condiciones óptimas.
H. Utilizar electroforesis en gel para confirmar la presencia de productos de PCR. Deseche los
pares de cebadores que no se amplifican después de varios intentos.
I. Verifique si hay polimorfismo ejecutando los pares de imprimaciones exitosas en 10-20 individuos.
Estimar la diversidad alélica y los niveles de heterocigosidad. Descartar los loci invariantes.
J. Compruebe la fiabilidad. Vuelva a ejecutar los pares de cebadores exitosos en los mismos
individuos dos veces más para asegurarse de que la puntuación del genotipo sea reproducible de
manera consistente. Descarte los loci con una amplificación poco fiable.
H. Ordene imprimaciones etiquetadas fluorescentemente para el resto de los loci. Completar el proceso
completo de selección detallado en el texto. Descartar los loci problemáticos.
K. Agilizar el genotipado del conjunto de datos completo con los loci restantes mediante el
establecimiento de un protocolo de PCR "multiplex" - los cebadores para loci múltiples (etiquetados con
diferentes colorantes) se amplifican en una sola reacción de PCR.
Apéndice S2. Puntuación de genotipos de microsatélites a partir de la salida de datos del secuenciador.
Antecedentes del genotipado de microsatélites con un secuenciador de ADN

Un secuenciador de ADN es un aparato de electroforesis en gel de alta precisión. Los productos
de PCR se cargan en el gel y se separan por tamaño aplicando una carga. Un láser escanea el gel para
detectar bandas que contienen tinte fluorescente. Los primers utilizados en la reacción PCR están
marcados con diferentes colorantes fluorescentes para permitir esta detección. El software del
secuenciador convierte el patrón de bandas en un gráfico con picos correspondientes a la anchura e
intensidad (altura) de cada banda. La posición del pico a lo largo del eje x corresponde al tamaño del
producto de ADN en la banda medido en pares de bases (BP). La altura/intensidad corresponde a la
concentración del producto de ADN, que es consecuencia de la eficacia del proceso de amplificación en
la PCR. Se utiliza un color para un patrón de tamaño para calibrar las posiciones de la banda con el
tamaño del producto de ADN (aquí es rojo). Un asterisco identifica todos los verdaderos alelos de los
microsatélites en las figuras siguientes.
100 125 150 175 200
A Un rendimiento ideal: Los dos alelos de este heterocigoto son uniformes en altura y fáciles de
distinguir de los "picos de tartamudeo" adyacentes a ellos - durante la PCR algunos productos son de 1,
2 ó 3 repeticiones cortas debido a errores en la replicación (similar a la mutación escalonada) y aparecen
como picos espaciados uniformemente con una altura decreciente a la izquierda del verdadero pico.
Algunos loci muestran tartamudez extensiva y otros prácticamente ninguno. Las bandas de tartamudeo
son útiles para distinguir los productos de microsatélites de los productos no específicos o no objetivo.
Observe que hay "picos de pull-up" en la sección verde del espectro. El pull-up se debe principalmente al
solapamiento espectral en los espectros de emisión de los colorantes que el secuenciador registra como
un falso pico en un color diferente. Este es un artefacto común del proceso de análisis del secuenciador
de ADN que puede crear confusión en algunas situaciones.
B Dos ejemplos de salidas más complicadas: El genotipo azul es un heterocigoto pero los 2 alelos son
sólo una repetición diferente en tamaño. Esto crea un patrón característico para los loci con tartamudeo
en los que el segundo pico es más alto que el primero debido a la intensidad aditiva del primer pico de
tartamudeo del alelo más grande y el pico real del alelo más pequeño. Si los dos primeros picos fueran
iguales en altura, sería difícil determinar si el
el genotipo tiene uno o dos alelos. Una pista es que hay 4 picos de tartamudeo a la derecha del pico
más grande en lugar de 3 (asumiendo que el patrón de la parcela A es característico del locus azul). El
segundo locus de esta gráfica se muestra con tinte negro y tiene alelos más grandes. Este locus no
tiene tartamudez quizás porque hay pocas repeticiones de modo que la Taq polimerasa no comete
errores paso a paso. Este genotipo también es heterocigoto, pero el alelo más grande es débil. Los
alelos más grandes suelen presentar al menos picos ligeramente más cortos porque la PCR es menos
eficaz para los productos más largos. Aquí, el alelo más grande es tan pequeño que podría ser
fácilmente pasado por alto o confundido con ruido. Si se cargara menos producto de PCR en el gel,
podría no aparecer en absoluto - en cuyo caso sería un ejemplo de "gran pérdida de alelos", otra fuente
común de recuentos de homocigocidad inflados.
C Más ejemplos: Cuando se cargan varios loci en el mismo carril de gel para mayor eficiencia, o se
amplifican juntos en una reacción PCR "multiplex", los picos alélicos pueden solaparse y a veces ser
fáciles de pasar por alto. Aquí los loci verdes y azules comparten un tamaño de alelo. La distinción de los
verdaderos alelos se hace aún más difícil debido a la aparición de picos de pull-up de color verde. Si el
producto de alelo verde fuera menos intenso que el producto de alelo azul (en lugar de igual como se
muestra aquí), podría confundirse con un pico de estiramiento. Si se vuelve a ejecutar el locus verde por
separado en estos casos, se minimizará el error de puntuación. Aquí también, el locus azul muestra dos
alelos que difieren en un par de bases. Las alturas son las mismas porque este lugar no muestra un
tartamudeo fuerte. Pero el locus azul muestra pequeños picos flanqueantes - el lado izquierdo es un
tartamudeo muy tenue, por lo que sólo se puede ver el pico de tartamudeo más grande, y el lado
derecho puede ser un "A-Tail", cuando el Taq agrega un nucleótido de adenina extra en algunas copias
del producto, aumentándolo en 1 pb. No se confundirá con un alelo de microsatélite porque no se
produciría una diferencia de altura extrema para dos alelos de tamaño tan cercano, ya que sus
eficiencias de amplificación deberían ser similares. El locus negro es un homocigoto. Aunque hay un
pequeño pico negro en el lado izquierdo de la parcela, un alelo más pequeño casi nunca es más corto
que un alelo más grande. Una pista adicional es que el pico negro más grande es bastante gordo y alto -
- la PCR produce aproximadamente el doble de la cantidad de producto cuando un alelo es homocigótico
porque no compite por la Taq con un segundo alelo. El locus púrpura representa un problema de "pico
dividido" que ocurre por las altas tasas de A- Tailing por la Taq. Los picos "+A" se dan en todos los picos
de tartamudez, lo que dificulta la puntuación, especialmente en los heterocigotos con alelos de gran
tamaño. Aunque el verdadero alelo se denota aquí, un lugar con alelos que se parecen al púrpura sería
demasiado difícil de puntuar de forma fiable. Por lo general, el problema se puede corregir añadiendo un
paso de extensión adicional al programa de PCR que da tiempo a la Taq para añadir un A-Tail a todas
las copias del producto de forma consistente (haciendo que todos los alelos y el tartamudeo aumenten
de tamaño en 1 pb de su longitud real).
D Loci inescrutables: El locus azul es un "estegosaurio" con un tartamudeo inaceptablemente alto. El

locus negro tiene demasiados picos de artefactos inespecíficos como para elegir de forma fiable los
alelos de los microsatélites. El locus verde se ha sobrecargado en el gel o tiene una concentración de
producto de PCR inusualmente alta y se está manchando en el carril.
Apéndice S3. Citas de los documentos utilizados para generar el Cuadro 3. Examinamos los artículos
más recientes de las revistas Molecular Ecology and Evolution y elegimos los primeros 25 de cada
revista, en orden cronológico inverso de los números de julio de 2005, que utilizaban microsatélites para
evaluar los rasgos ecológicos y genéticos de una o varias especies. Se excluyeron los estudios que
utilizaron marcadores de microsatélites tomados de estudios de investigación previamente publicados
para minimizar la posibilidad de que algunas pruebas se realizaran previamente y por lo tanto no se
informaran en el estudio actual. A continuación, se examinaron estos documentos para estimar la
frecuencia y los resultados del cribado de marcadores notificado, tal como se explica en la Parte III del
texto y en el Cuadro 2.
Ecología
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Ecology Letters, (2006) 9:615–629 doi: 10.1111/j.1461-0248.2006.00889.x

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C. Separe los fragmentos con secuencias repetidas:

D. Secuencia los fragmentos para encontrar loci microsatélites:

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