UNIVERSIDAD AUTONOMA DE AGUASCALIENTES

CENTRO DE CIENCIAS BÁSICAS

DEPARTAMENTO DE INGENIERÍA BIOQUÍMICA
MATERIA: Laboratorio Biotecnología Microbiana

CENTRO ACADÉMICO: Centro de Ciencias Básicas

DEPARTAMENTO
Departamento de Ingeniería Bioquímica
ACADÉMICO:
PROGRAMA
Licenciado en Análisis Químico Biológicos
EDUCATIVO:
AÑO DEL PLAN DE CLAVE DE LA
ESTUDIOS:
2010 SEMESTRE: Noveno
MATERIA:
18410
PERIODO EN
ÁREA ACADÉMICA: Biotecnología QUE SE Agosto-Diciembre
IMPARTE:
HORAS SEMANA T/P: 3/3 CRÉDITOS: 9
NATURALEZA
MODALIDAD EDUCATIVA Obligatoria.
Presencial DE LA
EN LA QUE SE IMPARTE: Teórico/Práctica.
MATERIA:
ELABORADO POR: Academia de Biotecnología
REVISADO Y APROBADO FECHA DE
Academia de Biotecnología Agosto 2018
POR LA ACADEMIA DE: ACTUALIZACIÓ
Dra. Norma Angélica Chávez Vela TLQ. Magdalena Alvarado
TITULAR ASISTENTE
Durón.

DESCRIPCIÓN GENERAL

El laboratorio de Biotecnología Microbiana abarcará principalmente los estudios sobre

los microorganismos más usados en la industria para fines provechosos, como aislarlos, su
propagación, su conservación y aplicación.
El propósito es dar al alumno las herramientas mínimas necesarias para la obtención
de metabolitos de interés comercial, conocer las variables críticas que influyen en el
rendimiento y evaluar y optimizar los procesos de producción de metabolitos.

OBJETIVO (S) GENERAL (ES)

El objetivo de este manual es el de ofrecer un material práctico y fundamentado para

facilitar el trabajo de personas que se desenvuelvan en el área de biotecnología. Este
laboratorio tiene como fin fundamental que los estudiantes del campo tengan un marco
común y necesario del cultivo microbiano y sus aplicaciones.

1
 CONTENIDOS DE APRENDIZAJE

Unidad No de Nombre de la práctica Fecha

práctica

Presentación del programa de prácticas 14 Agosto

I y II 1 Preparación de medios para uso industrial 16 Agosto

Aislamiento e identificación de un microorganismo

I y II 2 21 -30 Agosto
de uso industrial

II 3 Etapas u operaciones de un proceso biotecnológico 30 Ago - 06 Sep

Obtención de productos de interés biotecnológico 11 - 25 Sept

III 4
(Producción de etanol por fermentación)
III 5 Producción de ácido láctico por fermentación 27 Sept – 09 Oct

IV 6 Uso y manejo de biorreactores 16 Octubre

V 7 Cinética de crecimiento microbiano (Cultivo Batch) 18 – 25 Octubre

VI 8 Diseño de esterilización 06 – 13 Nov

08 – 22 Nov
VII 9 Fermentación en sustrato sólido
Entrega de todas las prácticas revisadas y
engargoladas 29 Noviembre

METODOLOGÍA DE ENSEÑANZA - APRENDIZAJE

Al iniciar la práctica, el alumno deberá llegar con el protocolo leído a fin de comprender los objetivos
específicos y como los llevará a cabo, en un orden lógico, realizar la toma de datos completa, y
optimizar el tiempo. Por su parte el maestro apoyará a los alumnos durante la realización de la
práctica y ayudará a resolver las cuestiones que se presenten.

CONDICIONES DE TRABAJO DE LABORATORIO

 La asistencia al laboratorio es obligatoria, abandonarlo sin previo aviso se considera como

inasistencia.
 La hora de entrada será en punto de la hora indicada, solo se permite un retraso de 10 minutos,
pasando este tiempo NO SE PERMITE EL ACCESO AL LABORATORIO.
 El alumno debe portar su protocolo y los materiales que le hayan solicitado para el desarrollo del
experimento o que se encuentren descritos en los mismos.
 Portar bata, de lo contrario no puede permanecer en el laboratorio. Es requisito trabajar con la bata
bien cerrada
 Destinar apropiadamente los residuos peligrosos al ambiente en recipientes etiquetados con ese
fin (preguntar a lo asistente del laboratorio). En caso de no ser peligrosos al ambiente: a) si son
sólidos se tiran al basurero, b) los líquidos en la tarja.
 El cuidado de instalaciones y material es responsabilidad de todos los alumnos; deberá
reponerse si se daña. Reportarlo con la asistente técnica.
2
 Se prohíbe introducir alimentos, fumar o tomar bebidas embriagantes dentro del laboratorio.

Todo alumno que tenga algún adeudo de laboratorio, dependiendo del material dañado, se dará
un plazo de 30 días para reponerlo.

EVALUACIÓN DE LOS APRENDIZAJES

El laboratorio de Biotecnología I, forma parte del curso teórico por lo tanto, la parte teórica constituirá
un 75% de la calificación total, completándose ésta con un 25% correspondiente al laboratorio.

La calificación de laboratorio estará constituida por los siguientes rubros:

1. El promedio de calificaciones de los reportes entregados

durante el semestre (80%): 85%

2. Miniexámenes y/o participación 5%

3. Entrega de un engargolado y en CD con todas las

prácticas entregadas durante el semestre 10%.

 La entrega de reportes es siempre una semana después de que se concluya la práctica. De

igual forma el maestro está obligado a regresar reportes calificados dos semanas después de que
los reciba.
 NOTA: En caso de que dos o más reportes sean iguales o muy similares se anularán,
quedando como calificación CERO
 No se aceptarán reportes en que los resultados, discusiones y conclusiones sean bajados
textualmente de software o internet. (Autor, año; autor, año)
 En introducción, discusiones y conclusiones deberán citarse las referencias bibliográficas. (NO
se aceptará información que sea sólo de Internet)
 Para obtener calificación del laboratorio: se deberá tener un 80% de asistencia, y entregar
como mínimo el 80% de los reportes. En caso de no asistir al laboratorio, no podrá entregar
reporte y tendrá una calificación de cero.

 La asistencia a las prácticas es obligatoria; abandonar el laboratorio sin previo aviso se

considera falta.
 No se aceptarán los reportes fuera de la fecha indicada.

 La evaluación del reporte experimental será en función de las siguientes

consideraciones:

FORMATO DEL REPORTE

Portada Incluyendo Institución, centro, departamento, carrera, nombre del alumno y fecha Indispensable

3
Introducción Obtenida por parte del alumno, indicando en forma breve antecedentes,
y objetivo importancia y estudios principales realizados sobre el tema de interés. Incluir las
15%.
referencias bibliográficas

Materiales y Copia de los materiales y métodos aplicados en la práctica

Indispensable
métodos
Resultados Reporte claro de los resultados obtenidos en forma de tablas, gráficas,
20%
esquemas, etc.
Discusión de Justificación de la metodología, y/o parámetros utilizados, análisis profundo de
resultados los resultados obtenidos y comparación con los reportados en literatura (Si los
resultados no son los apropiados o los esperados deben evaluarse las posibles 30%
causas que causan la discrepancia), así como la importancia y/o aplicación de los
vistos.
Conclusiones Las conclusiones son los principios generales que se comprobaron en la
práctica. En estas, deberán tomarse los siguientes puntos (teniendo en
cuenta las características propias de la práctica realizada):
a) Correspondencia de los resultados obtenidos con los esperados o
con los valores teóricos, si corresponden entre, si son lógicos o
no, según el procedimiento realizado.
b) Información práctica o teórica que brindan los resultados.
c) Si quedó demostrado lo que se pretendía.
d) Si los resultados no son los apropiados o los esperados deben
evaluarse las posibles causas que causan la discrepancia.
e) Las conclusiones deben ser escritas de forma clara. 20%

NO SE ACEPTAN CONCLUSIONES QUE:

a) Describan que se hizo en la práctica (no procedimientos).
b) Exponga lo que aprendió en la práctica (ejemplo: se
aprendió a calcular el peso molecular)
c) Que sean párrafos de libros, que sean muy largas o muy
cortas (3 conclusiones de máximo una cuartilla por las tres).
d) Que no sean parecidas en su redacción a las de los demás
compañeros o demás equipos.

Cuestionario Contestar pregunta que van al final de la práctica, relacionadas con lo visto.
10%
Bibliografía Referencias bibliográficas detalladas consultada para la introducción y la
discusión. Autor, Título de la publicación, Editorial, Lugar, Fecha, Página(s) 5%
Consultada(s).

RECURSOS DIDÁCTICOS:

Las técnicas didácticas serán principalmente: Exposición, Experimentación, Consulta Bibliográfica,

artículos, debate, etc. apoyados en recursos didácticos como: páginas de la web, videos,
presentación en PowerPoint, láminas, pizarrón y gis.

Se enviarán apuntes a las direcciones electrónicas de los alumnos o se le hará copia electrónica
de estos.

FUENTES DE CONSULTA:
BÁSICAS:

4
1. Bulock, J. y B. Kristiansen. (1991): Biotecnología Básica. Zaragoza: Acribia.
2. Buchholz, K. y J. Collins. (2010). Concepts in biotechnology: history, science and business.
Weinheim, Germany. Wiley-VCH.
3. Fulekar, M. H. (2010). Environmental biotechnology. Enfield, NH. Science Publishers.
4. García Garibay, M., R. Quintero Ramírez y A. López Munguía. (2001). Biotecnología alimentaria.
México: Limusa.
5. Glazer, A. N. y H. Nikaido. (2007). Microbial biotechnology :fundamentals of applied microbiology.
New York . Cambridge University Press.
6. Ignacimuthu, S. (2008). Biotechnology : an introduction. Oxford, U. K. Alpha Science International.
7. Kreuzer, H. (2005): ADN recombinante y Biotecnología. Guía para estudiantes. Zaragoza. Acribia.
8. Lacadena, J. (2002). Genética y Bioética. Bilbao: Universidad de Comillas-Desclée de Brouwer.
9. Michael, J. R. (2011). Biotechnology operations : principles and practices. Boca Ratón. CRC Press.
10. Scragg, A. (2001): Biotecnología ambiental. Zaragoza: Acribia.
11. Slater, A.., Scott, N., Fowler, M. (2008). Plant biotechnology: the genetic manipulation of plants.
New York. Oxford University Press.
12. Smith, J. (2009). Biotechnology. Inglaterra: Cambridge University Press.

13. COMPLEMENTARIAS:
14. Campbell-Platt, G. (Ed.). (2009): Food Science and Technology. USA: Wiley Blackwell.
15. FAO. (2000). Aspectos relativos a la inocuidad de los alimentos de origen vegetal genéticamente
modificados. Informe de una Consulta Mixta FAO/OMS de Expertos sobre Alimentos Obtenidos por
Medios Biotecnológicos. Sede de la Organización Mundial de la Salud. Ginebra. Suiza.
16. FAO. (2002). Biotechnology, GMOs, ethics and food production. Publicación de J. Dargie Director
del Joint FAO/IAEA Division Agriculture Department de la FAO.
17. Muñoz, E. (2006).Organismos Modificados genéticamente. España: Ephemera.
18. Ratledge, C. y B. Kristansen. (2009): Biotecnología Básica. Zaragoza: Acribia.
19. Renneberg, B. (2008). Biotecnología para principiantes. España: Editorial Reverté.
20. Thieman, W. y M. A. Palladino.(2010): Introducción a la Biotecnología. USA: Pearson.
21. Ward, O. (1991). Biotecnología de la fermentación. Principios, procesos y productos. Zaragoza:
Acribia.

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 CENTRO DE CIENCIAS BÁSICAS

DEPARTAMENTO DE INGENIERIA BIOQUIMICA

Manual de prácticas de:

BIOTECNOLOGÍA

CARRERA: Lic. Análisis Químico Biológicos

Agosto-diciembre 2018

MANUAL DE PRÁCTICAS elaborado y actualizado por:

Dra. NORMA ANGELICA CHAVEZ VELA
 I N D I C E

Nombre de la práctica No. Práctica

Preparación de medios de cultivo de uso industrial 1

Aislamiento e identificación de un m.o. productor de un

metabolito de interés 2

Etapas de unproceso biotecnológico (Producción

de dextrano) 3

Producción de etanol por fermentación 4

Producción de ácido láctico por fermentación 5

Uso y manejo de Biorreactores 6

Cinética de crecimiento microbiano (Cultivo batch ) 7

Diseño de esterilización 8

Fermentación en sustrato sólido 9

1
 PRESENTACIÓN DE LABORATORIO

OBJETIVO.

Al final de la práctica el alumno será capaz de:

1. Conocerá las reglas básicas de higiene y de seguridad que se deben observar en el laboratorio
de Biotecnología Microbiana.
2. Conocerá la logística de trabajo para el laboratorio de Biotecnología Microbiana.

INTRODUCCIÓN.

El laboratorio de Biotecnología Microbiana está enfocado en el desarrollo de prácticas elegidas para

confirmar y reafirmar los conocimientos teóricos impartidos en el salón de clase. De esta forma se logrará
desarrollar una actitud crítica hacia la materia, un mejor aprovechamiento de clase práctica y un apoyo
mayor a la clase teórica.

Debido a los riesgos que implica la manipulación cotidiana de sustancias peligrosas, el alumno se
debe comportar respetuoso de los peligros inherentes a su actividad y ejercer las mayores precauciones.
La mayor parte de las sustancias químicas con las que se trabaja en el laboratorio son tóxicas, debido a
ello, es fundamental por un lado conocer las características de los reactivos utilizados durante el
desarrollo de cada sesión, así como conocer las reglas básicas de higiene y de seguridad del laboratorio.

I. Reglas básicas de higiene y de seguridad del laboratorio.

1. Uso indispensable de bata como medida de protección.

2. No deben efectuarse experimentos no autorizados, a menos que estén supervisados por el docente.
3. Cualquier accidente debe ser notificado de inmediato al docente o al auxiliar del laboratorio
4. Lea cuidadosamente la etiqueta del frasco hasta estar seguro de que es el reactivo que necesita, no
utilice reactivos que estén en frascos sin etiqueta
5. Después de que utilice un reactivo tenga la precaución de cerrar bien el frasco.
6. No pipeteé ninguna solución, puede llegar a ingerirlos
7. No se debe probar ninguna sustancia. Si algún reactivo se ingiere por accidente, se notificará de
inmediato al docente.
8. No manejar cristalería u otros objetos con las manos desnuda, siempre usar guantes
9. No se debe oler directamente una sustancia, sino que sus vapores deben abanicarse con la mano
hacia la nariz.
10. No tirar o arrojar sustancias químicas sobre el área de trabajo. En cada práctica deberá preguntar al
profesor sobre los productos que pueden arrojar al desagüe para evitar la contaminación.
11. Cuando en una reacción se desprendan gases tóxicos o se evaporen ácido, la operación deberá
hacerse bajo una campana de extracción.
12. Los frascos que contengan los reactivos a emplear en la práctica deben mantenerse tapados
mientras no se usen.
13. Los tubos de ensaye calientes, con líquido o no, deben colocarse en una gradilla de alambre o
dentro de un vaso de precipitados.
14. Cuando se calientan sustancias contenidas en un tubo de ensaye, no se debe apuntar la boca del
tubo al compañero o a sí mismo, ya que pueden presentarse proyecciones del líquido caliente.

II. Logística del laboratorio.

1. Cada alumno deberá ser parte de un equipo

2. Se firmará un vale sobre el material que le sea asignado para su uso durante toda la sesión; el cual
deberá ser entregado al final del curso, en la cantidad y estado en que se le fue entregado.
3. Al realizar cada práctica deben seguirse las instrucciones, observar y registrar lo que sucede.
4. No deberá cambiar los reactivos de mesa, ya que los equipos de soluciones que son necesarios
para cada uno de los análisis serán puestos completos en su mesa de trabajo. Si llegara a faltar
algún reactivo en su mesa, favor de pedirlo al encargado (a), no lo tome de otra mesa, pues esto
ocasiona una pérdida de tiempo a los demás y el riesgo de contaminación del mismo.
5. Se asesorará y resolverán las preguntas durante el análisis de cada grupo.
2
6. Es importante señalar la necesidad de seguir todos los pasos indicados en cada práctica para
obtener los resultados correctos de cada experimento.
7. En todas las prácticas deberán anotarse las observaciones, los resultados y las conclusiones.
8. En el caso de que el experimento no resultará como está planeado, el alumno deberá investigar,
consultar y agotar todas las posibilidades para lograr un desarrollo correcto. Si no se lograra el
objetivo de la práctica, debe preguntar al docente, él le explicara en donde está la falla y la manera
de corregirla.
9. Cuando la sesión experimental haya finalizado, el alumno deberá limpiar su lugar de trabajo y se
deberá cerciorar de que las llaves del gas y del agua queden cerradas.
10. Debido a la alta peligrosidad de los reactivos, está prohibido estrictamente introducir alimentos al
laboratorio.
11. Antes de salir del laboratorio, el alumno deberá lavarse las manos

3
 PRACTICA No. 1
PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO DE USO INDUSTRIAL

OBJETIVO.

Al final de la práctica el alumno será capaz de:

1. Conocer los componentes para la preparación de medios de cultivo de uso industrial.
2. Aprender como se prepara un medio de cultivo de uso industrial para un determinado propósito.
3. Comparar los requerimientos nutricionales para obtener diferentes productos y/u organismos.

INTRODUCCIÓN.

Una gran variedad de materias primas son comúnmente requeridas como nutrientes de
fermentaciones industriales. El espectro incluye, aparte de las sustancias tradicionales de carbono y
nitrógeno, varios productos industriales y agrícolas los cuales provienen de diferentes países.

Los medios utilizados en las fermentaciones industriales deben contener todos los elementos
necesarios para la síntesis del material celular y para la formación de producto; además, deben satisfacer
los objetivos técnicos del proceso ofreciendo un medio ambiente favorable para el crecimiento y/o
formación de producto y al mismo tiempo ser económicamente rentables.

En 1969, Salomons compila una lista detallada de sustancias nutritivas empleadas en Inglaterra
y Zabriskie publica una similar para USA.

PROCEDIMIENTO.

I. PREPARACIÓN DE MEDIO BUFFER-CEREAL PARA PRODUCCIÓN DE ENZIMAS FUNGICAS

1. Preparar 50 ml de medio buffer-cereal para la producción de enzimas ligninoliticas.

Bran-flakes 1g
Buffer fosfatos 60 mM pH 6.0 50 ml

2. Esterilizar el medio en autoclave a 15 lb/plg por 15 min.

II.- PREPARACIÓN DEL MEDIO PARA CULTIVO DE BACTERIAS Y LEVADURAS

a) Preparar 120 ml para la bacteria Leuconostoc mesenteroides

Peptona 3 gr.
Extracto de levadura 1 gr.
Cloruro de sodio 0.1 gr.
Sacarosa 10 gr.
Agar 2 gr.
Agua destilada 100 ml

b) Preparar 120 ml de medio de cultivo especial para levaduras, el cual tiene la siguiente composición:

Para 100 ml de medio se utiliza:

Extracto de levadura 1 gr.
Peptona 2 gr.
Dextrosa 1 gr.
Agar 1.5 gr.
pH 6.5 - 6.8

4
III.- PREPARACIÓN DEL MEDIO MS PARA CULTIVO DE TEJIDOS VEGETALES

Se parte de soluciones madre, preparadas de la siguiente manera:

Sol. A 1000 X para 50 ml:

CaCl2 16.61 g
Sol. B 1000 X para 50 ml:
KI 41.5 g
CoCl2 6H2O 1.25 mg

Sol. C 400 X para 50 ml:

Fosfato monobásico de potasio KH2 PO4 3.4 gr.
Ac. Bórico H3 BO3 0. 124 gr.
Molibdato de sodio NaMOO4 5.0 mg.
Sol. D 400X para 50 ml:
Sulfato de magnesio MgSO4 7H2 O 7.40 gr.
Sulfato de manganeso MnSO4 H2O 0.34 gr.
Sulfato de zinc ZnSO4 7H2O 0.172 gr.
Sulfato de cobre CuSO4 5H2O 0.50 mg.
Sol. E 200X para 100 ml:
Sulfato ferroso FeSO4 7H2O 0.557 gr.
EDTA disódico 0.745 gr.

Sol. F 100X para 100 ml (Sol. De vitaminas MS):

Glicina 20.0 mg.
Piridoxina-HCl 5.0 mg.
Ac. Nicotinico 5.0 mg
Tiamina-HCl 1.0 mg
Inositol 1.0 g

1. Para preparar 1 Lt ml de medio MS , se adicionan las siguientes cantidades en ml de c/u de los

componentes anteriores.

Sol. A 1 ml
Sol. B 1 ml
Sol. C 2.5 ml
Sol. D 2.5 ml
Sol. E 5.0 ml
Sol. F 10 ml

2. Pesar y agregar hasta disolver:

Sacarosa 30 g
Nitrato de potasio 1.9 g
Nitrato de amonio 1.65 g

3. Ajustar el pH a 5.7 y posteriormente aforar a 100 ml con agua destilada.

4. Si se prepara un medio liquido se deja tal cual, pero si se desea preparar un medio semisólido es
necesario agregar un agente gelificante (agar-agar por ejemplo).

REPORTAR:

1. Función de cada nutriente usado en la preparación de los 3 medios de cultivo

2. Comparación de los requerimientos nutricionales para obtener los organismos o productos vistos en
esta práctica.

5
CUESTIONARIO:

1. ¿Cuál es papel que tiene cada componente de los medios en el crecimiento del organismo a
cultivar.?

2. ¿Cuál es la razón por la cual se necesita preparar soluciones Madre concentradas?

3. ¿Cómo prepararías una solución madre 1000 X de NaCl cuya concentración en el medio sea
0.085 mM. ?

4. ¿Qué otros medios podrían ser usados para la producción de enzimas fúngicas ?

6
 PRÁCTICA No. 2
AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE UN MICROORGANISMO DE USO INDUSTRIAL
(productor de etanol y de un microorganismo productor de dextrano)

OBJETIVOS:

1. El alumno conocerá los pasos para aislar e identificar un microorganismo de uso industrial
2. El alumno aislará un microorganismo levadura o bacteria que sea productor de etanol.
3. El alumno aislará la bacteria productora de dextrano (Leuconostoc mesenteroides) a partir de una
muestra de pulque.

INTRODUCCIÓN:

La biotecnología alimentaria tradicional utiliza ampliamente los microorganismos, que intervienen

en diferentes etapas de la obtención del producto.

En la naturaleza existe una gran cantidad de microorganismos: hongos, bacterias ó levaduras

que pueden tener facultad de crecer sobre un medio rico en azúcares y metabolizar estos para producir
un metabolito primario de gran importancia industrial. La Búsqueda de microorganismos que producen
metabolitos deseados implica una buena técnica y paciencia.

Los cultivos de interés deben ser repurificados debido a la presencia de otros de crecimiento más
lento y menos productores del metabolito de interés. Después de la selección del microorganismo
productor, la mejora genética y la preservación a largo plazo de la cepa son esenciales para el proceso
industrial final.

Los microorganismos pueden ser aislados de la naturaleza, para esto se requiere métodos de
enriquecimiento.

Los microorganismos productores de etanol, los podemos encontrar en los lugares donde
existan azúcares fermentables viñedos, frutas, ingenios azucareros, destilerías, etc. Por lo tanto
debemos tomar muestras de estos lugares para asegurar que entre la población microbiana existen
algunos productores de etanol.

El Leuconostoc mesenteroides es un microorganismo productor de dextrano y se encuentra

ampliamente distribuido sobre todo en productos agrícolas (del que es responsable de su fermentación),
así como en algunos tipos de zumo o jugos de frutas. Se ha encontrado en un preparado fermentado del
jugo de mamey que se conoce como pulque y en ingenios azucareros.

MATERIAL REACTIVOS
6 cajas de petri Peptona
2 matraces de 125 ml. extracto de levadura
5 tubos con tapón de rosca agar – agar
4 pipetas de 1 ml. agua destilada estéril
1 asa bacteriológica azul de metileno
1 mechero Fischer Glucosa
Portaobjetos Sacarosa
Cubreobjetos hidróxido de bario
Microscopio cristal violeta
alcohol – acetona
Safranina
Solución salina de NaCl al 1%

PROCEDIMIENTO:

I. AISLAMIENTO DEL MICROORGANISMO PRODUCTOR DE ETANOL.

7
A)

1. Preparar 60 ml. de medio de cultivo especial para levaduras, el cual tiene la siguiente composición:
Para 100 ml de medio se utiliza:
Extracto de levadura 1 gr.
Peptona 2 gr.
Dextrosa 1 gr.
Agar 1.5 gr.

pH 6.5 - 6.8

2. Esterilizar, vaciar aproximadamente 20 ml. de medio en cada caja y dejar enfriar.

3. De una muestra de pulque o de fruta fermentada, tomar una asada y sembrar por estría abierta en
una caja de petri con el medio preparado anteriormente. Ver figura.
4. Incubar a 28°C de 24-48 hrs

B). Selección e Identificación de la cepa productora de etanol.

1. De la caja que contiene las colonias de microorganismos potencialmente productores de etanol

(levaduras) seleccionar 2 ó 3 que estén bien separadas y marcarlas por la parte de atrás.

8
 2. Tomar un poco de la colonia y realizar una tinción para observar si son colonias de levaduras

NOTA: Las levaduras son muy parecidas a bacterias macroscópicamente pero son más cremosas y los
colores que presentan son blancos, beiges o un poco más oscuros. Algunas son rosadas o
rojas. Al microscopio se ven células de diferente forma (esférica o alargada) y se debe ver
alguna gema (célula con otra al lado o encima).
En el interior de la célula grande se ven estructuras

Técnica de tinción:
a) Fijar la preparación
b) Cubrir con una gota de azul de metileno 1 minuto
c) Lavar, secar y observar al microscopio

Comprobación de que las cepas aisladas son productoras de etanol:

1. Inocular una asada de cada colonia aislada diferente en un tubo de fermentación.

2. Incubar a 25°Cy observar la producción de gas (posiblemente CO 2) a las 24 y 48 horas
3. Comprobar la presencia de CO2 añadiendo lentamente (gota a gota) solución saturada de hidróxido
de bario. La formación de un precipitado blanco confirma que la prueba es positiva.
4. Seleccionar la cepa más productora de etanol en base a los resultados (mayor producción de CO 2)
en un mismo tiempo.

II. AISLAMIENTO DEL MICROORGANISMO PRODUCTOR DE GOMA (Leuconostoc

mesenteroides).

1. Preparar 60 ml. del medio de cultivo que tenga la siguiente composición:

Para 100 ml de medio se utiliza:

Peptona 3 gr.
Extracto de levadura 1 gr.
Cloruro de sodio 0.1 gr.
Sacarosa 10 gr.
Agar 2 gr.

2. Esterilizar, vaciar aproximadamente 20 ml de medio en cada caja y dejar enfriar.

3. De una muestra de pulque fresco, tomar una asada y sembrar por estría abierta en una caja de petri
con el medio de cultivo preparado anteriormente.
4. Incubar en estufa a 28º C por 24 - 48 hrs.
5. Observar las colonias formadas.

IV IDENTIFICACIÓN DE LA CEPA PRODUCTORA DE DEXTRANAS.

1. Observar si alguna de las cepas de las bacterias aisladas, al crecer en el medio de cultivo sólido,
produce una apariencia gomosa transparente.
2. Observar al microscopio mediante tinción de Gram estas cepas de bacterias aisladas. El Leuconoctoc
mesenteroides es bacteria Gram (+).
Técnica de tinción:
a) Fijar la preparación

b) Cubrir con una gota de de violeta genciana 2 minutos. Lavar con agua.
c) Cubrir con lugol, escurrir y lavar con agua
d) Decolorar con alcohol-acetona
e) Cubrir con fucsina o safranina 2 minutos, lavar, secar y observar al microscopio.
Las bacterias gram (+) se observan violeta azul y las Gran (-) rojo
9
REPORTAR:

1. Todas las observaciones en cajas, portaobjetos y tubos de fermentación.

2. Dibujos de las colonias y microorganismos observados.
3. Resultados obtenidos.
4. Discusiones.
5. Conclusiones .
6. Bibliografía.

CUESTIONARIO:

1. Para aislar la levadura se pueden utilizar los dos medios utilizados en la práctica, mientras que para
aislar el Leuconostoc mesenteroides, se requiere únicamente el medio que lleva sacarosa. Explique
el por qué de cada caso.

2. Describa los pasos que seguiría usted para aislar e identificar a la cepa más productora de un
metabolito de interés.

3. Cuál sería el sustrato principal para aislar un microorganismos productor de:

(a) amilasas, (b) pectinasas, (c) enzimas que degraden colorantes.

4. Cuál es la finalidad de pre-enriquecer el pulque mediante la adición de azúcar?

5. Cuál es la reacción que ocurre en el tubo de fermentación al adicionar hidróxido de bario.

10
 PRÁCTICA No. 3
ETAPAS DE UN PROCESO BIOTECNOLOGICO

OBJETIVO:

El alumno conocerá las etapas de un proceso biotecnológico

El alumno aplicará las etapas de un proceso biotecnológico para obtener un metabolito de interés
(dextrano)

INTRODUCCIÓN:

Un proceso biotecnológico no se reduce en general a una sola etapa operativa.

Operacionalmente se pueden distinguir 5 etapas fundamentales en cualquier proceso biotecnológico:

a) Elección del cultivo : En esta primera etapa se buscan las cepas adecuadas para la producción
del producto que se quiera desarrollar. También en esta etapa se pueden mejorar las cepas
mediante técnicas de genética.
b) Cultivo en masa : Se realiza el proceso de multiplicación de los microorganismos, es decir el
aumento de la biomasa (desarrollo de inóculo).
c) Respuestas celulares : Esta etapa es importante porque los productos por los cuales se están
cultivando las células, solamente se producirán bajo condiciones bastante específicas y
probablemente no serán las mismas que para obtener biomasa.
d) Operación del proceso : Se controlan las variables del proceso, para buscar la reproducibilidad
de los microorganismos. Esta es una de las etapas más difíciles y menos estudiadas ya que cada
proceso tiene sus propias características específicas.
e) Recuperación del producto : En etapa final se busca la recuperación del producto creado
(separación del producto).

La ejecución satisfactoria de todas las etapas , completamente optimizado en cuanto a seguridad,

reproducibilidad, control y eficiencia es en su mayor parte un asunto de diseño de ingeniería del proceso,
aplicado con un completo entendimiento de los factores biológicos, químicos y socioeconómicos

Metabolitos de interés industrial que se obtiene por biotecnología son los dextranos naturales,
que son producidos normalmente por fermentación con diversos géneros de microorganismos, tales
como Leuconostoc mesenteroides, L. dextranicum y Streptococus mutans.

Estos dextranos no han sufrido alteraciones por hidrólisis o fraccionamiento, el peso molecular
promedio es de 30 a 50 millones, determinado por métodos de dispersión de luz. Los dextranos naturales
se modifican por hidrólisis parcial o fraccionamiento para obtener dextranos clínicos, apropiados para su
utilización como componentes esenciales de productos para la reposición de volumen sanguíneo.

MATERIAL REACTIVOS
1 Matraz Erlenmeyer de 500 ml Algodón
1 Probeta de 100 ml y 250 ml Gasa
1 Mechero Fisher Extracto de levadura
1 Vaso de precipitado de 500 ml. Peptona
1 Agitador Sacarosa
1 Asa bacteriológica Metanol o etanol para precipitar
1 Embudo Agar-Agar
1 Baño con agitación Cloruro de sodio
1 Matraz kitazato

11
PROCEDIMIENTO:

I.- PRODUCCIÓN DE DEXTRANOS.

1. Preparar 100 ml del medio de cultivo que tenga la siguiente composición:

Sacarosa 15 %
Peptona 2%
Extracto de levadura 1%
NaCl 0.1 %
Agua 100 ml.
pH 6.5

2. Esterilizar a 10 lb/plg2 por 30 minutos.

3. Enfriar a temperatura ambiente e inocular con tres a cuatro asadas del microorganismo
(Leuconostoc mesenterios).
4. Incubar en baño con agitación por 48 hrs. a 25 º C.

II.- SEPARACIÓN Y PURIFICACIÓN DEL DEXTRANO.

1. Una vez terminada la fermentación al matraz que contiene el dextrano, adicionarle un volumen igual
de metanol o etanol para precipitar el dextrano. Agregarlo lentamente y con agitación constante.
2. Si se forman partículas pequeñas se tendrá que filtrar a vacío para poderlas separar.
3. Purificar el dextrano obtenido adicionándole 100 ml. de agua y calentando la mezcla a 50 - 60 ºC.
4. Separar por decantación o filtración y secar a una temperatura entre 40 y 50 º C.
5. Pesar el dextrano obtenido y obtener y reportar el rendimiento

CUESTIONARIO:

1. Describa cada una de las etapas del proceso biotecnológico desarrollado en esta práctica.
2. Que son los dextranos y que aplicación industrial tienen?
3. ¿Porqué el medio de fermentación se esteriliza a baja presión y 30 minutos en lugar de esterilizar 15
lb/plg2 durante 15 minutos?
4. A qué se debe el aumento de la viscosidad en el medio de fermentación a medida que esta avanza?

12
 PRÁCTICA No. 4
OBTENCIÓN DE PRODUCTOS DE INTERÉS BIOTECNOLÓGICO
(Producción de Etanol por fermentación))

OBJETIVO:

El alumno:
a) Utilizará un microorganismo aislado para la producción de etanol utilizando un medio adecuado.
b) Conocerá las etapas del proceso de producción de etanol.

INTRODUCCIÓN:

El etanol es uno de los productos obtenidos por fermentación más comunes. Para su producción
se utilizan levaduras y algunas especies de bacterias. Estos microorganismos trabajan en condiciones de
anaerobiosis sobre sustratos que contienen azúcares fermentables (principal fuente de carbono), para
producir el producto deseado. La aplicación principal tradicional ha sido la producción de bebidas
alcohólicas

Para sacar ventaja de las técnicas de fermentación es deseable que el medio líquido
tenga las siguientes características:

1) La concentración de azúcares fermentables deber estar correctamente ajustada para hacer rentable
el proceso y asegurar que los azúcares residuales después de la fermentación sean mínimos

2) Los m.o. diferentes de los del inóculo principal deben ser eliminados

3) La sustancias tóxicas para los m.o deben eliminarse o ser reducidos a un nivel mínimo aceptable.

MATERIAL REACTIVOS

1 Matraz Erlenmeyer de 1 litro Glucosa o medio con azúcares

fermentables
1 Matraz Erlenmeyer de 125 ml Sulfato de amonio
1 Equipo de destilación simple Fosfato de amonio
2 Soportes HCl 0.1 N
1 Parrilla NaOH 0.1 N
Algodón
Gasa
1 Pinzas para bureta
1 Probeta de 250 ml.
2 Pipetas de 5 ml.
1 Mechero Fisher
1 Bomba para aireación
1 Tapón Bihoradado
1 Tubo de vidrio doblado
1 Refractómetro
1 Potenciómetro
1 Alcoholímetro
2 Mangueras

13
PROCEDIMIENTO:

I.- Preparación del inóculo.

1. En un matraz de 500 ml preparar 200 ml de medio de cultivo que tenga la siguiente composición:

Azúcares 15 %
Fosfato de Amonio 2 %
Sulfato de amonio 1 %
Extracto de levadura 1%
pH 4 - 4.5
2. Separar 30 ml del medio en un matraz para posteriormente con este preparar el inóculo.
3. Esterilizar un tapel medio de cultivo a 10 lb/plg2 por 20 minutos. Enfriar el medio de cultivo
4. Tapar el matraz que contiene el medio a fermentar con un tapón que contenga dos varillas y
manguera para airear (este deber. El tapón, las varillas y la manguera deberán estar estériles.
5. Preparar el inóculo tomando dos o tres asadas de la levadura seleccionada e incubar en la estufa a
27 ºC por 24 hrs.

II.- Proceso fermentativo

1. Vaciar el inóculo al medio.

2. Conectar el difusor de aire al matraz y al filtro de aire.
3. Airear por un periodo de 30 minutos manteniendo la temperatura a 27º C y después introducir CO 2
para crear condiciones anaeróbicas.
4. Incubar en la estufa por 3 o 5 días o hasta que el contenido de azúcares sea el mínimo, lo cual se
observará por la poca formación de espuma o desprendimiento de CO 2. Tomar una muestra de 5 ml,
colocarla en un tubo con tapón de rosca y refrigerar (posteriormente se determinarán azúcares
reductores).

III.- Cuantificación del etanol producido.

a)- Grado alcohólico.

1. En un matraz de destilación colocar 80 ml de muestra con 80 ml de agua destilada, se conecta el
aparato de destilación simple y se calienta con mechero hasta obtener 80 ml de destilado.
2. Bajar la temperatura destilado hasta la temperatura de calibración que se indica en el alcoholímetro
(15 °C) y vaciar el líquido a una probeta de 100 ml.
3. Introducir el alcoholímetro a la probeta procurando que este no toque las paredes y tomar la lectura
que marca en el menisco superior.
4. En caso de no enfriar el destilado, tomar la temperatura de este y efectuar la medición del grado
alcohólico el cual deberá ser corregido por medio de tablas.

IV.- Cuantificación de azúcares consumidos para obtener rendimiento:

Los azúcares consumidos se cuantificarán mediante la medición de azúcares reductores antes y

después de la fermentación, para lo cual se utilizará el método del ácido dinitrosalicílico (DNS), que se
describe a continuación.

IV.1.- Preparación de la curva patrón.

1. Preparar una solución patrón de azúcar (dextrosa) en agua a una concentración de 1mg/ml.
2. Preparar la curva patrón tomando los siguientes volúmenes de solución patrón y agua.

ml. patrón 0 0.1 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0

ml. agua 1.0 0.9 0.8 0.6 0.4 0.2 0

14
3. Preparar un blanco con 1 ml. de agua para calibrar el equipo.
4. Colocar en 7 tubos de ensaye 0.5 ml. de cada una de las muestras y se le agregan 0.5 ml. de
reactivo DNS.
5. Calentar todos los tubos a baño María por 5 minutos, enfriar y agregar 5ml. de H 2O
6. Leer absorbancia a cada una de las muestras a 540nm

IV.2.- Determinación de azúcares reductores en las muestras problema

1. Tomar 0.1 ml de la muestra de medio tomada antes de la fermentación y aforar a 20 ml

2. Tomar 1 ml de la muestra después de la fermentación y aforar a 20 ml
3. Repetir pasos 4, 5 y 6 de la curva patrón
4. Calcular la cantidad de azúcares reductores en cada muestra por interpolación en la curva estándar.
Considerar en el cálculo el factor de dilución

REPORTAR:
1. Resultados obtenidos
2. Curva Patrón de azúcares
3. Grado alcohólico obtenido
4. Azúcares consumidos, rendimiento y productividad de la fermentación
5. Eficiencia de la fermentación.

CUESTIONARIO:
1. ¿Cual es la importancia actual de la producción de etanol a nivel mundial ?
2. ¿Cuales son los microorganismos que tienen mayor importancia en este tipo de industria?
3. ¿Qué papel juega la biología molecular en la producción de etanol?
4. ¿Menciona algunos proyectos que ejemplifiquen la pregunta anterior?
5. ¿Por qué es necesario suministrar aire al inicio del proceso de fermentación?
6. Ruta metabólica involucrada en esta fermentación si se emplea levadura y si se empleara Z. mobilis.
7. Como podría incrementarse el rendimiento en este tipo de fermentación?
8. Escriba el fundamento de la determinación de azúcares por el método del DNS,

15
 PRÁCTICA No. 5
PRODUCCIÓN DE ACIDO LACTICO POR FERMENTACIÓN.

OBJETIVO:

1. El alumno conocerá el proceso de producción de ácido láctico por fermentación.

2. Purificará el ácido láctico obtenido de la fermentación.

INTRODUCCIÓN:

El ácido láctico o hidroxipropiónico (CH3-CHOH-COOH) era conocido como componente de la

leche agria desde que el hombre apacentó a sus primeros rebaños. Su verdadera naturaleza fue
descubierta por Scheele, quién lo aisló y lo identificó como principal ácido de la leche agria en 1780.

No fue sino hasta 1881 que el ácido láctico se produjo a escala industrial y actualmente se
produce a partir de azúcar de maíz y suero de leche.

El sustrato para la producción de ácido láctico por fermentación puede ser lactosa (suero),
glucosa(jarabes de glucosa) o sacarosa, sea pura o como melazas de remolacha, y la fermentación es
anaerobia. Además de carbohidratos, el medio incluye nutrientes inorgánicos que suministran nitrógeno,
fósforo, potasio, etc.

Lactobacillus delbrückii crece a temperatura de hasta 50°C y L. bulgáricus hasta 44°C, son los
microorganismos más usados a nivel industrial para la producción del ácido láctico. Este ultimo debe ser
utilizado para la fermentación del suero, ya que el primero no puede fermentar lactosa

El ácido láctico tiene diversas aplicaciones en el área de cosméticos, en alimentos, en la industria

textil y en área de farmacia, razón por la que su producción es importante.

MATERIAL REACTIVOS
1 Matraz Erlenmeyer de 1 lt Fuente de carbono ( suero de leche)
1 Matraz Erlenmeyer de 125 ml Líquido de remojo de maíz
1 Matraz aforado de 100 ml Peptona
1 Probeta de 250 ml Extracto de carne
2 Pipeta de 10 ml Extracto de levadura
1 Vaso de precipitado 100 ml Glucosa
1 Bureta K2HPO4
1 Parrilla Acetato de sodio
1 Mechero Fisher Triacetato de amonio
1 Asa bacteriológica MgSO4. 7H2O
Estufa de incubación MnSO4. 4H2O
Algodón Tween 80
Gasa NaOH 0.5 N
Fenolftaleina
Acido sulfúrico
Carbón activado
Hielo
Agua destilada
Cal

16
PROCEDIMIENTO:

I.- Preparación del inoculo.

1. Preparar 25 ml de medio de cultivo que contenga la siguiente composición:

Peptona 1%
Extracto de carne 1%
Extracto de levadura 0.5 %
Glucosa 2%
K2HPO4 0.2 %
Acetato de sodio 0.5 %
Triacetato de amonio 0.2 %
MgSO4. 7H2O 0.02 %
MnSO4. 4H2O 0.02 %
Tween 80 0.1 ml/100 ml.
pH 6.2 - 6.6

2. Esterilizar a 15 lb/plg2 por 15 minutos.

3. Enfriar a temperatura ambiente e inocular 1 ml de de bebida láctea fermentada (“Yakult” o “Chamito”)
e incubar a 37 ºC por 48 horas.

II:- Preparación del medio de cultivo.

1. Preparar 250 ml de medio que tenga la siguiente composición:

Suero de leche desproteinizado 225 ml.

Líquido de remojo de maíz 25 ml.
pH 5-6

2. Poner 20 gr. de cal en un matraz Erlenmeyer de 125 ml y agregar 50 ml de agua destilada.

3. Esterilizar el medio y la cal a 15 lb/plg2 durante 15 minutos.
4. Dejar enfriar hasta aproximadamente 43 ºC.
5. Añadir el inoculo en condiciones asépticas.
6. Incubar a 43 ºC por un periodo de 48 horas y agregar cal para subir el pH cuando sea necesario.
7. Una vez terminada la fermentación, el pH aumenta hasta cerca de 12 con una lechada rica en cal,
elevar la temperatura hasta el punto de ebullición; dejar hervir la mezcla a fuego lento por 20 minutos.
Se elimina por filtración el fosfato de calcio precipitado.
8. Decolorar 50 ml del filtrado con carbón activado.

III.- Purificación del ácido láctico.

1. En un baño con hielo agregar poco a poco ácido sulfúrico al filtrado obtenido en la sección II para
precipitar el sulfato de calcio y dejar libre el ácido láctico.
2. Filtrar.
3. Separar una muestra de 10 ml del filtrado para la determinación por titulación (punto 5). Dejar
precipitar el ácido láctico a 4 °C por 24 hrs, filtrar y pesar.
4. Cuantificar por gravimetría la cantidad total de ácido láctico producido.
5. Hacer una solución 1:10 con el filtrado y titular con hidróxido de sodio 0.5 N utilizando fenolftaleina
como indicador.
6. Cuantificar la cantidad total de ácido láctico producido. Comparar las determinaciones gravimétrica y
por titulación.

17
REPORTAR:

Rendimiento y productividad de la fermentación del ácido láctico

Eficiencia
Justificación de los pasos y reactivos empleados en cada parte del proceso

CUESTIONARIO:

1. Menciona 5 microorganismos que se usen para la producción de ácido láctico

2. Explica la importancia de controlar el pH durante el proceso
3. Menciona qué otros ácidos orgánicos son producidos por biotecnología y explica en que se emplean
cada uno de ellos?
4. Por qué para el ajuste de pH se usa Ca(OH)2 y no algún otro álcali?
5. Escribe la ruta metabólica de la producción de ácido láctico

18
 Práctica No. 6
CONOCIMIENTO Y MANEJO DE BIORREACTORES.

OBJETIVO:

Al finalizar la práctica el alumno será capaz de :

1. Conocer e identificar cada una de las partes que componen a un biorreactor.

2. Conocer los módulos de instrumentación y control que forman parte importante del biorreactor y que
miden y controlan los diferentes parámetros.
3. Conocer y dominar como se conectan los diferentes accesorios con los que cuentan los biorreactores
para su buen funcionamiento.

INTRODUCCIÓN:

Los biorreactores son los dispositivos en los cuales los procesos biotecnológicos se llevan a cabo
para la obtención de algún metabolito y/o proliferación celular, todo bajo condiciones de asepsia y
además donde se controlan los principales parámetros medio ambientales en un rango óptimo para poder
maximizar la producción del producto de interés.

Es de gran importancia conocer cada una de las partes que componen un biorreactor, así como
su funcionamiento y además se hace necesario saber que parámetros mide y controla dicho equipo, entre
mayor sea el número de parámetros a controlar mejores resultados de dicho proceso se obtendrán.

MATERIAL:

1 Fermentador de New Brunswick Scientific.

1 Biorreactor GallenKamp.

Procedimiento.

El maestro de laboratorio explicará cada un de los biorreactores (sus partes, su función y como se realiza
su conexión ), el alumno anotara todo esto pues formará parte de lo que se tiene que reportar.

Partes del biorreactor:

C Calentador
MT Medidor de temperatura
pH Medidor de pH
IN Indicador de nivel
VE Nivel de espuma
OD Medidor de oxígeno disuelto
F Flecha de agitador
Tb Turbina
As Aspersor de aire
Co Condensador
SIC Sistema de intercambiador de calor
Sistema de entrada del medio
Sistema de entrada de aire
Sistema para toma de muestras
Sistema para control de pH

19
 PROCEDIMIENTO GENERAL PARA EL MANEJO
DEL BIORREACTOR DE NEW BRUNSWICK

1. Checar que todos los interruptores estén en posición de apagado, el control de la velocidad de
agitación este en el mínimo la perilla debe girarse a la izquierda y el interruptor del medidor de
temperatura este en off.
2. Colocar el dispositivo de transmisión del movimiento al eje del motor.
3. Colocar el biorreactor en su lugar, procurando que quede bien sentada la tapa en dos pernos que se
encuentran en los lados izquierdo y derecho del mueble.
4. Apretar las mariposas que también se encuentra en los lados.
5. Conectar el dispositivo de transmisión del movimiento a la flecha de agitación del biorreactor.
6. Colocar los conductos de entrada y salida de agua, salida de condensados, entrada y salida de aire si
se necesitan y estas deben estar conectadas a los filtros.
7. Conectar el medidor y el registrador de temperatura en las primeras dos conexiones del lado derecho
del mueble, introducir estas en los tubos correspondientes.
8. Abrir la llave del agua que se encuentra cerca de la pared
9. Encender el biorreactor y los demás interruptores del panel de control.
10. Fijar con la perilla de control de temperatura la temperatura deseada del proceso.
11. Checar que circule agua por los tubos de hule.
12. Accionar la perilla de control de velocidad y acomode la velocidad deseada que se registra en el
medidor analógico que está debajo de la perilla.
13. Para medir la temperatura es necesario accionar el interruptor del lado derecho del graficador de
temperatura y colocarlo en “on” , una aguja se moverá y marcará la temperatura del medio de cultivo
dentro del biorreactor.
14. Para introducir aire: 1) se debe encender el compresor que esta afuera de la caldera, 2) fijar la
presión del aire a la entrada del laboratorio en 2 Kg/cm^2 con el regulador de presión que esta en la
pared poniente del laboratorio cerca del intercambiador de calor; 3) abrir la válvula del aire que está
en la pared en la parte de atrás del mueble del biorreactor; 4) fijar la presión de salida del aire con la
perilla que esta debajo del manómetro y 5) con el rotámetro fijar el flujo de aire deseado en lt/min.
15. Al terminar la practica debe apagar todos los interruptores y cerrar las llaves del agua y aire
desconectar los conductos de agua y condensados y el dispositivo de transmisión del movimiento y
por ultimo retirar el biorreactor.

REPORTAR:

1. Ilustraciones donde se indique el nombre de cada una de las partes del biorreactor.
2. Se elaborará una secuencia de operación para cada biorreactor que le permita al alumno manejarlo
sin causar daño al equipo.
3. Reportar las ventajas y desventajas de los biorreactores vistos.

CUESTIONARIO.

1. Que tipo de biorreactores se utilizan para el cultivo de los siguientes organismos

a) Hongos en cultivo sumergido
b) Células vegetales en cultivo en suspensión (raíces vegetales)
c) Células animales.

2. Menciona cuales son la principales características de los biorreactores air-lift.

20
 PRACTICA No 7
CINÉTICA DEL CRECIMIENTO MICROBIANO
CULTIVO BATCH

OBJETIVOS:
al finalizar la práctica el alumno será capaz de.

1. Determinar la cinética de crecimiento de B. subtilis y representar los datos obtenidos en gráficas.

2. Determinar la velocidad especifica de crecimiento, consumo de sustrato, la productividad y el
rendimiento celular.
3. Conocer algunos de los métodos para cuantificar la biomasa microbiana.
4. Establecer algunas ventajas y desventajas de los métodos de cuantificación.

INTRODUCCIÓN.

Las etapas del crecimiento de un microorganismo son de vital importancia en la biotecnología,

básicamente todos los procesos industriales tienen como base una o varias formas de monitorear el
crecimiento microbiano debido a que de él depende la producción del metabolito deseado. En la
actualidad toda empresa biotecnología tiene bien establecidas las condiciones del microorganismo que
utiliza, así como los factores que influyen en su crecimiento, tales como el pH, la temperatura, la
concentración de nutrientes, factores de crecimiento, oxigeno disuelto, agitación , nivel de espuma, etc.

Todos estos parámetros son los que determinan el éxito o el fracaso del proceso biotecnológico.
Por todo lo anterior es vital que el alumno de biotecnología maneje en forma adecuada el crecimiento
microbiano.

MATERIAL Y MÉTODOS.

 Medio de caldo nutritivo  Biorreactor de 1 o 3 lt

 Cultivo de B. Subtilis  Espectrofotometro UV/visible
 Pipetas de 10  Cuenta colonias
 15 Tubos con tapón de baquelita estériles  Estufa de incubación.
 15 Tubos con tapón de baquelita con Sol. estándar de glucosa 0.1 mg/ml
solución salina estéril para dilución  Sol. de fenol al 5%
 Perilla para pipetas de 10 ml  Ac. sulfúrico concentrado
 20 Tubos de ensaye
 Pipeta de 0.1 ml
 Pipetas de 5 ml
 1 Embudo estéril

PROCEDIMIENTO:

I. Desarrollo de la curva de crecimiento microbiano.

1. Preparar un volumen tal de medio de cultivo liquido (caldo nutritivo) que sea equivalente al 70% -80
del volumen del biorreactor a usar.
2. Colocar el medio en el biorreactor y esterilizarlo a 15 lb/plg por 15 min.
3. Enfriar el medio
4. Sacar con una pipeta estéril 50 ml de muestra de medio que servirá de blanco, vaciar a un matraz
estéril y refrigerar.
5. Preparar con el inoculo con 24 hrs de anticipación, el cual se preparará utilizando caldo nutritivo
estéril y varias asadas del cultivo de B. subtilis , e incubar a 37 °C. El volumen del inoculo será de
aproximadamente del 2-3% del volumen de medio del biorreactor.
6. Inocular el biorreactor con el cultivo anterior usando un embudo estéril y haciendo esta en la
campana de flujo laminar.

21
 7. Colocar el biorreactor en su lugar y conectarle todos los aditamentos necesarios para el monitoreo de
los diferentes parámetros a medir y controlar.
8. Mezclar bien utilizando el agitador del biorreactor y tomar la muestra # 1 que será la del tiempo To,
la muestra se colocará en un tubo estéril con tapón de rosca y otra parte de la muestra en una
celdilla.
9. A la muestra de la celdilla se le agitar bien y se le determina turbidez a 560 nm, mientras que a la
muestra del tubo con rosca se refrigera para su posterior determinación de azúcares.
10.Repetir el muestreo a las 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 12 y 24 hrs.

II. Determinación de la turbidez del crecimiento microbiano.

1. Se enciende el espectrofotómetro y se deja calentar 20 min. se ajusta la longitud de 560 nm onda y

se ajusta a cero usando medio estéril sin inocular.
2. De la muestra tomada se agita bien se colocan en una celdilla del espectrofotómetro y se determina
el valor de la absorbancia

III. Determinación de azucares totales por el método del DNS

a) Preparación de la curva patrón.

Preparar una solución patrón de azúcar (dextrosa) en agua a una concentración de 1 mg/ml.

1. Preparar la curva patrón tomando los siguientes volúmenes de solución patrón y agua.

ml. patrón 0 0.1 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0

ml. agua 1.0 0.9 0.8 0.6 0.4 0.2 0

2. Colocar en 7 tubos de ensaye 0.5 ml. de cada una de las muestras y se le agregan 0.5 ml. de
reactivo DNS.
3. Calentar todos los tubos a baño maría por 5 minutos, enfriar y agregar 5 ml. de H 2O
4. Calibrar el espectrofotómetro con el tubo que no tiene solución patrón a 540 nm
5. Leer absorbancia a cada una de las muestras a 540 nm

b) Determinación de azúcares reductores para determinar el rendimiento celular

1. Centrifugar las muestras refrigeradas a 3000 r.p.m durante 5 min. Las muestras que se analizarán
será del tiempo 0 min y la de las 24 horas de fermentación.
2. Tomar 0.1 ml de sobrenadante y aforar a 1 ml (Sólo para la muestra de tiempo 0 min)
3. Repetir pasos 2, 3, 4, y 5 del procedimiento anterior
4. Calcular la cantidad de azúcares reductores en cada muestra por interpolación en la curva estándar y
considerando el factor de dilución

-
REPORTAR.

1. Tablas de datos obtenidos.

2. Hacer gráfica de absorbancia de turbidez de contra tiempo, de azúcares reductores y de peso seco
contra absorbancia
3. Determinar la velocidad especifica de crecimiento del microorganismo en la fase exponencial o
logarítmica, el tiempo de doblado del microorganismo, la velocidad especifica de consumo de
sustrato, el rendimiento celular en base al sustrato consumido y productividad.

CUESTIONARIO.

22
1. Investigar y explicar otros 3 métodos para determinar la biomasa o el # de células.
2. Cual de todos los métodos se pueden aplicar a hongos y porque.
3. Investiga como seria la curva de crecimiento para células vegetales y animales.
4. Calcular el tamaño del inoculo en cel/ml si al cabo de 10 hrs de cultivo la concentración celular es de
1x1015 cel/ml y el tiempo de doblado es de 30 min.
5. En que se fundamenta la determinación de azucares totales por el método usado

23
 Práctica No.8
DISEÑO DE ESTERILIZACION

INTRODUCCIÓN.

Se requiere que los procesos biotecnológicos sean operados sin contaminación biológica para
asegurar el producto y la calidad de este a obtener, así como control de del medio ambiente cuando se
vierten los desechos. Existen muchos métodos para efectuar la esterilización de un medio, ya sea por
eliminación física o destrucción de los posibles contaminantes, de estos, el más utilizado es el método de
esterilización por calor.
Para una temperatura específica la mortalidad de los microorganismos cuando se exponen a calor
(mortalidad térmica) es proporcional al número de células vivas que se tienen. La mortalidad de los
microorganismos se puede expresar de 4 formas: 1)Punto de muerte térmica, 2) tiempo de muerte térmica,
3) porcentaje de muerte, 4) tiempo de reducción al décimo.

OBJETIVO. Al finalizar la práctica el alumno será capaz de:

1. Determinar el tiempo de muerte térmica de un microorganismo.

2. Determinar el punto de muerte térmica de un microorganismo
3. Determinar la constante de velocidad de esterilización (k) de Bacillus subtilis

MATERIAL.

4 Matraces Erlenmeyer Parrilla eléctrica

20 Cajas de petri
5 Pipetas de 1 ml
Termómetro

Procedimiento.

1. Vaciar a un matraz Erlenmeyer 50 ml de una muestra de caldo cerebro corazón

2. Calentar el matraz en una parrilla a 50°C y una vez alcanzada la temperatura inocular 10 ml de un
cultivo de Bacillus subtilis
3. Tomar 0.1 ml de este caldo en condiciones asépticas y determinar la concentración inicial de
microorganismo (No) por el método de vaciado en placa (sembrar por duplicado)
4. Seguir calentando el matraz a esta temperatura y determinar concentración (por duplicado) de
microorganismo (N) a los 10, 15 y 25 minutos de calentamiento a esta temperatura.
5. Repetir los pasos 2, 3 y 4 pero a 75 y 100°C.
6. Incubar las cajas sembradas a 28°C por 24 horas
7. Hacer conteo de colonias de bacillus subtilis

Graficar:
Tiempo (min) vs Ln (N/No) para cada temperatura
Obtener constante de muerte térmica (K) para cada temperatura ensayada

Reportar:
1. Gráficas de muerte térmica para Bacillus subtilis
2. El punto de muerte térmica de Bacillus subtilis
3. Tiempo de muerte térmica del microorganismo empleado
4. Constante de velocidad de esterilización para B.subtilis para cada temperatura ensayada.

Cuestionario

1. Que ventajas y desventajas presenta la esterilización por calor?

2. En que casos se recomienda aplicar el punto de muerte y la temperatura de muerte térmica?
3. Qué aplicación tiene la constante de velocidad de esterilización?

24
 PRÁCTICA No.9

FERMENTACIÓN EN SUSTRATOS SÓLIDOS

(PRODUCCIÓN DE ENZIMAS)

OBJETIVO

Al final de la práctica el alumno será capaz de:

- Realizar la recuperación y evaluación del producto en un proceso de obtención de enzimas en sustrato

sólido.

INTRODUCCIÓN.

La producción de enzimas es una actividad industrial que se encuentra entre las que reportan
más beneficios económicos en virtud, de las grandes cantidades requeridas en la industria de los
detergentes y a menor escala, pero con más valor económica por unidad de volumen, en la industria
farmacéutica. En esta práctica se iniciará con la producción de enzimas por crecimiento de A. Níger en
salvado de trigo, lo que ocasiona generación de enzimas amilasa por parte del microorganismo, con el fin
de metabolizar los polisacáridos que se encuentran en el sustrato.

La extracción de enzimas requiere de numerosos cuidados, por existir el riesgo de desnaturalizar

las proteínas que las constituyen, terminando así con su acción biológica como catalizadores, por lo que
en ocasiones se utilizan mezclas crudas, sólidas o líquidas procedentes de procesos de fermentación o
de otros materiales biológicos. En otros casos, se extrae el complejo proteico de un proceso fermentativo,
en el cual se encuentran las enzimas que nos interesan, utilizando productos como el sulfato de amonio,
que es un a gente precipitante no selectivo.

En esta práctica se utilizará una mezcla de salvado con micelio fúngico, el cual, al crecer excreta
al medio enzimas con actividad amilásica. Se obtendrá también un complejo proteico utilizando sulfato de
amonio y liofilizando el extracto. En ambos casos, se realizarán pruebas de actividad amilolítica.

MATERIALES Y REACTIVOS :

 Un matraz aforado de 100 ml  1500 ml de etanol al 95 %

 Una charola de plástico  2 gramos de almidón
 2 cajas Petri  100 ml de solución de yodo al 2 %
 5 tubos de ensayo  50 gramos de sulfato de amonio
 2 matraz Erlenmeyer  750 ml de HCl 0.3 N
 Un matraz kitasato de 500 ml  750 gramos de salvado de trigo
 Un embudo Büchner
 2 vasos de precipitado de 100 ml
 Bomba de vacío
 1 pieza de papel filtro

PROCEDIMIENTO

1. Mezclar 750 ml de HCl 0.3 N más 750 gr de salvado de trigo

2. Esterilizar a 15 PSIA durante 30 minutos.
3. Enfriar
4. Colocar en charolas sanitizadas hasta completar una capa de 1 pulgada de altura.
5. Inocular con esporas de A. Níger

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 6. Incubar a 30 ° C en condiciones aerobias hasta crecimiento de micelio. INCUBAR POR ESPACIO
DE 10 a 15 DIAS APROXIMADAMENTE
7. Colocarse cubrebocas y cubrir el salvado con alcohol etílico para inactivar las esporas, dejándose
en contacto por tres horas.
8. Extender una porción de salvado hasta que se seque, de preferencia el que presente menos
esporulación.
9. Tomar 0.1 gr de salvado seco y hacerle una prueba de la actividad amilásica, mezclándolo con 3
ml de solución de almidón al 2 %, a la que previamente se hubieron añadido dos gotas de
solución de yodo. Si se observa decoloración de la solución, existe actividad amilásica. Tomar el
tiempo que tardó la solución en decolorarse.
10. Se toman 25 gr de salvado, mezclándose con 50 ml de agua destilada, dejándose en maceración
por una hora, después de lo cual se presiona el sólido con la mano (guantes) para permitir la
máxima extracción posible de enzimas.
11. Se decanta el sobrenadante, se filtra, se enfría hasta 4 ° C.
12. Se le añaden 25 ml de solución de sulfato de amonio 4M (fría) y se deja en reposo en
refrigeración, hasta observar la formación de un precipitado. Se filtra y se resuspende el
precipitado en 10 ml de solución salina al 0.1%. se congela la muestra y de ser posible, se liofiliza
hasta obtener un polvo seco (mezcla de proteínas), del cual se toman 0.001 gr de producto por
cada tubo de ensaye utilizado para medir la actividad amilolítica.

CUESTIONARIO

1. Investiga y reporta los métodos de extracción y purificación de enzimas utilizados en la

actualidad, desarrollando en particular, el método de precipitación utilizando sulfato de amonio.
2. Resumir los mecanismos utilizados para el control de la producción de enzimas (control de la
expresión genética).
3. Reporta de ser posible, la concentración de enzimas en el extracto, así como, los tiempos
utilizados para realizar la decoloración de la solución de almidón.

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