UNIVERSIDAD DE SANTANDER

FACULTAD DE CIENCIAS EXACTAS, NATURALES Y AGROPECUARIAS

PROGRAMA DE MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL
16162-A1 LABORATORIO DE BIOQUÍMICA

Cuantificación de Proteínas

Gamboa, J.P 18331002. Rojas, J.D 18331015 & Villamizar, M.C 18332002
Universidad de Santander, Bucaramanga, Colombia, 26 de septiembre 2019
Microbiología Z

RESUMEN

Según la RAE, cuantificar se define como el

hecho de expresar la cantidad, el número o INTRODUCCIÓN
el grado de lo designado mediante un
elemento gramatical. Para la determinación Los diferentes métodos que se manejan
de la concentración de una proteína se
para la cuantificación de proteínas, son
recurre al uso de una curva de calibración;
así mismo se ha empleado este concepto utilizados para determinar la concentración
desarrollando diferentes métodos para de estas en una muestra de interés en este
determinar la cuantificación de proteínas caso leche, para este procedimiento se hará
totales o una en particular, para la uso del método de Bradford el cual se basa
determinación de cuantificación de en el color que se desarrolla al unirse con el
proteínas totales, es de gran importancia colorante azul coomassie G-250, a la
incluir el método de medición de la
proteína y mediante un espectrofotómetro
absorbancia a 280nm. Para la realización de
este práctica se recurre al uso del reactivo se mide la absorbancia de luz en unidades
de Bradford por su rapidez y es por esto que cuantificables1 .Las proteínas se unen a la
es uno de los más usados, también cabe forma azul para formar un complejo
destacar los métodos de Lowry y Biuret por proteína-colorante con un coeficiente mayor
su precisión y por su precisión que el colorante libre, este método tiene una
respectivamente.
característica especial, y es que depende de
la interacción relativamente inespecífica
entre un colorante hidrofóbico y las
PALABRAS CLAVES
proteínas, por lo tanto es sensible a la
presencia de contaminantes tales como los
Espectrofotometría,
restos de detergentes y líquidos orgánicos,
Proteínas,
"por lo que las proteínas pueden perder su
Cuantificación,
estabilidad y perder su forma nativa, lo que
Concentración,
provocaría la perdida de la unión entre el
Muestra problema,
cromóforo y la zona hidrofóbica de las
Método de Bradford y
proteínas2 .
Curva de Calibración
Cabe destacar que el método de Bradford, MATERIALES Y MÉTODOS
consiste en la formación de un compuesto
de adsorción entre los residuos de
aminoácidos básicos de las proteínas y el
colorante, este absorbe luz a 595 nm, así ● Espectrofotómetro
mismo presenta un rango de determinación
de proteína el cual es de 1-10 mg/ml ● Cubetas para espectrofotómetro
(ensayo micro) y de 0.5-1.4 mg/ml (ensayo ● Agitador vortex
estándar), por otro lado, presenta una
intensidad de absorción dependiendo del ● Tubos de ensayo
contenido de aminoácidos básicos y
aromáticos. Una desventaja que presenta ● Gradilla para tubos
este método es que los detergentes y los
● Tubos eppendorf de 1.5 o 2.0 Ml
anfolitos pueden producir interferencia.
Para este proceso en primera instancia se ● Balón aforado de 10 Ml
hace uso de una curva de calibración para
determinar el punto de partida al momento ● Micropipetas de 100uL, 100uL
de analizar las disoluciones las cuales nos
● Puntas para micropipetas
dirán el contenido proteico real que posee la
leche. Esta curva es una representación ● Papel parafinado
gráfica de una señal que se mide en función
de la concentración de un analito. ● Toallas de papel

Reactivos
OBJETIVO DE LA PRÁCTICA
 Los estudiantes necesitan traer por
Aplicar la espectrofotometría en la grupo Leche líquida.
cuantificación de proteínas en una muestra
problema (leche) mediante el método de  Agua destilada.
Bradford para determinar las
concentraciones de proteínas cálculos que
 Reactivo de Bradford.
se encuentran en esta, realizando una curva
de calibración.  Solución 1 mg/Ml de BSA.

Curva de Calibración con el reactivo de

Bradford.
Se preparo 1Ml de cada patrón (Tabla 1)
en tubos de ensayo, cada grupo se le
asigno una concentración.
Tabla 1. Patrones a preparar para la Curva
de Calibracion.

Patrón mg/mL V sln BSA V agua

1 0 Blanco
2 0.1 0,1uL 0,9uL

3 0.25 0,25uL 0,75uL

4 0.5 0.5uL 0.5uL
0.75 0.75uL 0.25uL
5
6 1 0.9uL 0.1uL

Estos cálculos se realizaron mediante la

fórmula Se prepararon 5 mL de solución
patrón-reactivo de Bradford en relación 1:50.
Se esperó 5 min y se hizo la lectura de la
absorbancia a 595 nm por triplicado

RESULTADOS

Tabla 3. Valores de Absorbancia Vs

Para la cuantificación de proteínas totales en
Concentración para realizar la Curva de
leche (Tabla 2) en la cual teníamos diferentes
Calibración 595 nm.
tipos de diluciones, y volumen para agua y
leche.

Tabla 2. Cuantificación de Proteínas totales

en Leche

Dilución Volumen de Volumen

de Leche Agua de Leche
0
1/2 500uL 500uL
1/5 800uL 200uL
1/10 900uL 100uL
 Tabla 4. Cuantificación de proteínas totales
en leche de los grupos, en diferentes Se observa que los valores de absorbancia
diluciones, midiendo la absorbancia a tienen una amplia diferencia (0,591-1,620nm)
por lo cual no son confiables igual obtuvimos un
595nm.
promedio de 1,105nm. En las demás
concentraciones como lo son 0,1; 0,25 y 0,5 los
Tipo de Grup Dilucione Absorbanci valores de absorbancia se muestran normales.
Leche o s en a Esto se puede identificar en la gráfica de la
Leche Curva de Calibración en el (Anexo 1).
Cantina 1 1/10 0,888 nm Basándonos en los cálculos realizados con la
Ecuación de la recta para hallar las
Entera 2 1/2 2,993 nm concentraciones (Anexo 2)

Deslactosad 3 1/10 1,574 nm La mayoría de los investigadores utilizan BSA

a como estándar proteico ya que es económica y
Entera 4 1/5 2,106 nm de fácil disponibilidad, pero no siempre es
adecuada. De hecho, una de las desventajas de
Entera 5 1/10 2, 393 nm utilizar BSA es que produce una fuerte tinción
con el colorante, pudiéndose subestimar el
contenido de proteínas. Se debería utilizar
inmunoglobulina G (IgG) o lisozima, u otro
estándar proteico dependiendo del tipo de
proteína de la muestra (Kruger N.1994).
ANALISIS DE RESULTADOS
Entre las ventajas de este método se encuentran
De acuerdo a los resultados obtenidos en el
su compatibilidad con agentes reductores
laboratorio de Cuantificación de Proteínas,
mediante el estudio previo de la teoría, y utilizados para estabilizar las proteínas en
cálculos realizados en la (Tabla 3) se tomaron solución, los cuales no son compatibles con el
en cuenta las variables Absorbancia Vs ensayo de Lowry y en algún grado con el ensayo
Concentración para realizar la Curva de de BCA, y la posibilidad de medir proteínas de
calibración, mediante el uso del alto peso molecular ya que el colorante no se
espectrofotómetro a 595nm, los resultados une a péptidos de bajo peso molecular (Olson B,
obtenidos en los cuales en algunas
Markwell J. 2007).
concentrados se tenían por triplicado en el caso
de (0,75) o duplicado (1) en los cuales se aplicó
un promedio para tener una media de ellos. En Cuantificación de proteínas totales en leche de
las concentraciones de 0,75 los valores de los grupos, en diferentes diluciones, midiendo la
absorbancia fueron muy cercanos, lo cual indica absorbancia a 595nm. Los resultados obtenidos
que eran confiables y obtuvimos un dato en la (Tabla 4) Cada grupo tenía como muestra
promedio de 0,518nm, por el contrario, para el un tipo de leche (Cantina, Entera, Deslactosada)
caso de las concentraciones en (1) se ve un
en diferentes diluciones.
error en alguno de los dos grupos que realizaron
esta muestra, ya sea por mal manejo del Se debe tener en cuenta que la concentración
material volumétrico como son las micropipetas, de proteína en la leche varía de 3.0 a 4.0%
o no tener los cálculos correctos. (30-40 gramos por litro). El porcentaje varía con
la raza de la vaca y en relación con la cantidad
de grasa en la leche.
Existe una estrecha relación entre la cantidad de Leche Entera: Es leche fresca que ha sido
grasa y la cantidad de proteína en la leche- sometidaalprocesode ultrapasteurización
cuanto mayor es la cantidad de grasa, mayor es (UHT), que consiste en exponer la leche
la cantidad de proteína. (Agrobit 2016) durante un corto plazo (de 2 a 4 segundos)
a una temperatura que oscila entre 135 y 140
Para esto se realiza una comparación entre las °C y seguido de un rápido enfriamiento, no
tablas nutricionales de los dos tipos de leche superior a 32 °C. Conserva todas las
utilizados en la práctica, para dicha comparación propiedades de la leche fresca, y aunque
no se toma en cuenta la leche de cantina puesto pierde parte de su sabor original, se
que esto es un factor dependiente de la raza de mantiene óptima para su consumo entre 3 y
la vaca. 6 meses. Leche sin lactosa: Este tipo de
derivado láctico se obtiene a partir de la
L. deslactosada L. entera. leche desnatada, a la que se le elimina gran
parte de la lactosa, o azúcar de la leche, y
sus azúcares se dividen en dos mucho más
digeribles, la glucosa y la galactosa. El resto
de nutrientes de la leche permanecen
totalmente intactos.

Al momento de realizar la dilución 1/10 para

los grupos 1, 3 y 5, cada uno con su tipo de
leche diferente (Cantina, deslactosada y
entera) se observa que los valores de
absorbancia para cada uno es distinto, esto
se debe a que para cada tipo de leche varía
la concentración de grasas y proteínas ya
que normalmente, la grasa (o lípido)
Fig. 1 Tablas Nutricionales de Leche entera constituye desde el 3,5 hasta el 6,0% de la
y Leche deslactosada. leche, variando entre razas de vacas y con
En la industria de productos lácteos se utiliza las prácticas de alimentación. Por otro lado,
principalmente la LECHE DE VACA, la cual en el caso de 1/2 que es la menos diluida del
se compone principalmente de agua en un grupo 2 (leche entera), su valor de
80%, proteínas, lactosa, enzimas, grasas, absorbancia fue de 2,993 nm y 1/5 grupo 4
vitaminas, minerales y sales minerales. con leche entera su resultado de
Las proteínas son: caseína, globulina y absorbancia fue de 2,106 nm. Por lo que se
albúmina. La lactosa que es un azúcar podría afirmar que en estas diluciones
compuesto de glucosa y galactosa. Las menos diluidas los valores de absorbancia
grasas son muy variables dependiendo el son grandes.
tipo de leche que se consuma. La concentración final de la leche para cada
Entre las vitaminas que encontramos en la una de estas absorbancias fue:
leche están: vitamina A, vitamina D, vitamina 1/10 Leche de cantina A=0.888nm una
B1 y vitamina B2. Los minerales son: calcio, concentración de 8.7mg/mL.
sodio, potasio, magnesio y hierro. Las sales 1/2 Leche entera A=2,993nm una
minerales son: nitratos, sulfatos, carbonatos concentración de 5,9mg/mL.
y fosfatos.En la composición de la leche 1/10 Leche deslactosada A=1,574nm una
influye la raza, la edad, la alimentación, el concentración a 167mg/mL.
método de ordeña y el estado de salud de la 1/5 Leche entera A=2,106nm una
vaca. concentración de 10,67mg/mL.1/10 Leche
entera A=2,396nm una concentración a
247mg/mL.
CONCLUSIONES

 Gracias al uso correcto del espectrofotómetro en la cuantificación de proteínas mediante el

método de Bradford, se logro el objetivo de determinar las concentraciones de proteínas en
una muestra problema (Leche) mediante una curva de calibración, con los cálculos correctos
previamente realizados, teniendo en cuenta las Ecuaciones utilizadas que fueron de gran
aporte para el desarrollo de esta práctica de laboratorio.

 Resaltar la gran importancia del buen uso del material volumétrico se vio reflejado encada
uno de los procedimientos realizados, una habilidad que hemos ido fortaleciendo y es vital
para nuestra carrera como microbiólogos industriales, no obstante, también existen errores
que se presentan durante el desarrollo de la práctica, que igual aportan a la hora de discutir
los resultados lo que nos deja una enseñanza.

 De acuerdo a la teoría se puede afirmar que la leche es una fuente excelente para la
mayoría de los minerales requeridos para el crecimiento de los más pequeños como
resultado, la leche es la mejor fuente de calcio para el crecimiento de un niño y el
mantenimiento de la integridad de los huesos en el adulto, debido al aporte enriquecido
de nutrientes, minerales, proteínas y vitaminas.

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

 Voet, D. Voet, JG. “Fundamentos de Bioquímica”. Editorial Médica Panamericana.

2ª Ed.Bioquímica, Madrid, 2007.

 NELSON, D.L., Cox, M. M. Lehninger Principios de Bioquímica. Ediciones Omega.

Capítulo 3 (2006).

 WILSON, K., and Walker, J. 2000. Principles and Techniques of practical

Biochemistry. Fifth edition. Cambridge University Press.

 SKOOG, Douglas A.; HOLLER, James F.; y NIEMAN, Thimothy A. Principios de

análisis instrumental. Madrid: McGraw-Hill, 2001. 1028 p.

● Rex Montgomery, Thomas W. Conway, Arthur A. Spector y David Chappell:

Bioquímica. 6ª. Edición. Edit. Harcourt Brace de España, S. A. 1998.

● Robert K. Murray, Meter A. Mayes, Daryl K. Granner, Victor Rodwell. Bioquímica, de

Harper. 16 y 17ª. Edición. Editorial El Manual Moderno. 2007.
 ANEXOS

Anexo 1. Curva de Calibración.

Curva de Calibración de BSA

Absorbancia vs Concentración
para la cuantificacion de proteinas
(Metodo de Bradford)
1.2

1
Absorbancia 595 nm

0.8

0.6

0.4

0.2

0
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2

Concentración mg/mL

Anexo 2. Cálculos para hallar las concentraciones de Leche.