Guias de Laboratorio y Prelaboratorios - II-2019

PRIMERA SEMANA DEL CURSO
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA

FACULTAD DE CIENCIAS
DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGÍA
CURSO DE BACTERIOLOGÍA GENERAL
Materiales que el estudiante debe tener para trabajar en el laboratorio
o 1 lonchera para guardar el material

o 1 frasco con hipoclorito de sodio para descartar las láminas usadas
o 1 Frasco gotero con Solución Salina
o 1 Frasco gotero con alcohol antiséptico (etanol al 70%)
o 1 caja de láminas
o 1 caja de laminillas
o 1 caja de colores
o 1 asa recta
o 1 asa con argolla
o 1 aguja de disección recta
o 1 aguja de disección curva
o 1 rollo de cinta de enmascarar
o 1 rollo pequeño de cinta transparente
o 1 marcador para escribir sobre vidrio
o 1 sobre de papel de arroz (papel para lentes)
o 1 tijera
o 1 pinza sin dientes
o 1 lupa (opcional)
o 1 pipeteador
o Palillos
o 1 frasco de jabón líquido
o 1 toalla de manos
o Toallas de papel
o 1 caja de fósforos o encendedor
o 10 pipetas Pasteur plásticas
o Papel vinilpel para envolver cajas de petri
PRIMERA SEMANA DEL CURSO

Normas de bioseguridad en el laboratorio
Introducción
Para trabajar en el laboratorio de Bacteriología General es imprescindible el conocimiento previo

de los principios físicos, el manejo adecuado de los equipos, instrumentos y materiales, así
como de las normas de bioseguridad y bio-protección, establecidas internacionalmente y las
normalizadas por el Ministerio de Salud y Ministerio del Medio Ambiente de Colombia.
Nota: La mayoría de los accidentes son causados por la NO OBSERVACIÓN DE LAS NORMAS
ESTABLECIDAS.
El Departamento de Microbiología ha establecido normas generales y específicas para cumplir

en cada uno de los laboratorios en donde se realicen practicas docentes.
Propósitos
 Conocer y aplicar los conceptos de bioseguridad y bioprotección
 Identificar las señales y símbolos relacionados con la seguridad en el laboratorio de
docencia.
 Fomentar el uso de buenas prácticas para bioseguridad y bioprotección
Desarrollo del tema

Para desarrollar el tema de bioseguridad es imprescindible que el estudiante investigue por el
documento emitido por el Departamento de Microbiología y tenga en cuenta el Manual de
Bioseguridad para el Laboratorio de Microbiología de la OMS (3ª edición) que se puede
consultar en la siguiente dirección: http//www.who.int/csr/resources/publications/biosafety o por
google y se escribe: libro de la oms sobre bioseguridad.
Como se observará el manual está desglosado en nueve partes. Los temas que se contemplan
son: directrices en la materia de bioseguridad, la bioprotección, los equipos de laboratorio, las
técnicas microbiológicas adecuadas, aspectos de biotecnología, la seguridad química y
eléctrica, la organización y formación en bioseguridad, y algunos anexos como primeros
auxilios, inmunización del personal, sustancias químicas peligrosas y precauciones. El
desarrollo del tema consiste en contestar las preguntas que se hacen a continuación y cuyas
respuestas aparecen en dicho documento.
PREGUNTAS PARA EL TALLER DE PRIMERA SEMANA
 ¿Para qué se hace un manual de bioseguridad?

 ¿En cuántos grupos se clasifican los microorganismos infecciosos y como se define cada grupo?
 Cómo se clasifican los laboratorios y en que se basan las designaciones de niveles de bioseguridad ?
 Para conocer la relación de los grupos de riesgo con los niveles de bioseguridad, las prácticas y el
equipo, interprete el cuadro 2.
 Dado que en el curso de bacteriología general, se trabaja a nivel 2, indique que requisitos se deben tener
en cuenta.
 ¿Que otros factores inciden, además de conocer en que grupo de riesgo se clasifican los microrganismos
?
 ¿Que significa el código de prácticas ?
 ¿Por qué hay que tener en cuenta el acceso, protección personal, los procedimientos y las zonas de
trabajo, para reducir los riesgos de inseguridad ?
 ¿El personal que labora en el laboratorio necesita capacitación? ¿Cuál?
 ¿Qué es el autoclave? ¿Para que se utiliza?
 ¿Cuáles son los procedimientos para manipulación y eliminación de material y desechos contaminados?
 ¿Qué son y para que se usan los guardianes, las bolsas verdes y las bolsas rojas?
 ¿Dibuje, describa y compare las cabinas de seguridad I, II, III
 ¿Qué es seguridad biológica, ¿Qué es bioprotección ? ¿Qué se utiliza para garantizar bioseguridad y
bioprotección?
 ¿Cuáles son las principales causas de accidentes en el laboratorio?
 ¿Cómo se deben usar las pipetas ?
 ¿Qué técnicas existen para evitar la ingestión de material infeccioso, y/o su contacto con la piel y los
ojos?
 ¿Para que se usa el hipoclorito de sodio y a que concentración?
 ¿Qué procedimiento se debe seguir cuando hay una herida punzante, o cortes?
 ¿Qué se debe hacer cuando se rompe un recipiente con sustancias infecciosas?
 ¿Qué técnicas se utilizan en el campo de la desinfección y esterilización?
 Defina los siguientes términos: antimicrobiano, antiséptico, desinfectante.
 ¿Cuándo se debe hacer el lavado y descontaminación de las manos?

 PRIMERA SEMANA DEL CURSO-LABORATORIO

DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGIA
Seguridad en el laboratorio
En los laboratorios destinados para trabajos con muestras biológicas, microorganismos,

compuestos químicos y agentes físicos que representen algún riesgo, se deben seguir normas
de seguridad e higiene, que garanticen la protección del personal que trabaja en ellos, así como
de la comunidad y el medio ambiente. Seguir las normas de seguridad garantiza además la
implementación con calidad de tas técnicas y confiabilidad de los resultados.
Es necesario identificar los factores de riesgo físico, químico, biológico y de seguridad en el

trabajo diario de laboratorio. Así mismo, el nivel de bioseguridad y los grupos de riesgo a los
cuales pertenecen los microorganismos manipulados en el curso.
Teniendo en cuenta la patogenicidad de los microorganismos presentes en las muestras

procesadas en el laboratorio de docencia, el Centro de Control de Enfermedades (CDC) de
Estados Unidos y el Instituto Nacional de Salud (INS) en Colombia han establecido 4 niveles de
Seguridad Biológica y han determinado normas especificas para trabajo en cada uno de ellos.
En el nivel 1: Ningún riesgo o riesgo moderado para el individuo y la comunidad.

Se trabaja con microorganismos no patógenos bien conocidos y con patógenos oportunistas.
Básicamente se refiere a microorganismos que tienen poca probabilidad de causar enfermedad
a humanos o animales, incluye bacterias, hongos, virus y parásitos que no causan enfermedad.
En el nivel 2: Riesgo individual moderado, bajo riesgo para la comunidad.

Se trabaja con microorganismos y muestras con un potencial de riesgo de moderado a alto,
como los estudiados en laboratorios de enseñanza, en diagnostico microbiológico y laboratorios
de microbiología en el centro de atención primaria. Generalmente se refiere a microorganismos
que pueden causar enfermedades a humanos o animales, pero es poco probable que
represente un serio riesgo para el personal de laboratorio, la comunidad o medio ambiente. La
exposición en el laboratorio puede causar infecciones serias pero con un efectivo tratamiento y
medidas preventivas el riesgo de difusión de la infección puede ser limitado. Algunos
microorganismos de este grupo son:
Actinomyces pyrogenes
Clostrídíum botulínum
Escherichía colí (enterotoxígénica)
En el nivel 3: Riesgo individual y bajo para la comunidad.

Se trabaja con microorganismos y muestras de alto riesgo, como los estudiados en
laboratorios de diagnostico especializado. Corresponde a patógenos corno:
Baclllus anthracis
Coxíella bumetil
Mycobacteríum tuberculosis
Virus hanta
Virus de la fiebre amarilla
Virus de la rabia
En el nivel 4: Alto riesgo individual y alto riesgo para la comunidad.

Se trabaja con microorganismos de altísimo riesgo, o que son exóticos en el país y requieren
máxima seguridad. Son patógenos que causan serias enfermedades en humanos o anímales
que pueden ser fácilmente transmitidos por el individuo directa o indirectamente. El tratamiento,
difusión y medidas preventivas usualmente no son efectivos. Algunos microorganismos de este
grupo son bacterias y virus como:
Mycobacteríum avium
Virus de la fiebre hemorrágica
Herpes simplex virus genus
Normas de bioseguridad para el primer nivel. (Laboratorios de docencia e investigación

básica).
En este nivel se cumplirán las siguientes normas:
o Utilizar bata limpia en buen estado (cerrada) y gorro adecuado para trabajo de
laboratorio (NO CACHUCHA O GORRA). En caso de ser necesario utilizar guantes,
tapabocas u otro elemento indicado por el profesor.
o Utilizar prendas de vestir y zapatos adecuados y cómodos (uniforme para estudiantes de

las carreras de microbiología y bacteriología).
o Lavar las manos con jabón líquido antes de iniciar y al terminar su trabajo de laboratorio.
o Al trabajar con microrganismos se debe tener la puerta del Laboratorio cerrada.
o No consumir alimentos o bebidas, masticar chicle, ni fumar.
o Mantener las uñas cortas y sin esmalte.
o No utilizar joyas y/o accesorios que representen riesgo como los siguientes tipos:
pulseras, aretes largos, piercing, entre otros.
o Mantener el puesto de trabajo solo con e! material necesario. Los morrales y otros
elementos, deben colocarse debajo del mesón o en e! lugar indicado por e! profesor.
o En el caso de trabajar con medios de cultivo, microorganismos o muestras para
aislamientos de los mismos, mantener cerca e! mechero encendido.
o No poner ningún elemento de trabajo en contacto con el cuerpo.

o Evitar transitar al máximo por el laboratorio y hablar en voz alta.
o Descartar los desechos generados durante la práctica de laboratorio en los recipientes

dispuestos para tal fin (bolsa roja, caneca verde, caneca blanca y guardián). En caso de
que algún recipiente se encuentre lleno avisar al profesor o al auxiliar correspondiente.
o El material contaminado se debe descartar en bolsa roja o recipientes con hipoclorito de

sodio. Las muestras de sangre deben descartarse vertiendo la sangre en un recipiente
con hipoclorito de sodio; el tubo desocupado debe ir a la bandeja de material
contaminado. Una vez dispuesto en las bolsas o recipientes adecuados, debe ser
recogido por el auxiliar de laboratorio y descontaminado por esterilización.
o En caso de rompimiento de tubos con sangre o cajas con cultivos microbianos, avisar al
profesor y auxiliar de laboratorio encargado, quienes procederán a cubrir con hipoclorito
de sodio al 3%, tapar con una hoja de papel periódico y dejar sedimentar los aerosoles
durante media hora, para luego envolverlo en papel y llevarlo a esterilización, antes de
ser descartado.
o Los elementos cortopunzantes deben descartarse en el guardián rojo.
o No transitar con la bata de laboratorio en áreas no apropiadas (cafeterías, baños, salones

de clase entre otros),
o Al terminar la práctica deje completamente limpio el sitio de trabajo, verifique que las
llaves de gas se encuentren cerradas, recoja los elementos personales y quítese la bata,
gorro v otros elementos al momento de salir. Recuerde que gorro, guantes y tapabocas
son elementos desechables que deben descartarse una vez utilizados.
PRIMERA SEMANA DEL CURSO-LABORATORIO

CURSO DE BACTERIOLOGIA GENERAL
Prelaboratorio 1- Microscopio óptico
Dibuje un microscopio óptico (o pegue una foto), señalando cada una de sus partes.
Escriba las funciones de cada una de las partes del microscopio.
Cuáles son los cuidados y precauciones que se deben tener en cuenta para proteger el
microscopio, la muestra a observar y el analista ?
Cuál es la función del aceite de inmersión en la observación microscópica ?. Cómo se
emplea el aceite de inmersión ?. Que densidad debe tener un aceite de inmersión
adecuado ?.
Defina:
Poder de resolución
Refracción
Amplificación
SEGUNDA SEMANA DEL CURSO-LABORATORIO
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERÍANA

Prelaboratorio 2: Coloración de estructuras
 Realice un dibujo de bacterias teñidas con colorantes de Grarn.

 Indique cómo se realiza un informe de una coloración de Gram.
 Realice un dibujo de bacterias con presencia de cápsula, coloreadas con rojo congo y
tinta china.
 Realice un dibujo de bacterias sin cápsula, coloreadas con rojo congo y tinta china.
 Indique cómo se realiza un informe de una coloración de rojo congo y tinta china.
 Realice un dibujo de bacterias con presencia de espora, teñidas con colorantes de
Wayson.
 Realice un dibujo de bacterias sin espora, teñidas con colorantes de Wayson.
 Indique cómo se realiza un informe de una coloración de Wayson.

Laboratorio 2. Parte A: Coloraciones simples
Introducción
Para realizar el estudio microbiológico de una muestra, ya sea humana, animal, vegetal,
industrial o del medio ambiente, se debe someter a una serie de procesos estandarizados de
laboratorio que permiten el reconocimiento de los microorganismos presentes. Dentro de los
procesos más importantes se encuentran las coloraciones, con las cuales se pueden observar
características morfológicas, agrupaciones y estructuras presentes en los microorganismos.
Objetivos
 Adquirir destreza en la elaboración de frotis de microorganismos a partir de medios
sólidos y líquidos,
 Aprender a realizar coloraciones simples.
 Reconocer las diferentes formas y/o agrupaciones que puedan presentar los
microorganismos.
 Interpretar los resultados obtenidos.
 Familiarizarse con el correcto uso del microscopio
Materiales
Curso:
o Cultivos bacterianos líquidos y sólidos
o Azul de metileno
o Fucsina básica
o Aceite de inmersión
o Microscopio
o Escobillones
o Goteros plásticos
Estudiantes:
o Muestras de agua de charco o de florero

o Cinta de enmascarar o marcador para vidrio
o Láminas
o Laminillas
o Asas bacteriológicas
Procedimiento
1. Toma de Muestras
Para la toma de la muestra en general se deben tener presentes las normas de bioseguridad
para evitar la contaminación personal, del medio ambiente o de la misma muestra. El material
(escobillones, bajalenguas, cuchillas, bisturís, etc) debe estar estéril y se empleará de acuerdo
con las circunstancias. Para obtener resultados confiables en la investigación microbiológica se
deben tener en cuenta las siguientes recomendaciones: no aplicar sobre la piel sustancias
antibióticas ni desinfectantes durante las 72 horas anteriores, tomar la muestra de la lesión o
del sitio apropiado y procesarla antes de media hora.
2. Elaboración del frotis
a. A partir de medio sólido

a. Marque una lámina limpia y desengrasada en uno de los extremos. Use cinta de
enmascarar ó un marcador para vidrio.
b. Ponga sobre la lámina una gota de agua con el asa estéril (recta o de argolla).
c. Tome una colonia con el asa estéril (recta o de argolla).
d. Emulsione la colonia con la gota de agua.
e. Extienda el frotis en un área no mayor de 0.5 cm de diámetro, para formar una película
delgada y homogénea (no mas de dos muestras por lamina).
f. Deje secar el frotis a temperatura ambiente. Este proceso no se debe realizar por
medio de calor, debido a que se facilita, la formación de abundantes aerosoles,
precipitados de colorantes y alteración de la forma de los microorganismos.
g. Una vez seca la lámina, fije el frotis por medio de calor (ver punto d).
h. Realice una coloración simple (ver punto 3).
b. A partir de medio líquido

b. Tome la muestra del medio líquido, introduciendo el asa de argolla estéril.
c. Ponga la muestra sobre la lámina
d. Extienda el frotis en un área no mayor de 0.5 cm de diámetro, para formar una película
delgada y homogénea.
e. Deje secar el frotis a temperatura ambiente. El secado no se debe forzar.
f. Una vez seca la lámina, fije el frotis por medio de calor (ver punto d).
g. Realice una coloración simple (ver punto 3).
c. A partir de muestra de placa dental

b. Ponga sobre la lámina una gota de agua con el asa estéril (recta o de argolla).
c. Tome una muestra de placa dental con un escobillón estéril.
d. Rote el escobillón sobre la gota de agua
e. Deje secar el frotis a temperatura ambiente. Este proceso no se debe realizar por medio
de calor, debido a que se facilita, la formación de abundantes aerosoles, precipitados de
colorantes y alteración de la forma de los microorganismos.
f. Una vez seca la lámina, fije el frotis por medio de calor (ver punto d).
g. Realice una coloración simple (ver punto 3).
d. Fijación del frotis con calor

La fijación tiene como fundamento destruir los microorganismos y fijarlos a la lámina para
colorearlos posteriormente. Para realizar el proceso de fijación:
 Sostenga la lámina con una pinza
 Pásela por el lado opuesto del frotis, sobre la llama del mechero, en tres oportunidades
consecutivas y rápidas.
 Evite el calentamiento excesivo debido a que este daña las estructuras celulares.
3. Coloración Simple
 Ponga dos gotas de un sólo colorante sobre el frotis.
 Déjelo actuar durante 1 minuto. Escurra.
 Lave con agua.
 Deje secar a temperatura ambiente.
 Ponga una gota de aceite de inmersión sobre el frotis coloreado.
 Realice el montaje en el microscopio, visualice a 10X y luego observe con el objetivo de
100X (ver punto 5).
4. Lámina en fresco
o Marque una lámina limpia y desengrasada en uno de los extremos. Use cinta de
o Coloque sobre la lámina una gota de agua de charco o de florero.
o Inmediatamente después cubra la gota con una laminilla.
o Realice el montaje en el microscopio y visualice con el objetivo de 40X (v. punto 5).
5. Montaje del microscopio
o Compruebe que los lentes del ocular y de los objetivos estén limpios: de no ser así,
límpielos con papel de arroz o papel especial para óptica. No toque los lentes con los
dedos.
o Si los lentes tienen residuos de aceite de inmersión, humedezca el papel de arroz con
etanol al 70% y límpielos.
o Coloque la preparación con la muestra en la parte superior sobre la platina sujetándola
con el dispositivo móvil.
o Ilumine la preparación bajando totalmente el condensador (más contraste), y con el
diafragma abierto.
Si va a enfocar en objetivo de 10X:
o Coloque el objetivo correspondiente (10X) y enfoque con el macrométrico hasta obtener

una imagen nítida.
o Visualice varios campos moviendo la platina hacia los lados o hacia delante y atrás.
Si va a enfocar en objetivo de 40X;

o Después de enfocar en 10X, pase al objetivo de 40X.
o Suba ligeramente el condensador y abra parcialmente el diafragma.
o La imagen debe estar casi enfocada; afine el foco con el micrométrico.
o Visualice varios campos moviendo la platina hacia los lados o hacia delante y atrás.
Si va a enfocar en objetivo de 100X;

 Gire el revolver hacia el objetivo de inmersión.
 Coloque una gota de aceite de inmersión sobre el punto de luz.
 Termine de girar suavemente el revólver hasta la posición del objetivo de inmersión,
asegurándose de que este no toca la preparación, pero si la gota de aceite.
 Suba totalmente el condensador y abra el diafragma totalmente. Posteriormente ajuste
la luz hasta que esté conforme.
 Enfoque cuidadosamente con el micrométrico. No olvide mover suavemente el
micrométrico, porque la distancia de trabajo desde el lente frontal del objetivo de
inmersión a la preparación es mínima, por lo que el riesgo de accidente es ahora máximo.
 Una vez enfocado con nitidez puede cambiar de campo y en cada caso es importante
mover el micrométrico para obtener una buena nitidez.
Resultados e informe
o Realice los dibujos de la observación microscópica de los 3 tipos de frotis y la lámina

en fresco e informe lo observado:
Frotis de medio sólido
Frotis de medio líquido
Frotis de placa dental
Lámina en fresco

Laboratorio 2. Parte B: Coloración de estructuras
• Coloración de Gram para observación de pared bacteriana
Introducción
La coloración de Gram fue descrita en 1884, por el histólogo Christian Gram y aún hoy en día,
sigue siendo la tinción mas empleada en microbiología. Está clasificada como una coloración
compuesta y diferencial, debido a que en el proceso se utilizan dos colorantes: el cristal violeta
y la fucsina básica, y dependiendo del colorante que toma la pared, las bacterias se diferencian
y agrupan en dos grandes categorías denominadas: Gram positivas las que se tiñen con el
cristal violeta y Gram negativas las que toman el color de la fucsina básica. La reacción tintorial
que presentan las bacterias al ser coloreadas con Gram. demuestra que la composición química
y estructural de la pared es diferente y. por consiguiente, permite que los colorantes se unan a
sus compuestos moleculares en forma específica. De esta manera la tinción de Gram permite
el reconocimiento primario de los microorganismos, la elección del tratamiento selectivo con
antibióticos y el comportamiento de las bacterias frente a agentes físicos y químicos.
Tabla. Reacción de las bacterias frente a los componentes de la coloración de Gram
COMPONENTES GRAM-POSITIVAS GRAM-NEGATIVAS

Cristal violeta La bacteria toma color La bacteria toma color
violeta violeta
Lugol La bacteria toma color La bacteria toma color
violeta violeta
Alcohol acetona Bacteria de color La bacteria se vuelve
violeta. Deshidratación incolora, extracción de
de paredes celulares, lípidos de la pared,
retracción de poros, mayor porosidad,
disminución de liberación del complejo
permeabilidad colorante-fijador
La bacteria permanece La bacteria se tiñe de
Fucsina básica de color violeta color rosado
El control de calidad de la coloración de Gram se debe realizar por medio de un frotis con una
mezcla de la bacterias Escherichia coli (bacilo Gram negativo) y Staphylococcus aureus (coco
Grampositivo), siempre que sean de sistemas de referencia, para garantizar los resultados. Al
observar el frotis coloreado con Gram se deben ver simultáneamente la morfología y coloración
de los dos microrganismos. Si se observan únicamente bacterias violeta o Gram positivas,
deberá aumentarse el tiempo de decoloración con el alcohol acetona. Si por el contrario solo se
ven bacterias rosadas o Gram negativas, deberá disminuirse el tiempo de la decoloración, hasta
obtener la observación simultanea de los dos tipos de microorganismos, cada uno con su
coloración correspondiente.
Objetivos
o Adquirir destreza en la realización de la coloración de Gram.

o Diferenciar bacterias Gram positivas de Gram negativas.
o Interpretar los resultados de la coloración de Gram.
o Aprender a informar la coloración de Gram
Materiales
Curso:
o Agar nutritivo (AN) sembrado con Klebsiella sp
o AN sembrado con Staphylococcus sp
o AN sembrado con Escherichia coli
o AN sembrado con Bacillus sp
o Colorantes de Gram
o Microscopio
Estudiantes:
o Láminas
Procedimiento
• Marque una lámina limpia y desengrasada en uno de los extremos. Use cinta de
• Realice otro frotis a partir de los microorganismos que se encuentran sembrados en AN
(un frotis diferente por cada microorganismo).
• Fije el frotis con calor. Aplique sobre el frotis cristal violeta (colorante primario)
• Deje actuar durante 1 minuto. Lave con agua y escurra
• Aplique lugol y deje actuar durante 1 minuto. Lave con agua y escurra.
• Aplique alcohol acetona, deje actuar durante 20 segundos. Lave con agua.
• Aplique fucsina básica y deje actuar durante 1 minuto (colorante de contraste). Lave con
agua y escurra.
• Ponga una gota de aceite de inmersión sobre el frotis coloreado
• Enfoque con objetivo de 100X
NOTA: Antes de comenzar a utilizar el lote de colorantes preparados, siempre se deben

estandarizar los tiempos, haciendo el control de calidad de la coloración.
Realice los dibujos de la observación microscópica de los 4 microorganismos coloreados e

informe lo observado.
Klebsiella sp
Staphylococcus sp
Escherichia coli
Bácillus sp
• Coloración de Wayson para endosporas
Introducción
Las endosporas son cuerpos ovales de pared gruesa, que se forman dentro del cuerpo de la
célula vegetativa. En ellas se recoge el material celular y la célula se deshidrata, se sintetiza
dipicolinato de calcio y se recubre de una serie de capas protectoras. El exosporium, contiene
en su interior la cubierta de la espora, que está compuesta de una capa parecida a la de la
pared celular. Por debajo de la cubierta de la espora se encuentra la corteza y, dentro de ella,
el núcleo o corazón, que contiene a la pared celular usual. Así, la espora difiere de la estructura
de la célula vegetativa. La localización y el tamaño de las esporas, varia de acuerdo a la especie;
existen esporas terminales, subterminales y centrales, punto importante en la identificación de
las bacteria. Las endosporas dan a la bacteria alta resistencia a factores físicos y químicos
desfavorables y son características del género Bacillus y Clostridium.
La coloración para endosporas, está clasificada como una coloración especial, por demostrar
la presencia de esta estructura especial que caracteriza a la bacteria. El poder observar esta
estructura es de gran importancia, para determinar el proceso de estudio a seguir, realizar el
diagnóstico exacto y dar un tratamiento adecuado al agente infeccioso.
Objetivos
- Adquirir destreza en la realización de la coloración de Wayson.
- Reconocer las endosporas y ver su posición dentro de la célula vegetativa.
- Interpretar los resultados de la coloración de Wayson.
- Aprender a informar la coloración de Wayson
Materiales
Curso:
o AN sembrado con Klebsiella sp
o AN sembrado con Staphylococcus sp
o AN sembrado con Escherichia col i
o Colorante de Wayson
Estudiantes:
 Cinta de enmascarar o marcador para vidrio
 Láminas
 Asas bacteriológicas
Procedimiento
o Marque una lámina limpia y desengrasada en uno de los extremos, use cinta de
o Realice un frotis a partir de Bacillus sp
o Realice un frotis diferente a partir de cualquier otro de los microorganismos que se
encuentran sembrados en AN
o Coloque sobre el frotis 2 gotas de colorante de Wayson durante 30 segundos.
o Lave con agua y escurra.
o Ponga una gota de aceite de inmersión sobre el frotis coloreado.
o Enfoque con objetivo de 100X
o Realice los dibujos de la observación microscópica de los 2 microorganismos

coloreados e informe lo observado
Bacillus sp
Otro microorganismo seleccionado

• Coloración de Rojo Congo y tinta china para glicocálix y capsula
Introducción
El glicocálix, hace referencia a sustancias densas o pegajosas, constituidas por glucanos
solubles e insolubles que secretan la mayoría de procariotas, sobre su pared. Algunas forman
una capa de poco espesor, llamada microcápsula, otras forman capas de mayor diámetro que
constituyen una verdadera cápsula. El glicocálix cumple la función de fijar los microorganismos
patógenos a sus huéspedes, hacerlos difíciles de reconocer y destruir por fagocitosis. Esta
sustancia tiene especial importancia en la génesis de la caries dental y en infecciones
pulmonares; son adhesinas que intervienen en los procesos de adhesión, agregación y
coagregación de las bacterias a las superficies lisas ya sea, de los tejidos, del esmalte de los
dientes, las paredes, objetos metálicos o a otras bacterias.
Las coloraciones utilizadas para la observación de glicocálix, y cápsula son las denominadas
negativas y son: rojo congo, nigrosina y tinta china. Estas coloraciones por tener el ion colorante
cargado negativamente, son rechazadas por la cápsula y el glicocálix, dejando la estructura
incolora pero coloreando el medio que la rodea. Como resultado se observará un fondo
coloreado sobre el cual se observan pequeños agujeros incoloros que corresponden a la
cápsula cuando es de escaso diámetro, y al glicocálix cuando el diámetro es más amplio. Si en
el proceso de coloración se incluye un colorante básico, este tiñe la pared de la bacteria,
observándose coloreada dentro de la cápsula o del glicocálix.
Objetivos
 Adquirir destreza en la realización de las coloraciones de rojo congo y tinta china.
 Reconocer los microorganismos encapsulados
 Interpretar los resultados de las coloraciones de rojo congo y tinta china.
 Aprender a informar las coloraciones de rojo congo y tinta china.
Materiales
Curso:
o Agar nutritivo (AN) sembrado con Klebsiella sp
o Agar nutritivo (AN) sembrado con Staphylococcus sp
o Agar nutritivo (AN) sembrado con Escherichia coli
o Agar nutritivo (AN) sembrado con Bacillus sp
o Colorantes de rojo congo y tinta china
o HCL 1N
Estudiantes:
o Láminas
Procedimiento
Coloración con Rojo Congo
• Marque una lámina limpia y desengrasada en uno de los extremos. Use cinta de
• Ponga sobre una lámina limpia y desengrasada una pequeña gota de rojo congo.
• Mezcle una asada de Klebsiella sp con la gota de rojo congo y extienda la mezcla sobre
la superficie de la lámina.
• Repita los pasos anteriores, pero empleando otro de los microorganismos que se
encuentran sembrados en AN.
• Deje secar a temperatura ambiente. NO FIJE LA LÁMINA CON CALOR, ya podría dañar
la cápsula o glicocálix.
• Fije con HCL 1N, sumergiendo la lámina dentro del ácido y retirándola inmediatamente
• Lave con agua y escurra.
• Cubra el frotis con azul de metileno durante 5 minutos
• Lave con agua y escurra.
• Ponga una gota de aceite de inmersión sobre el frotis coloreado
• Enfoque con objetivo de 100X
Coloración con Tinta China

o Marque una lámina limpia y desengrasada en uno de los extremos. Use cinta de
o Ponga sobre una lámina limpia y desengrasada una pequeña gota de tinta china.
o Mezcle una asada de Klebsiella sp con la gota de tinta china y extienda la mezcla sobre
la superficie de la lámina.
o Repita los pasos anteriores, pero empleando otro de los microorganismos que se
encuentran sembrados en AN.
o Deje secar a temperatura ambiente. NO FIJE LA LÁMINA CON CALOR, ya que podría
dañar la cápsula o glicocálix.
o Ponga una gota de aceite de inmersión sobre el frotis coloreado.
o Enfoque con objetivo de 100X.
o Realice los dibujos de la observación microscópica de los 2 microorganismos coloreados
con rojo congo y tinta china e informe lo observado.
Coloración de Rojo Congo
Klesiella sp
Coloración de Tinta China
Klesiella sp

TERCERA SEMANA DEL CURSO-LABORATORIO

Prelaboratorio 3: medios de cultivo

1. Qué es un medio de cultivo? Cuál es su función e importancia?
2. Cómo se clasifican los medios de cultivo según su consistencia, su
composición y su utilidad.
3. Complete la siguiente tabla sobre los medios de cultivo que se emplearán en el
laboratorio durante todo el semestre.
Bacteria
Medio Fdto* Clasificación 1 Clasificación 2
cultivada
Consist. Compos. Utilid. (Según peligrosidad)
Agar sangre
Agar chocolate
Agar SIM
Caldo nutritivo
Agar avena
Agar
Mueller Hinton
Caldo Brilla
Agar Plate Count
Agar Saboureaud
(sólo y suplementado
con cloranfenicol 50
mg/L)
* En el fundamento incluya: modo de acción de los principales componentes del medio

(nutrientes, inhibidores de otros microorganismos, etc.), cambios que se presenten en el medio
debido al crecimiento de los microorganismos (color, pH, turbidez, gas, etc.), cómo se observan
los microorganismos de interés y otro tipo de microorganismos.
4. Describa los tipos de hemolisis que se pueden observar en el agar sangre.
5. Realice los cálculos para preparar 33 cajas de agar TSI, teniendo en cuenta que
para su preparación se necesitan 58 g/L del compuesto A, 15 mg/L del
compuesto B, 21 g/10 mL del compuesto C y el compuesto D va al 7% (recuerde
que en cada caja se sirven 20 mi )
6. Realice los cálculos para preparar 59 tubos de caldo y (5 mL/tubo), teniendo en

cuenta que para su preparación se necesitan 10ug/l, del compuesto E, 44 g/L
del compuesto F, 51 mg/100 mL del compuesto G y el compuesto H va al 0.5%.

Laboratorio 3. Parte A: métodos de siembra de los medios de cultivo
Introducción
Para las diferentes tareas a realizar en microbiología es importante lograr el crecimiento de los
microorganismos y en cuyo objetivo se utilizan medios de cultivos que ofrezcan los
requerimientos necesarios. Posteriormente es necesario el aislamiento del microrganismo en
medios solidos que permitan ver sus características macroscópicas y realizar la identificación.
En la presente guía encontrara los diversos métodos de siembra en medios sólidos, líquidos y
técnicas de aislamiento que puede utilizar en su vida diaria microbiológica.
Objetivos
o Aprender los diferentes métodos de siembra
Materiales
Curso:
 Cajas de petri vacías estériles para ensayar el manejo de la caja
 1 caja de agar chocolate, 1 caja de agar nutritivo, 1 caja de agar sangre, 1 caja de agar
Mueller-Hinton
 1 tubo de caldo nutritivo (CN)
 1 tubo de agar SIM
 1 tubo con caldo tripticasa de soya
 1 tubo agar TSI , 1 tubo agar UREA
 Escobillones
 AN sembrado con Escherichia coli
 AN sembrado con Salmonella sp
 CN con cultivo de muestra de suelo
 CN con cultivo de Salmonella sp
 CN con cultivo de Escherichia coli
Estudiantes:
o Asas bacteriológicas (asa recta y redonda o de argolla)
Procedimiento
1. Método de Siembra para Aislamiento de Colonias (a partir de una muestra humana)
 Marque la caja de agar chocolate con el número de grupo, fecha y origen de la muestra
 Antes de iniciar un aislamiento verifique que la superficie del medio de cultivo esté seco,
si no es así colóquelo en una incubadora a 37°C por dos horas con la tapa de la caja
ligeramente levantada.
 Si el medio de cultivo está almacenado en refrigeración, saque las cajas con suficiente
anticipación para que lleguen a la temperatura de trabajo (medio ambiente).
 Tome muestra de placa dental con el escobillón, y cerca al mechero abra la caja de agar
sangre o chocolate.
 Rote el escobillón con suavidad sobre una pequeña área circular, al borde del medio.
 Descarte el escobillón en la bolsa destinada para ello.
 Para el aislamiento bacteriano, el asa debe esta previamente estéril, también puede usar
asas desechables (es especial para estudios de métodos ecométricos).
 Recuerde que la caja con la tapa debe estar en una de sus manos. Para ello tome la
caja, la base de esta debe sostenerse con los dedos meñique, anular y corazón, la tapa
se asegura con los otros dos dedos. Levante la tapa (nunca la deje sobre la mesa) cerca
al mechero.
 Extienda la muestra con el asa esterilizada (sin quemar), en forma de "Z" de 5 a 10 veces
(esto dependerá del tipo de muestra, entre más contaminada menos estrías), las líneas
no deben tocarse entre ellas. El ángulo del asa debe ser cercano a 45°C con el fin de
que no queden estrías gruesas que no permiten separar las colonias.
 Reesterilice el asa y a partir de la última estría realice nuevamente 5 a 6 estrías en
sentido perpendicular conservando la forma de "Z".
 Reesterilice el asa y a partir de la última estría realice nuevamente 5 a 6 estrías en
 Lleve las cajas a la incubadora a 37°C durante 24 a 48 horas para permitir el desarrollo
bacteriano. Las cajas deben ponerse en la incubadora con el medio hacia arriba, para
que el agua de condensación que se libera durante la incubación caiga sobre la tapa de
la caja de Petri y no perjudique el cultivo.
Este proceso se denomina aislamiento de colonias, debido a que las bacterias presentes en
una muestra se distribuyen sobre la superficie del agar y cada célula se reproduce
independientemente hasta formar un conglomerado de bacterias observables a simple vista,
con las mismas características fenotípicas y genotípicas. A este grupo de bacterias se le
denomina colonia bacteriana. De esta manera es posible observar sobre la superficie del agar,
colonias de diferentes características en cuanto a forma, superficie, borde, color, aspecto y
elevación, lo que indica a simple vista la presencia de diferentes tipos de bacterias en la
muestra. Así se puede estudiar e identificar independientemente cada especie bacteriana
(tabla).
Tabla . Características de las colonias bacterianas
FORMA BORDE ELEVACIÓN SUPERFICIE
Puntiforme Entero Plana Lisa brillante

Circular Lobulado Elevada Rugosa
Rizoide Ondulado Convexa Seca
Irregular Rizada Umbilicada Algodonosa
Filamentosa Filamentoso Levantada Granulosa
2. Método de Siembra para Aislamiento de Colonias (a partir de una muestra líquida)

• Marque la caja con el número de grupo, fecha y origen de la muestra
• Tome muestra del cultivo de suelo en CN, introduciendo el asa de argolla estéril y fría,
en el tubo.
• Distribuya la muestra pasando suavemente el asa redonda sobre una pequeña área
circular, al borde de la caja de agar nutritivo.
• Recuerde que la caja con la tapa debe estar en una de sus manos. Para ello tome la
caja, la base de esta debe sostenerse con los dedos meñique, anular y corazón, la tapa
se asegura con los otros dos dedos. Levante la tapa (nunca la deje sobre la mesa) cerca
al mechero.
• Extienda la muestra con el asa recta o redonda esterilizada (sin quemar), en forma de
"Z" de 5 a 10 veces (esto dependerá del tipo de muestra, entre más contaminada menos
estrías), las líneas no deben tocarse entre ellas. El ángulo del asa debe ser cercano a
45°C con el fin de que no queden estrías gruesas que no permiten separar las colonias.
• Reesterilice el asa y a partir de la última estría realice nuevamente 5 a 6 estrías en
• Reesterilice el asa y a partir de la última estría realice nuevamente 5 a 6 estrías en
• Lleve a incubar a 37'C durante 24 a 48 horas.
3. Método de Siembra para Aislamiento de Colonias (a partir de una muestra sólida)

o Marque el material con el número de grupo, fecha y origen de la muestra.
o Tome muestra del cultivo de Escherichia coli o Salmonella sp sembrado en AN con el
asa recta. Para esto, toque con la punta del asa, el centro de una colonia aislada.
o Coloque la muestra sobre el agar sangre cerca de uno de los bordes de la caja
o Extienda la muestra con el asa recta (sin quemar), en forma de "Z" de 5 a 10 veces (esto
dependerá del tipo de muestra, entre más contaminada menos estrías), las líneas no
deben tocarse entre ellas. El ángulo del asa debe ser cercano a 45°C con el fin de que
no quede estrías gruesas que no permiten separar las colonias.
o Reesterilice el asa y a partir de la última estría realice nuevamente 5 a 6 estrías en
o Reesterilice el asa y a partir de la última estría realice nuevamente 5 a 6 estrías en
o Lleve a incubar a 37°C durante 24-48 horas.
Si después de la incubación no obtiene colonias aisladas, deberá realizar un nuevo aislamiento,
en especial si estas colonias se van a utilizar para identificaciones bioquímicas.
Tenga en cuenta las siguientes consideraciones:
 Los microorganismos son microscópicos por lo que en la "carga" de una asa pueden
existir muchos microorganismos aunque no los vea, por lo cual solo tome muestra una
vez, entre mas inoculo tome menor probabilidad de aislamiento tendrá
 Se considera un buen aislamiento cuando al menos logra tener 10 colonias aisladas.
 Antes de usar un medio cerciórese de que realmente no presenta contaminaciones.
 Asegúrese de cumplir con las buenas prácticas de laboratorio y las normas de
bioseguridad
NOTA: Este procedimiento lo debe realizar cada uno de los integrantes del grupo de trabajo.
4. Método de Siembra Masiva

Estas siembras se hacen cuando se parte de muestras puras (colonias aisladas) y se requiere
un crecimiento masivo para poder verificar resultados de inhibición, casos concretos son:
antibiogramas, pruebas de desinfectantes y pruebas de antagonismo. Normalmente en esta
técnica se utiliza un medio líquido que se siembra con el microoorganismo a evaluar. El
procedimiento es el siguiente:
Tome la colonia del medio solido, inocule el medio líquido (CN) y ajuste la turbidez de acuerdo
a la instrucciones de la técnica. Tome muestra de la suspensión bacteriana a evaluar con
escobillón estéril, humedézcalo bien y cuando vaya a retirar el escobillón del tubo presione este
con la pared interna del tubo para evitar que se riegue la muestra. Con el escobillón extienda la
muestra sobre la superficie del agar Mueller-Hinton con movimientos rotatorios, hasta cubrir
toda la superficie del agar, para garantizar un crecimiento uniforme. Lleve a incubar de acuerdo
a las recomendaciones.
5. Método de Siembra por Picadura en Medio Semisólido (SIM)

o Marque el material con el número de grupo, fecha y origen de la muestra.
o Tome muestra del cultivo de Salmonella sp o de Escherichia coli con el asa recta estéril
y fría.
o Siembre por picadura el medio de SIM, introduciendo el asa por la parte central del medio
hasta dos terceras partes de profundidad, procurando sacar el asa por el mismo sitio de
picadura, y así, evitar falsas interpretaciones de movilidad bacteriana.
o Lleve a Incubar a 37°C durante 24 a 48 horas.
6. Método de siembra en medio líquido

 Marque el material con el número de grupo, fecha y origen de la muestra.
 Antes de iniciar la siembra verifique la temperatura del medio a sembrar y la esterilidad
de este.
 Tome la muestra con asa de argolla previamente esterilizada y enfriada
 Introduzca el asa con la muestra dentro del medio líquido (caldo tripticasa de soja) y
agítela, lleve a incubar a 37°C durante 24 a 48 horas o de acuerdo a las condiciones que
necesita.
7. Método de siembra en medio solido en pico de flauta

o Tome muestra del cultivo de Salmonella sp o de Escherichia coli con el asa recta estéril
y fría.
o Siembre por picadura el tubo TSI, introduciendo el asa hasta el fondo, saque hasta la
superficie de pico de flauta y sobre esta realice estrías. Siembre también el medio UREA
solo en estrías sobre la superficie. Lleve a Incubar los dos tubos a 37°C durante 24 a 48
horas.
 Realice la descripción de las diferentes colonias obtenidas en cada medio.
 Dibuje el aspecto macroscópico de las colonias formadas, cambio de color, cambio de
textura, etc, en todos los medios utilizados.
 Interprete los cambios presentados en cada medio.
 Explique por qué se desarrollan o crecen algunos microorganismos y no otros sobre los
medios
 Haga coloración de Gram de algunas de las colonias.
 De acuerdo con la siguiente tabla sobre la clasificación de las colonias bacterianas,
dibuje en el espacio asignado las colonias según su forma, borde, elevación y superficie:
Forma Borde Elevación Superficie
Puntiforme Entero Plana Lisa brillante
Circular Lobulado Elevada Rugosa
Seca
Rizoide Ondulado Convexa
pulverulenta
Irregular Rizada Umbilicada Algodonosa
Filamentosa Filamentoso Levantada Granulosa


Laboratorio 3. Parte B: Ubicuidad de los microrganismos
Introducción
Los microorganismos están presentes en todos los lugares en los que pueda existir o no existir
vida. Abarcan un amplio abanico de condiciones ambientales que van desde temperaturas muy
frías hasta temperaturas extremas, igualmente en condiciones de nutrientes, pH, oxigeno,
presión osmótica, presión de CO2, etcétera, muy diferentes a la de condiciones óptimas. Quizás
es su tamaño microscópico el que les permite una gran capacidad de dispersión, a su
variabilidad y flexibilidad metabólica, que les acondiciona a existir en diferentes condiciones
ambientales, y también a sus características genéticas.
Los microorganismos incluyen bacterias, mohos, levaduras, protozoarios, microalgas y virus,

que cumplen con diferentes funciones benéficas o perjudiciales. Dado el tamaño microscópico
de las bacterias que no permite verlas, se pueden cultivar en medios nutritivos y de cultivo que
permiten su crecimiento.
El medio de cultivo es un conjunto de nutrientes, factores de crecimiento y otros componentes

que crean las condiciones necesarias para el desarrollo de los microorganismos. Los principales
constituyentes de los medios: agar, que es el agente solidificante; una fuente de carbono, por
ejemplo glucosa; extractos de órganos o tejidos, extracto de levaduras, extracto de carne;
amortiguadores que minimizan los cambios de pH; agentes reductores como el tioglicolato o la
cisteina, necesarios para microorganismos anaerobios.
Objetivos
• Comprobar la presencia de microorganismos en diferentes ambientes: aire y superficies
de trabajo.
• Comprobar la presencia de microorganismos en el personal que los cultiva.
Fundamento
Al sembrar diferentes muestras los microorganismos crecerán (multiplicación) formando
colonias de diferentes aspectos.
Materiales
Curso:
• 1 caja de agar nutritivo por estudiante
• 1 escobillón estéril.
Procedimiento
A. Siembra (Dia 1).
1. Marcar cada una de las cajas en la parte que contiene el medio, con el número
del grupo, el material sembrado y la fecha.
2. Cada estudiante debe dejar abierta una caja con el medio de cultivo destapado
durante 15 minutos (a este método de siembra se le denomina por
sedimentación). Alternativamente, el estudiante puede obtener la muestra a partir
de un fuente solida:
• Tocar el medio con un dedo
• Pasar el escobillón por la piel y sembrar pasándolo luego sobre el
medio.
• Pasar el escobillón por la superficie de la mesa y sembrarlo en el medio
de cultivo.
• Toser sobre el medio de cultivo
• Recoger una gota de agua del chorro y verterla sobre el medio, dando
un movimiento de vaivén.
3. Llevar las cajas a incubación a 37° C durante 24-48 horas.
B. Lectura (Día 2)
Resultados
 Observar a simple vista o con ayuda de una lupa la superficie del agar.
 Anotar y dibujar las colonias observadas en las cajas de Petri teniendo en cuenta su
forma, color y apariencia.
 Comparar los resultados con los de los demás grupos.
 Discutir los resultados obtenidos en los diferentes grupos
 Sacar conclusiones con respecto a la ubicuidad de los microrganismos.
CUARTA SEMANA DEL CURSO-LABORATORIO

Laboratorio 4. Parte A: Control de crecimiento bacteriano por acción de pH, presión

osmótica, temperatura y oxígeno
Introducción
Las bacterias tienen gran capacidad para crecer en diferentes ambientes, como en aquellos
donde el crecimiento de otros organismos no es posible. Por ejemplo, son capaces de
desarrollarse a temperaturas muy altas o bajas, a pH ácido o alcalino, en lugares con escasez
de agua, en zonas con exceso de solutos, en ausencia de oxígeno, entre otros.
Es por esto, que cuando algunas condiciones o factores externos cambian, ciertos
microorganismos no son capaces de resistir los cambios y detienen su crecimiento o mueren.
No obstante, otros tienen la capacidad de resistir los cambios, y pueden sobrevivir en diferentes
ambientes.
Algunos de los factores que más afectan el desarrollo bacteriano son el pH, la temperatura, la
presión osmótica y el oxígeno, entre otros. El rango de pH en el que se desarrollan la mayoría
de microorganismos se encuentra entre 6.5 - 7.5. Por debajo de 6.5 se denominan acidófílos y
por encima de 7.5. alcalófilos.
En cuanto a la temperatura, la mayoría de las bacterias se desarrollan a temperaturas entre 15-

45 °C y se conocen como mesófilos. Otros microorganismos necesitan temperaturas por debajo
de 15°C para crecer y son los psicrófílos. Por el contrario, los termófilos crecen adecuadamente
a temperaturas por encima de 45°C. De estos, aquellos que crecen a temperaturas superiores
a 80°C se conocen como hipertermófilos.
Respecto a la presión osmótica, existen dos grupos de microorganismos: aquellos que pueden
crecer en altas concentraciones de sal y se conocen como halófilos y los que sobreviven en
altas concentraciones de azúcares y son los osmófilos ó sacarófilos.
En relación al oxígeno, los aerobios son aquellos que necesitan el oxígeno para sobrevivir, ya
que lo emplean como aceptor final de electrones. Existen otros microorganismos que necesitan
el oxígeno, pero en bajas concentraciones y son los microaerofílicos. Los anaerobios estrictos,
por el contrario, son aquellos microorganismos que no pueden vivir en presencia de oxígeno y
emplean otros compuestos como aceptores de electrones. Por otra parte, existen
microorganismos capaces de crecer en presencia o ausencia de oxígeno y se denominan
anaerobios facultativos, y los aerotolerantes, que son aquellos que toleran el oxigeno.
Objetivos
o Evidenciar el efecto que ejercen el pH, la presión osmótica y la temperatura en el
desarrollo y actividad de los microorganismos.
o Determinar el pH, la presión osmótica y la temperatura óptima para los
microrganismos en estudio
Materiales
Curso:
o 1 tubo con caldo nutritivo (CN) con 1% de glucosa, pH 3.0.
o 1 tubo con CN con 1% de glucosa, pH 5.0.
o 1 caja con agar nutritivo (AN) con NaCl al 0.85%
o 1 caja con AN con NaCl al 7.5%
o 3 tubos con CN
o 2 cajas con AN
o Generador de anaerobiosis
o Indicador de anaerobiosis
o Campana de anaerobiosis
o AN sembrado con Klebsiella sp
o AN sembrado con Staphylococcus aureus
o AN sembrado con Escherichia coli
Estudiante:
• Asas bacteriológicas
Procedimiento
A. Siembra (Día 1)
• Seleccione una de las cepas microbianas (cualquiera) y siembre en:
5 tubos de CN con 1% de glucosa, con pH 3.0, 5.0, 6.8. 9.0 y 11.0.
2 cajas de AN con NaCl al 0.85 y 7.5% (por aislamiento).
3 tubos con CN.
2 cajas con AN (por aislamiento).
• Lleve los tubos de CN con 1% de glucosa, con pH 3.0, 5.0, 6.8, 9.0 y 11.0 y las cajas de
AN con NaCl al 0.85 y 7.5% a incubación a 37°C, durante 24 horas.
• Lleve los tubos de CN a incubar a temperaturas de 4, 37 y 60°C durante 24 horas.
• Lleve una de las cajas de AN a incubación a 37°C, durante 24 horas. La otra caja
introdúzcala en una campana de anaerobiosis e incube a 37°C durante 24 horas.
.
B. Lectura (Día 2)
• Observe la presencia de crecimiento en los tubos por turbidez y en las cajas por
presencia de colonias visibles.
• Complete la tabla con cada uno de los factores evaluados y determine los valores
óptimos para el desarrollo del microorganismo seleccionado.
Nombre del microorganismo evaluado:
Factor Crecimiento Óptimo
pH 3.0
5.0
6.8
9.0
11.0
Presión NaCl al
Osmótica
0.85%
NaCl al
7.5%
Temperatura 4°C
37°C
60°C
Oxígeno
Aerobiosis
Anaerobiosis
Nota: Escala para valorar el crecimiento:

Abundante: +++
Medio: ++
Escaso:+
Ausencia de crecimiento: 0
CUARTA SEMANA DEL CURSO-LABORATORIO

Laboratorio 4. Parte B: Control del crecimiento bacteriano por medio de sustancias

químicas y agentes quimioterapeúticos
Introducción
Las sustancias químicas conocidas como desinfectantes y antisépticos tienen la capacidad de
matar o inhibir los microorganismos. Ningún agente químico antimicrobiano tiene la capacidad
de actuar eficazmente sobre todo tipo de microorganismo, debido a la actividad propia del
químico y las variadas características de sensibilidad y resistencia que presentan las
bacterias.
Un buen agente desinfectante debe presentar las siguientes características: tener actividad
antimicrobiana, ser soluble en agua, ser estable, no presentar toxicidad, no reaccionar con la
materia orgánica, tener capacidad de penetración, no ser corrosivo, tener capacidad detergente
y un precio razonable. Para determinar la acción de los desinfectantes y de los antisépticos se
debe tener en cuenta: la concentración de la sustancia, la población microbiana, el tiempo de
exposición, el pH del medio y el tipo de microorganismo.
Entre los desinfectantes se encuentran el cloro, el hipoclorito, las cloraminas, el fenol, los
agentes alquilantes, los detergentes, etc. Estos se usan sobre material inerte como pisos,
mesas, baños.
Los antisépticos como alcohol yodado y mertiolate se emplean sobre tejidos vivos.
Los agentes quimioterapéuticos son compuestos químicos que se pueden usar por vía interna
y se clasifican como agentes sintéticos y antibióticos. Dentro de los sintéticos están los análogos
de los factores de crecimiento, como la sulfamidas, la isoniazida, fluorouracilo y bromouracilo.
Las quinolonas son una clase de antibióticos sintéticos que interaccionan con la DNA girasa
bacteriana impidiendo que la girasa produzca un DNA superenrrollado, necesario para el
empaquetamiento del DNA en la célula bacteriana.
Los antibióticos son compuestos químicos producidos por microorganismos que inhiben o
destruyen otros microorganismos. Los géneros microbianos que proveen antibióticos son los
Streptomyces y Bacillus, al igual que gran cantidad de géneros de hongos, como por ejemplo,
Cephalosporium y Penicillum. Dentro de los antibióticos se encuentran los Beta lactámicos:
penicilinas, cefalosporinas y cefamicinas. Otros son los aminoglucósidos, macrólidos y
tetraciclinas.
Para determinar la actividad de los antibióticos sobre un microorganismo, existen varios
métodos de laboratorio como son:
1. La técnica de dilución en tubo, en la cual se preparan una serie de tubos con medio de
cultivo, cada uno con una concentración diferente de antibiótico y se siembran con el
microorganismo. Después de la incubación, se observa la concentración mínima de
antibiótico que inhibe el crecimiento del microorganismo (CMI).
2. Otro procedimiento, es el método de difusión en agar. Este método fue estandarizado
por Kirby Bauer. En él se emplea el agar Mueller Hinton, sobre el cual se realiza la
siembra masiva del microrganismo a una concentración estandarizada. Posteriormente
sobre la superficie sembrada se colocan los sensidiscos con diferentes antibióticos y
concentraciones conocidas. En otros procedimientos se emplean diluciones en agar,
gradientes de agar y métodos automatizados.
Objetivos
Determinar la actividad que ejercen los quimioterapéuticos y las sustancias químicas sobre los
microorganismos.
Materiales
Curso:
• Caldo nutritivo sembrado con Staphylococcus aureus
• Caldo nutritivo sembrado con Escherichia coli
• 2 cajas de agar Mueller Hinton
• 2 escobillones
• 1 tubo de 13 x 100 con 2 mL de solución salina al 0.85%
• Discos de antibióticos (6 diferentes) para Gram positivos y Gram negativos
• Discos impregnados con antisépticos y desinfectantes:alcohol yodado al 10%, hipoclorito
de sodio 2%, mertiolate, jabón líquido al 50%, cristal violeta de Gram, formol 8%, fenol
5% y benzal 2%
• Colorantes de Gram
Estudiante:
• Pinzas
• Regla
Procedimiento
A. Siembra (Día 1)
- Seleccione una de las cepas bacterianas (cualquiera).
- Realice frotis y coloración de Gram para confirmar su comportamiento
- Tome con el asa colonias del microorganismo y prepare una suspensión en el tubo con
solución salina isotónica.
- Compare la turbidez de la bacteria que está preparando con la del tubo de referencia 0.5
de McFarland que equivale a 1 x 108 UCF/ ml. Con este fin trace una raya horizontal bien
marcada, sobre una hoja blanca, y coloque sobre ella simultáneamente los dos tubos, en
la cual la raya se debe observar con la misma nitidez en los dos tubos.
- Introduzca un escobillón estéril dentro de la emulsión bacteriana estandarizada y saque
el escobillón rotándolo contra las paredes del tubo para remover el exceso del inoculo.
- En condiciones de esterilidad y con el mechero encendido siembre masivamente la
suspensión en las 2 cajas de agar Mueller Hinton.
- En una de las cajas, coloque con las pinzas estériles los sensidiscos correspondientes a
los antibióticos. Ponga cinco discos en la periferia y uno en el
centro, con una distancia aproximada de 2 cm entre cada uno, para evitar que las
zonas de inhibición se superpongan. Haga una ligera presión sobre los antibióticos para
asegurar un contacto uniforme sobre el agar.
- Marque la caja con el nombre de la bacteria inoculada y la posición de los antibióticos.
Incube a 37°C durante 24 horas.
- En la otra caja, coloque con las pinzas estériles los sensidiscos correspondientes a los
antisépticos y desinfectantes. Realice también una ligera presión sobre ellos para
asegurar un contacto uniforme sobre el agar.
- Ponga siete discos en la periferia y uno en el centro, a una
distancia aproximada de 2 cm entre cada uno, para evitar que las zonas de inhibición se
superpongan.
- Marque la caja con el nombre de la bacteria inoculada y la posición de los antisépticos y
desinfectantes.
- Incube a 37°C durante 24 horas.
B. Lectura (Día 2)
De acuerdo a la acción ejercida por las sustancias químicas y los antibióticos sobre el
microorganismo en estudio, se pueden observar en caso de sensibilidad de la bacteria a la
sustancia, halos de inhibición del crecimiento alrededor de los sensidiscos. Para hablar de
sensibilidad en la actividad con antibióticos los halos deben medir como mínimo 18 mm de
diámetro a excepción de la ampicilina y la penicilina G que deben medir como mínimo 29 mm,
siempre es mejor consultar con las tablas de referencia para cada antibiótico. Cuando la bacteria
es resistente a la acción del antibiótico, los halos miden menos de 18 mm. y, en el caso de la
ampicilina y la penicilina G, menos de 29 mm.
En el caso de los antisépticos y desinfectantes no hay reglas generales. Sin embargo, entre
mayor sea el tamaño del halo, mayor es el efecto inhibitorio de la sustancia sobre el
microrganismo:
 Mida con una regla el diámetro de la zona de inhibición, de cada antibiótico. Para facilitar
la medición de los halos se debe colocar la caja sobre una superficie oscura y tener
buena iluminación. Figura 1.
 Compare la lectura con las medidas de la Tabla 1.
 Complete la Tabla 2 con los antibióticos usados en el laboratorio, su clasificación y su
mecanismo de acción.
Tabla 1. Medidas de los halos de inhibición de algunos antibióticos
Antibiótico Diámetro de la zona de inhibición (mm)

Cantidad en
Resistente Intermedia Sensible
el disco
Ampicilina 10 ug 11 o menos 12-13 14 o más
Ampicilina 10 ug 28 o menos 29 o más
para S. aureus
Gentamicina 10 ug 12 o menos 13-14 15 o más
Kanamicina 30 ug 13 o menos 14-17 18 o más
Penicilina G 10 unidades 11 o menos 12-21 22 o más
Penicilina G 10 unidades 28 o menos 29 o más
para S. aureus
Estreptomicina 10 ug 1 1 o menos 12- 14 15 o más
Clindamicina 2 ug 14 o menos 15-16 17 o más

Cloranfenicol 30 ug 12 o menos 13-17 18 o más
Tabla 2. Clasifícación de los antibióticos usados en el laboratorio
Nombre del Clasificación Mecanismos de acción

antibiótico

Guias de Laboratorio y Prelaboratorios - II-2019

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PRIMERA SEMANA DEL CURSO

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA

Materiales que el estudiante debe tener para trabajar en el laboratorio

o 1 lonchera para guardar el material

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA

Normas de bioseguridad en el laboratorio

Para trabajar en el laboratorio de Bacteriología General es imprescindible el conocimiento previo

El Departamento de Microbiología ha establecido normas generales y específicas para cumplir

Desarrollo del tema

 ¿Para qué se hace un manual de bioseguridad?

 ¿Que significa el código de prácticas ?

 ¿El personal que labora en el laboratorio necesita capacitación? ¿Cuál?

 ¿Qué es el autoclave? ¿Para que se utiliza?

 ¿Dibuje, describa y compare las cabinas de seguridad I, II, III

 ¿Cuáles son las principales causas de accidentes en el laboratorio?

 ¿Cómo se deben usar las pipetas ?

 ¿Para que se usa el hipoclorito de sodio y a que concentración?

 ¿Qué se debe hacer cuando se rompe un recipiente con sustancias infecciosas?

 ¿Qué técnicas se utilizan en el campo de la desinfección y esterilización?

 Defina los siguientes términos: antimicrobiano, antiséptico, desinfectante.

 ¿Cuándo se debe hacer el lavado y descontaminación de las manos?

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA

En los laboratorios destinados para trabajos con muestras biológicas, microorganismos,

Es necesario identificar los factores de riesgo físico, químico, biológico y de seguridad en el

Teniendo en cuenta la patogenicidad de los microorganismos presentes en las muestras

En el nivel 1: Ningún riesgo o riesgo moderado para el individuo y la comunidad.

En el nivel 2: Riesgo individual moderado, bajo riesgo para la comunidad.

En el nivel 3: Riesgo individual y bajo para la comunidad.

En el nivel 4: Alto riesgo individual y alto riesgo para la comunidad.

Normas de bioseguridad para el primer nivel. (Laboratorios de docencia e investigación

En este nivel se cumplirán las siguientes normas:

o Utilizar prendas de vestir y zapatos adecuados y cómodos (uniforme para estudiantes de

o Al trabajar con microrganismos se debe tener la puerta del Laboratorio cerrada.

o No consumir alimentos o bebidas, masticar chicle, ni fumar.

o Mantener las uñas cortas y sin esmalte.

o No poner ningún elemento de trabajo en contacto con el cuerpo.

o Descartar los desechos generados durante la práctica de laboratorio en los recipientes

o El material contaminado se debe descartar en bolsa roja o recipientes con hipoclorito de

o Los elementos cortopunzantes deben descartarse en el guardián rojo.

o No transitar con la bata de laboratorio en áreas no apropiadas (cafeterías, baños, salones

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA

Prelaboratorio 1- Microscopio óptico

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERÍANA

Prelaboratorio 2: Coloración de estructuras

 Realice un dibujo de bacterias teñidas con colorantes de Grarn.

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA

Laboratorio 2. Parte A: Coloraciones simples

o Muestras de agua de charco o de florero

2. Elaboración del frotis

a. A partir de medio sólido

b. A partir de medio líquido

c. A partir de muestra de placa dental

d. Fijación del frotis con calor

5. Montaje del microscopio

Si va a enfocar en objetivo de 10X:

o Coloque el objetivo correspondiente (10X) y enfoque con el macrométrico hasta obtener

Si va a enfocar en objetivo de 40X;

Si va a enfocar en objetivo de 100X;