UNIVERSIDAD NACIONAL DE SAN

AGUSTÍN DE AREQUIPA
FACULTAD DE INGENIERÍA DE PROCESOS

ESCUELA PROFESIONAL DE INGENIERÍA

QUÍMICA

GUÍA DE PRÁCTICA
BIOQUÍMICA APLICADA

AUTORES:
Dr. Ing. Raúl Omar Gallegos Jara
Ing. Marcia Juana Quequezana Bedregal
Ing. Karina Moran Medina

AREQUIPA – PERÚ
2014
 PROLOGO

Se ha desarrollado la presente Guía de Práctica con el objeto de hacer llegar al

interesado los alcances actuales de la bioquímica aplicada en el laboratorio.

Los agigantados pasos del avance del conocimiento humano tienen como base el
desarrollo de la biología molecular, lo que a su vez ha generado el desarrollo de la
bioquímica como consecuencia natural.

La aplicación de los nuevos conocimientos de la bioquímica han determinado el

gran impulso que la bioquímica aplicada ha dado a la nueva tecnología de los
bioprocesos.

Todos los avances de la biotecnología tienen como sustento el conocimiento

previo de la biología y de la bioquímica aplicada.

La presente Guía de Prácticas brinda a los estudiantes de Ingeniería Química las

destrezas básicas para el empleo de los diferentes instrumentos requeridos para el
estudio práctico de la bioquímica.

Los Autores

ÍNDICE

PROLOGO

ÍNDICE

Págs.
PRÁCTICA 1 SEPARACIÓN EN CAPA FINA DE UNA MEZCLA DE AMINOÁCIDOS................3

PRÁCTICA 2 DETERMINACIÓN DE LAS PROPIEDADES QUÍMICAS DE LAS

PROTEÍNAS...................................................................................................................11

PRÁCTICA 3 DETERMINACIÓN ESPECTROFOTOMÉTRICA DE PROTEÍNAS........................18

PRÁCTICA 4 CONCENTRACIÓN DE EXTRACTOS PROTEICOS POR DIÁLISIS.......................25

PRÁCTICA 5 DETERMINACIÓN DE PROTEÍNAS POR MICRO-KJELDAHL..............................29

PRÁCTICA 6 REACCIONES DE IDENTIFICACIÓN DE CARBOHIDRATOS...............................34

PRÁCTICA 7 METABOLISMO DE CARBOHIDRATOS: FERMENTACIÓN.................................40

PRÁCTICA. 8 INMOBILIZACION DE ENZIMAS Y CELULAS. PRODUCCION DE

ETANOL POR SACCHAROMYCES cerevisiae INMOVILIZADA............................44

PRÁCTICA 9 EXTRACCIÓN DE ENZIMAS VEGETALES..............................................................48

PRACTICA 10 DETERMINACIÓN DE ACTIVIDAD ENZIMATICA EN UREASA.........................53

PRACTICA 11 CINETICA ENZIMATICA EN UREASA.....................................................................59

PRACTICA 12 EXTRACCION DE ADN DE HIGADO DE POLLO....................................................66

INSTRUCCIONES GENERALES

A. Busca los conceptos antecedentes y repórtalos, previo a la realización de

la práctica.

B. Construye la hipótesis de trabajo, antes de solicitar el material.

C. Lee cuidadosamente los experimentos antes de ejecutarlos.

2
 D. Recurre a tus libros de texto y/o de consulta para aclarar dudas y
comprender el porq ué de las operaciones que se han efectuado; o consulta
de inmediato al profesor responsable.

E. Realiza cuidadosamente tus experimentos, procurando entender el

porq ué de los hechos acaecidos.
F. Al efectuar cada uno de los pasos del desarrollo experimental, observa
minuciosamente y anota los cambios ocurridos: (olor, color, gases,
liberación o absorción de calor, etc.), en tu manual o cuaderno.

G. Al concluir el desarrollo experimental, resuelve el cuestionario para su

futura revisión.

H. Elabora tus conclusiones.

Material necesario para trabajar por alumno:

a) Individualmente: U n a bata de trabajo con manga larga.

b) Por equipo: Una cinta masking-tape de 1/2 pulgada, un paquete de
toallas de papel, un marcador indeleble, un lienzo para limpiar la mesa.

3
PRECAUCIONES EN EL DESARROLLO DE CADA EXPERIMENTO

Las medidas oportunas y la comprensión de las prácticas a seguir, hará del

laboratorio un lugar seguro como cualquier salón de clases. Para ello deberán
tenerse en cuenta, en forma general, las siguientes precauciones:

1. Observa dónde dejas el material caliente, cerciorándote de que esté frío

antes de tomarlo con la mano.

2. Cuando calientes un tubo de ensaye, no lo apuntes hacia ti o hacia tus

compañeros, puede proyectarse su contenido.

3. Si cae sobre ti o en tu ropa un material corrosivo, lávate inmediatamente con

agua abundante y llama a tu instructor.

4. Nunca pruebes una sustancia si no se te indica. Puede ser veneno.

5. Al detectar el olor de un líquido, no pongas la cara sobre la boca del

recipiente. Con tu mano abanica hacia ti el aroma.

6. Antes de usar un reactivo, lee dos veces la etiqueta para estar seguro de
su contenido.

7. Los aparatos o recipientes en los que haya desprendimientos gaseosos

no deben cerrarse herméticamente, pues las presiones formadas en su
interior pueden explotarlo.

8. Los tubos de ensaye no deben calentarse por el fondo sino por las paredes,
para evitar la expulsión de su contenido.
9. No arrojes cuerpos sólidos en los lavabos, a menos que estén
pulverizados y sean fácilmente arrastrables o solubles en agua. No viertas
directamente los ácidos en los lavabos, ya que los corroe.

10. Cuando interrumpas un experimento, coloca etiquetas con leyendas

apropiadas a los frascos y matraces que contengan sustancias, así te será
fácil identificarlos.

11. Cuando trabajes con fuego, mantén tu cabello recogido para evitar se
incendie.

12. Cuando necesites encender el mechero, nunca lo hagas con un papel,

puede iniciar un incendio.

4
El profesor indicará el uso adecuado y la ubicación de las instalaciones de
agua, luz, drenaje, gas, y otras que existen en el labora- torio. Se recomienda
que los alumnos realicen un croquis de dichas instalaciones y practiquen
simulacros de evacuación del edificio.

REGLAMENTO INTERNO DE LABORATORIO

1. Tendrán derecho al acceso y uso de laboratorio únicamente los alumnos que

están matriculados en el curso respectivo o las personas debida- mente
autorizadas por la Dirección.

2. Los alumnos respetarán durante todo el período de prácticas el horario

que tengan asignado.

3. Los alumnos se presentarán a la práctica en su horario asignado acompañados

de su profesor.

4. En las prácticas de la primera hora (7:00 a.m.), habrá una tolerancia máxima de
15 minutos para ingresar al laboratorio.

5. A partir de las 8:00 a.m., el alumno tendrá 10 minutos de tolerancia para

presentarse al laboratorio.

6. No se permitirá la entrada al laboratorio si el alumno no se presenta con su

bata.

7. En ningún caso el alumno podrá sustraer del laboratorio, aparatos o materiales

sin la autorización respectiva por escrito.

8. Es obligación de los alumnos conservar en buen estado las instalaciones,

materiales y equipo del laboratorio, así como mantenerlo aseado, depositando la
basura en los cestos que para tal efecto existen.

9. El material y equipo de laboratorio recibido deberá ser revisado de inmediato

y reportar cualquier anomalía o desperfecto al responsable de laboratorio.

10. Es obligación del alumno entregar al responsable de laboratorio el material y

equipo usado, limpio y en buen estado, 5 minutos antes del término de la
sesión de práctica

11. El material o equipo que se deteriore o se pierda será repuesto por los
responsables en un plazo no mayor de 5 días hábiles, de lo contrario se perderá el
derecho de uso de laboratorio.

5
12. Sin excepción de persona, está prohibido fumar e ingerir alimentos y bebidas
en el interior del laboratorio.

13. Las prácticas realizadas y reportadas en un curso no son transferibles a otros

alumnos.

14. Si por causas de fuerza mayor se suspendiera alguna práctica programada en el

curso, ésta se realizará en la sesión inmediata sin perjuicio para el alumno.

15. Las prácticas se evaluarán de acuerdo al criterio del profesor de cada

asignatura.

16. Los alumnos que muestren indisciplina dentro del laboratorio serán
sancionados de acuerdo a la gravedad de su falta ya que este tipo de conducta
puede originar un accidente.

6
 PRÁCTICA 1
PRÁCTICA 1

SEPARACIÓN EN CAPA FINA

SEPARACIÓN EN CAPA FINA
DEUNA
DE UNAMEZCLA
MEZCLADE
DEAMINOÁCIDOS
AMINOÁCIDOS

7
I. OBJETIVO:
Aplicar la técnica de cromatografía en capa fina para la identificación de
aminoácidos presentes en una muestra biológica.

II. FUNDAMENTO TEÓRICO:

AMINOÁCIDOS
Los aminoácidos son las unidades estructurales de las proteínas.
Por lo tanto, si a una determinada proteína se le somete a una hidrólisis ya sea ácida o
alcalina; éste proceso rendirá una mezcla de sus aminoácidos constituyentes, los
cuales pueden ser susceptibles de ser analizados o identificados por métodos
cromatográficos.
 Todas las proteínas son polímeros y los monómeros que se cambian para
formarlos son los a -aminoácidos.

 Los diferentes aminoácidos se diferencian por sus cadenas laterales.

 In vivo el pH fisiológico es próximo a la neutralidad.
 El pKa de los grupos carboxílo y amino de los alfa -aminoácidos es
aproximadamente 2 y 10 respectivamente.
 Por lo tanto, en la proximidad del pH neutro, el grupo carboxilato habrá
perdido un protón y el grupo amino habrá captado un protón para dar la
forma ZWITTERION.
 En los genes, de todos los organismos están codificados 20 aminoácidos
que se incorporan a las proteínas.
 Todos los aminoácidos son enantiómeros (L)
 Existen otros aminoácidos (no proteicos) y también hay aminoácidos
modificados que se hallan en las proteínas.
 La variedad de las cadenas laterales (hidrofílicas, hidrófobas, ácidas,
básicas, neutras) permite una gran complejidad funcional en las
proteínas.
CROMATOGRAFÍA
Método de Separación

8
  Permite separar, aislar e identificar componentes estrechamente
relacionados presentes en mezclas complejas.
 En estos métodos se emplea:
- Fase estacionaria : Sólido/líquido
- Fase móvil : liquido/gas
 “Los componentes de una mezcla se transportan a través de una fase
estacionaria por medio de una fase móvil que fluye”.
 Las separaciones se basan en las diferencias de velocidad de migración
entre los componentes de la muestra.
Cromatografía en Capa Fina
 Tiene 2 partes: Fase móvil y Fase estacionaria.
 El soporte o Fase Estacionaria.
Es un sólido poroso capaz de retener solvente y sólido pueden ser.

El soporte poroso está adherido a la base, está pegado gracias a la presencia de

SO4Ca que ayuda a pagar el soporte.
En las leyendas de las placas de sílica se encuentran como:

El ZnS bajo luz UV la placa de silica gel se torna verde y si hay alguna marcha de
la migración de muestra o estándares esta marcha ya no es verde sino violeta.

III. PROCEDIMIENTO:
Primer Proceso: Sembrado de la muestra
 Se siembra los estándares y la muestra con un capilar bastante fino.
 Tener precaución de que en el sembrado se intenta tener una mancha
entre 1 y 2 mm de diámetro.

9
 La distancia entre las siembras puede ser no menor de 6-7mm
aproximadamente.

Segundo Proceso: Elusión

 Una vez sembrada la muestra se procede a la fase móvil con la ayuda de
un solvente de elusión.
 Para ello se coloca dentro de una cámara de elusión

“El solvente debe estar por debajo del sembrado de la muestra”.

 El solvente comienza a subir por capilaridad.
 Las muestras se comportan diferente según el solvente utilizado y sus
componentes algunos migrarán rápidamente otros no.

Tercer Proceso: Visualización o Revelado

El producto puede verse:
 Por sí mismo porque tiene color.
 Por incidencia de UV (254 nm/365 nm) porque no se ve a simple vista.
 Utilizando vapores de iodo, el iodo se impregna dónde está la mancha dando
coloraciones amarillas profundas.
 Usando métodos químicos, usando una sustancia química como revelado, ( en este
caso ninhidrina en butanol)

10
 Cuarto Proceso: Reporte de los Resultados

Se describe la trayectoria de un soluto particular en función de su factor de retardo R F

que se define como:

La distancia recorrida por un soluto se compara frecuentemente con la de una

sustancia patrón en idénticas condiciones.
“La razón de estas distancias se designa por Rf”

IV. PARTE EXPERIMENTAL:

 Sembrado de estándares de aminoácidos y muestras
 Corrida cromatográfica. Elusión
Mezcla solvente entre fenol: agua (75:25)
Tapar herméticamente y dejar que proceda el desarrollo de la separación
cromatográfica, hasta que el solvente haya alcanzado el frente trazado en la parte
superior de la placa.
 Revelado del cromatograma
- Una vez que haya alcanzado el frente del solvente.
- Destapar la cámara y retirar con cuidado la placa de vidrio. - Secar la placa
con ayuda de una secadora de cabello.

11
 - Con la ayuda de un spray aplicar Ninhidrina 0.1% en butanol sobre la placa.
Secar la placa con una secadora.
 Identificación
Luego proceder a identificar las manchas existentes que deberán corresponder a
aminoácidos para ello se deberán hacer los cálculos de los Rfde los estándares y
luego los Rf correspondientes a las manchas de las muestras.
Rx. Ninhidrina es la reacción que identifica aminoácidos a través de una
coloración azul violeta.

V. CUESTIONARIO:
5.1. Haga un esquema de los resultados observados.

5.2. Calcular los Rf de los estándares y muestras.

5.3. Identificar que aminoácidos están presentes en las muestras problemas.

5.4.

12
5.5. Qué es la cromatografía de exclusión molecular y la cromatografía de
intercambio iónico y cuáles son sus aplicaciones.
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
______________

5.6. Qué métodos existen para el análisis de aminoácidos de las proteínas.

_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________

5.7. Indicar tipos de solventes de elusión para la fase móvil tanto para silica y
alúmina.
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________

5.8. Haga el mecanismo de reacción de la Ninhidrina con los aminoácidos.

5.9. La cromatografía en capa fina separa las sustancias según su peso molecular.?
Fundamente.
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________

13
VI. OBSERVACIONES

____________________________________________________________________
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________

VII. CONCLUSIONES

____________________________________________________________________
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________

VIII. BIBLIOGRAFÍA

____________________________________________________________________
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________

14
 PRÁCTICA 2

PRÁCTICA 2

DETERMINACIÓN
DETERMINACIÓN DE LAS QUÍMICAS
DE LAS PROPIEDADES PROPIEDADES
DE LAS
PROTEÍNAS
QUÍMICAS DE LAS PROTEÍNAS

15
I. OBJETIVOS:
Al término de esta práctica, el alumno será capaz de describir y demostrar de manera
cualitativa las propiedades químicas de las proteínas en base a los siguientes
aspectos:
Solubilidad de las proteínas.
Las propiedades electroquímicas de las proteínas.
El efecto ácido-básico en la solubilidad de las proteínas.

II. PRERREQUISITOS:
1. Salting In y Salting Out.
2. Agentes precipitantes de proteínas.
3. Propiedades fisicoquímicas del agua.
4. Ecuación de Henderson-Hasselbach.

III. INTRODUCCIÓN:
Se considera a las proteínas como polímeros biológicos de aminoácidos. En las
proteínas existen 20 tipos de aminoácidos diferentes los cuales están en un número y
secuencia determinados por el código genético.
Con respecto a su tamaño, las proteínas van desde un peso molecular de 6000 Dalton
hasta varios millones de Dalton con una considerable variación de formas y
estructuras. Para su estudio se consideran cuatro niveles de complejidad estructural;
siendo la más simple la estructura primaria y la más compleja la estructura
cuaternaria cuya conformación depende de diferentes fuerzas químicas de atracción y
repulsión que son ejercidas sobre la estructura molecular de la proteína y por lo tanto
son responsables de su estabilidad.
Por convención se acepta dividir a las proteínas en dos grupos: proteínas simples y
conjugadas, las cuales presentan diferencias en sus propiedades químicas y físicas.
Sin embargo, para los fines que se persiguen en esta práctica se les mencionara en
forma general.
Los factores que pueden afectar la solubilidad de una proteína son: La fuerza iónica
del medio, el pH. la temperatura y la constante dieléctrica del solvente. Cuando hay
un cambio de cualquiera de estos factores, la proteína responde con una intensidad
proporcional al cambio, esto es, que puede afectar la estructura proteica de una
manera superficial o lo hace tan drásticamente que desnaturaliza a la proteína. Por
fortuna, en nuestro organismo, la variación de tales factores es mínima por lo que son
imperceptibles los cambios en la proteína.

16
IV. MATERIAL:
13 tubos de ensaye de 10 X 150 mm
1 pipeta de 10 ml
5 pipetas de 5 ml
1 pipeta de 5 ml
1 gradilla

V. METODOLOGÍA:
En esta práctica se trata de provocar cambios de solubilidad en proteínas que se
encuentran en el organismo, mediante la modificación las propiedades de los
solventes, para establecer una relación con los efectos que se pueden presentar en el
organismo.
Fundamento Químico:
Las proteínas poseen cargas positivas y negativas dependiendo del pH de la
solución en la cual se encuentran; cuando se neutralizan, se presenta precipitación
proteica.
La adición de una sal a una solución proteica modifica la constante dieléctrica del
solvente permitiendo una mayor solubilidad de la proteína. Sin embargo, cuando se
añade exceso de una sal, se neutralizan las cargas de la proteína y ésta tiende a
precipitar. Este mismo efecto ocurre al añadir sales metálicas cargadas
electropositivamente. Con la adición de un ácido o una base a una solución proteica
se alcanza un estado en que hay el mismo número de aniones que de cationes. Este
efecto, neutraliza la carga de la proteína y tiende a precipitar. El pH que determina el
número igual de cargas de signos opuestos se denomina punto isoeléctrico.

Experimento No. 1
Determinación del punto Isoeléctrico de la caseína por adición de un ácido.
Preparar una solución de caseinato de sodio, tomando 250 mg de caseína, 20 ml de agua
destilada y 5 ml de NaOH 1N. Cuando la solución sea perfecta, se agregan 5 ml de
ácido acético 1 N. Mezclar bien, diluir a 50 ml con agua destilada. Si la solución no
está suficientemente clara, se puede filtrar.
• Preparar los siguientes tubos como se indica a continuación

Tubo pH Agua Ac. Acético Ac. Ac. Acético Caseinat

destilada 0.01N Acético 0.1 1.0N o de
Sodio
1 8.38 0.62 0 0 1.0
2 7.75 1.25 0 0 1.0
3 8.75 0 0.25 0 1.0
4 8.5 0 0.5 0 1.0
5 8.0 0 1.0 0 1.0
6 7.0 0 2.0 0 1.0
7 5.0 0 4.0 0 1.0
8 1.0 0 8.0 0 1.0
9 7.4 0 0 1.6 1.0

17
 10 5.8 0 0 3.2 1.0

Mezclar bien , esperar 30 minutos y observar los cambios que presente la

solubilidad de la caseína en cada tubo. Reportar el punto isoeléctrico
correspondiente al tubo donde se presenta la mayor precipitación.
Calcular el pH de cada tubo utilizando la ecuación de Hendersosn-Hasselbach.
Experimento No. 1
Determinación del punto Isoeléctrico de la caseína por adición de un ácido.
Tubo pH Solubilidad

1
2
3
4
5
6
7
8
9

Cuál es el punto isoeléctrico de la proteína ?

____________________________________________________________________

VI. CUESTIONARIO:
6.1. De qué factores depende la solubilidad de una proteína en el agua.
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________

6.2. Explique en términos fisicoquímicos el efecto que provoca la adición de un

ácido o una base fuerte.
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________

18
6.3. Explique cómo afecta un cambio en la constante dieléctrica del agua a la
solubilidad de una proteína.
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________

6.4. Qué es el Salting in y qué tipo de compuestos pueden promoverlo.

_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________

6.5. Qué es el Saltingout y qué tipo de compuestos pueden promoverlo.

_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________

6.6. Qué relación existe entre el punto isoeléctrico y la solubilidad de una proteína.
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________

6.7. Qué es la ecuación de Henderson-Hasselbach y en que casos está indicado

utilizarse.
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________

19
 6.8. Mencione que propiedades fisicoquímicas de la albúmina le permiten
interaccionar y transportar cualquier compuesto incluyendo hidrofóbicos a
través de un medio acuoso.
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________

VII. OBSERVACIONES
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________
______________________________________________________

VIII. CONCLUSIONES
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________

20
 ____________________________________________________________________
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________

IX. BIBLIOGRAFÍA
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________

21
 PRÁCTICA 3

DETERMINACIÓN
PRÁCTICA 3
ESPECTROFOTOMÉTRICA DE PROTEÍNAS
DETERMINACIÓN ESPECTROFOTOMÉTRICA DE PROTEÍNAS

22
I. OBJETIVO
Determinar la concentración de una solución de proteínas mediante la reacción
de Biuret y el espectrofotómetro.

II. FUNDAMENTO:

La presencia de proteínas en una mezcla se puede determinar mediante la

reacción del Biuret. El reactivo Biuret contiene CuSO4 en solución alcalina. La
reacción se basa en la formación de un compuesto de color violeta, debido a la
formación de un complejo de coordinación entre los iones Cu (+2) y los pares
de electrones no compartidos del nitrógeno que forma parte de los enlaces
peptídicos.

Los compuestos que contienen 2 o más enlaces peptídicos producen un color

violeta
característico con soluciones diluidas de sulfato de cobre (CuSO4) en solución
alcalina.
El color se debe al compuesto de coordinación formado al existir enlaces
químicos entre los pares de electrones libres del átomo de nitrógeno presente en
los enlaces peptídicos de las cadenas proteicas con el ion cobre.

Los espectros de absorción de los complejos entre los iones de Cu+2 y las
diferentes proteínas son similares pero no idénticas por lo tanto, se puede
utilizar una proteína como patrón de calibración. La curva de calibración
obtenida por este método, se hará utilizando como patrón solución de extracto
de levadura, cuya concentración es de 8 mg/ml preparada con agua destilada.

Espectrofotometría. Principios básicos

La reacción de biuret es cuantificable, es decir a mayor concentración de
proteínas, mayor intensidad de color violeta, estas reacciones en las que el color

23
formado es proporcional a la cantidad de sustancia se llaman reacciones
colorimétricas.

Midiendo la intensidad de color se podría conocer la concentración de la

sustancia que lo produce. Para ello se aplican técnicas fotométricas, empleando
un aparato llamado colorímetro (si mide sólo un determinado color) o
espectrofotómetro (si realiza una medida de todo el espectro de colores).
La luz es parte de la radiación electromagnética, que se propaga de forma
ondulatoria. Las distintas radiaciones luminosas se diferencian unas de otras por
sus longitudes de onda que se mide en nm. La luz visible engloba las
radiaciones comprendidas entre 380-750 nm, que corresponden a los colores
del arcoíris, de tal forma que cada color corresponde a una radiación con una
longitud de onda específica. El espectrofotómetro dispone de una lámpara que
emite luz monocromática, de una longitud de onda determinada, que incide y
atraviesa la muestra coloreada a medir, y de un detector, que medirá la cantidad
de luz que no es absorbida por la muestra. Para cada sustancia determinada, se
utilizará la radiación de longitud de onda a la que absorba más cantidad de luz
( a la longitud de onda de máxima absorbancia).

Su funcionamiento se basa en la ley de Beer-Lambert: la fracción de luz

incidente que es absorbida por una solución es proporcional a la concentración
de soluto y al espesor de la sustancia atravesada por la luz. La relación entre luz
incidente (Io) y la reflejada (I) dará una idea de la cantidad de radiación que ha
sido absdorbida por la muestra. Esto es lo que se denomina Absorbancia
(Abs)óDensidaOptica (DO)

Laley de Beer-Lambert se formula como:

Abs (DO) =e x C x 1

Siendo e el coeficiente de extinción molar (específico para cada sustancia a una

longitud de onda y en unas condiciones determinadas (M-1, cm-1), C es la
concentración de la muestra a medir (M), 1 el espesor de la muestra. La mayoría
de los espectrofotómetros utilizan cubetas para la muestra de 1 cm de espesor,
por lo que 1 se puede ignorar. Así la concentración desconocida de la sustancia
será:

C = Abs /e

24
III. MATERIALES Y EQUIPO
 Espectrofotómetro
 Gradilla para tubos de ensayo
 Tubos de ensayo
 Vasos de precipitado
 Probetas, Pipetas
 Materiales: extracto de levadura, reactivo biuret

IV. PROCEDIMIENTO

Realización de una curva patrón: Como se desconoce el coeficiente de extinción

molar (€) de las proteínas coloreadas con el reactivo biuret, se procederá a construir
una curva patrón, midiendo la absorbancia de soluciones con concentraciones
conocidas de proteína, para sobre ella interpolar el valor de Abs de la solución
problema y determinar su concentración gráficamente y también por regresión
lineal. Para ello se dispone de una solución de 10 mg/ml de proteína (extracto de
levadura) a partir de ella se realizan diluciones conocidas aplicando la fórmula:

Ci x Vi = Cf x Vf

Dónde:

Ci = concentración de la solución madre inicial

Vi = volumen a tomar de la solución madre inicial

Cf= concentración final de la solución a preparar

Vf= volumen total final de la solución a preparar

En 8 tubos de ensayo se preparan, a partir de la solución madre (Ci=10 mg/ml) las

soluciones de la tabla.

25
 Conc. Final. Volumen Volume Volumen Volume Abs.
Sol. a Sol. n agua Rx. n Final 570nm
preparar Madre Biuret
inicial

Tubo Mg/ml ml ml ml ml

Blanco 0 0,0 4,0 4 8

1 0,5 3,5 4 8

2 1,0 3,0 4 8

3 1,5 2,5 4 8

4 2,0 2,0 4 8

5 2,5 1,5 4 8

6 3,0 1,0 4 8

7 3,5 0,5 4 8

8 4,0 0,0 4 8

Muestr 4,0 0,0 4 8

a

Al añadir el reactivo biuret dejar reposar 10 minutos y leer la absorbancia.

Medición de la absorbancia en el espectrofotómetro:
a) Seleccionar la longitud de onda, 570 nm ( longitud de máxima absorbancia para
la reacción del biuret)
b) Poner en la cubeta del espectrofotómetro el contenido del tubo blanco, secarla y
limpiarla bien por fuera e introducirla en el espectrofotómetro.
c) Ajustar la lectura a 100 de transmitancia y 0 de absorbancia.
d) Se devuelve el contenido al tubo original y se mide la absorbancia de las
soluciones de los otros tubos, comenzando por el de menor concentración.
e) Limpiar con agua la cubeta, secarla por fuera y medir la Abs del tubo muestra.
f) Con las medidas obtenidas de los tubos 1 al 8 y el blanco (Abs=0), se construye
una recta en papel milimetrado, representando las concentraciones en el eje de
abscisas y las Abs. en las ordenadas.
g) Interpolar la Abs de la proteína problema en la gráfica y calcular su
concentración.
h) Considerando que la absorbancia es directamente proporcional a la
concentración y que la relación es lineal: Y = a + b X (Y = A + B x
Conc.). Utilizando regresión lineal se obtiene el valor de los coeficientes A y B
y se puede despejar concentración que en este caso es de la muestra
desconocida.

26
27
V. CUESTIONARIO
5.1 ¿Cuál es la concentración de proteínas de la muestra?

5.2 ¿Se podría determinar la concentración de cualquier muestra de proteínas con

esta curva patrón?

5.3 ¿Los aminoácidos y los dipéptidos darían positiva la reacción del Biuret?

5.4 Investigue si existe alguna proteína en la que no esté presente ninguna

aminoácido con anillo bencénico en su cadena lateral, e indique que
consecuencias tendría sobre la determinación espectrofotométrica

28
VI. OBSERVACIONES
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
_____________________________________________

VII. CONCLUSIONES
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
_____________________

VIII. BIBLIOGRAFÍA
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________

29
30
 PRÁCTICA 4
PRÁCTICA 4

CONCENTRACIÓN DE EXTRACTOS PROTEICOS POR

CONCENTRACIÓNDIÁLISIS DE EXTRACTOS

PROTEICOS POR DIÁLISIS

31
I. OBJETIVO
Aumentar la concentración de las proteínas en un extracto o solución que las
contenga.

II. FUNDAMENTO
La diálisis es una técnica que separa las moléculas de acuerdo a su tamaño usando
membranas semipermeables que contienen poros de dimensiones menores que las
macromoléculas que se deseen separar como las proteínas, los poros permiten la
difusión de las moléculas de solventes, sales y otras moléculas pequeñas, pero
bloquean el paso de proteínas por su gran tamaño.
Se usan membranas de celofán (acetato de celulosa), nitrocelulosa, colodión, u otras
de naturaleza semipermeable.
Los mecanismos de transporte son: osmosis, y difusión por diferencia de
concentración.

III. MATERIALES Y EQUIPOS

 01 pliego de papel celofán.
 1Kg de azúcar.
 Solución de extracto proteico al 0.5%.
 Pipeta de 10 ml.
 Vaso de precipitados.
 Piceta.

IV. MÉTODO
 Preparar una bolsa con el papel celofán, de modo que no se presenten fugas al
llenarla con una solución.
 Preparar en el vaso de precipitados 50 ml de una solución de proteína al 0.5%.
 Comprobar la concentración de proteína con el espectrofotómetro a 280 nm.
 Llenar la bolsa de celofán con 50 ml de solución proteica, usando para tal fin la
pipeta de 10 ml., y sellar luego la bolsa de modo que no presente fugas.
 Preparar un tazón con azúcar, y colocar allí la bolsa de celofán conteniendo la
solución proteica.
 Untar toda la bolsa de celofán, con el azúcar, cubriéndola por completo.
 Esperar 15 a 30 min y retirar la bolsa del azúcar, observando los cambios
ocurridos.
 Medir el volumen de líquido que quedó en la bolsa de celofán y comparar con
el volumen inicial.
 Mediar nuevamente la concentración de proteínas en el espectrofotómetro a 280
nm.

32
V. CUESTIONARIO
Señale las principales técnicas de separación de solutos por membrana, y las
principales aplicaciones de cada una de ellas.
______________________________________________________________
______________________________________________________________
______________________________________________________________
______________________________________________________________
____________

Investigue la composición química de la membrana utilizada y explicar las

razones de su porosidad.
______________________________________________________________
______________________________________________________________
______________________________________________________________
______________________________________________________________
____________

Efectúe los cálculos de variación en el volumen y la concentración de la

proteína en solución.

Indique el principio y la ecuación básica del transporte de solventes por

osmosis.
______________________________________________________________
______________________________________________________________
______________________________________________________________
______________________________________________________________
______________________________________________________________

Indique el principio y la ecuación básica del transporte de solutos por difusión

debida a diferencias de concentración.
______________________________________________________________
______________________________________________________________
______________________________________________________________

VI. OBSERVACIONES

33
 ___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
_____________________________________________

VII. CONCLUSIONES
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
_____________________

VIII. BIBLIOGRAFÍA
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________

34
 PRÁCTICA 5

DETERMINACIÓN DE PROTEÍNAS POR

PRÁCTICA 5
MICRO-KJELDAHL
DETERMINACIÓN DE PROTEÍNAS POR MICRO-KJELDAHL

35
I. OBJETIVO.
Determinar indirectamente el contenido de proteínas totales en una muestra
desconocida.

II. FUNDAMENTO
El método de micro-kjeldahl es una simplificación hecha por HACH en el proceso
Kjeldahl tradicional. Realizando el mismo análisis en un tiempo corto y con
pequeñas muestras.
Se funda en la transformación del nitrógeno presente en las proteínas a nitrógeno
inorgánico. Para ello se siguen tres etapas claramente diferenciadas
1. En la primera, se digiere el material por acción del ácido sulfúrico en presencia
de oxidantes fuertes (peróxido de hidrógeno), de esta manera todo el carbono
presente se libera como CO2 y nitrógeno como NH3, luego este se combina
con el exceso de ácido sulfúrico para dar sulfato de amonio.
2. En la segunda se destila el amonio, previamente liberado por la acción de un
álcali fuerte Na(OH), el amoniaco liberado se recibe en una solución de ácido
débil en presencia de colorante indicador.
3. En la tercera se titula la solución con un ácido fuerte cuantificando el nitrógeno
presente.
Luego se aplica la relación siguiente:
%N = ml.N.fc.meq.100
peso de muestra
dónde: ml.N.fc.meq = peso de nitrógeno en la muestra
ml = gasto de ácido sulfúrico en la titulación (ml)
N. normalidad del ácido
Fc. Factor de corrección del ácido
meq.= peso del miliequivalente del nitrógeno
Suponiendo que la muestra solo contiene proteínas simples con 16% de N, el
porcentaje de proteínas será:
Proteína = 6.25xN

III. PROCEDIMIENTO
El proceso de determinación se hace en tres etapas:

DIGESTIÓN.
 Medir 4 ml de muestra liquida (o 0.25 g si es sólido) y colocar en el
matraz de digestión
 Agregar 4 ml de ácido sulfúrico concentrado al matraz
 Verificar que el control automático del digestor este en 440ºC y que haya
succión en la columna de fraccionamiento.

36
  Digerir la muestra por 4 min después de haber alcanzado la temperatura
indicada.
 Añadir 10 ml de peróxido de hidrógeno al 50% a la muestra a través de un
embudo de la columna de fraccionamiento. Si el digesto no se torna
incoloro, añadir porciones adicionales de 5 ml hasta que el digesto se
aclare.
 Retirar el matraz del calentador y dejarlo enfriar. Quitar la columna de
fraccionamiento, y colocar el matraz sobre un bloque y tapar hasta que se
haya enfriado.
 Diluir el digesto con 50 ml de agua destilada.

DESTILACIÓN
 El digesto obtenido y diluido a 50 ml se traslada a un balón de destilación.
 Preparar un vaso de 100 ml que contenga 12.5 ml de ácido borrico al 4% (
en volumen) adicionándole indicador azul de metileno y rojo de metilo,
dando una coloración violeta.
 El balón de destilación que contiene el digesto se añade 13 a 15 ml de
hidróxido de sodio al 50% v/v y 2 a 3 granallas de zinc.
 Conectar el equipo de destilación y destilar el digesto durante unos 10 a
20 min (hasta que el vaso receptor tenga una coloración verdusca y su
volumen sea más o menos 3 veces del volumen inicial)

TITILACIÓN.
 Preparar una solución de ácido sulfúrico 0.1 N y valorizarla.
 Titular el contenido del matraz receptor hasta que vire de verde a violeta

IV. CUESTIONARIO
Explique la diferencia entre proteínas simples y conjugadas.
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
________

Indique ejemplos y estructuras primarias de dos proteínas simples y dos proteínas

conjugadas

Escriba las ecuaciones de las reacciones de cada una de las etapas durante el
proceso de determinación del nitrógeno

37
 Efectué los cálculos y determine el contenido de proteínas en la muestra

Indique que tipo de enlaces de una proteína se rompen durante la etapa de digestión

Explique el objetivo de la etapa de destilación.

___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________

___________________________________________________________________

Explique porque la titilación se hace con ácido sulfúrico y no con un álcali.

___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________

___________________________________________________________________

V. OBSERVACIONES

___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________

38
 ___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________

VI. CONCLUSIONES

___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
__________________

VII. BIBLIOGRAFÍA

___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________

39
 PRÁCTICA 6
PRÁCTICA 6
REACCIONES DE IDENTIFICACIÓN DE
REACCIONES DE IDENTIFICACIÓN DE CARBOHIDRATOS
CARBOHIDRATOS

40
I. OBJETIVOS:
 Reconocer los principios inmediatos de los carbohidratos.
 Diferenciar experimentalmente monosacáridos, disacáridos y polisacáridos.
 Familiarizarse con la clasificación de los hidratos de carbono en reductores y no
reductores.
 Estudiar las propiedades del almidón.

II. FUNDAMENTO TEÓRICO:

Se denominan carbohidratos o glucósidos los derivados aldehídicos cetónicos,
reales o potenciales de alcoholes polivalentes o sus productos de condensación
según la cantidad de glucósidos o azúcares sencillos que se obtengan por hidrólisis
de los policarbohidratos.
Se les clasifica como:
Polisacáridos (celulosa, almidón)
Trisacáridos (rafinosa)
Disacáridos (sacarosa, lactosa, maltosa), y
Monosacáridos
Los monosacáridos por el grupo carbonilíco pueden ser aldosas o cetosas por el.
número de átomos de oxigeno, pueden ser hexoaas (glucosa, galactona, manosa,
fructosa), pentosa (arabinosa, xilosa, ribosa, lixosa), terrosas (treosa y eritrosa).
Los carbohidratos poseen algunas propiedades de las funciones carbonilo y
oxhidrilo y, además, algunas específicas. Todos son óptimamente activos. Por el
calor y la acción de ácidos fuertes se deshidratan, dando en algunos casos derivados
del furfural.
Los hidratos de carbono más abundantes de la biósfera están constituidos por el
almidón y celulosa que son polímeros de glucosa presentes en plantas.
El almidón está distribuido ampliamente en las plantas que lo almacenan en granos
y en tubérculos como reserva alimenticia para el momento de la germinación.
Todos los tipos de almidón producen un color azul con el yodo, lo cual sirve de
indicador cualitativo sensible, tanto para ensayar el yodo como el almidón.
La hidrólisis del almidón catalizada por ácidos lo convierte en varias clases de
dextrinas, en maltosa y por último en D (+) glucosa.
El ensayo con yodo se utiliza para seguir la marcha de la hidrólisis puesto que la
coloración va cambiando de azul a rojo a medida que decrece el peso molecular
delcompuesto orgánico.
Los grupos funcionales existentes en el almidón y en la celulosa son los grupos
hidroxilo y acetal. Estos polisacáridos tienen diferente configuración, siendo el
almidón un glucósido y la celulosa un f -glucósido. También difieren en el tamaño
teniendo lacelulosa un peso molecular medio mucho mayor que el del almidón.

III. MATERIALES Y REACTIVOS

 Reactivo Molisch  Tubos de ensayo
 Reactivo Fehling  Pipetas

41
  Reactivo Tollens  Baño de agua hirviente
 Reactivo Seliwanoff  Pinzas
 Reactivo Barfoed  Baño hirviente
 Sol. glucosa 1%  Vaso de precipitados
 Sol. fructuosa 1%  Luna de reloj
 Sol. sacarosa 1
 Sol. lactosa 1%
 Sol. almidón 1%
 Sol. sacarosa 5%
 Sol. HCl 10%
 Sol. NaOH 10%
 Sol. yodo - yodurado

IV. PROCEDIMIENTO:
Reacciones genéricas de los carbohidratos
 Reacción de Molisch
En 6 tubos de ensayo ponga respectivamente 1 ml. de una solución de glucosa
al1%, 1 ml. de solución de fructuosa o levulosa al 1%, 1 ml. de una solución de
sacarosa al 1%, 1 ml. de una solución de lactosa al 1%, 1 ml. de una solución
de almidón al 1% y en el último 1 ml. de agua (testigo). A cada una agréguele
2 gotas
de reactivo de Molisch; inclinando el tubo, deje resbalar por las paredes 2 ml.
de ácido sulfúrico concentrado.
Observe el color violáceo del anillo formado en la interfase entre los dos
líquidos. Anote aquellas soluciones que den positiva la prueba.
Reacciones Específicas
 Reacciones de Fehling
En 5 tubos de ensayo mezclar en cada uno 0.5 ml. de solución A de Fehling
con 0.5 ml. de la solución B de Fehling, agrégueles 1 ml. de la solución de los
carbohidratos utilizados en el experimento anterior.
Introducir los tubos en un baño hirviente, observe si hay cambios de color,
formación de precipitados.
 Reacción de Tollens
En 5 tubos de ensayo colocar a cada uno 1. ml. de Reactivo de Tollens
recientemente preparado, añadir a cada uno 2 ml. de las soluciones de
carbohidratos utilizados anteriormente.
Introducir los tubos en un baño hirviente, observe si hay formación de espejo
de plata y cuales carbohidratos dan negativa esta reacción.
Realice una comparación de estos resultados con los de la prueba de Fehling.

42
  Reacción de Seliwanoff
En 5 tubos de ensayo coloque 1 ml. del reactivo Seliwanoff, luego añada 3
gotas de solución de los carbohidratos utilizados anteriormente, luego lleve los
tubos a baño hirviente. Anote el tiempo en que se colorea cadaa tubo y el color
adquirido.
 Reacción de Barfoed
En 5 tubos de ensayo coloque 1 ml. del reactivo Bartoed luego añada 1 ml. de
solución de los carbohidratos utilizados anteriormente, luego llevar los tubos a
baño hirviente y observar la formación de un precipitado de color rojo ladrillo,
lo que indicará la presencia de monosacáridos.
Los disacáridos también precipitan óxido cuproso, pero muy lentamente.
 Hidrólisis de la Sacarosa
En 3 tubos de ensayo coloque 5 ml. de solución de sacarosa al 5%, llévelos a
baño hirviente y a cada tubo añada volúmenes iguales de agua para el primer
tubo, ácido clorhídrico al 10% en el segundo tubo, e hidróxido sódico acuoso al
10% en el tercero.
Calentar los tubos durante cinco minutos y ensaye a continuación la reacción
de una porción de cada mezcla con la solución de Fehling. ¿Qué conclusiones
deduce?
 Ensayo del Almidón frente al Iodo
En un tubo de ensayo coloque 6 ml de solución de almidón al 1%, añada una
gota de solución de Iodo - lodurada, observe el color de la solución. Luego
caliente la solución coloreada a ebullición y observe el efecto, observe también
qué efecto produce el enfriamiento de la solución.
 Hidrólisis del Almidón
En un vaso de precipitados coloque 50 ml de solución de almidón al 1%, añada
1 ml de ácido dorhídrico concentrado. Hierva la solución y retire muestras de Y
ml. a intervalos próximos, ensayando su reacción frente al iodo. Anote el color
en los diferentes ensayos.
Cuando la solución ya no produzca coloración con el iodo, neutralícela y
ensaye la reacción de una muestra frente al Fehling. Formule estructuralmente
los productos finales de la hidrólisis del almidón (un disacárido y un
monosacárido).

V. CUESTIONARIO:
5.1. Indique la composición de los reactivos utilizados en la práctica (R. Molish,
R. Seliwanoff, R Barfoed, R Fehling).

43
 5.2. Elabore un diagrama de flujos del proceso de producción de la glucosa a nivel
industrial.

5.3. ¿A qué se debe la coloración azul del iodo sobre las muestras de almidón?
______________________________________________________________
______________________________________________________________
______________________________________________________________
______________________________________________________________
____________

5.4. ¿Cómo se utiliza el ensayo del iodo para seguir la hidrólisis del almidón?
______________________________________________________________
______________________________________________________________
______________________________________________________________
______________________________________________________________
____________

VI. OBSERVACIONES
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________

44
 ___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________

VII. CONCLUSIONES
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
________________________

VIII. BIBLIOGRAFÍA
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
____________

45
 PRÁCTICA 7

METABOLISMO DE CARBOHIDRATOS:
PRÁCTICA 7
FERMENTACIÓN.
METABOLISMO DE CARBOHIDRATOS: FERMENTACIÓN.

46
I. OBJETIVOS
1) Observar experimentalmente los fenómenos de respiración celular anaeróbica
(fermentación) en levaduras.
2) Comprobar el efecto de inhibidores de la glicólisis y de la respiración celular.
3) Aplicar los conceptos de sustrato, inhibidores competitivos, inhibidores no
competitivos, oxido-reducción, modificación de pH e inhibidores en la
interpretación de sus resultados.

II. ACTIVIDADES
Fermentación alcohólica en levaduras (Saccharomycescerevisiae).
La fermentación alcohólica en levaduras ocurre de acuerdo a la reacción:
C6H12O6 2CO2 2 C2H5OH (etanol)
El etanol se acumula en el medio y el CO2 es liberado como gas, por lo que se
puede medir la fermentación por la producción de CO2.

III. PROCEDIMIENTOS.
3.1. Complete la siguiente batería de tubos:

Tubos 1 2 3 4
Suspensión de 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml
levadura 7%
Sol. Glucosa 0 1 ml 1 ml 1 ml
Sol. NaF 0 0 1 ml 0
Agua 2 ml 1 ml 0 0
destilada(43°C
)
Sol.Rojo 0 0 0 1 ml
Neutro

Agitar por inversión para homogenizar el contenido de cada tubo.

3.2. Tapar cada tubo con un frasco de penicilina invertido, presionándolo girar
rápidamente de manera que el tubo quede invertido dentro del frasco. Marcar
el nivel de la burbuja en la parte superior del tubo y amarrando con un elástico
los 4 frascos, ponerlos a incubar en un baño de agua a 43°C.
3.3. Al cabo de 30 min. Marque el nivel final de la solución en el tubo y mida el
volumen de gas producido con una pipeta con agua.
3.4. Cuál es el objetivo del tubo 4? Verifique el pH en el tubo 2 con papel pH.
3.5. Anote y discuta sus resultados.

47
 Soluciones:

1. Solución de levadura: disolver a homogeneidad 7 g de levadura en 10 ml de

agua destilada a 43°C y completar a 100 ml con agua destilada a 43°C.
2. Solución de glucosa 0,1 M
3. Solución de NaF0,1 M
4. Solución rojo neutro 0,02 M
Papel pH.

IV. OBSERVACIONES

___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________

V. CONCLUSIONES

___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________

48
 ___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
________________________

VI. BIBLIOGRAFÍA

___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________

49
 PRÁCTICA. 8

INMOBILIZACION
PRÁCTICA. 8DE ENZIMAS Y
CELULAS. PRODUCCION DE ETANOL POR
INMOBILIZACION DE ENZIMAS Y CELULAS. PRODUCCION DE ETANOL POR
SACCHAROMYCES
SACCHAROMYCES cerevisiae INMOVILIZADA. cerevisiae

INMOVILIZADA.

50
I.- OBJETIVOS
1) Inmovilizar S. cerevisiae en soporte de agar- agar.
2) Obtener etanol a partir de levaduras inmovilizadas.
3) Evaluar por refractometría el grado alcohólico del producto de la fermentación

II.- ACTIVIDADES
Fermentación alcohólica en levaduras (Saccharomycescerevisiae).
La fermentación alcohólica en levaduras ocurre de acuerdo a la reacción:
C6H12O6 2CO2 2 C2H5OH (etanol)
El etanol se acumula en el medio y el CO2 es liberado como gas, por lo que se
puede medir la fermentación por la producción de CO 2 y por la concentración del
producto formado o por la disminución de la concentración del sustrato (en grados
Brix)

III.- MATERIALES.

- Material biológico: Levadura S. cerevisiae, mosto de uvas

- Reactivos: Agar-agar, solución de glucosa 5%
- Material: balones, probetas, pipetas, baguetas, hipodérmicas de 20cc, espátulas,
picetas, papel toalla.
- Equipos: Balanza, refractómetro, baño maría.

IV.- PROCEDIMIENTO

Acondicionamiento de materiales:
Solubilizar la levadura comercial de panificación en 50 ml de agua destilada.
En un matraz disolver 5g de agar-agar en 250 ml de agua destilada, con calentamiento
y agitación constante.
Calibrar el baño de maría a 40ªC, para mantener dentro del agar licuado.
Colocar en una probeta de 100ml, 50ml de aceite vegetal y ponerla en refrigeración
(aproximadamente 4ªC), por 30 minutos.
Inmovilización de la enzima:
Mezclar 50 ml de la suspensión de levaduras y 50 ml de agar agar licuado y
homogenizar.
Tomar con una hipodérmica de 20 ml un volumen de la mezcla y dejar caer gota a gota
en la probeta que contiene el aceite vegetal refrigerado.
Repetir el paso anterior hasta agotar la mezcla.
Decantar los pellets y lavarlos tres veces con agua destilada con movimientos rotatorios
suaves.
Secar los pellets en papel toalla.
Obtención del mosto de uva:
Obtener por prensado 50ml de mosto de uva.
Filtrar con una gasa el jugo obtenido.
Tomar una alícuota y leer los grados brix o porcentaje de azúcar en el refractómetro.
Obtención de etanol:

51
Colocar los pellets en un vaso de precipitados con 50ml de mosto de uva, (o 50ml de
una solución de glucosa al 5%). To0mar una alícuota, considerando la muestra a tiempo
cero y leer los grados brix o porcentaje de azúcar en el refractómetro.
Agitar la mezcla por 45 minutos. Tomar alícuotas cada 15 minutos. Leer los grados brix
en el refractómetro para cada alícuota.

V .- CUESTIONARIO.

1.-Indique la importancia de la inmovilización de enzimas y/o células.

_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
2- Cuál es el fundamento de la inmovilización de levaduras en agar?.
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
3.- Explique las características coagulantes del agar-agar.
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
4.- Como explica que la glucosa llegue a tener contacto con las células de levadura, si
estas están atrapadas en la matriz de agar-agar.
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________

5- Presente al menos un caso detallado de aplicación de la inmovilización de enzimas.

_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________

6- Qué otros métodos para la inmovilización se utilizan?

_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________

52
VI.- OBSERVACIONES Y COMENTARIOS
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________

VI.- CONCLUSIONES

______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
_____________________

VIII.- BIBLIOGRAFÍA
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________

53
 PRÁCTICA 9

PRÁCTICA 9

EXTRACCIÓN
EXTRACCIÓN DE ENZIMAS
DE ENZIMAS VEGETALES

VEGETALES

54
I. OBJETIVO.
Extraer la enzima Ureasa de la cáscara de frejol y comprobar su actividad
catalítica.

II. FUNDAMENTO.
Las enzimas son proteínas con acción catalítica.
Las proteínas se encuentran en el interior de las células en un estatus particular, a
pH fisiológico, y con estructura nativa estabilizada por diversas mezclas de
sustancias.
La extracción de enzimas debe realizarse de modo que conserven las características
estructurales y las propiedades funcionales de las mismas.
Las leguminosas son conocidas por su alta actividad ureásica, debido a la enzima
ureasa presente en la cáscara.
La enzima ureasa al actuar sobre el sustrato úrea provoca la hidrólisis de esta con
la consiguiente liberación de amoniaco y anhídrido carbónico, según la siguiente
reacción.
NH2
O=C + H2O ---------- 2NH3 + CO2
NH2
La actividad ureásica se puede comprobar haciendo reaccionar el amoniaco
liberado con el Reactivo de Nessler (K 2Hg14). Este reactivo es el Yoduro doble de
Mercurio y Potasio, que al reaccionar con el amoniaco en medio alcalino da
productos de color amarillo-anaranjado (complejo cuya fórmula se supone sea
HgONH2I), cuya intensidad de color puede medirse a longitudes de onda de 405 a
420 nm.

III. MATERIALES Y EQUIPOS

 150 gr. De cubierta de frejol, solución de úrea0.3 M, agua destilada
 Buffer fosfato 0.005 M de pH=7.4, reactivo Nessler.
 Espectrofotómetro, Baño María, Balanza, Equipo de filtración, papel filtro,
Gradilla de tubos, 02 fiolas de 100ml,04 tubos de ensayo de 10 ml. Balón de
500ml. Vaso de precipitados de 500 ml.

IV. PROCEDIMIENTO.

Extracción de la Enzima.
 Remojar 200 gr. De frejol en 500ml de agua destilada o (agua hervida fría)
, después de 24 horas remover la cáscara por fricción, y proceder a
escurrir el agua.
 Preparar 200 ml. De buffer fosfato de sodio 0.005 M.( PO 4HNa2) , y
200ml. De solución EDTA 0.001 M. Usando en ambos casos agua
destilada fría, mezclar ambas soluciones, y enfriar a 4ºC. En un balón de
500 ml.

55
  Pesar 20 gr de cáscara de frejol y colocarlo en un vaso de precipitados de
500 ml.
 Agregar 90 ml. De buffer fosfato previamente preparado, y licuar
cuidando se mantenga baja la temperatura.
 Filtrar la mezcla con una gasa y enjuagar con 10 ml. De agua destilada.
 Centrifugar la suspensión a 14,000 g. Por 10 min. o pasar la solución por
un filtro rápido y enjuagar el papel filtro con 10 ml. De agua destilada.
 Separar el sobrenadante y medir el volumen final del extracto obtenido,
llevar a refrigeración.
 Preparar un cuadro de resultados.
CASCAR BUFFE AGU EXTRACT FINAL
A R A O (ml)

Determinación de presencia de proteínas en el extracto por

espectrofotometría.
Preparar tubo blanco: tomar 4ml de agua destilada y 4 ml de reactivo biuret.
Preparar tubo muestra: tomar 3 ml de extracto decantado, 1 ml de agua y 4 ml
de reactivo biuret.
Calibrar el espectrofotómetro y leer la absorbancia a 570 nm. Para comprobar
la presencia de proteínas.
Anotar la lectura de Absorbancia.

Comprobación de La actividad enzimática.

 Preparar dos tubos de ensayo y rotular uno como tubo muestra y el otro
como tubo de blanco.
 En ambos tubos agregar 0.2 ml de solución de úrea al 0.3 M y 1.5 ml de
buffer fosfato.
 Llevar ambos tubos a pre-incubación a 37ºC por 3 min.
 Agregar al tubo muestra 1.0 ml. del extracto y 4.8 ml de agua, al tubo
blanco 5.8 ml de agua, agitar suavemente, para lograr mezclar.
 Llevar ambos tubos a incubación en baño maría a 37ºC por 15 min.
 Después de incubar los tubos, adicionar el Reactivo Nessler a los tubos;
(0.5 ml a cada tubo. Volumen total 8 ml.
 Dejar reposar por 4 min. Para atemperar al medio ambiente.
 Calibrar el espectrofotómetro a 420 nm.
 Medir la absorbancia. La muestra de extracto dará coloración y un alta
absorbancia por el amoniaco liberado.

V. CUESTIONARIO.

56
 Explique por qué es necesario licuar la cáscara durante la extracción de la enzima
ureasa.
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________

Diga que pruebas se tienen de haber extraído realmente enzimas vegetales.

___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________

Haga los cálculos de reactivos para las soluciones que se prepararon.

Explique el papel que juegan en la extracción el buffer fosfato y la refrigeración.

___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
____________

Haga un diagrama de flujo cuantitativo del proceso de extracción utilizado en

laboratorio.

VI. OBSERVACIONES

57
 __________________________________________________________________
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
_________________________________

VII. CONCLUSIONES

__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
__________________

VIII. BIBLIOGRAFÍA

__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
__________

58
 PRACTICA 10

PRACTICA 10
DETERMINACIÓN
DETERMINACIÓN DE ACTIVIDAD
DE ACTIVIDAD ENZIMATICA EN UREASA

ENZIMATICA EN UREASA

59
I. OBJETIVO
Determinar la capacidad catalítica o actividad enzimática de la enzima ureasa.(enz.
Urea-amidohidrolasa EC.3.5.1.5)

II. FUNDAMENTO.
La actividad enzimática (U) es la expresión del poder catalítico de la enzima y se
obtiene midiendo la velocidad de la reacción que cataliza.
La actividad enzimática (U) se define como la cantidad de enzima contenida en 1
ml de solución que transforma o produce 1 mg de sustrato ó producto por minuto
medidas en las condiciones optimas de operación de la enzima.
La ureasa es una enzima que se encuentra en diversos organismos vivos, mas no en
el organismo humano. Algunas fuentes comunes son las bacterias, o la cáscara de
frejol.
La ureasa cataliza la descomposición de la úrea según la reacción:
NH2
CO + H2O 2NH3 + CO2
NH2
La velocidad de una reacción enzimática como la velocidad de cualquier reacción
puede ser determinada midiendo:
1. la cantidad de sustrato transformado en un determinado tiempo de reacción
2. la cantidad de productos formados. Cualquiera de ellos.
Para el caso de la reacción catalizada por ureasa se puede hacer el ensayo midiendo
la cantidad de urea en el tiempo, o midiendo cualquiera de los productos (CO2 ó
NH3) producidos en un tiempo determinado.
Por facilidad se medirá la cantidad de amoniaco formado, lo cual se hace por
medios espectrofotométricos utilizando el reactivo Nessler que es un ioduro doble
de mercurio y potasio que al reaccionar con el amoniaco en medio alcalino forma
un complejo de color anaranjado castaño.
2K2HgI4 + NH3 + 3KOH HgONH2I + 7KI + 2H2O
La intensidad del color formado será directamente proporcional a la cantidad de
amoniaco presente en cada tubo y se medirá la absorbancia de cada tubo a 420 nm
(filtro morado).

III. DESARROLLO EXPERIMENTAL.

Materiales.
 Preparar 50 ml de solución de urea 0.3 M.
 Preparar 100 ml buffer fosfato 0.05M de pH=7.4, con EDTA 0.001M
 Reactivo Nessler.
 50 ml de solución de ureasa 0.6 mg/ml en buffer fosfato pH, 7.4 ( a 4ºC)

60
  100 ml de solución de sulfato de amonio al 5x10-4 M (5x10-
4milimoles/ml)

Material de vidrio.
 02 fiolas de 50 ml.
 02 fiola de 100ml.
 08 tubos de ensayo.
 01 gradilla para tubos.
 01 espectrofotómetro.
 baño de hielo.
 Incubadora a baño maría.

Determinación de la curva de calibración.

Se preparan en los tubos de ensayo soluciones de sulfato de amonio según la tabla
siguiente:

Patrón Concentració SO4(NH3) ml de Buffe Nessle Volume Absorbanci

Nº n (NH3) 2 nmol/ml SO4(NH3) r (ml) r (ml ) n final a
mol/ml 2 ml 420 nm.
Blanc 00 0.0 0.0 7.50 0.5 8.0
o
1 5.0 0.01 7.49 0.5 8.0
2 10 0.02 7.48 0.5 8.0
3 15 0.03 7.47 0.5 8.0
4 20 0.04 7.46 0.5 8.0
5 25 0.05 7.45 0.5 8.0
6 30 0.06 7.44 0.5 8.0
Con los datos obtenidos se construye la curva de equivalencia o curva de
calibración.

Medida de la actividad ureasica.

Preparar dos tubos de ensayo y rotular uno como tubo muestra y el otro como
tubo de blanco.
En ambos tubos agregar 0.2 ml de solución de úrea al 0.3 M y 1.5 ml de
buffer fosfato.
Llevar ambos tubos a pre-incubación a 37ºC por 3 min.
Agregar al tubo muestra 1.0 ml. de solución de ureasa y 4.8 ml de agua, al
tubo blanco 5.8 ml de agua, agitar suavemente, para lograr mezclar.
Llevar ambos tubos a incubación en baño maría a 37ºC por 15 min.

61
 Después de incubar los tubos,Sacar el tubo de incubación e introducir en baño
de hielo para detener la reacción.
Adicionar el Reactivo Nessler a los tubos; (0.5 ml a cada tubo). Volumen
total 8 ml, agitar.
Dejar reposar por 4 min. Para atemperar al medio ambiente.
Leer la absorbancia a 420 nm.

IV. CUESTIONARIO
1.- Efectúe los cálculos para completar los datos de la tabla.

2.- Calcule la cantidad de NH3 producido en la reacción enzimática.

3.- Calcule la actividad enzimática de la solución de ureasa en nmol de NH3

producido/min.

4.- Explique por qué durante la reacción debe incubarse a 37ºC

5.- Realizar los cálculos de micromoles de sulfato, amoniaco, y urea para cada
tubo patrón usados en la construcción de la curva de calibración.

62
 6.- Encontrar la equivalencia por el cálculo del factor de equivalencia y por la
determinación analítica de la ecuación de la curva.

7.- Diga si la curva de calibración obtenida obedece a la ley de Beer. Explique por
qué.

8.- Explique por qué es necesario contar con un blanco en las determinaciones de
actividad enzimática.

9.- Explique la diferencia entre actividad enzimática y actividad específica.

63
V. OBSERVACIONES
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________

VI. CONCLUSIONES
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________

VII. BIBLIOGRAFÍA
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________

64
 PRACTICA
PRACTICA 11 11
CINETICA ENZIMATICA EN UREASA
CINETICA ENZIMATICA EN UREASA

65
I. OBJETIVO.
Verificar la variación de la velocidad de las reacciones enzimáticas con la
concentración del sustrato.

II. FUNDAMENTO.
La úrea puede descomponerse por acción de la enzima Ureasa, para formarse
amoniaco y bióxido de carbono según la siguiente ecuación.
NH2
CO + H2O 2NH3 + CO2
NH2
Luego el Amoniaco liberado puede ser cuantificado por espectrofotometría a
l = 420 nm, si previamente se le compleja con reactivo Nessler.
Cinética de MichaelisMenten.
La velocidad de las reacciones enzimáticas varían con la concentración del
sustrato según una cinética autosaturante que se describa por la Ec.
DeMichaelis-Menten.

V = Vmax. [S]
Ks + [S]
La representación gráfica de tal ecuación tiene la forma:

La ecuación de Michaelis-Menten se puede resolver haciendo uso de la

Linearización de Lineweaver-Burk, en cuyo caso toma la forma.

66
 Donde los parámetros anteriores se relacionan por la ecuación de una recta.
1 = 1 + [S]
VVmaxKs

III. MATERIALES Y EQUIPOS

Materiales.
 20 ml de solución de sulfato de amonio al 5x10-4 M
 50 ml de solución de ureasa 0.6 mg/l. En buffer fosfato de pH=7.4, con EDTA,
0.5 nM.
 Agua destilada.
 reactivo Nessler.
 Baño de hielo.
Equipos y material de vidrio.
 fiolas de 50 y 100 ml.
 07 tubos de ensayo de 10 ml.
 02 matraz de 100 ml.
 pipetas de 1, 2, 5, y 10 ml.
 Equipo de baño maría.
 01 espectrofotómetro Espectronic 20D+
 01 termómetro de 0- 100 ºC

IV. PROCEDIMIENTO.
Preparación de muestras.
 Hacer los cálculos y preparar la solución patrón de sulfato de amonio al
5x10-4 M
 Hacer los cálculos y preparar la solución de urea 0.3 M

Calibración del Espectrofotómetro.

A fin de transformar los valores de intensidad de color en valores de
concentración del producto formado (NH3), y por tanto de actividad de la

67
enzima se trazará una curva de equivalencia de Densidad Óptica (Abs) vs.
Concentración. Con ese fin se preparan soluciones de amoniaco de
concentración conocida, las que se neutralizan con reactivo Nessler, para
obtener diversas intensidades de color. Por la dificultad del uso del NH3 se
usará soluciones de sulfato de amonio.
 Preparar solución madre de SO(NH4)2, al 5x10-4 M

 Preparar 6 muestras que contengan de 5 a 30 nanomoles de Sulfato de

Amonio, calcular las nmol de NH3 que liberan cada una y su
equivalencia con nmol de úrea. Completar la siguiente tabla.

68
Tabla Nº 1
PATRON nº Sol. de Contenido nmol Contenido nmol Equivalencia en
sulfato(ml) de sulfato de NH3 nmol de úrea
1 50
2 100
3 150
4 200
5 250
6 300

 Utilizar los datos obtenidos de la curva de calibración de la práctica

anterior.
 Completar la siguiente tabla.
Tabla Nº 2
Muestra Nº Volumen de sulfato NH3 en la muestra Absorbancia
tomado ( ml) (nmol)
Blanco
1
2
3
4
5
6
Construir la curva de equivalencia y encontrar la ecuación que relaciona DO
vs
[NH3], haciendo los tratamientos estadísticos que sean necesarios.
Pruebas cinéticas.
 A partir de la muestra madre de urea 0.3 M. preparar 6 muestras y un
blanco para completar la tabla 3 como se muestra.
 Preparar solución madre de ureasa 6gr/l en buffer fosfato

69
 Tabla Nº 3

Tubo Urea Urea Buffer Incuba Ureas Incuba Bañ Nessle Reposa Volume Abs
o.3 fosfat r 37°C a r 37°C o r r n final
µMo 420
M o ml hielo
l 3 min ml 15 ml 5 min. ml nm.
ml min
Blanc 0 0 7.0 0.5 0.5 8
o
1 60 0.2 6.8 0.5 0.5 8
2 120 0.4 6.6 0.5 0.5 8
3 180 0.6 6.4 0.5 0.5 8
4 240 0.8 6.2 0.5 0.5 8
5 300 1.0 6.0 0.5 0.5 8
6 360 1.2 5.8 0.5 0.5 8

 Calcular la cantidad de NH3 formado y de urea que reacciona ( de la

curva de calibración), y completar la tabla 4

Tabla Nº 4
Muestra [urea] en Densidad óptica Nmol de NH3 Nmol de urea
-2
nmol/ml x10 (Abs) producidos que reaccionan
1 0.1
2 1.0
3 3.0
4 4.0
5 5.0
6 6.0
Blanco -
Tratamiento de datos.
 Para cada muestra calcular la velocidad de reacción mediante la relación
v = P/t, donde (p) es nmol de NH3 producidos, y (t) es el tiempo de
reacción enzimática ( 15 min.) y completar la siguiente tabla.

70
 Tabla 5
Muestra [S] nmol/ml. 1/[S] V(nmol/min.) 1/v
1
2
3
4
5
6
 Graficar v vs. [S], y ajustar a una curva autosaturante.

 Estimar el valor de Vmax.

 Graficar 1/v vs. [S] y ajustar a una línea recta.

 Determinar gráficamente los valores de Vmax. Y Ks.

 Escribir la ecuación que representa a esta reacción enzimática.

71
V. OBSERVACIONES
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________

VI. CONCLUSIONES
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________

VII. BIBLIOGRAFÍA
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________

72
 PRACTICA 12

EXTRACCION DE ADN12
PRACTICA DE HIGADO
DE POLLO
EXTRACCION DE ADN DE HIGADO DE POLLO

73
I. OBJETIVO

Extraer ADN de un tejido animal

II. MARCO TEORICO

El ADN y ARN son biomoléculas que intervienen en el almacenamiento y la

transferencia de la información genética. Son componentes fundamentales de la
célula y constituyen en conjunto, entre el 5 y el 10% del peso seco.

Normalmente no se encuentran solos sino que se hallan formando núcleo

proteínas, ya que suelen unirse a determinados tipos de estas, como las histonas.

El ARN se localiza tanto en el citoplasma celular como en el núcleo ,

mitocondrias y cloroplastos, mientras que el ADN se sitúa fundamentalmente en
el núcleo de la célula y también cloroplastos y mitocondrias en pequeñas
cantidades.

Poseen una importancia manifiesta por el hecho de que ellos dirigen y llevan a
cabo la síntesis de proteínas, y por tanto de las enzimas necesarias para el
funcionamiento celular.

Por otra parte el ADN es el vehículo de la herencia que se transmite de padres a

hijos de generación en generación.

III. FUNDAMENTO:

El ADN se puede aislar mediante una técnica relativamente sencilla, consiste en

primer lugar en romper las membranas celulares para liberar los núcleos, para
ello se tritura el hígado de pollo en un mortero.

Al añadir una solución hipertónica, como el NaCl 2M, se produce el estallido de

los núcleos, el detergente forma un complejo con las proteínas y las separa del
ADN, El alcohol tiene como función precipitar el ADN que se va agrupando
para dar lugar a la formación de unas fibras blancas visibles a simple vista, que
se pueden colorear mediante un colorante selectivo para ADN como el
anaranjado de acridina.

74
IV. MATERIALES

 Hígado de pollo 10 gr
 Cloruro de sodio 2M
 Etanol 96|°
 SDS 20%
 Arena
 Varilla de vidrio
 vasos de precipitados
 Mortero
 Embudo
 Pipetas
 Probetas
 Gasa

V. METODOLOGÍA

1.- Triturar 10 gr de hígado de pollo, dentro de un mortero, con la adición de

5gr de arena lavada, para promover el rompimiento de las membranas
celulares.

2.- Añadir al triturado de hígado 50 ml de agua destilada hasta obtener una

papilla.

3.- Filtrar varias veces, en una probeta de 100 ml, logrando separar los restos de
tejido que quedaron sin romper membranas.

4.- Medir el volumen del filtrado final.

5.- Añadir al filtrado un volumen igual de NaCl 2M., verterlo todo a un vaso de
precipitados.

6.- Añadir 1 ml de SDS 20%.

7.- Añadir mediante una pipeta 25 a 50 ml de etanol frío, por las paredes,
logrando se formen dos capas, en la interface precipita el ADN.

8.- Con la ayuda de una varilla de vidrio, ir removiendo en la misma dirección

tratando de hilar las fibras de ADN; sobre la varilla se van adhiriendo unas
fibras blancas de ADN visibles a simple vista, que es el resultado de la
agrupación de muchas fibras de ADN.

75
76
VI. CUESTIONARIO
1. ¿De qué está formada la cromatina?
2. Durante la extracción del ADN ¿Cuál es la razón de triturar el hígado?, ¿para
qué añadimos arena al triturado?
3. ¿Por qué crees que estallan los núcleos al añadir NaCl 2M?
4. ¿Qué acción tiene el ADN sobre la cromatina?
5. Durante la extracción del ADN se utiliza un detergente y etanol, con que
finalidad

VIII. OBSERVACIONES
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________

IX. CONCLUSIONES
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________

X. BIBLIOGRAFÍA
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________

77