Cuantificación de Proteínas

1. Objetivos
1.1 Objetivo General
En el laboratorio se estudiará las características fisicoquímicas de las proteínas estudiadas en laboratorio al
ser mezcladas con otros reactivos.
1.2 Objetivos Específicos
Se deberá de definir químicamente las proteínas, con las cuales se construirán una curva de calibración
espectrofotométrica usando un estándar de la concentración conocida. Con la cual podremos identificar la
concentración por el Método de Bradford
2. Fundamento Teórico
2.1 Proteína
Las proteínas son moléculas formadas por aminoácidos que están unidos por un tipo de enlaces conocidos
como enlaces peptídicos. El orden y la disposición de los aminoácidos dependen del código genético de
cada persona. Todas las proteínas están compuestas por:
Carbono, Hidrógeno, Oxígeno y Nitrógeno
Y la mayoría contiene además azufre y fósforo.
Las proteínas suponen aproximadamente la mitad del peso de los tejidos del organismo, y están presentes
en todas las células del cuerpo, además de participar en prácticamente todos los procesos biológicos que se
producen
De entre todas las biomoléculas, las proteínas desempeñan un papel fundamental en el organismo.
Son esenciales para el crecimiento, gracias a su contenido de nitrógeno, que no está presente en otras
moléculas como grasas o hidratos de carbono. También lo son para las síntesis y mantenimiento de diversos
tejidos o componentes del cuerpo, como los jugos gástricos, la hemoglobina, las vitaminas, las hormonas y
las enzimas (estas últimas actúan como catalizadores biológicos haciendo que aumente la velocidad a la
que se producen las reacciones químicas del metabolismo). Asimismo, ayudan a transportar determinados
gases a través de la sangre, como el oxígeno y el dióxido de carbono, y funcionan a modo de amortiguadores
para mantener el equilibrio ácido-base y la presión oncótica del plasma. (CuidatePlus, 2021)
2.2 Métodos Colorimétricos de cuantificación
Se conocen varios métodos colorimétricos para la cuantificación de sustancias pécticas, entre ellos los
métodos del carbazol (McCready y McComb, 1952) y del m-hidroxifenilfenol (Blumenkrantz y Asboe-
Hansen, 1973). Estas técnicas se fundamentan en la reacción del ácido 5-formil-2 furanocarboxílico,
procedente de la acción en caliente del ácido sulfúrico sobre el ácido galacturónico, con un reactivo
colorimétrico para obtener un producto coloreado que se absorbe a una determinada longitud de onda
máxima (Ros et al., 1992). Barazarte et al. (2007) encontraron que ambos métodos reproducen bastante
bien los valores de ácido anhidrogalacturónico al comparar medidas experimentales con los patrones
correspondientes.
os métodos colorimétricos de análisis permiten, mediante la medida de la variación de absorbancia de una
muestra a determinada longitud de onda, calcular la concentración de los analitos de interés. Este método
de detección puede ser usado en el ensayo LAL (lisado de amebocitos de Limulus) para endotoxinas.
2.3 Sensibilidad de los métodos de cuantificación
Actualmente, es necesario definir métodos de análisis químico y bioquímico “personalizados” y cada vez
más sensibles, teniendo en cuenta las características de la determinación analítica y la tecnología científica
disponible en ese momento. En este contexto, la sensibilidad se define como “la medida de la capacidad
de un método de análisis para diferenciar pequeñas variaciones en la concentración de analito”, es decir,
de la sustancia química presente en el material que es objeto de detección, cuantificación y/o caracterización
mediante el análisis químico de una muestra del mismo.

La química analítica se basa en la determinación cualitativa (qué es) y cuantitativa (cuánto hay) de un
analito, situando a la sensibilidad como una característica (parámetro de calidad), muy valiosa a la hora de
escoger un método de análisis u otro. Existen innumerables casos en los que un análisis químico necesita
una elevada sensibilidad para llevar a cabo su cometido, en algunas ocasiones incluso rozando la ciencia
ficción. (WordPress,2018)

2.4 Cuantificación de Proteínas

La cuantificación de proteínas es un paso importante en el control de calidad durante el flujo de trabajo de
la biología molecular, para asegurar que los pasos siguientes entreguen resultados certeros. La
Espectrofotometría con micro volúmenes le permite a los trabajadores del laboratorio estudiar materiales
proteómicos de las muestras en volúmenes muy pequeños, lo que a su vez, permite preservar aquellas
muestras que son más valiosas.
La medición de la concentración de una proteína soluble, es un ensayo vital en la investigación bioquímica
en los laboratorios y sus aplicaciones pueden ir desde estudios de enzimas hasta la entrega de
información para la fabricación en lote de productos farmacéuticos. La cuantificación de proteínas con
Espectrofotometría es un método que usa la luz ultravioleta y la espectroscopía visible para determinar de
manera rápida la concentración de proteínas. (Cromtek)
2.5 Métodos de Cuantificación
Los principales métodos empleados para la determinación de proteínas totales son los siguientes:
Método del Biuret En solución alcalina el Cu+2 reacciona con el enlace peptídico de las proteínas dando
un color purpúreo que se cuantifica espectrofotométricamente (540nm). Como estándar se utiliza una
solución de albúmina.
Proteína + Cu+2 Complejo Cu-Proteína (púrpura)
Muestra: suero o plasma (heparina o EDTA). Separar el suero del coágulo o el plasma de las células antes
de 3h. Si el paciente está acostado durante la extracción el resultado será menor. ·
Método de Lowry Dependen de la concentración de tirosina y triptófano de la muestra. Consiste en dos
reacciones:
1. Reacción de Biuret
2. Reacción de Folin: característica de los grupos –OH reductores de los aminoácidos tirosina y
triptófano que, junto con los complejos Cu+2 , reducen el reactivo de Folin generando un color
azul.
Está sujeto a muchas interferencias. Se utiliza fundamentalmente en orina.
Turbidimetría Medición de la turbidez resultante de la precipitación de proteínas
Absorción en el ultravioleta Se mide la absorbancia a 270nm originada fundamentalmente por los anillos
aromáticos de triptófano y tirosina.
Métodos de unión a colorantes NOTA: para semicuantificar la concentración de proteínas en orina se
utilizan tiras reactivas.
3. Materiales y Reactivos
3.1 Materiales
• Cubetas
• Pipeta
• Espectrofotómetro
3.2 Reactivos
• Reactivo de Brandford
• Proteína

4. Datos
Tabla 1.- Tabla de datos a agregar para la experimentación.
Cubeta Proteína (ml) Reactivo de Bradford (ml)
 1 1 2
2 2 1
3 3 0
En la tabla 1 se observan los datos utilizados para la determinación de la concentración de cada una de
las muestras obtenidas y para la experimentación de cada una de las muestras
Tabla 2.- Registro de concentración y absorbancia de la solución analizada.

Concentración (mg/L) Absorbancia

2400 0.187
1200 0.362
800 0.547
En la tabla 2 se observan los datos encontrados de la experimentación de cada una de las soluciones
analizadas. En esta podemos observar los datos de concentración de absorbancia encontradas
Tabla 3.- Tendencia de la curva de calibración

Pendiente (m) -0.0002

Ordenada en el origen (b) 0.6685
Coeficiente de correlación lineal (r) 0.9562
2
Coeficiente de determinación (r ) 0.9143
En la tabla 3 se observan los datos encontrados a partir de la curva de calibración con los datos
encontrados de la concentración y de la absorbancia.
5. Resultados y Discusión
5.1 Calcular la concentración de proteínas en las cubetas 2 y 3 sabiendo que la concentración
inicial de la solución madre de proteína es de 800mg/l.
Para poder determinar la concentración de las cubetas podemos utilizar la siguiente ecuación:
𝐶1 𝑉1 = 𝐶2 𝑉2 (1)
Para la cubeta 2, sabemos que:
𝐶1 =Concentración de la solución (800 mg/l)
𝑉1=Volumen de la solución (3ml)
𝐶2 =Concentracion de la proteína
𝑉2 = Concentración de la proteína
𝑚𝑔
800 ⁄𝐿 ∗ 3𝑚𝑙 = 𝐶2 ∗ 2𝑚𝑙
𝑚𝑔
𝐶𝑐𝑢𝑏𝑒𝑡𝑎 2 = 1200 ⁄𝐿

Para la cubeta 3, sabemos que:

𝐶1 =Concentración de la solución (800 mg/l)
𝑉1=Volumen de la solución (3ml)
𝐶2 =Concentracion de la proteína
𝑉2 = Concentración de la proteína
𝑚𝑔
800 ⁄𝐿 ∗ 3𝑚𝑙 = 𝐶2 ∗ 3𝑚𝑙
𝑚𝑔
𝐶𝑐𝑢𝑏𝑒𝑡𝑎 3 = 800 ⁄𝐿

5.2 Graficar y explicar la curva de calibración usando los datos de la Tabla 2

Concentracion vs Absorbancia
0.6

0.5

0.4
Absorbancia

0.3

0.2 y = -0.0002x + 0.6685

R² = 0.9143
0.1

0
0 500 1000 1500 2000 2500 3000
Concentracion

5.3 Se mezcla 1 ml de una muestra problema con reactivo de Bradfort, para un volumen total
de 3ml. Calcula la concentración en mg/l de proteínas en la muestra de partida si el ensayo
ha proporcionado un valor 𝑨𝟓𝟗𝟓 = 𝟎. 𝟒𝟑𝟐
Datos
𝑽𝑩𝒓𝒂𝒏𝒅𝒇𝒐𝒓𝒕 = 𝟏𝒎𝒍

𝑽𝒕𝒐𝒕𝒂𝒍𝒆𝒔 = 𝟑𝒎𝒍
𝑨𝟓𝟗𝟓 = 𝟎. 𝟒𝟑𝟐
𝑽𝑷𝒓𝒐𝒕𝒆𝒊𝒏𝒂𝒔 = 𝑽𝒕𝒐𝒕𝒂𝒍𝒆𝒔 − 𝑽𝑩𝒓𝒂𝒏𝒅𝒇𝒐𝒓𝒕

𝑽𝑷𝒓𝒐𝒕𝒆𝒊𝒏𝒂𝒔 = 𝟐𝒎𝒍
𝑨𝟏 𝑨𝟐
=
𝑪𝟏 𝑪𝟐
De la tabla 2, sabemos que:
Para 2 ml de proteína tenemos:
𝑐1 = 1200
𝐴1 = 0.362
𝐴2 = 0.432

𝟎. 𝟑𝟔𝟐 𝟎. 𝟒𝟑𝟐
=
𝟏𝟐𝟎𝟎 𝑪𝟐
𝑪𝒂 𝟓𝟗𝟓 = 𝟏𝟒𝟑𝟐. 𝟎𝟏𝟏 𝒎𝒈/𝑳
5.4 Explique el fundamento de la reacción del método de Bradford para la cuantificación de
proteínas
Este método constituye una forma rápida y confiable para determinar la concentración de proteínas. Se basa
en la cuantificación de la unión del colorante Azul Brillante de Coomassie a una proteína desconocida y la
comparación de esta unión con la de diferentes cantidades de una proteína standard
5.5 Indique, la razón por la cual el análisis se realiza a 595 nm
La absorción de la solución de la muestra a 595 nm sirve como magnitud de medición para la concentración
de proteínas. El colorante posee afinidad con los aminoácidos básicos y aromáticos. Se estudiaron
intensamente la dependencia respecto al tipo de proteínas y las posibles interacciones con diferentes
reactivos, que son mas visibles en este valor.
5.6 Indique, los estándares de proteínas que se utilizan para construir la curva de calibración
De la curva de calibración (conjunto de concentraciones que describen el intervalo en el cual se deberá
cuantificar el compuesto por analizar) y a fin de asegurar que la recta encontrada con los puntos
experimentales se ajuste correctamente al modelo matemático de la ecuación se calculan los valores de la
ordenada al origen, la pendiente y el coeficiente de determinación.
5.7 Compare la sensibilidad del método Bradford con otros métodos de cuantificación de
proteínas
Metodo de Biuret: Se basa en la formación de un complejo coloreado entre el Cu2+ y los grupos NH
de los enlaces peptídicos en medio básico. 1Cu2+ se acompleja con 4 NH. La intensidad de coloración
es directamente proporcional a la cantidad de proteínas (enlaces peptídicos) y la reacción es bastante
específica, de manera que pocas sustancias interfieren. La sensibilidad del método es muy baja y sólo
se recomienda para la cuantificación de proteínas en preparados muy concentrados (por ejemplo en
suero). Con un rango de sensibilidad entre 1000-10000.
Métodos de BCA: El ácido bicinconínico, sal sódica, es un compuesto capaz de formar un complejo
púrpura intenso con inones Cu1+ en medio alcalino. Este reactivo forma la base de un método analítico
capaz de monitorizar el ión cuproso producido en una reacción entre las proteínas con Cu2+ en medio
alcalino (reacción de Biuret). La estabilidad del reactivo y el cromóforo proporciona un método para la
cuantificación de proteínas que es sencillo, rápido, muy sensible, y que muestra una gran tolerancia a
compuestos que afectan a otros métodos. Con un rango se sensibilidad entre 0.5-10.
Método de Lowry El ensayo de proteínas de Lowry es un ensayo bioquímico para la determinación
del nivel total de proteínas en una disolución. La concentración total de proteínas se detecta por la
diferencia de color con una disolución de muestra, que es medida utilizando técnicas de colorimetría,
con una sensibilidad de 25-100 a 500nm, a 2-30 a 660nm y de 1-2 a 750nm.
5.8 Discuta los resultados obtenidos
 Pudimos determinara las diferentes concentraciones requeridas mediante los datos obtenidos, los cuales
son acertados ya que son muy cercanos dando cierta correlación en la experimentación, además de
identificar cada uno de las diferencias entre los diferentes métodos de obtención de proteínas y sus
sensibilidades en cada uno de los casos.
6. Conclusiones
En el laboratorio pudimos observar las características fisicoquímicas de las proteínas, donde pudimos
definir químicamente las proteínas, con las cuales pudimos determinar una curva de calibración
espectrofotométrica, los cuales fueron hallados por espectrofotómetro de una solución de reactivo de
Bradford y la proteína. Además, adquirimos conocimientos teóricos de diferentes métodos de identificación
de proteínas.
7. Cuestionario
a. Indique los componentes del reactivo de Bradford
El reactivo de Bradford: 100mg Colorante Coomassie Brillant Blue G-250, se disuelven en 50ml de etanol
y 100 ml de ácido fosfórico al 85%.

b. Si pretendiera cuantificar la concentración de proteínas en una muestra de leche ¿Qué

método emplearía?
Creo que el método que usaría para la cuantificación de proteínas de la leche, un buen método seria el de
Bradford, o también el método de Lowry.

c. ¿Podría utilizar la espectrofotometría con la luz UV para cuantificar proteínas?

Si se podría utilizar espectrofotometría para la cuantificación de proteínas mediante un método que usa
la luz ultravioleta y la espectrometría visible para determinar la concentración de las proteínas

d. Investigue los métodos no espectrofotométricos para identificar proteínas, explique el

fundamento y el uso.
Electroforesis: Una partícula cargada se la desplaza a un campo eléctrico, la cual contiene partículas
cargadas haciendo que las cargas negativas migren hacia el ánodo o polo positivo mientras que las cargas
positivas migran hacia el electrodo negativo, todas las proteínas migran hacia el ánodo (carga negativa)
dando un pH de 8.6

Inmunoelectroforesis: Es una inmunodifusión en la que se aplica una corriente eléctrica para separa
proteínas de la muestra.

Inmunoelectroforesis en cohete: Es una técnica cuantitativa equivalente a la inmunodifusión radial, en la

cual se incorpora al de manera que el Ac (antisuero) no puede migrar.

Inmunofijación: Consiste en una separación electroforética de las proteínas de la muestra seguido del
contacto del gel.

8. Biliografia
1. CuidatePlus (2021) En: PROTEINAS Disponible en:
https://cuidateplus.marca.com/alimentacion/diccionario/proteinas.html (Revisado 27/5/21)
2. Humberto Barazarte (2010) En: CUATIFICACION DE PROTEINAS Disponible en:
http://ve.scielo.org/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S1316-
 33612010000200010#:~:text=Se%20conocen%20varios%20m%C3%A9todos%20colorim%C3%A
9tricos,Asboe%2DHansen%2C%201973).&text=El%20m%C3%A9todo%20del%20carbazol%20ha,
y%20San%20Juan%2C%202000). (Revisado 27/5/21)
3. FUJIFILM (2018) En: METODO COLORIMETRICO Disponible en:
https://www.wakopyrostar.com/blog-es/kit-lal/post/uso-del-metodo-colorimetrico-en-el-
ensayo-de-lal/ (Revisado 27/5/21)
4. Dr. Justo Giner Martinez-Sierra (2017) En: SENSIBILIDAD QUIMICA Disponible en:
https://justoginer.com/2018/02/13/sentido-y-sensibilidad-en-los-metodos-de-analisis-
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5. Alexandra Acosta Diaz (2020) En: METODOS DE CUANTIFICACION Disponible en:
https://repository.javeriana.edu.co/bitstream/handle/10554/52072/M%C3%89TODOS%20Y%20
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20LA%20INDUSTRIA%20DE%20ALIMENTOS.pdf?sequence=1&isAllowed=y (Revisado 27/5/21)