LABORATORIO No. 8.

EXTRACCIÓN E IDENTIFICACIÓN DE ADN

OBJETIVOS

Comprender el fundamento teórico de técnicas de extracción y purificación de DNA y sus

aplicaciones.

Familiarizarse con métodos de separación electroforética de ácidos nucleicos

FUNDAMENTO TEÓRICO
El ADN es el material genético de todos los organismos. La extracción y purificación de ADN es
el primer paso de muchos experimentos en biología molecular, entre ellos cuando queremos
estudiar genoma entero o clonación de un gen.
El ADN se desnaturaliza por distintos factores (Calentamiento, pH, medio salino, interacción con
sustancias, entre otras) y experimenta un desenrollamiento y separación de las dos hebras
polinucleotídicas que la componen. La desnaturalización es un proceso que puede llevarse a cabo
de manera parcial (por fragmentos) y localizada de acuerdo con la abundancia de pares de bases
GC y TA (Figura 1). Por poseer un enlace de hidrógeno adicional el par GC sobre el TA, el primer
par requiere mayor energía para disociarse que el segundo; dicho requerimiento energético influye
directamente en la temperatura de fusión (Tm) del ADN la cual corresponde a la temperatura donde
la mitad del par de cadenas se encuentra disociada.
La desnaturalización del ADN conlleva una mayor exposición de los nucleótidos que en un
principio yacen en el interior de la doble hélice y se aumenta la probabilidad de que los fragmentos
de piridina y purina interactúen con la luz incidente del espectrofotómetro. Un aumento en la
probabilidad de absorción se reflejado en el coeficiente de absortividad molar como un resultado
directo de la desnaturalización, por lo que se puede cuantificar el grado apertura de cadena
midiendo que tanto absorbe las cadenas de ADN en la longitud de onda de mayor absorción (260
nm). A dicho fenómeno se denomina corrimiento hipercrómico.
 Figura 1. Desnaturalización del ADN.
La concentración de sal tiene un efecto inverso sobre la pareja de cadenas del ADN pues este
presenta menor desnaturalización a mayor concentración de sal por reducción de repulsiones de
grupo fosfatos intercadena gracias a la presencia de cationes monovalentes.
Cuando se realizan procesos de extracción de ADN, se deben tener en cuenta tres pasos:
 Lisis celular
Las células se lisan, usando medios mecánicos y químicos. La pared celular, membrana celular y
membrana nuclear deben ser alteradas para liberar el ADN. Las membranas celulares están
constituidas por proteínas y lípidos, los cuales pueden ser disueltos con detergentes. Las bacterias,
levaduras y células vegetales poseen una pared celular que puede ser alterada por fuerza mecánica
o digestión enzimática.
 Purificación
Una vez que las células se rompen, todo el contenido celular se mezcla, por ello es importante
realizar un proceso de purificación, sabiendo que la mayoría de las manipulaciones de ADN
requieren que el ADN esté libre de proteínas y ARN. Para su degradación o eliminación se puede
usar enzimas s, calor, ciertos químicos y solventes orgánicos como el fenol, entre otros
 Precipitación y concentración
El ADN es soluble en agua e insoluble en alcohol. Para visualizar el ADN, se agrega etanol al
lisado celular. El ADN formará una masa fibrosa en la interfaz del alcohol y las capas acuosas. En
el laboratorio se colecta esta masa de ADN por centrifugación y se puede suspender en buffer o en
agua. El ADN es una molécula extremadamente estable y puede almacenarse durante años.

La electroforesis es la migración de una partícula cargada en un campo eléctrico. Las biomoléculas

poseen grupos ionizables y existen en solución como especies cargadas. Existen muchos tipos de
electroforesis, que se agrupan en dos categorías fundamentales: 1) electroforesis de frente móvil y
2) electroforesis de zona. Actualmente, sólo se utiliza la electroforesis de zona, en la cual la
muestra se desplaza sobre un soporte sólido, como papel de filtro, celulosa o gel (principalmente
agarosa o acrilamida) y los componentes de la muestra migran en forma de pequeñas bandas,
también llamadas zonas.

La separación de ácidos nucleicos, que tiene múltiples aplicaciones (análisis de PCR, análisis de
mapas de restricción, Southern-bloting, Northern-bloting, entre otros), tradicionalmente se lleva a
cabo empleando la electroforesis en gel. El material más empleado es la agarosa, polímero de
residuos alternos de D-galactosa y 3,6-anhidro-Lgalactosa unidos por enlaces glicosídicos, a partir
del cual es posible recuperar las muestras por procedimientos sencillos. El gel se comporta como
un tamiz molecular, que permite separar las moléculas en función de su tamaño y forma. La
migración por cada molécula es inversamente proporcional al logaritmo de su peso molecular. En
ácidos nucleicos se emplea el término pares de bases (pb) para definir el tamaño de un fragmento.
La solución de corrida es un buffer pH 8,0 con el cual se asegura la existencia de formas aniónicas,
que se desplazarán al ánodo. La determinación del peso molecular es relativa al desplazamiento
de marcadores de tamaño conocido (marcadores de bajo peso molecular, cada 100pb o de alto peso
molecular cada 1kb), los cuales se adquieren comercialmente o pueden obtenerse a partir de la
digestión de un genoma conocido con una enzima de restricción específica como por ejemplo el
del bacteriófago Lambda con corte enzimático de HindIII.

La visualización de los ácidos nucleicos, se realiza mediante la adición de bromuro de etidio (EtBr)
u otros compuestos, al gel de agarosa. El Et-Br se intercala entre las bases del DNA y emite luz
naranja cuando se ilumina con luz ultravioleta (UV). Finalizada la electroforesis, se visualiza el
gel con una lámpara de luz UV, y se verán las bandas correspondientes a los ácidos nucleicos
separados. El límite de detección del Et-Br es de 2ng por mm cuando se ilumina el gel con UV de
254nm y de 20ng por mm cuando se emplea UV de 366nm. Como el Et-Br se intercala en el DNA,
esta sustancia tiene un poderoso efecto mutágeno y, posiblemente puede ser cancerígeno o
teratógeno. Actualmente existen otros compuestos que cumplen con la función del bromuro de
etidio pero que no tienen efecto mutagénico, como el SyBR Safe (Invitrogen).

Es posible igualmente realizar la visualización de los ácidos nucleicos mediante coloración con
azul de metileno, procedimiento más seguro de usar ya que no es tóxico, aunque menos sensible
puesto que su límite de detección es de 0,5–2,5 microgramos, además requiere mayor tiempo de
incubación, alcanzando el orden de 1 a 4 h a temperatura ambiente o toda la noche a 4ºC.

Al visualizar DNA plasmídico en gel de agarosa la conformación de la molécula es un factor que

también afecta la migración. Un plásmido A con un tamaño definido, se presentará a menudo en
tres bandas, que corresponderán a las tres formas principales con las que migra el DNA en función
de su grado de enrollamiento (circular, enrollada y superenrollada), las cuales se movilizan de
menor a mayor velocidad respectivamente. La resolución de los geles de agarosa va de 50pb a
algunas Mb, con el uso de concentraciones de agarosa del 3% al 0,5%, respectivamente.
MATERIALES Y REACTIVOS.
0.2 M NaCl, 0.5 M NaHCO3
SDS 20%
Etanol Absoluto
de solución salina de EDTA
de perclorato de sodio 6M,
de cloroformo-alcohol isoamílico (24:1)
Buffer borato 0,05M, pH 8,5
*Formulación de soluciones para la electroforesis de DNA en geles de agarosa
Buffer de corrida TAE 1X -Solución amortiguadora de electroforesis Tris:-Acetato-EDTA
Tris 40 mM, Acetato 20 mM, EDTA 1 mM
Buffer de corrida TBE 0,5X -Solución amortiguadora de electroforesis Tris-Borato-EDTA
Tris 44,5 mM, Borato 44,5 mM, EDTA: 1 mM
Buffer TE 1X
Solución de Tris EDTA (10:1): Tris-HCl pH 8,0 10 mM, EDTA 1 mM
Buffer carga de muestra 6X
Glicerol 50 %, Azul de bromofenol 0,02% en buffer TE
Solución Azul de metileno 0,025%

Mortero, Embudo , Erlenmeyer 100 mL, Pipeta graduada 10 mL, Vaso de precipitados , Balón
aforado 25 mL, Balón aforado 10 mL, Tubos de plástico para centrifuga , Centrifuga refrigerada,
Balanza analítica, Micropipeta de 100 L, Microcentrífuga, microondas o placa calefactora,
equipo de electroforesis (cubeta, soporte, peine, fuente de alimentación).

PROCEDIMIENTO

I. EXTRACCIÓN

Protocolo de frutas/vegetales (Será realizado por grupos IMPARES)

Pesar 20 g de la fruta o vegetal. Agregar 10 ml de buffer de extracción de ADN (0.2M NaCl, 0.5M
NaHCO3). Macerar en un mortero frío hasta ver una suspensión homogénea (si es necesario,
agregue arena lavada para generar la lisis completa del material). Filtrar el líquido a través de una
gasa triple y recoger el filtrado en un tubo de ensayo. En caso de observar partículas grandes en
suspensión, centrifugue a 2000 RPM por 5 minutos. Con una pipeta agregue 2 ml de solución
detergente (SDS 20%) al tubo de ensayo. Lentamente agregue aproximadamente 5 ml una solución
de precipitación compuesta por etanol al 75% o mejor absoluto, a lo largo del lado del tubo de
ensayo. Se debe formar una capa en la parte superior del extracto filtrado. Esto ayudará a agrupar
el ADN. Sumerja una varilla de vidrio en el tubo, justo donde está el etanol. Gire la varilla de
vidrio suavemente y observe que una fibra gelatinosa se enrollará en la varilla de vidrio. Esta
hebra es el ADN extraído. Resuspenda este ADN en 4 mL de agua con 0,2 mL de EDTA. Medir
la absorbancia a 260 nm.

Protocolo Levadura (será realizado por grupos PARES)

Pesar 2,5 g de levadura y se llevar al mortero con 5 g de arena lavada. Macerar durante 5 minutos.
Transferir esta mezcla a un erlenmeyer y agregar 5 mL de solución salina de EDTA, agitando
suavemente durante 1 minuto y posteriormente adicionar 1 mL de SDS 20%. Homogenice la
suspension y caliente a 60°C por 10 minutos. Cuando se enfríe nuevamente, añadir 2,5 mL de
perclorato de sodio 6M, 20 mL de cloroformo-alcohol isoamílico (24:1) y agitar durante 15
minutos. Esta solución se centrifuga a 1000 rpm 10 min. Retirar la fase acuosa superior amarilla y
depositarla en un Erlenmeyer. Agregar 15 mL de etanol y mezclar lentamente con una varilla de
vidrio. Centrifugar a 2500 rpm por 5 minutos. Descartar el líquido sobrenadante. El precipitado se
disuelve en 4 mL de agua con 0,2 mL de EDTA y se mide el volumen final. Medir la absorbancia
a 260 nm.

II. EFECTO DEL pH Y AL TEMPERATURA SOBRE EL ADN

Preparación solución stock 1

En un vaso de precipitado prepare 50 ml de ADN en NaCl 0.15%, asegurando que la absorbancia a 260
nm se encuentre cercana a 1,0 +_ 0,3 unidades. Determine al lectura también a 280 nm.

 Efecto del pH

1. Rotular 6 tubos de ensayo.

2. Adicionar las cantidades indicadas en la tabla 1.
3. Medir absorbancia a 260 nm.

Tabla 1. Muestras experimentales del efecto del pH en el ADN.

Tubo B 1 2 3 4 5

Solución stock 1 (mL) - 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5

Buffer borato 0.05 M (mL) 3.0 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5

pH buffer 8.5 8.5 9.5 10.5 11.5 12.5

 ● Efecto del calentamiento y rápido enfriamiento

1. Rotular 6 tubos de ensayo.

2. Adicionar las cantidades indicadas en la tabla 2.
3. Calentar a las temperaturas señaladas durante 15 min.
4. Terminado el tiempo de calentamiento pasar inmediatamente los tubos a un baño de hielo.
5. Medir absorbancia a 260 nm.

Tabla 2. Muestras experimentales del efecto del calentamiento y rápido enfriamiento en el ADN.
Tubo B 1 2 3 4 5

Solución stock 1 (mL) - 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5

Buffer borato 0.05 M, pH 8.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5
(mL)

NaCl 0.15% (mL) 1.5 - - - - -

Temperatura (°C) 37 20 37 60 80 90

III. ELECTROFORESIS

1. Preparación del gel de agarosa al 1%

En un matraz pesar 0,5 g de agarosa y suspender en 40 mL de agua destilada. Fundir la suspensión
de agarosa en un microondas o placa calefactora (Manejar con precaución la solución de agarosa
caliente, la agitación puede causar salpicaduras y con ello provocar quemaduras). Adicionar buffer
de electroforesis TBE 5X o TAE 50X en la cantidad necesaria para alcanzar la concentración
deseada de buffer de corrido (TBE 0,5X o TAE 1X). Dejar enfriar la suspensión hasta que alcance
unos 50ºC aproximadamente.. Sellar con cinta adhesiva el soporte donde se verterá el gel de
agarosa y colocar el peine que servirá para formar los pocillos de aplicación de muestra en el gel.
Una vez que la solución de agarosa ha alcanzado 50ºC aproximadamente, se vierte en el soporte,
previamente sellado. Permitir la polimerización durante unos 30 minutos.

2. Preparación de las muestras de DNA

A 200 ng APROXIMADAMENTE del DNA aislado se añaden buffer de carga 6X hasta
concentración de uso 1X.

3. Electroforesis
Retirar la cinta adhesiva con la que se ha sellado el soporte del gel y colocar en la cubeta de
electroforesis. Añadir buffer de electroforesis 0,5X TBE o 1X TAE, de acuerdo con el buffer que
se haya preparado el gel, hasta que cubra bien el gel de agarosa. Cargar 10μL de la muestra
preparada en el gel y marcador de peso molecular, cada uno en pozos diferentes del gel. Correr la
electroforesis a 100 Volts durante 30-45 minutos. Finalizada la electroforesis visualizar los
fragmentos de DNA mediante luz UV y documentar la imagen.
4. Visualización del DNA
Sumergir el gel en una solución 0,025% de azul de metileno por 30 minutos. Eliminar los excesos
de reactivo de tinción destiñendo en agua destilada de 5 a 30 minutos. El DNA es visible cuando
se observa en una lámpara de luz blanca en el caso de azul de metileno. Documentar el gel.
Preparar una recta de calibrado con los pesos moleculares de los marcadores en función de la
distancia recorrida en la electroforesis e interpolar las distancias recorridas por los distintos estados
de enrollamiento del plásmido para conocer su tamaño molecular.

Precauciones
• Usar guantes durante toda la práctica para evitar el contacto con productos tóxicos y la
degradación de las muestras.
• Cada punta de micropipeta se usará una sola vez, para evitar la contaminación de las muestras.
• La luz UV puede dañar los ojos. Antes de conectar la lámpara de luz UV colocar una pantalla
o gafas protectoras.
• En caso de dudas, antes de actuar, preguntar al profesor.

REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS
• Anzola C., López E. (2005). Guías de laboratorio de bioquímica. Extracción de DNA y estudio
de algunas propiedades. Pp 29.
• Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Sambrook J, Russell D. 3rd edition, Vols 1–3. New
York: CSH Laboratory Press, 2001
• E. coli Plasmid Vectors: Methods and Applications. Edited by Nicola Casali Andrew Preston.
Humana Press, 2006
• PCR Strategies. Edited by Michael A. Innis, David H. Gelfand and John I. Sninsky. Academic
Press, Inc., 1995
• Molecular Biology techniques: an Intensive laboratory course Wald Ream, E.G. Rield, 2005
• Gene Cloning and Manipulation. Christopher Howe. Cambridge University Press, 2006