Código:

Centro Nacional de Asistencia Técnica a la Industria – ASTIN 9230-FP-F-322

Versión: 2
“TALLER PRÁCTICO: CURVA DE CRECIMIENTO LEVADURA”

1. IDENTIFICACIÓN DEL INSTRUMENTO:

Programa de Formación: Ficha de caracterización:
Tecnólogo en química aplicada a la industria 1619390
Nombre de la Guía: Obtención de bio-productos a nivel de Código de la Guía:
laboratorio a partir de sustratos agroindustriales aplicando la En codificación
gestión de calidad.
Nombre del Instructor: Marcelo Guancha / Jaqueline Garcia C.
Ciudad y fecha: Cali, agosto 4 de 2019

2. PRESENTACIÓN E INSTRUCCIONES PARA EL DILIGENCIAMIENTO:

Señor/a Aprendiz:
♦ Entregar el pre informé respectivo de la práctica de laboratorio
♦ Realizar la práctica de laboratorio de acuerdo al procedimiento.
♦ Entregue los productos al Instructor (tabla de datos e informe respectivo).

3. CUERPO DEL INSTRUMENTO:

3.1. INTRODUCCION
Los microorganismos presentan un crecimiento que sesta determinado por factores tanto nutricionales como
ambientales, por lo tanto, bajo condiciones controladas y optimas en el laboratorio es posible generar una
curva de crecimiento que es característica para cada especie de microrganismo. Esta curva por lo general
muestra claramente 4 etapas o fases características del crecimiento microbiano:
1- Fase de Adaptación
2- Fase de Crecimiento
3- Fase Estacionaria
4- Fase de Declinación o muerte.
Con esta práctica se pretende representar la curva de crecimiento para una levadura usando un método
conteo directo.

3.2. OBJETIVO
Determinar la curva de crecimiento microbiano de levadura comercial mediante el uso de la cámara de
Neubauer.

3.3. ACTIVIDADES PRELABORATORIO

Consultar sobre:
Absorbancia, Transmitancia, Longitud de onda.
Ley de Lambert – Beer, Curva de calibración espectrometría –UV
Celdas, tipos de celdas.
Curva de crecimiento levadura
Métodos para cuantificar células de levadura: turbidimetría V, cámara Neubauer y otros

3.4. MATERIALES DEL APRENDIZ

Cada Aprendiz debe contar con los siguientes implementos de trabajo y seguridad
● Guía de laboratorio.
● Cuaderno exclusivo para el laboratorio.
● Blusa blanca de laboratorio que cubra hasta las rodillas de manga larga.
● Gafas de seguridad de alta transparencia.
● Guantes de nitrilo.
● Botas de seguridad.
 Código:
Centro Nacional de Asistencia Técnica a la Industria – ASTIN 9230-FP-F-322

Versión: 2
“TALLER PRÁCTICO: CURVA DE CRECIMIENTO LEVADURA”

● Calculadora, regla, tijeras, toalla pequeña, cinta de enmascarar.

3.5. MATERIALES Y REACTIVOS QUE SUMINISTRA EL LABORATORIO

Materiales Reactivos
2 Erlenmeyer de 500mL Agua destilada
2 vidrio-reloj o cajas Petri Glucosa
2 espátulas (NH4)2SO4
1 piseta Extracto de levadura
2 pipetas graduadas de 1mL KH2PO4
1 balón aforado de 50mL MgSO4.7H2O
1 frasco tapa rosca de 1L C6H8O7
1 cámara de Neubauer CaCO3
1 cubreobjetos NaOH al 0,1M
3 pipetas Pasteur o goteros Azul de metileno
1 probeta de 1000 mL Levadura comercial
2 pipetas volumétricas de 10mL Pulpa de piña
2 varilla de agitación Fenol
1 barra magnética
1 micropipeta
3 tubos de ensayo NaCl
5 balón aforados de 25mL
Equipos
3 erlenmeyer de 250mL Agitador orbital
Autoclave
Balanza de precisión
pHmetro
Microscopio óptico
Refractómetro
Plancha de calentamiento y agitación
Espectrofotómetro UV-vis

3.6. ACTIVIDADES EXPERIMENTALES

Preparación del Inoculo
● En un Erlenmeyer de 500mL preparar 200mL de medio de cultivo para el inoculo, de acuerdo con la
siguiente composición (usar agua destilada para realizar la solución):
Composición del medio de cultivo
Glucosa 100g/L
Sulfato de amonio 5g/L
Extracto de levadura 3g/L
KH2PO4 1g/L
Sulfato de magnesio
pentahidratado 1g/L
 Código:
Centro Nacional de Asistencia Técnica a la Industria – ASTIN 9230-FP-F-322

Versión: 2
“TALLER PRÁCTICO: CURVA DE CRECIMIENTO LEVADURA”

● Verificar que el pH del medio se encuentre entre 4,0 y 5,0 (si es menor a 4,0 utilice carbonato de
calcio (CaCO3), adiciónelo con una espátula limpia y seca y si es superior 5,0 utilice solución de
NaOH).
● Una vez ajustado el pH, esterilizar el medio para el inoculo en autoclave a T= 121°C por un tiempo
de 30 min.
● Retirar de la autoclave y dejar enfriar a temperatura ambiente.
● Agregar al medio ya frío 1g de lavadura.
● Poner en agitación constante por 24 horas a temperatura ambiente, en el agitador orbital.
● Determinar la concentración inicial de levadura con cámara Neubauer (células/mL)

**Para realizar el conteo usar el siguiente procedimiento:

a. Transferir con una pipeta Pasteur una gota de la suspensión de levaduras sobre la cuadricula de la cámara
Neubauer (Ver figura 1).
b. Adicionar una gota de azul de metileno.
c. Colocar un cubre objetos sobre la cámara evitando la aparición de burbujas.
d. Colocar la cámara en el microscopio óptico y enfocar en el objetivo de 10x.
e. Ubicar el cuadro grande (numeral 1 de la figura 1) de la cuadricula y tomar una foto. Asegurarse de que
quede enfocado y nítido todo el cuadro.
f. Procesar la imagen en el software ImageJ. Tener en cuenta el protocolo entregado por el instructor para
realizar dicha actividad.
g. Calcular el número de células/mL de acuerdo a la ecuación de la figura 1 (tener en cuenta la cantidad de
cuadros sobre los que se está haciendo el conteo.

Figura 1- Cámara de Neubauer

Preparación del mosto o medio de cultivo

• Calcular las cantidades en gramos requeridos de agua destilada, pulpa de piña y sacarosa
comercial necesarios para preparar 1000g del medio de cultivo el cual debe contener el 23% en
 Código:
Centro Nacional de Asistencia Técnica a la Industria – ASTIN 9230-FP-F-322

Versión: 2
“TALLER PRÁCTICO: CURVA DE CRECIMIENTO LEVADURA”

peso de pulpa de piña y aproximadamente 18ºBrix, los cuales se deben ajustar con sacarosa
comercial.
• Calcular la cantidad de nutrientes menores: sulfato de amonio ((NH4)2SO4) y ácido cítrico (C6H8O7),
las cuales se adicionan al medio en proporciones de 0,5 y 1,5 g/L respectivamente.
• En un recipiente limpio y seco pesar en la balanza de precisión la cantidad de pulpa de piña
necesaria para preparar el medio de cultivo.
• Pesar la cantidad de sacarosa comercial calculada en balanza de precisión.
• Mezclar la pulpa de piña y el azúcar en el recipiente destinado para la fermentación.
• En una probeta de 1000mL medir el volumen de agua destilada necesaria para la fermentación de
acuerdo a los cálculos realizados. Adicionar a la mezcla anterior.
• Verificar en el refractómetro si el medio de cultivo contiene aproximadamente 18ºBrix. Ajustar con
sacarosa comercial si es necesario.
• Pesar y adicionar al medio de cultivo la cantidad necesaria de sulfato de amonio y ácido cítrico.
• Finalmente verifique que el pH del medio se encuentre entre 4,5 y 5,0. Si es menor a 4,5 utilice
carbonato de calcio (CaCO3), adicionarlo con una espátula limpia y seca.
En caso de que el medio sea suministrado por su instructor tomar 300mL en un Erlenmeyer de 500mL
y proceder a estilizarlo en autoclave a 121°C por 15 min., después verificar el contenido celular en este
mediante la cámara de Neubauer.

Nota: Si no conoce el uso de los equipos consultar el protocolo de manejo o con el instructor.

Inoculación del medio con levadura (saccharomyces cerevisiae)

• Verificar que el contenido celular en el inoculo se encuentre como mínimo a una concentración de
levadura 3,0×107 células/mL. Realizar el conteo de acuerdo al procedimiento indicado
anteriormente**.
● Determinar el volumen necesario de inoculo necesario para que el medio de cultivó contenga una
concentración inicial de levadura de 1,0x107 células/mL.
● Verter la cantidad calculada del inóculo dentro del recipiente que contiene el medio de cultivo
debidamente rotulado.
● Colocar el Erlenmeyer con el medio de cultivo inoculado en el baño maría a temperatura de 30°C
con agitación permanente. Registrar la hora de inicio de la incubación.
Para esta operación se puede utilizar también plancha de calentamiento y agitación o agitador
orbital.

Método de contabilización con espectrómetro UV-vis

● Para determinar la curva de crecimiento se deben tomar muestras de 2mL del cultivo cada 30 min
y medir su absorbancia en el espectrofotómetro y el número de células en cámara Neubauer.
● Realizar una dilución 1:10 con solución salina antes de medir la absorbancia.
● Medir la absorbancia de la muestra a 620nm en el espectrofotómetro UV-vis.
 Código:
Centro Nacional de Asistencia Técnica a la Industria – ASTIN 9230-FP-F-322

Versión: 2
“TALLER PRÁCTICO: CURVA DE CRECIMIENTO LEVADURA”

● Utilizar el medio de cultivo esterilizado sin levadura como blanco. Registra la información en la
tabla 2.
● Construir la curva de crecimiento absorbancia vs el tiempo y concentración de levadura vs tiempo.

Nota: Si la absorbancia es mayor que 0,4 diluir la muestra.

Curva de calibración método espectrómetro UV-vis

● Preparar 100mL de una solución de levadura en el medio de cultivo de (1g/L). Para evitar el
crecimiento de la levadura adicionar 4 gotas de Fenol o llevar a ebullición por 5 minutos antes del
aforo.
● A partir de la muestra de patrón de levadura, preparar soluciones seriadas de 0,0g/L (blanco),
0,125g/L, 0,250g/L, 0,375g/L y 0,500g/L en balones aforados de 25ml. Aforar con la solución de
medio de cultivo.
● Verter parte de la solución del blanco en la celda de cuarzo del espectrofotómetro.
● Colocar a cero el espectrofotómetro con la muestra de la curva estándar que contiene el blanco.
(conservar esta muestra en blanco para su uso posterior)
● Leer las absorbancias de todas las otras muestras a 620nm, al hacer la lectura, hacerlo de la
concentración más baja a la más alta. Diligencie la tabla 1.
● Construir la curva de calibración (A620 vs g de levadura /L), y determinar la ecuación de la recta de
la curva (verificar el R2 de los datos).

Nota: Use guantes para verter cada una de las muestras de balones de 25 ml en la celda de cuarzo.

Método de contabilización con cámara Neubauer

● Se toman 10µL de muestra de solución de levadura con la micropipeta.
● Se coloca una gota en la cámara superior e inferior de la campara Neubauer.
● Se adiciona con otra punta de la micropipeta azul de metileno
● Se coloca un cubreobjetos sobre la cámara de Neubauer y se lleva al microscopio. Realice el
procedimiento de enfoque desde el enfoque más bajo al más alto. Recuerde que el conteo se debe
realizar a 40x
● En caso de que aparezcan burbujas, el cubreobjetos se haya movido o algo no haya salido bien,
repetir la operación.
● Realice el conteo identificando las células vivas y muertas (color azul). Registre en la tabla de datos
(tabla 3).
Tenga en cuenta el archivo anexo a la práctica para determinar la forma del conteo y la ecuación a utilizar
para los cálculos de la concentración.

3.7. RESULTADOS

Tabla 1. Curva de calibración

Concentración Punto de
0,000 0,125 0,250 0,375 0,500 Pendiente R2
de levadura (g/L) corte (b)
A620 nm
 Código:
Centro Nacional de Asistencia Técnica a la Industria – ASTIN 9230-FP-F-322

Versión: 2
“TALLER PRÁCTICO: CURVA DE CRECIMIENTO LEVADURA”

Tabla 2. Curva de crecimiento

Absorbancia Concentración Factor de Concentración
Muestra tiempo (min)
(620nm) (g/L) dilución Final (g/L)
0
30
60
90
120
150
180
210
240
270
300
330
360
390
420
450
480

Tabla 3. Conteo en cámara Neubauer

Numero
Células Células Factor de % Células
Tiempo Muestra Cuadro Total Promedio de
Vivas Muertas dilución viables
células
1
2
Muestra
3
1
4
5
1
2
Muestra
3
2
4
5
1
2
Muestra
3
1
4
5
1
 Código:
Centro Nacional de Asistencia Técnica a la Industria – ASTIN 9230-FP-F-322

Versión: 2
“TALLER PRÁCTICO: CURVA DE CRECIMIENTO LEVADURA”

2
Muestra 3
2 4
5
1
2
Muestra
3
1
4
5
1
2
Muestra
3
2
4
5
1
2
Muestra
3
1
4
5
1
2
Muestra
3
2
4
5
1
2
Muestra
3
1
4
5
1
2
Muestra
3
2
4
5
1
2
Muestra
3
1
4
5
1
Muestra
2
2
3
 Código:
Centro Nacional de Asistencia Técnica a la Industria – ASTIN 9230-FP-F-322

Versión: 2
“TALLER PRÁCTICO: CURVA DE CRECIMIENTO LEVADURA”

4
5
1
2
Muestra
3
1
4
5
1
2
Muestra
3
2
4
5
1
2
Muestra
3
1
4
5
1
2
3
4
Muestra
5
2
2
3
4
5

BIBLIOGRAFIA

McKee, T., & McKee, J. R. (2003). Bioquímica: la base molecular de la vida. McGraw-Hill Interamericana de
España.
Brock, T. D., Madigan, M. T., Martinko, J., & Parker, J. (1999). Biología de los microorganismos. Prentice-Hall.

4. PRODUCTO (S):
1. Pre-informe de la práctica.
2. Realización de la práctica.
3. Presentación del informe de la práctica.

Observaciones y/o recomendaciones: