Manual de Microbiologia

UNIVERSIDAD NACIONAL JORGE BASADRE GROHMANN
ESCUELA DE INGENIERIA EN INDUSTRIAS ALIMENTARIAS
GUIA DE PRÁCTICAS
MICROBIOLOGIA DE LOS ALIMENTOS

I Y II
DRA. LILIANA LANCHIPA BERGAMINI

ING. AMELIA CASTRO GAMERO
TACNA - PERÚ
2014
PRESENTACIÓN
El siguiente Manual de Prácticas de Microbiología de los Alimentos está dirigido a los

estudiantes de Ingeniería en Industrias Alimentarias, con el fin de impartir los
conocimientos suficientes para calificar la calidad microbiológica de : productos
alimenticios, agua, ambientes de los talleres de producción, utensilios y maquinarias
,además para poder controlar los procesos tecnológicos, desde el punto de vista
higiénico –sanitario, con el debido uso de la BPM ( Buenas Prácticas de Manufactura).
La realización de estos controles dará la seguridad de la obtención de productos

alimenticios aptos para consumo humano. La importancia de la correcta realización de
los análisis en el laboratorio de Microbiología de los Alimentos garantizará alcanzar
este fin. Con ayuda de este manual, los alumnos podrán preparar los materiales
necesarios, cumplir con las técnicas de asepsia, aprender las técnicas de desarrollo de
cada análisis, comparar resultados y finalmente obtener seguridad en la aplicación de
los métodos de conservación de alimentos, cuyas bases son el control de los procesos
microbiológicos que ocurren en los alimentos.
El conocimiento de la variedad y cantidad de microorganismos en las materias primas,

en los productos alimenticios y el uso de los indicadores microbiológicos dará lugar, a
poder evaluar y calificar la aplicación correcta de las BPM en la elaboración de
productos alimenticios.
Igualmente, aprenderán a dirigir, organizar con responsabilidad, seguridad y valorar

las actividades de orden, limpieza y desinfección en los talleres de producción y en los
laboratorios de control de calidad.
Con el desarrollo de estas prácticas, los alumnos secuencialmente, lograrán al final

del curso investigar en muestras de alimentos los indicadores microbiológicos que
exigen las normas del Codex Alimentarius y las Normas Técnicas Nacionales de
INDECOPI para desarrollar el control de elaboración de productos alimenticios.
Escuela Académico Profesional de Ingeniería en Industrias Alimentarias
ÍNDICE
Pág.
PRÁCTICA 1 Reglas generales en el laboratorio de microbiología 4

general y de los alimentos, reconocimiento de materiales y
equipos.
PRÁCTICA 2 Coloración GRAM 6
PRÁCTICA 3 Preparación de medios de cultivo 11
PRÁCTICA 4 Métodos de siembra y cultivo 14
PRÁCTICA 5 Aislamiento de staphylococcus áureos 20
PRÁCTICA 6 Identificación de hongos 24
PRÁCTICA 7 Aislamiento de Enterobacterias 29
PRÁCTICA 8 Numeración de Microorganismos Aerobios Mesófilos Viables 35
PRÁCTICA 9 Numeración de Hongos y Levaduras 39
PRÁCTICA 10 Numeración de Coliformes, Determinación del Número más 43

Probable (NMP)
PRÁCTICA 11 Numeración de Staphylococcus áureos Coagulasa Positivo 49
PRÁCTICA 12: Control higiénico de superficies método del hisopado o de las 54

torundas
PRÁCTICA 13: Detección de Salmonella 58
Microbiología de los alimentos I y II /Ing. Amelia Castro G./ Dra. Liliana Lanchipa B. 3
PRÁCTICA 1
REGLAS GENERALES EN EL LABORATORIO DE

MICROBIOLOGÍA DE LOS ALIMENTOS
1. No se debe comer ni beber en el laboratorio.

2. Evite llevarse objetos a la boca (como lápices, dedos, etc., cuando este en el
laboratorio.
3. Lave sus manos con agua y con jabón al terminar cada sesión del
laboratorio.
4. Si por accidente se derramara un cultivo de microorganismos llame al jefe de
práctica inmediatamente.
5. Si usted sufre algún percance (las quemaduras suelen ser bastante
comunes), notifique al jefe de prácticas inmediatamente.
6. Mantenga el orden y la limpieza del laboratorio.
7. Asegúrese de que todas las llaves de agua y gas, así como todos los
aparatos eléctricos en su mesa de trabajo estén apagados antes de cerrar el
laboratorio.
8. Al hervir un recipiente con agar para derretirlo asegúrese que el tapón este
un poco flojo, de otra manera la botella puede estallar.
9. Al usar el microscopio: todos los lentes deben limpiarse con papel para
lentes diariamente antes y después de usar el aparato (con gota de agua y
luego papel) o con papel humedecido con xilol.
10.Para evitar romper láminas portaobjetos: usar el anillo macrómetro para
descender el objetivo hasta que esté tan cerca del porta objetos como sea
posible, el descenso del objetivo debe observarse lateralmente con cuidado
para asegurarse que el lente no toque el portaobjetos. Nunca observe por el
ocular y haga descender el objetivo al mismo tiempo. Cuando el lente esté a
punto de tocar el portaobjetos, entonces ya puede ver por el ocular y
empezar a enfocar moviendo el objetivo hacia arriba hasta alcanzar el mejor
foco posible.
REGLAS DE TRABAJO EN EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA

GENERAL Y DE LOS ALIMENTOS
1. Usar siempre mandil, gorra, zapatos especiales.

2. No salir fuera de los límites del laboratorio con la ropa especial.
3. Cada trabajador está obligado a conservar su higiene personal, la limpieza
de su lugar de trabajo y del laboratorio.
4. No se debe comer ni fumar dentro del laboratorio.
5. El material (muestras) que ingresa al laboratorio siempre se considera
infectado.
6. Si cae algo del material que se investiga o cultivo de microorganismos en la
mesa de trabajo se limpia con una solución desinfectante que debe
encontrarse cerca.
7. El material de vidrio usado siempre se esteriliza, luego se lava, se esteriliza
y se puede usar nuevamente.
8. Cuando ingresa una muestra se rotula y se registra en un cuaderno especial.
RECONOCIMIENTO DE MATERIALES
1. Nombre y grafique los equipos existentes en el Laboratorio de

microbiología de los alimentos.
2. ¿Cuáles son los materiales de vidrio más utilizados para realizar las
siembras de microorganismos?
3. ¿Cómo se realiza el ciclo de limpieza del material de vidrio?
4. ¿Cuáles son los principales regímenes de esterilización del material de

vidrio?
5. Indique las partes de un microscopio, y los cuidados que se deben de

tener con los objetivos.
PRÁCTICA 2
COLORACIÓN GRAM
I. FUNDAMENTO
La coloración de Gram ha constituido, desde los albores de la
bacteriología, un elemento fundamental para la taxonomía e
identificación. Luego del descubrimiento casual realizado por el
investigador danés Christian Gram, pasaron muchos años durante los
cuales se efectuaron las más variables especulaciones sobre el
mecanismo de esta coloración. Resultaba indudable, sin embargo, su
practicidad a los fines de la identificación.
El conocimiento de las estructuras de las membranas bacterianas, tanto
en el aspecto físico como en su composición molecular que fueron
logrados a partir de la década del sesenta, demostró que la coloración
de Gram distingue dos grupos de bacterias totalmente diferentes. Las
bacterias Gram positivas que presentan una gruesa capa de
peptidoglicano como estructura fundamental por sobre la membrana
citoplasmática, y las Gram negativa, que encima de esta presentan una
delgada capa de peptidoglicano, a la que se superpone una capa de
lipopolisacáridos-lipoproteina, denominada membrana externa.(Espinal
Georgina; Manual de prácticas de microbiología; Santo Domingo, 2005)
II. OBJETIVOS
 Profundizar el conocimiento de las formas básicas y disposición
de las bacterias a través de la realización de la coloración de
Gram.
 Reconocer la importancia de la coloración de Gram en la
identificación microbiana.
 Realizar la coloración de Gram.
III. EQUIPOS Y MATERIALES
 Microscopio
 Asa de inoculación
 Láminas de vidrio
 Alcohol- acetona o alcohol de 95º
 Solución de cristal violeta
 Solución de lugol
 Solución de safranina
 Aceite de cedro
 Cultivo de Streptococcus thermophilus, Lactobacillus bulgaricus y
Saccharomyces cerevisae.
PREPARACIÓN DEL REACTIVO
1. Solución de cristal violeta:

Composición:
- Cristal violeta 2 gr
- Alcohol etílico a 95%....20ml
- Oxalato amónico 0,8gr
- Agua destilada 80ml
Preparación
- Disolver el cristal violeta en el alcohol y el oxalato amónico en

el agua destilada. Mezclar las dos soluciones y esperar 24
horas antes de utilizar la mezcla.
2. Solución de yodo
Composición:
- Yodo 1 gr
- Yoduro potásico 2gr
Preparación:
- Triturar el yoduro potásico y el yodo junto en un mortero

añadiendo sucesivamente pequeñas cantidades de agua
durante la operación. Pesar la solución a un matraz
volumétrico y enjuagar el mortero completando el volumen a
100ml.
- NOTA: puede utilizarse también la modificación de Gram de la
solución de yodo de lugol. Esta solución es la misma que la de
Burke, excepto que la cantidad de agua es de 300ml en lugar
de 100ml.
3. Colorante de contraste:
Composición:
- Safranina 0,25gr.
- Alcohol etílico 10ml
Preparación:
- Disolver la safranina en el alcohol y mezclar la solución

resultante con el agua destilada.
IV. PROCEDIMIENTO:
1) Limpie dos láminas portaobjetos. Realizar en cada una un frotis

de los cultivos indicados.
2) Secar el mechero bunsen a una temperatura moderada; pasando
varias veces la lámina por la llama hasta que toda el agua sea
evaporada.
3) Recubrir la lámina con la solución de cristal violeta por 1 minuto.
4) Lavar suavemente con agua.
5) Recubrir con la solución de lugol por 1 minuto. Eliminar el
exceso.
6) Lavar suavemente con agua
7) Decolorar con alcohol – acetona

8) Lavar con agua para eliminar el alcohol-acetona residual
9) Recubrir la lámina de safranina por 30 segundos
10) Lavar suavemente con agua
11) Secar con un papel filtro o al calor del mechero
12) Observar al microscopio con objetivo de inmersión. (emplear
aceite de cedro).
V. RESULTADOS
Observaciones microscópicas:
Muestra 1
Nombre:
Muestra 2
Nombre:
Muestra 3
Nombre:
Muestra 4
Nombre:
VI. CONCLUSIONES
VII. RECOMENDACIONES
VIII. CUESTIONARIO
1. ¿Cuáles son las diferencias de la estructura de la pared celular

de los microorganismos Gram-positivos y de los Gram-negativos?
Grafique.
2. Grafique los pasos para realizar la coloración Gram.
3. ¿Cómo actúa el cristal violeta en la estructura de la célula durante la
Tinción?
4. ¿Qué importancia tiene la decoloración?
5. Nombre 5 géneros de bacterias Gram-positivas
6. Nombre 5 géneros de bacterias Gram-negativas.
IX. BIBLIOGRAFÍA
1.-Dr. L. Jack Bradshaw. Microbiología de Laboratorio .Editorial el

manual moderno.
2.- Merck. Manual de medios de cultivo. Ed. Merck, Alemania, 1982.
X. ANEXOS
PRÁCTICA 3
PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO
I. FUNDAMENTO
Para obtener colonia de microorganismos es necesario utilizar determinados

sustratos nutritivos (medio de cultivo), en los cuales los microorganismos
pueden desarrollar todos sus procesos vitales.
Los medios de cultivo deben de reunir los siguientes requisitos:
- Deben de contener nitrógeno, carbono, oxígeno, hidrógeno, sales

minerales (Na, K, etc.), (Fe, Cu, Cr, Zn, etc.) y factores de
crecimiento (vitaminas, hormonas, etc.). todas las sustancias
deben ser fácilmente asimilables por los microorganismos.
- Todos tienen un pH específico.
- La presión osmótica en el medio debe ser igual que dentro de la
célula microbiana.
- Los medios de cultivo deben ser esterilizados.
Actualmente existen medio de cultivos desecados, los cuales se almacenan en

recipientes bien cerrados en lugares oscuros y a una temperatura de 15- 30 ºC
son higroscópicos. Tienen un tiempo de duración de 5 años desde su fecha de
fabricación.
II. OBJETIVO
 Los alumnos deben conocer los principios y procedimientos para
la preparación de los medios de cultivo.

 Autoclave
 Baño María
 Material de vidrio (balones, placas Petri, tubos de ensayo, pipetas y

matraces).
 Cocinas
 Balanza y estufa
IV. PROCEDIMIENTO
Para la preparación de medios de cultivo se utiliza agua limpia, destilada

neutra. Los recipientes que se utilizan se lavaran esmeradamente con el fin
de eliminar cualquier sustancia extraña.
En lo posible se prepara máximo 2 litros por recipiente.
Se separan según las indicaciones de las etiquetas del envase de cada

medio de cultivo. Los medios que contienen agar o gelatina deben ser
calentados para obtener su disolución. (¡Con cuidado!), los medios que no
contienen agar ni gelatinas se pueden disolver por lo general con agua fría o
bajo ligero calentamiento.
Antes de esterilizarlos es conveniente repartir el medio de cultivo en

porciones más pequeñas si las normas indicadas en el envase no indican
otra cosa, la esterilización de los medios de cultivo se lleva a cabo en
autoclave, a 121ºC durante 15 minutos.
V. RESULTADOS
Características de los medios sólidos al final de la preparación:

-
-
Características de los medios líquidos al final de la preparación:
-
-
VI. CONCLUSIONES
VIII. CUESTIONARIO
1. ¿Cómo se clasifican los medios de cultivo?

2. ¿Qué laboratorios expenden medios de cultivo?
3. ¿Cómo se esterilizan los medios de cultivo?
4. ¿Cómo se deben ser los envases para conservar los medios de cultivo
deshidratados?
IX. BIBLIOGRAFÍA
1. Dr. L. Jack Bradshaw. Microbiología de Laboratorio .Editorial el Manual

Moderno.
2. Merck. Manual de medios de cultivo. Ed. Merck, Alemania, 1982.
X. ANEXOS
PRÁCTICA 4
MÉTODOS DE SIEMBRA Y CULTIVO
I. FUNDAMENTO TEÓRICO
Dependiendo del tipo del material para la siembra de los fines de investigación
del medio de cultivo utilizado existen varios métodos de siembra. Todos ellos
cumplen con un fin: aislar microorganismos por eso se requieren trabajar
rápido, pero sin movimientos bruscos y durante el proceso de siembra no está
permitido conservar, las siembras deben realizarse en lugares especiales para
este fin.
Atención: no olvide cumplir con las normas de seguridad durante el trabajo.
Un medio de cultivo es un material alimenticio que se usa en el laboratorio

para el desarrollo de los microorganismos. Una vez que ha sido preparado, un
medio de cultivo puede ser inoculado(es decir, se le añaden microorganismos)
y a continuación se incuban en condiciones que favorezcan el crecimiento
microbiano. El crecimiento de los microorganismos es el cultivo. Un cultivo puro
contiene un único tipo de microorganismos. Los medios de cultivo deben
contener los nutrientes y factores de crecimiento necesarios y deben estar
exentos de cualquier microorganismo contaminante. Los medios de cultivo
contienen como mínimo: carbono, nitrógeno, azufre, fósforo y sales
inorgánicas. En muchos casos serán necesarias ciertas vitaminas y otras
sustancias inductoras del crecimiento. También se añaden colorantes que
actúan como indicadores para detectar, por ejemplo, la formación de ácido o
como inhibidores del crecimiento de unas bacterias y no de otras.
El agar es el principal agente solidificante utilizado en medios bacteriológicos.
Se disuelve completamente a 100°C y se solidifica al enfriarse a 40°C.
II. OBJETIVO
Aprender los principales métodos de siembra de microorganismos
III. MATERIALES Y EQUIPOS

 Placas Petri.
 Tubos de ensayo.
 Pipetas.
 Asa de nicromo.
 Agujas de nicromo.
 Medios de cultivo.
 Mechero Bunsen, estufa incubadora, estufa esterilizadora,
Baño maría.
IV. PROCEDIMIENTO
Para desarrollar la presente práctica, requeriremos una muestra que en

este caso será la levadura de pan. La muestra se encuentra mezclada
en solución de agua y colorante rojo para la percepción eficaz de la
siembra de microorganismos, en el cual se tratara de aislar colonias.
Para tal efecto es necesario que el área de trabajo esté debidamente
esterilizada, para ello se procede así:
 Limpiar la superficie de contacto con trapo húmedo.
 Esterilizar el área con alcohol y flamearla con el mechero bunsen.
 Dejar el mechero bunsen siempre prendido ya que nos permite
esterilizar un área de 40cm2.
A. SIEMBRA EN TUBOS.
1. SIEMBRA DE UN TUBO DE ENSAYO A OTRO TUBO

El tubo con el material para la siembra y el tubo con el medio de
cultivo se toman ambos con la mano izquierda en forma inclinada de
tal manera que los extremos de ambos tubos estén a un mismo
nivel.
Con la mano derecha se toma el asa y se esteriliza en posición en el

mechero con la mano se extrae los dos tapones con el dedo
meñique y el siguiente apoyándolos a la palma al mismo tiempo, se
flamea el extremo de los dos tubos: con el asa se toma un poco de
material de siembra luego de enfriarla y con cuidado se le traslada al
tubo con el medio de cultivo.
a. Cuando la siembra es en un caldo de cultivo, el asa con el

material se introduce en el líquido por la pared inferior del tubo y
se extrae por la pared superior. Atención ¡el caldo de cultivo
no debe mojar al tapón de algodón!
b. Para sembrar en un agar inclinado, al asa con el material se le
da movimiento de zig-zag en la superficie del agar de abajo
hacia arriba.
c. Para sembrar en una columna de agar vertical (por picadura) se
utiliza una aguja la cual se esteriliza bajo mechero y con el
material de siembra se introduce al fondo de la columna.
Después de la siembra el asa de aguja se extrae del tubo se
flamea al extremo del tubo, se le coloca el algodón y se esteriliza
el asa o aguja en el mechero en posición vertical.
d. La siembra en un caldo de cultivo, se puede realizar con una
pipeta de Pasteur o una pipeta graduada, luego de la siembra
las pipetas se colocan en un líquido desinfectante.
2. LA SIEMBRA A UN TUBO CON MEDIO DE CULTIVO DESDE UNA

PLACA PETRI.
La placa Petri con el material de siembra se coloca frente a uno con
la tapa hacia arriba, se esteriliza el asa, se abre la placa bajo
mechero, se toma con el asa un poco de material se retira el asa, se
cierra la placa y con la mano izquierda se toma el tubo con el medio
de cultivo. La siembra se realiza como en los casos del punto 1.
B. SIEMBRA EN PLACA PETRI.
1. TÉCNICAS DE LA PLACA ESTRIADA EN SECTORES (EN

SUPERFICIE).
La placa Petri con agar se divide en sectores. La siembra se realiza

con un asa (con material de siembra) sobre el agar realizando
movimientos en zig-zag desde un extremo de la placa hacia el centro
de asa. Es necesario que las estrías no toquen los sectores vecinos.
Esterilizar el asa al terminar la siembra luego de cerrar la placa y
colocar la placa con la tapa hacia abajo.
2. TÉCNICAS DE SIEMBRA CON UN EXTENSOR (EN SUPERFICIE).
Con la mano izquierda levantar la tapa de la placa Petri bajo

mechero sosteniendo con el dedo índice y el pulgar. Con un asa o
pipeta se vierte el material de siembra a la superficie del agar y con
el extensor se cubre toda la superficie con el material haciendo
movimientos giratorios. Al final se extrae el extensor se cierra la
placa y se coloca el extensor en una solución desinfectante. Colocar
la placa con la tapa hacia abajo.
3. TÉCNICA DE VACIADO EN PLACA POR INCORPORACIÓN.
Rotular las placas. Colocar el material de siembra con una pipeta en

cada placa (1 ml). Agregar el agar. Realizar movimientos de vaivén
para distribuir bien el material. Colocar las placas con la tapa hacia
arriba hasta que enfríe el agar. Invertirlas en el momento de llevarla
a incubar.
V. RESULTADOS
Siembra en tubos de ensayo:
1.- 2.- 3.- 4.-
Siembra en placas Petri:
1.- 2.- 3.- 4.-
VI. CONCLUSIONES
VIII. CUESTIONARIO
1. Grafique los métodos de siembra y cultivo.

2. ¿Cómo se prepara el asa de kholle : forma, esterilización?
3. ¿Cómo funciona una cabina de bioseguridad del tipo A-2?
4. Principales regímenes de incubación de placas Petri sembradas en forma
aeróbica.
5. ¿Cómo se realiza la incubación anaeróbica de placas Petri sembradas?
IX. BIBLIOGRAFÍA
1. Dr. L. Jack Bradshaw. Microbiología de Laboratorio .Editorial el manual

moderno.
2. Merck. Manual de medios de cultivo. Ed. Merck, Alemania, 1982.
3. Pelczar M ,Reid R, Chan E. Microbiología 4ta.edición. Editorial
Mc.Graw Hill.
X. ANEXOS
PRÁCTICA 5
AISLAMIENTO DE STAPHYLOCOCCUS AUREUS
I. FUNDAMENTO TEÓRICO:
El S. áureus es un coco inmóvil, de 0.8 a 1 micrómetro de diámetro,

que se divide en tres planos para formar grupos de células
irregulares semejantes a racimos de uvas. En extendidos de pus los
cocos aparecen solos, en pares, en racimos o en cadenas cortas.
Los racimos irregulares son característicos de extendidos tomados
de cultivos que se desarrollan en medios sólidos, mientras que en
otros cultivos son frecuentes las formas de diplococos y en cadenas
cortas. Unas pocas cepas producen una cápsula o capa de baba que
incrementa la virulencia del microorganismo.
El S. áureus es un microorganismo Gram-positivo pero las células

viejas y los microorganismos fagocitados se tiñen como Gram-
negativos.
II. OBJETIVOS:
Aislar bacterias de la familia micrococaceae, género staphylococcus

y estudiar sus propiedades fermentativas y patogenicidad.
III. MATERIALES:
- Probetas, placa Petri, porta-objetos, matraces Erlenmeyer, asa

bacteriológica, extensores, etc. estériles.
- Agar manitol-salado, agar Baird Parker, solución salina al 0,9%.
IV. PROCEDIMIENTO :
Utilizar el siguiente material de investigación:

- Secreciones de la nariz y la garganta.
- Productos alimenticios contaminados
Realizar siembra en superficie en el Agar BAIRD PARKER y en el
agar manitol-salado y realizar la prueba de la coagulasa.
Agar manitol-salado:
MICROORGANISMO CRECIMIENTO COLOR DE COLONIA
inhibido ---
Enterobacter aerogenes
inhibido ---
Escherichia Coli
buena a excelente Amarillo
Staphylococcus áureos
pobre Rojo
Staphylococcus epidermis
buena a excelente rojo.
Staphylococcus epidermis
Agar Baird – Parker:
MICROORGANISMOS COLONIAS
Staphylococcus áureos Negras lustrosas convexas, 1a 5 mm de diámetro con borde

estrecho, blanquecino, rodeados por un halo claro de 2 a
5mm. De anchura dentro del halo claro presencia de anillos
opacos no visibles antes de la 48 horas de incubación
Staphylococcus epidermidis Negras lustrosas, pero de forma irregular. Al cabo de 24
horas, presencia de zonas opacas alrededor de las colonias
Micrococcus Crecimientos ocasionales , muy pequeñas , pardas hasta
negras, ausencia de halos de clarificación
Bacillus Pardo-obscuras, mate, presencia a veces de halos de
clarificación al cabo de 48horas
Levaduras Blancas y sin halos de clarificación
V. RESULTADOS
En placas Petri con Baird Parker.
Muestra1:………………………… Muestra 2:………………………….
Muestra 3:……………………….. Muestra 4:…………………………….
Muestra 5:…………………………..
Observación microscópica de Staphylococcus áureas:
VI. CONCLUSIONES
VII. RECOMENDACIONES.
VIII. CUESTIONARIO
1. En el agar Baird Parker ¿cómo crecen las colonias de

staphylococcus aureus?
2. ¿Cómo se prepara el Agar Baird Parker?.
3. ¿Quiénes son los principales portadores y transmisores de

esta bacteria?
4. ¿Por qué son termorresistentes?
IX. BIBLIOGRAFÍA
1.-Dr. L. Jack Bradshaw. Microbiología de Laboratorio .Editorial el

manual moderno.
2.- Merck. Manual de medios de cultivo. Ed. Merck, Alemania,1982
3.-Pelczar M ,Reid R, Chan E. Microbiología 4ta.edición. Editorial
Mc.Graw Hill.
X. ANEXOS
PRÁCTICA 6
IDENTIFICACIÓN DE HONGOS
Los hongos son microorganismos aerobios que se diferencian según su

morfología. Por esta característica se les puede identificar
microscópicamente y diferenciarlos por géneros. Los principales
géneros que se desarrollan en los alimentos: mucor, ryzhopus,
thamnidium, penicillium, aspergillus y alternaría.
Los hongos se pueden desarrollar en medios de cultivo como: OGA,
agar suero naranja y el agar patata glucosa.
II. OBJETIVO
Identificar los hongos provenientes de muestras de alimentos según su

género y estudiar su morfología.
III. EQUIPOS Y MATERIALES:
1. Microscopio compuesto con lente de inmersión.
2. Portaobjetos y cubreobjetos.
3. Aguja de inoculación o estilete.
4. Lugol (líquido de montaje).
5. Pequeña cantidad de alimento atacada por hongos en bolsas de
plástico.
IV. PROCEDIMIENTO:
1. Tomar una parte del hongo (micelio, esporas) y colocarlo sobre

un portaobjeto limpio y desengrasado en el que se ha colocado
una gota del líquido de montaje, dispersar o extender el micelio
con la ayuda de una aguja y la punta del cubreobjetos, luego
colocar el cubreobjetos sobre el material extendido. Observar con
el lente de inmersión.
2. Cuando el hongo presenta mucho micelio aéreo o desarrollado

superficial fino, o para estudiar las estructuras esporuladas utilizar
un pedazo de cinta adhesiva que se presiona sobre el micelio,
colocar la cinta con el micelio adherido en forma invertida sobre
una gota de lugol, añadir otra gota sobre la cinta y colocar el
cubreobjetos. Observar con lente inmersión.
3. Micro cultivo método de Riddell
Colocar en el centro de un portaobjeto estéril un pequeño block

de agar (6x6x2) y en cada uno de los 4 lados sembrar el hongo
en examen. Colocar el cubreobjetos estéril sobre el agar y el
portaobjeto así preparado, colocarlo en una cámara húmeda:
placa de Petri estéril con papel de filtro humedecido y de 2 varillas
de vidrio para colocar el portaobjeto. Incluir a temperatura
ambiente por 3 a 5 días.
Luego:
a) Con poco aumento examinar los bordes superiores del
desarrollo micelial del hongo en el cultivo proporcionado.
b) Anotar las siguientes observaciones.
Micelio si es septado o no, hialino u oscuro, delgado tipo

de ramificación de la hifa.
Esporas asexuales si es conidia, esporangiospora o

artrospora su forma, tamaño, color, si es suave, rugoso, o
si tiene 1,2 o más células.
Fructificación
1) Si es esporangio, su tamaño, color forma e hifa.

2) Si está dispuesto en conidia, si es uno o más
conidias, conidióforo, forma, y arreglo del esterigma,
arreglo de la conidia.
3) Estructura especial y localización: estolones,
rizoides, columela, apófisis, clamidospora, etc...
V. RESULTADOS
 En placas Petri :
Muestra 1.:……………………………..
Muestra 2:…………………………….
Muestra 3:……………………………..
Muestra 4:………………………………
Muestra 5:………………………………
Muestra 6:……………………………
 Observaciones microscópicas
VI. CONCLUSIONES
VIII. CUESTIONARIO
1.- ¿Cuáles son los principales géneros de hongos que se presentan en

los alimentos?
2.-Graficar cada género e indicar los nombres de sus estructuras,

morfología.
3.- ¿Cuáles son los principales factores de crecimiento para hongos?
4.- ¿Cómo se puede inhibir el crecimiento de hongos?
IX. BIBLIOGRAFÍA
1.-Dr. L. Jack Bradshaw. Microbiología de Laboratorio .Editorial el manual

moderno.
3.-Pelczar M ,Reid R, Chan E. Microbiología 4ta.edición. Editorial Mc.Graw Hill.
X. ANEXOS
PRÁCTICA 7
AISLAMIENTO DE ENTEROBACTERIAS
I. FUNDAMENTO: La familia enterobacteriaceae, está formada por

bacterias patógenas y no patógenas, su morfología es en forma de
pequeños bastones, son gram – negativos y fermentan la glucosa. Las
que tienen mayor importancia son las de los géneros Escherichia,
Shigella y Salmonella.
En el género Escherichia o coliformes se considera como indicador a E.
Coli de origen fecal, por su frecuencia. Son lactosa positivos, crecen a
37ºC a pH = 2 – 7,4.
Las bacterias del género Salmonella son lactosas negativas; crecen a
37oC, a pH = 7, 2,6.
A 65oC mueren en 15min. Y a 100oC en forma instantánea.
II. OBJETIVOS:
Aislar enterobacterias en medios adecuados y desarrollar la
prueba de IMVIC.
 Estufa, autoclave, mechero, baño María, asas bacteriológicas.
 Placas Petri con medios de cultivo (EBM, BPLS, VRBA, VRBA
GLUCOSADO Y SS).
 Tubos con caldos de enriquecimiento BRILA y Tetrationato
inoculados.
 Medios de cultivo para la prueba de IMVIC.
IV. PROCEDIMIENTO:
 Sembrar en estría del Caldo Brilla al VRBA Y EBM
 Sembrar en estría del Caldo tetrationato al BPLS Y SS.
 De ambos caldos pueden sembrar al VRBA Glucosado
 Luego de incluir a las temperaturas y tiempos adecuados realizar
la prueba de IMVIC para una colonia representativa de E. Coli.
Prueba de indol:
 Inocular en tubos con caldo peptonado o triptosa.

 Incubar por 24 horas adicionar de 2 a 3 gotas de reactivo de
Kovacs por las paredes.
 Dejar los tubos en reposo y observar la formación de un anillo de
color rojo para el resultado positivo, o anillo color amarillo para
negativo.
Prueba del rojo de metilo.
 Inocular los tubos conteniendo caldo MR – VP.

 Incubar a los tubos por 72 horas a 37oC.
 Después de las 72 horas adicionar a 5 gotas de solución Rojo de
metilo y agitar.
 Anotar como el Rojo de metilo positivo, la aparición de un color
rojo, y como negativo la operación de un color amarillo.
Prueba de Voges – proskauer:
 Inocular los tubos de caldo MR – VP.

 Incubar a 37oC por 48 horas.
 A 1ml de cultivo añadir 0.6 ml de solución de alfa naftol y 0.2 ml
de sol. KOH 40%. Agitar. Dejar reposar de 2 a 4 horas.
 Reacción positiva: coloración rosada o carmesí.
Prueba del citrato:
 Inocular los tubos de citrato de Simmons.

 Incubar a 37oC por 24 horas.
 Anotar como positivo un crecimiento visible, acompañado de un
cambio de color verde al azul.
MEDIOS DE CULTIVO
EMB agar – eosina-azul de metileno-lactosa-sacarosa
COLONIAS MICROORGANISMOS
Transparentes, de color ambarino Salmonella y Shiguella
Verdosas con brillo metálico a la luz E. Coli.

reflejada, con el centro negro azulado
a la luz transmitida.
Más grandes que las E. Coli, Entrobacter, klebsiella y otros

mucosas, confluentes, con el centro
pardo grisáceo a la luz transmitida.
MEDIOS DE CULTIVO
VRBA agar – violeta cristal –rojo neutro-bilis.
Rojas con halo de precipitación rojizo: Enterobacterias lactosa- positivas:
de 1-2mm de diámetro. coliformes, E. Coli.
Colonias con punta de alfiler rosadas. Enterococos eventualmente

Incoloras. kleibsiella.
Incoloras Enterobacteriaceas lactosa-negativas
MEDIOS DE CULTIVO
BPLS agar – verde brillante –rojo de fenol-lactosa-sacarosa
Rojo-rosadas con halo rojo Lactosa- negativas y sacarosa- negativos:
Salmonella y otros.
Verde- amarillentas con halo Lactosa – positivos o sacarosa- positivos:

verde- amarillento. E. Coli, Citrobacter. Proteus vulgaris,
klebsiella y otros.
No obstante a veces inhibición completa.
MEDIOS DE CULTIVO
SS agar para salmonella y Shigella
Incoloras, transparentes Shigella y la mayoría de las

salmonellas.
Transparentes con centro negro. Proteus y algunas de las salmonellas.
Rosadas hasta rojas E. Coli
Mayores que las de E. Coli rosada de Enterobacter aerogenes

color cremoso- blanquecinas opacas,
mucosas.
V. RESULTADOS
Para lactosa + (coliformes):
1.-Crecimiento en Caldo Brilla:
2.-Crecimiento en VRBA:
3.-Crecimiento en BPLS:
4.-Crecimiento en EBM (E.coli):
5.- Prueba de IMVIC:
6.- Observación microscópica: (E.coli):
VI. CONCLUSIONES
VIII. CUESTIONARIO
1.-Interprete los resultados de la prueba de IMVIC, para E.coli. Explique

la formación de indol.
2.- ¿Cuáles son las bacterias coliformes, qué géneros son no

patógenos?
3.-¿Cómo crece E.coli en el agar azul de metileno? ¿Cómo actúa este

medio?
IX. BIBLIOGRAFÍA
1.-Dr. L. Jack Bradshaw. Microbiología de Laboratorio .Editorial el manual

moderno.
3.-Pelczar M ,Reid R, Chan E. Microbiología 4ta.edición. Editorial Mc.Graw Hill.
X. ANEXOS
PRÁCTICA 8
NUMERACIÓNDE MICROORGANISMOS AEROBIOS

MESÓFILOS VIABLES
La aceptabilidad de un proceso es frecuentemente el aspecto más difícil
del análisis de alimentos. Los análisis microbiológicos de los alimentos
son una herramienta eficaz en esta evaluación, pero la interpretación de
los resultados de laboratorio obtenidos en microbiología es,
frecuentemente, el más difícil y complejo aspecto de todo el proceso de
evaluación, donde entran en juego el criterio profesional y las
circunstancias que rodean al hecho (brote, control de rutina, toma de
muestra en línea de proceso o en punto de venta, producto listo para
consumo, etc.). Para una adecuada interpretación de estos resultados
es importante establecer qué resultados son alcanzables y/ o
esperables.
Este indicador el RTBAMV es el más importante para calificar la correcta
manipulación de la materia prima durante todo el proceso de producción
y el buen uso de la BPM hasta obtener el producto alimenticio final.
II. OBJETIVO
Conocer el método para determinar el número de microorganismos
aerobios mesófilos viables.

1. Los requisitos necesarios para la dilución de las muestras de alimentos.
2. Placas Petri
3. Pipetas bacteriológicas de 1 y 10ml
4. Baño de agua regulado a 44- 46°C para mantener el agar licuado
5. Baño de agua regulado a 29-31ºC
6. Contador de colonias
7. Agar Plate Count.
IV. PROCEDIMIENTO :
1. Preparar la muestra
2. Pipetear por duplicado a placas de Petri estériles alícuotas de 1ml a
partir de dilución Se sugiere esta
serie de diluciones cuando no se conoce el rango aproximado del
número de bacterias.
3. Agregar rápidamente a las placas de Petri 15ml de agar licuado y
temperatura entre la preparación de la dilución y la dilución del agar
no debe transcurrir más de 10 minutos.
4. Mezclar inmediatamente la alícuota con el agar mediante
movimientos de vaivén y rotación de las placas Petri. Una secuencia
satisfactoria de paso es la siguiente:
a. Mover la placa de arriba abajo 5 veces en una dirección
b. Rotar 5veces la placa en sentido de las agujas del reloj.
c. Mover la placa 5 veces en la dirección que haga ángulo recto al
usado en el primer tiempo
d. Rotar la placa en sentido inverso al de las agujas del reloj.
5. Como control de esterilidad, adicionar a placas Petri, agar sin inocular
y agar inoculado con el diluyente.
6. Una vez solidificado el agar, invertir las placas e incubarlas a 29-31 °C
durante 48 +/-3 horas.
7. Computo del recuento estándar en placas
a. Seleccionar 2 placas correspondientes a una dilución que contenga
entre 30 y 300 colonias utilizando un contador de colonias
b. Si las placas de diluciones consecutivas presentan menores que
30 y mayores que 300, tomar el promedio de los 2 recuentos.
c. Si el número de colonias de las placas de 2 diluciones
consecutivas están dentro del rango de 30-300, computar el
recuento para cada una de las diluciones y establecer la relación
de los 2 recuentos. Si el cociente es menor que 2, reportar el
promedio de los 2 valores, pero, si el recuento mayor cociente 2
veces o más que al menor, en este caso se reportara en recuento
del menor.
d. Multiplicar por el factor de dilución reciproco de la dilución utilizada.

Reportar el resultado como número de microorganismos aerobios
mesófilos por gramo o mililitro según el caso.
8. Cómputo del estimado de recuentos estándar en placas.
a. Si la placa de las diluciones muestran más de 300 colonias, dividir
cada duplicado de las placas de la dilución más alta en secciones
radiales convenientes (2, 4, 8.) y contar todas las colonias en una o
más secciones. Multiplicar el total en cada caso por el factor
apropiado para obtener el número de colonias por cada placa.
Promediar los estimados de las 2 placas duplicadas y multiplicar
por la dilución correspondiente. Reportar el resultado como
estimado del número.
Si no hubiese colonias en placas de mayor concentración, reportar el

estimado como menor que la inversa de la dilución.
Ejemplo: = 0 colonias.
Se reporta como Si se hubiese sembrado, 0.1ml en

este caso se reporta
Expresión de resultados:
a. Se deberá reportar únicamente 2 dígitos significativos, ellos son el

primero y el segundo (comenzando por la izquierda) del promedio
de los recuentos. Los demás dígitos se reemplazaran por cero.
Ejemplo:
523.000 se reportara 520.000 = de alimento
según el caso.
Si el tercer digito de la izquierda es 5 o mayor que 5, adicionar una
unidad al segundo dígito (redondear)
b. Si el recuento en placa se utiliza para determinar la aceptación o

rechazo de un lote de alimentos, únicamente se considera el
recuento estándar en placa, nunca el estimado del recuento, éste
es útil solamente como una aproximación primaria en la

determinación de la calidad microbiológica de un alimento.
V. RESULTADOS:
Muestra RTBAMV
1.-
2.-
VI. CONCLUSIONES
VIII. CUESTIONARIO
1.- ¿Cómo se utiliza este indicador para evaluar la calidad de las

materias primas?
2.- ¿Qué valores son aceptables para productos lácteos y cárnicos
pasterurizados?
3.-Grafique el procedimiento de preparación de diluciones de muestras.
4.- ¿Por qué no se puede utilizar este indicador para productos
fermentados?
5.- ¿Cuál es la composición del medio de cultivo Plate Count?
IX. BIBLIOGRAFÍA
1.-Bourgeois C. M. Microbiología Alimentaria. Editorial Continental

S.A.1995.
2.-Frazier ,W.C. Microbiología de los alimentos .Ed. Acribia . España
2000.
3.- Mossel.D. Microbiología de los alimentos. Ed. Acribia. España 2000.
4.-DIFCO Manual de medios de cultivo. Ed. Difco.
5.-MERCK. Manual de medios de cultivo Ed. Merck, Alemania.
6.-Ministerio de Salud DIGESA . Manual de Análisis Microbiológico de
Alimentos.
7.-FAO-ONU- Manuales para el control de calidad de Alimentos para la
agricultura y la Alimentación. Roma.
X. ANEXOS
PRACTICA 9
NUMERACIÓN DE HONGOS Y LEVADURAS
Los hongos y las levaduras se encuentran ampliamente distribuidos en

el ambiente, pueden encontrarse como flora normal de un alimento, o
como contaminantes en equipos mal sanitizados. Ciertas especies de
hongos y levaduras son útiles en la elaboración de algunos alimentos,
sin embargo también pueden ser causantes de la descomposición de
otros alimentos. Debido a su crecimiento lento y a su baja
competitividad, los hongos y levaduras se manifiestan en los alimentos
donde el crecimiento bacteriano es menos favorable. Estas condiciones
pueden ser bajos niveles de pH, baja humedad, alto contenido en sales
o carbohidratos, baja temperatura de almacenamiento, la presencia de
antibióticos, o la exposición del alimento a la irradiación. Por lo tanto
pueden ser un problema potencial en alimentos lácteos fermentados,
frutas, bebidas de frutas, especias, oleaginosas, granos, cereales y sus
derivados y alimentos de humedad intermedia como las mermeladas,
especias, etc.
II. OBJETIVO
Realizar adecuadamente mediante el método de recuento en placa, la
numeración de hongos y levaduras viables presentes en productos
alimenticios destinados al consumo humano.
1. Los requisitos para la preparación de dilución de las muestras de

alimentos.
2. Placas de Petri de vidrio 100 y 15mm
3. Pipetas bacteriológicas de 1.5 y 10ml
4. Baño María o incubadora para temperar el agar a 44 – 46ºC

5. Incubadora regulada a 20 – 24ºC
6. Contador de colonias
7. Oxitetraciclina extracto de levadura glucosa agar (OGA),o Agar
patata glucosa o Agar suero de naranja.
IV. PROCEDIMIENTO
1. Preparar el alimento por uno de los tres procedimientos recomendados

en la sección sobre preparación y dilución de las muestras de alimentos.
2. Pipetear por duplicado a las placas de Petri estériles, alícuotas de 1ml
de las diluciones las diluciones preparadas y
sembradas pueden variar de acuerdo al número de colonias
sospechosas.
3. Agregar de 10 a 15ml de medio de cultivo, temperado a 44 – 46ºC.

4. Mezclar inmediatamente, la alícuota con el agar por:
a. Movimiento de la placa de arriba hacia abajo, por 5 veces.
b. Rotación de las placas en sentido de las agujas del reloj, 5 veces.
c. Movimiento de la placa 5 veces en la dirección que haga ángulo recto
del usado en el primer tiempo.
d. Rotación de la placa 5 veces en sentido inverso de las agujas del
reloj.
5. Después de solidificado el agar, invertir las placas Petri e incubarlas a 20
– 24ºC por 3 a 5 días.
6. Usando el contador de colonias, contar todas las colonias, contar todas
las colonias de las placas que contengan de 20 – 100 colonias, efectuar
el examen microscópico cuando se requiera identificar las colonias.
7. Reportar el número de ufc de hongos y de levaduras por g o ml de
alimento.
V. RESULTADOS
Muestra Numeración de Numeración de

Hongos Levaduras
1.-
2.-
VI. CONCLUSIONES
VIII. CUESTIONARIO
1.- ¿Cuáles son las temperaturas de letalidad para hongos y levaduras?
2.- ¿Qué son la micotoxinas ?
3.- ¿Qué importancia tiene como indicador microbiológico para evaluar

la materia prima y productos alimenticios?
4.-Según el codex alimentarius , en que alimentos consideran este

indicador microbiológico.
IX. BIBLIOGRAFÍA
1.-Bourgeois C. M. Microbiología Alimentaria. Editorial Continental

S.A.1995.
2.-Frazier ,W.C. Microbiología de los alimentos .Ed. Acribia . España
2000.
6.-Ministerio de Salud DIGESA. Manual de Análisis Microbiológico de
Alimentos.
X. ANEXOS
PRÁCTICA 10
NUMERACIÓN DE COLIFORMES, DETERMINACIÓN DEL

NÚMERO MÁS PROBABLE (NMP)
COLIFORMES:
La denominación genérica coliformes designa a un grupo de especies
bacterianas que tienen ciertas características bioquímicas en común e
importancia relevante como indicadores de contaminación del agua y los
alimentos.
Coliformes significa con forma de Coli, refiriéndose a la bacteria principal
del grupo, la Escherichia Coli, descubierta por el bacteriólogo alemán
THEODOR VON ESCHERICH en 1860.
Caracteres bioquímicos:
El grupo agrupa a todas las bacterias entéricas que se caracterizan por
tener las siguientes propiedades bioquímicas:
 ser aerobias o anaerobias facultativas
 ser bacilosGram negativos;
 no ser esporógenas
 fermentar la lactosa a 35 °C en 48 horas, produciendo ácido láctico
y gas.
Las bacterias de este género se encuentran principalmente en el

intestino de los humanos y de los animales de sangre caliente, es decir,
homeotermos, pero también ampliamente distribuidas en la naturaleza,
especialmente en suelos, semillas y vegetales.
Los coliformes se introducen en gran número al medio ambiente por las
heces de humanos y animales. Por tal motivo suele deducirse que la
mayoría de los coliformes que se encuentran en el ambiente son de

origen fecal. Sin embargo, existen muchos coliformes de vida libre.
II. OBJETIVOS
 Determinar el NMP de coliformes totales en muestras de
alimentos.
 Determinar la numeración de coliformes mediante el método de
recuento en placa.
 Determinar en NMP de coliformes fecales en muestras de
alimentos.

1. Los requisitos necesarios para la preparación y dilución de la
muestra de alimentos.
2. Incubadora de 35ºC – 37ºC
3. Pipetas bacteriológicas de 1ml
4. Aguja de incubación con alambre de nicrón o platino iridio.
5. Caldo verde brillante bilis lactosa (CALDO BRILA) volúmenes de
1ml en tubos de 150x15mm conteniendo tubos de fermentación
invertidos (75x1mm).
6. agar violeta cristal-rojo neutro- bilis (VRBA) o agar ENDO o agar
Mc CONKEY
IV. PROCEDIMIENTO
NUMERO MÁS PROBABLE DE COLIFORMES TOTALES
1. Preparar las muestras de alimento de acuerdo al procedimiento
recomendado.
2. Pipetear 1ml de c/u de las diluciones del homogenizado de alimento en
tubos de caldo verde brillante bilis lactosa (caldo BRILA) utilizando tres
tubos por dilución.
3. Incubar los tubos a 35ºC – 37ºC por 24- 48 horas
4. Anotar los tubos que muestren producción de gas (prueba presuntiva)
5. De cada tubo que contiene gas, aislar sobre placas con agar-violeta
cristal-rojo neutro-bilis (VRBA) o agar ENDO.
6. Incubar los tubos a 35ºC – 37ºC por 24- 48 horas

7. Confirmar la presencia de bacterias coliformes por:
a. la formación de colonias, rojo oscuro con diámetro mayor de 5mm
en agar VRBA.
b. La formación de colonias rojas rodeadas halo en agar ENDO.
8. Anotar el número de tubos confirmados. Referirse a la tabla del NMP
para expresar el resultado.
NUMERACIÓN DE COLIFORMES DE ORÍGEN FECAL
I. EQUIPOS Y MATERIALES
1. Asa de inoculación.
2. Baño de agua, regulado a 44 (+/- 0.1°C)
3. Pipetas bacteriológicas de 5ml
4. Caldo verde brillante bilis lactosa (caldo BRILA), volúmenes de 10ml en
tubos de 150x15mm. Conteniendo tubos de fermentación invertidos
(75x10mm).
5. Caldo triptosa, volúmenes de 1ml en tubos de 150x15mm.
6. Reactivo de KOVACS.
II. PROCEDIMIENTO:
1. Seleccionar los tubos de caldo verde brillante bilis lactosa (caldo
BRILA) que muestren formación de gas en prueba presuntiva.
2. Inocular una azada de cada tubo gas positivo a un tubo de caldo
BRILA y un tubo de caldo triptosado.
3. Incubar los tubos a 44 (+/- 0.1°C)
4. Después de 24 horas de incubación, efectuar la prueba de indol
en los tubos con caldo triptosa.
5. Controlar la formación de gas en los tubos con caldo BRILA
después de 24 y 48 horas de incubación.
6. Los cultivos que muestran producción de gas en caldo BRILA y
formación del indol en caldo triptosa son positivos para coliformes
fecales.
7. Referirse a la tabla de NMP para expresar el resultado.
NUMERACIÓN DE BACTERIAS COLIFORMES POR EL MÉTODO DE

RECUENTO EN PLACA
I. MATERIALES:
1. Los requisitos necesarios para la preparación y dilución de la
muestra.
2. Incubadora a 45-37°C.
3. Pipetas bacteriológicas de 1ml.
4. Baño de agua regulada a 44- 46°C, para temperar el agar.
5. Agar Violeta Cristal Rojo Negro Bilis (VRBA)
II. PROCEDIMIENTO
1. Prepara la muestra por el procedimiento recomendado para la
preparación de dilución de muestra.
2. Transferir 1ml de cada dilución de la muestra a una placa de Petri
estéril.
3. Adicionar a cada placa de Petri, 10-15ml de agar violeta cristal
rojo bilis temperado a 44- 46°C.
4. Mezclar el contenido de las placas mediante movimientos de
vaivén y rotación de cada placa. Dejar solidificar la mezcla 5 a 10
minutos, luego distribuir un adicional de 10ml de medio de
plaqueado como doble capa, cubriendo completamente la
superficie de medio solidificado e que inhibirá la formación de
colonias en la superficie.
5. Invertir e incubar las placas durante 24 horas a 35-37°C.
únicamente las colonias rojo oscuro que midan 0.5mm o más de
diámetro en la placa, que tengan entre 20 y 200 colonias, se
consideran bacterias coliformes. Si es posible seleccionar para el
recuento solamente aquellas placas no con más de 150 colonias
de estas colonias. Multiplicar el número de colonias por dilución
para obtener el número de bacterias coliformes por gramo o ml de
muestra.
Tabla de NMP para expresar resultados.
Dilución Dilución Dilución NMP 99% 95%

10-1 10-2 10-3 por g.
0 1 0 3 1 23 1 17
1 0 0 4 1 28 1 21
1 0 1 7 1 35 2 27
1 1 0 7 1 36 2 38
1 2 0 11 2 44 4 35
2 0 0 9 1 80 2 38
2 0 1 14 3 82 3 48
2 1 0 15 3 85 5 50
2 1 1 20 0 77 8 61
2 2 0 21 5 80 8 63
3 0 0 23 4 177 7 129
3 0 1 40 10 230 10 180
3 1 0 40 10 290 20 210
3 1 1 70 20 370 20 280
3 2 0 90 20 520 30 390
3 2 1 150 30 660 50 610
3 2 2 210 50 820 80 640
3 3 0 200 <100 1900 200 1400
3 3 1 500 100 3300 200 2400
3 3 2 >1100 200 6400 100 1800
a) Calculados a partir de los datos de Man (1975)
b) En cada nivel de dilución, inocular 1ml en cada uno de tres tubos de

medio.
Para calcular en NMP de las diluciones mayores que las que se señalan,
multiplicar el NMP por el factor de dilución apropiado de 10,100, 1000,
etc. Por ejemplo, si se han seleccionado tubos provenientes de las
diluciones 10-2,10-3, 10-4, multiplicar por 10, si de las diluciones 10-3, 10-4,
10-5 multiplicar por 100.
V. RESULTADOS
Muestra NMP de Coliformes Totales
1.-
2.-
VI. CONCLUSIONES
VIII. CUESTIONARIO
1.- ¿Por qué es importante este indicador microbiológico para evaluar la
calidad microbiológica de productos alimenticios?
2.- ¿Qué importancia tiene para evaluar la calidad microbiológica del
suelo y del agua?
3.- ¿Qué indica la presencia de E.coli?
4.- Utilizando ¿qué buenas prácticas de manufactura se podría evitar el
aumento del NMP de coliformes totales?
XI. BIBLIOGRAFÍA
1.- Bourgeois C.M. Microbiología Alimentaria. Editorial Continental

S.A.1995.
2.-Frazier, W.C. Microbiología de los alimentos .Ed. Acribia . España

2000.
Alimentos.
XII. ANEXOS
PRÁCTICA 11
NUMERACIÓN DE STAPHYLOCOCCUS AUREUS
COAGULASA POSITIVO
Morfología
El S. áureus es un coco inmóvil, de 0.8 a 1 micrómetro de diámetro, que
se divide en tres planos para formar grupos de células irregulares
semejantes a racimos de uvas. En extendidos de pus los cocos
aparecen solos, en pares, en racimos o en cadenas cortas. Los racimos
irregulares son característicos de extendidos tomados de cultivos que se
desarrollan en medios sólidos, mientras que en otros cultivos son
frecuentes las formas de diplococos y en cadenas cortas. Unas pocas
cepas producen una capsula o capa de baba que incrementa la
virulencia del microorganismo.
El S. aureus es un microorganismo Gram positivo pero las células viejas
y los microorganismos fagocitados se tiñen como gramnegativos.
II. OBJETIVOS
 Determinar la numeración de staphylococcus áureus en muestras

de alimentos.
 Diferenciar dentro del género de staphylococcus las especies no
patógenas y la patógena.
1. Los requisitos necesarios para la preparación y dilución de la muestra

de alimento
2. Placas de Petri de vidrio (100x 15mm) o de plástico de 90 x 15mm.
3. Pipetas de1ml graduadas al 0.1
4. Extensores de vidrio
5. Baño de agua regulado a 44-46ºC
6. Incubadora regulada a 35º-37ºC
7. AGAR SAIR- PARKER
8. Caldo de cerebro-corazón
9. Tubos de 75 x 10mm contenido 0.3ml de plasma de conejo.
IV. PROCEDIMIENTO
1. Preparar diluciones
2. Pipetear 0. 1ml del homogenizado y las diluciones por duplicado en
la superficie de las placas de Agar BAIRD PARKER previamente
secadas y, distribuir cada inoculo con un extensor de vidrio hasta que
la superficie del medio aparezca seca.
ABP
ABP
ABP ABP ABP
3. Incubar las placas en posición invertida a 37±1ºC durante 30-48horas.

4. Después de 30 horas de incubación seleccionar las placas que
representan entre 20 y 200 colonias y contar todas aquellas colonias
negras y brillantes con borde blanco angosto rodeadas de zonas
claras que contrastan con el medio opaco. Estas colonias
corresponden a Staphylococcus aureus.
5. Marcar la posición de las colonias a incubar las placas durante 18
horas adicionales.
6. Al final del periodo de incubación (48horas) contar todas las colonias
con las características descritas anteriormente y además aquellas
colonias negras brillantes con o sin borde blanco y sin zonas claras.
Someter un número significativo de colonias sospechosas (no menor
a 5) la prueba de la coagulasa. Algunas cepas de S. áureus pueden
aparecer rodeadas de zona opaca después de 30 horas de
incubación de 35-37ºC, para un gran número de cepas a veces no
muestra esta apariencia después de 48 horas y someter a un número
equivalente de ellas a la prueba de la coagulasa. esta prueba servirá
para distinguir aquellos cultivos de S. aureus (coagulasa positivo) de
S. epidermidis (coagulasa negativa) que puedan dar una apariencia
similar
7. PRUEBA DE LA COAGULASA
a) Sembrar las colonias seleccionadas en Caldo de cerebro –
corazón e incubar a 35-37°C. durante 20 a 24 horas.
b) Adicionar 0.1ml del cultivo a tubos de 75x10mm que contenga
0.3ml de plasma de conejo incubar a 35°-37°C.
c) Examinar después de 4 horas de incubación si el plasma ha
perdido su fluidez o se encuentra un coágulo más o menos
grande. Si la reacción es negativa, incubar los tubos a
temperatura de laboratorio y re-examinar después de 24 horas.
Las diferentes reacciones de coagulasa se observan en la
tabla de puntuación.
8. Calcular del total de colonias características, la proporción de la
colonias positivas a las prueba de la coagulasa teniendo en cuenta la
dilución empleada y expresar el número de Staphylococcus

coagulasa positivo por gramo o mililitro de muestra
V. RESULTADOS
Muestra Numeración de Staphylococcus áureus

coagulasa positivo
1.-
2.-
VI. CONCLUSIONES
VIII. CUESTIONARIO
1.- ¿Cómo se aplica este indicador microbiológico en la producción de la

leche y productos lácteos?
2.- ¿Cómo se aplica este indicador para evaluar la calidad del aire de
los talleres de producción de alimentos?
3.- ¿Cómo se aplica este indicador para evaluar la calidad de comidas

preparadas y productos de pastelería?
4.-Indique como se realiza la prueba de la coagulasa.
IX. BIBLIOGRAFIA

S.A.1995.
2000.
Alimentos.
X. ANEXOS
PRÁCTICA 12
CONTROL HIGIÉNICO DE SUPERFICIES MÉTODO DEL

HISOPADO O DE LAS TORUNDAS
Es importante aprender cómo realizar controles microbiológicos

higiénicos de superficies, envases, utensilios, superficies de
maquinarias, manos de los trabajadores y del aire del medio
ambiente ya que una parte muy significativa de la contaminación de
procesos alimentarios se debe a implementos y material de
procesamiento.
II. OBJETIVOS
 Realizar el control higiénico sanitario de superficies en talleres de

producción de alimentos.
 Controlar la limpieza de indumentaria y manos de los
trabajadores.
 Realizar el control microbiológico del agua y del aire del medio
ambiente.
1. Incubadoras a 35-37ºC, 29-31ºC, 20-24ºC.

2. Torundas de algodón con vástago de macera, estériles (3para
cada área)
3. Plantillas de aluminio, con área delimitada del
Estériles.
4. Pipetas bacteriológicas de 1ml, graduadas a 0.1ml
5. Extensores de vidrio
6. Tubos que contiene 10ml de agua peptonada al 0.1
7. Placas con agar cuentagérmenes BAM.
8. Placas con agar VRBA o ENDO
9. Placas con agar OGA
10. Placas con agar selectivo para enterococos.
IV. PROCEDIMIENTO
1. Humedecer la torunda del algodón en el agua peptonada.

2. Colocar la plantilla de aluminio sobre la superficie que se desea
controlar.
3. Pasar la torunda sobre la superficie delimitada por la plantilla en sentido
horizontal.
4. Depositar la torunda en el agua peptonada rompiendo el vástago por
debajo de la parte que está en contacto con los dedos, agitar l tubo para
dispersar el contenido.
5. Tomar una segunda torunda y proceder según los pasos 1-4, frotando la
superficie en sentido vertical.
6. Tomar una tercera torunda y seguir los paso 1-4, frotando la superficie
en sentido diagonal.
7. Dejar en reposo las tres torundas durante 20minutos agitando de cuando
en cuando.
8. Depositar 0.1ml del diluyente sobre cada una de las placas
9. Distribuir el inoculo sobre la superficie del agar empleando un extensor
de vidrio
10. Incubar las placas a temperaturas adecuadas.
V. RESULTADOS
Muestra RTBAMV Numeración Numeración Numeración de

de Hongos de levaduras coliformes
totales.
1.-
2.-
3.-
4.-
5.-
6.-
VI. CONCLUSIONES
VIII. CUESTIONARIO
1.- Graficar los resultados obtenidos en las placas petri de las muestras
con las que se trabajó.
2.- ¿Cómo se interpretan los resultados de los análisis del aire del medio
ambiente?
3.- ¿Qué importancia tiene analizar la superficie interna de los envases
para alimentos?
4.- ¿Qué métodos existen para analizar la superficie (piel ) de las
manos?
5.- ¿Qué superficies se pueden analizar en un taller de elaboración de
alimentos mediante el método del hisopado?
IX. BIBLIOGRAFÍA
S.A.1995.
2000.
Alimentos.
agricultura y la Alimentación. Roma
X. ANEXOS
PRÁCTICA 13
DETECCIÓN DE SALMONELLA
El género Salmonella pertenece a la familia de las enterobacterias y

constituye un grupo muy complejo de microorganismos patógenos para
el hombre, pudiendo afectar a diversos animales.
La Salmonella es un bacilo en forma de bastoncillo, negativa a la tinción
de Gram, que puede causar enfermedades diarreicas en los humanos.
Los miembros del genero salmonella son bacilos gran negativos, de 0.7
– 1.5 x 2- 5um no fermentadores de lactosa, anaerobios facultativos, no
esporulados generalmente móviles por flagelos perítricos.
Las salmonellas se multiplican bien en medios ordinarios, las
salmonellas crecen en un amplio rango de temperatura de 1 -28ºC y su
pH ideal para su crecimiento es entre 6.6-8.2, son incapaces de tolerar
altas concentraciones de sal, y sobreviven en agua congelada durante
periodos prolongados.
II. OBJETIVOS
 Investigar la presencia de Salmonella en muestras de alimentos.

 Diferenciar Salmonella y Shigella del género Proteus.
 Estudiar las enterobacterias lactosa negativas , mediante la
utilización de medios de cultivo apropiados y pruebas
bioquímicas.
1. Frasco con 225ml de caldo peptonado bufferado o caldo lactosado.

2. Tubos con 10ml de caldo de enriquecimiento selenito-cistina
3. Tubos con 10ml de caldo de enriquecimiento tetrationato seg.

MULLER-KAUFFMANN
4. Placas con Agar SS (salmonella shigella), o agar bismuto – sulfito
seg. WILSON BLAIR.
5. Placas con agar BPL (agar verde brillante - rojo fenol- lactosa seg.
KAUFFMANN).
6. Tubos con agar hierro tres azucares TSI.
7. Tubos de solución salina (0.85% NaCl).
8. Antisuero polivalente 0 (somático)
9. Pipetas de 10ml
10. Portaobjetos para la prueba serológica.
11. Asas y agujas de inoculación.
12. Baño de agua caliente regulada a 43 (+/- 0.1°C) o incubadora
regulada a 35-37°C.
IV. PROCEDIMIENTO
Los métodos para el aislamiento de salmonella se consideran en los

siguientes pasos:
1. Enriquecimiento no selectivo:
Pesar 25g de muestra, sembrar 225ml de caldo de enriquecimiento
caldo peptonado bufferado o alternativamente en 225ml de caldo
lactosado. Incubar a 35-37ºC por 16-24 horas. Este paso es
indispensable para alimentos desecados y liofilizados.
2. Enriquecimiento selectivo:
Llevar 1ml del cultivo anterior a 10ml de caldo de enriquecimiento
selenito y a 10ml de caldo de enriquecimiento de tetrationato seg.
MULLER y KAUFFMANN. Incubar a 43ºC por 24horas. O suspender
directamente en 100ml de caldo tetrationato unos 10g del material
objeto de investigación, incubar a 43ºC durante 18-24horas a 37ºC
durante 48horas.
3. Aislamiento de placas de agar selectivo:

Partir de los cultivos de incubados realizar siembras por estrías sobre
agar BPL y sobre agar SS. Incubar a 35-37ºC el agar BPL durante
24horas y el agar SS 18-24horas a 37ºC.
Examinar las placas: el agar BPL las colonias sospechosas de

salmonella son incoloras de un color intermedio entre rosa y el fucsia
o entre traslucidos y opacas y el medio que los rodea varía entre
rosáceo a rojo. En el agar SS son incoloras y transparentes o
transparentes con centro negro. En el agar bismuto sulfito son pardas,
grises y negras y presentan a veces un brillo metálico, el medio que
las rodea es por lo general oscuro al principio volviéndose más tarde
negro a medida que aumenta el periodo de incubación.
a. Pruebas bioquímicas:
Elegir dos o más colonias sospechosas de cada placa. Si se
trabaja con agar BPL y agar bismuto sulfito, purificar en placas con
agar MAC MONKEY. Sembrar en agar nutritivo inclinado. Incubar
a 35- 37ºC por 24horas. Comprobar la dureza de los cultivos
mediante la coloración gran, realizar prueba TSI. Si se trabaja con
el agar BPL y SS, realizar directamente la prueba TSI y demás
pruebas bioquímicas.
Prueba TSI: degradación lactosa, sacarosa, glucosa, producción de
gas y H2S; en el medio de cultivo en tubos de agar inclinado de
hierro de tres azucares, el cual se inocula por puntura y estría se
incuba a 35-37ºC por 24horas.
Reaccion positiva:
Parte inclinada: reacción alcalina (color rojo), lactosa y sacarosa
negativa. Parte columnar: reacción acida (color amarillo), glucosa
positivo con o sin producción de H2S.
b. Prueba serológica:
Técnicas para la reacción con el antisuero polivalente o somático

en portaobjetos.
1. Ensayar primero el antisuero con cultivos testigos a fin de

comprobar su eficacia.
2. Usando un marcador de vidrio dividir la lámina portaobjetos
en dos secciones de 1x2cm.
3. Depositar una pequeña cantidad de cultivo joven en agar
nutritivo en la parte superior de cada una de las secciones
marcadas.
4. Depositar una gota de una de una solución de cloruro de
sodio al 0.85% estéril en la parte inferior de cada sección
marcada. Con una aguja de inoculación estéril emulsificar el
cultivo con la solución salina en cada una de las secciones.
5. Añadir una gota de antisuero Salmonella polivalente 0 a uno
de los cultivos emulsificados y mezclar con un asa o aguja
estéril.
6. Imprimir al portaobjetos movimientos de balance adecuados
durante 1 minuto hasta conseguir la mezcla completa.
7. Observar la reacción sobre un fondo oscuro.
a. Si se produce una aglutinación en la mezcla cultivo-
solución salina-suero y en la mezcla cultivo solución
salina se considerara como prueba positiva.
b. Se considerara como prueba negativa si se produce
aglutinación en la mezcla cultivo – solución salina.
Estos cultivos deberán probarse con antisuero
polivalente H (flagelar).
c. Se considerara no especifico sino produce
aglutinación n ambas mezclas. En este caso será
necesario recurrir a las pruebas adicionales descritas
por EDWARDS y EWING 1972.
V. RESULTADOS
1.-En Caldo Tetrationato.
2.-En Agar BPLS
3.- En Agar SS
4.-Pruebas bioquímicas:
TSI LIA Caldo úrea
VI. CONCLUSIONES
VIII. CUESTIONARIO
1.- ¿Cuáles son los principales géneros de enterobacterias lactosa

negativas que se desarrollan en los alimentos y en cuáles?
2.- ¿Mediante qué pruebas bioquímicas se pueden diferenciar Proteus

de Salmonella y Shiguella en el agar SS.
3.- ¿Qué enfermedades puede causar Salmonella en el ser humano?
4.- ¿Qué características poseen las colonias de Salmonella en el agar

SS.
5.- ¿Qué otros agares se utilizan para el reconocimiento de Salmonella?
6.- ¿Qué indican las normas sobre la presencia de Salmonella para un

producto alimenticio terminado?
IX. BIBLIOGRAFÍA

S.A.1995.
2000.
3.- Mossel.D.Microbiología de los alimentos. Ed. Acribia. España 2000.
Alimentos.
agricultura y la Alimentación. Roma
X. ANEXOS

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UNIVERSIDAD NACIONAL JORGE BASADRE GROHMANN

ESCUELA DE INGENIERIA EN INDUSTRIAS ALIMENTARIAS

MICROBIOLOGIA DE LOS ALIMENTOS

DRA. LILIANA LANCHIPA BERGAMINI

El siguiente Manual de Prácticas de Microbiología de los Alimentos está dirigido a los

La realización de estos controles dará la seguridad de la obtención de productos

El conocimiento de la variedad y cantidad de microorganismos en las materias primas,

Igualmente, aprenderán a dirigir, organizar con responsabilidad, seguridad y valorar

Con el desarrollo de estas prácticas, los alumnos secuencialmente, lograrán al final

PRÁCTICA 1 Reglas generales en el laboratorio de microbiología 4

PRÁCTICA 2 Coloración GRAM 6

PRÁCTICA 3 Preparación de medios de cultivo 11

PRÁCTICA 4 Métodos de siembra y cultivo 14

PRÁCTICA 5 Aislamiento de staphylococcus áureos 20

PRÁCTICA 6 Identificación de hongos 24

PRÁCTICA 7 Aislamiento de Enterobacterias 29

PRÁCTICA 8 Numeración de Microorganismos Aerobios Mesófilos Viables 35

PRÁCTICA 9 Numeración de Hongos y Levaduras 39

PRÁCTICA 10 Numeración de Coliformes, Determinación del Número más 43

PRÁCTICA 11 Numeración de Staphylococcus áureos Coagulasa Positivo 49

PRÁCTICA 12: Control higiénico de superficies método del hisopado o de las 54

PRÁCTICA 13: Detección de Salmonella 58

REGLAS GENERALES EN EL LABORATORIO DE

1. No se debe comer ni beber en el laboratorio.

REGLAS DE TRABAJO EN EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA

1. Usar siempre mandil, gorra, zapatos especiales.

1. Nombre y grafique los equipos existentes en el Laboratorio de

3. ¿Cómo se realiza el ciclo de limpieza del material de vidrio?

4. ¿Cuáles son los principales regímenes de esterilización del material de

5. Indique las partes de un microscopio, y los cuidados que se deben de

III. EQUIPOS Y MATERIALES

PREPARACIÓN DEL REACTIVO

1. Solución de cristal violeta:

- Disolver el cristal violeta en el alcohol y el oxalato amónico en

- Triturar el yoduro potásico y el yodo junto en un mortero

- Disolver la safranina en el alcohol y mezclar la solución

1) Limpie dos láminas portaobjetos. Realizar en cada una un frotis

7) Decolorar con alcohol – acetona

1. ¿Cuáles son las diferencias de la estructura de la pared celular

1.-Dr. L. Jack Bradshaw. Microbiología de Laboratorio .Editorial el

PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO

Para obtener colonia de microorganismos es necesario utilizar determinados

Los medios de cultivo deben de reunir los siguientes requisitos:

- Deben de contener nitrógeno, carbono, oxígeno, hidrógeno, sales

Actualmente existen medio de cultivos desecados, los cuales se almacenan en

III. EQUIPOS Y MATERIALES

 Material de vidrio (balones, placas Petri, tubos de ensayo, pipetas y

Para la preparación de medios de cultivo se utiliza agua limpia, destilada

En lo posible se prepara máximo 2 litros por recipiente.

Se separan según las indicaciones de las etiquetas del envase de cada

Antes de esterilizarlos es conveniente repartir el medio de cultivo en

Características de los medios sólidos al final de la preparación:

1. ¿Cómo se clasifican los medios de cultivo?

1. Dr. L. Jack Bradshaw. Microbiología de Laboratorio .Editorial el Manual

MÉTODOS DE SIEMBRA Y CULTIVO

Un medio de cultivo es un material alimenticio que se usa en el laboratorio

Aprender los principales métodos de siembra de microorganismos

III. MATERIALES Y EQUIPOS

Para desarrollar la presente práctica, requeriremos una muestra que en