3.4 Microscopia Optica

MICROSCOPIA OPTICA
(Yang Leng)
La microscopia óptica es el medio primordial para los científicos e ingenieros que estudian la
microestructura de los materiales. El invento del microscopio óptico se remonta a los 1880,
desde entonces ha sido utilizado por investigadores metalúrgicos para estudiar los metales
siendo la técnica denominada metalografía.
1.1 Principios Ópticos

Los principio ópticos de los microscopios con:
 La formación de la imagen
 Aumento
 Resolución
1.1.1 Formación de la Imagen
Figura 1.1. Generación de una imagen real en una pantalla o en la película de una cámara
Figura 1.2.
Cuando miramos una microestructura con nuestros ojos, el camino de la luz atraviesa una
lente ocular para formar una imagen virtual en la retina del ojo humano. La imagen virtual es
invertida respecto al objeto.
El aumento o magnificación se puede calcular por óptica lineal, a partir del análisis de una
lente convergente en la que el aumento es:
𝑣−𝑓
𝑀= 𝑓
ec 1
Donde f es la distancia focal de la lente y v es la distancia entre la imagen y la lente. Una lente
de alto aumento tiene una distancia focal más corta.
El aumento o magnificación en un microscopio como el de la Fig 1.1 es la multiplicación entre

el aumento de la lente objetivo por el aumente de la lente del proyector
M = M1*M2 Ec 2
1.1.2. Resolución
Naturalmente nos preguntamos si hay una limitación en el aumento logrado en los
microscopios ópticos (MO) porque según la ec. 2 aparentemente no la hay.
Un aumento con significación en un MO está limitado por su resolución.
La Resolución es la distancia mínima entre dos puntos a la cual pueden ser visiblemente
distinguidos como dos puntos.
La resolución de un microscopio está teóricamente controlada por la difracción de la luz.

Esto puede ser ilustrado con las imágenes de dos puntos auto-luminosos como objetos.
Cuando el objeto de punto es magnificado, su imagen es un núcleo (spot) central rodeado de
una serie de anillos de difracción denominado Airy Disc (Figura 1.3) y no es un solo núcleo.
El disco de Airy es un fenómeno óptico. Debido a la naturaleza ondulatoria de la luz, cuando

ésta atraviesa una apertura circular se difracta produciendo un patrón de interferencia de
regiones iluminadas y oscuras sobre una pantalla alejada de la apertura.
El patrón de difracción resultante en una apertura circular iluminada uniformemente tiene una
región central brillante conocida como disco de Airy rodeada de una serie de anillos
concéntricos denominados patrón de Airy (ambos nombrados así en honor a George Airy).
El diámetro del disco central está relacionado con la longitud de onda de la luz y el tamaño de
la abertura circular.
La más importante aplicación de este concepto está en cámaras y telescopios. Debido a la

difracción, el punto más pequeño en el que se puede enfocar un rayo de luz usando una lente
tiene el tamaño de un disco de Airy. Así, incluso teniendo una lente perfecta, aún existe un
límite para la resolución de una imagen creada por dicha lente. Un sistema óptico en el que la
resolución no está limitada por imperfecciones en las lentes sino sólo por difracción se dice
que está limitado por difracción.
Tamaño del disco de Airy

Lejos de la apertura del sistema óptico el ángulo en el que se produce el primer mínimo de la
intensidad luminosa y medido a partir del eje óptico de la luz incidente viene determinado por
la siguiente expresión:
donde λ es la longitud de onda y d es el diámetro de la apertura. El criterio que se utiliza para

determinar si un sistema óptico resuelve dos focos de luz independientes es que el centro del
disco de Airy para el primer objeto debe estar como mínimo a la distancia del primer mínimo
del patrón de difracción del segundo objeto. De este modo la resolución angular de un sistema
óptico limitado por difracción viene dada por la misma fórmula.
Para distinguir dos objetos de punto auto-luminosos separados por una distancia corta, los
núcleos no deben traslaparse severamente uno sobre el otro. Entonces la clave para controlar
la resolución es controlar el tamaño de los núcleos. El tamaño de los núcleos (d) está
relacionada a la longitud de onda de la luz (λ) y el ángulo de la luz que llega a la lente. La
resolución de un microscopio está definida como la distancia mínima entre dos discos Airy que
pueden ser distinguidos (Figura 1.4). La resolución es función de los parámetros de
microscopio:
𝑑 0.61𝜆
2
= µ𝑠𝑒𝑛𝛼
ec 3
Donde µ es el índice de refracción del medio entre el objeto y la lente objetivo y α es el ángulo
mitad del cono de luz que ingresa a la lente objetivo (Fig 1.5). El producto µ𝑠𝑒𝑛𝛼 se denomina
apertura numérica (NA).
De acuerdo a la ec 3 para alcanzar alta resolución se debe utilizar longitudes de onda de luz
más cortas y más grande NA. La longitud de onda más corta de la luz visible es 400 nm
mientras que NA de la lente depende de α y el medio entre la lente y el objeto.
Para el aire µ = 1 y para aceite µ = 1.5. Por tanto el máximo valor de NA es 1,5.
Se estima que la mejor resolución de un microscopio óptico es cerca de 0.2 µm.
Aumento Efectivo.-
El aumento tiene significado solo si el ojo humano puede ver los detalles resueltos por el
microscopio. El microscopio debe agrandar los detalles a 0.2 mm que es el nivel de resolución
del ojo humano. Por tanto, el aumento efectivo del microscopio debería ser aproximadamente
0.2
𝑀𝑒𝑓 = 0.2∗10−3 = 1000
Un aumento más alto que el aumento efectivo solo hace la imagen más grande pero no provee
de más información de detalle.
Brillo y Contraste.
 El Brillo se refiere a la intensidad de luz. En los microscopios de luz transmitida, el brillo
está relacionado a la apertura numérica (NA) y al aumento.
(𝑁𝐴)2
𝐵𝑟𝑖𝑙𝑙𝑜 =
𝑀2
En los microscopios de luz reflejada el brillo es mas dependiente de la NA
(𝑁𝐴)4
𝐵𝑟𝑖𝑙𝑙𝑜 =
𝑀2
Estas relaciones indican que el brillo decrece rápidamente con el incremento del aumento y
que NA es el parámetro controlante de la resolución pero también del brillo.
 Contraste.- Se define como el cambio relativo de la intensidad de luz (I) entre un
objeto y su fondo.
1.1.2 Profundidad de Campo.

La profundidad de campo es un concepto importante cuando se fotografía una imagen. Se
refiere el rango de posición para un objeto en la que la nitidez de imagen no cambia. Como se
ilustra en la Figura 1.6 la imagen de un objeto está en foco cuando el objeto descansa en un
plano dentro de cierta distancia de la lente objetivo. La imagen esta fuera de foco cuando el
objeto descansa o más cerca o más lejos de la lente. Como el efecto de difracción limita la
resolución R, no muestra ninguna diferencia a la nitidez de la imagen si el objeto esta dentro
del rango de Df mostrado en la Figura 1.6. Entonces la profundidad de campo puede ser
calculad como:
𝑑 2𝑅 1.22𝜆
𝐷𝑓 = 𝑡𝑎𝑛𝛼 = tan 𝛼
= µ𝑠𝑒𝑛𝛼𝑡𝑎𝑛𝛼 ec 7
La Ec 7 indica que no se puede obtener una profundidad de campo grande y una alta
resolución al mismo tiempo. Un Df grande requiere de una R grande por tanto resolución mas
pobre. Se puede reducir el ángulo α para obtener una mejor profundidad de campo.

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1.1 Principios Ópticos

1.1.1 Formación de la Imagen

El aumento o magnificación en un microscopio como el de la Fig 1.1 es la multiplicación entre

Un aumento con significación en un MO está limitado por su resolución.

La resolución de un microscopio está teóricamente controlada por la difracción de la luz.

El disco de Airy es un fenómeno óptico. Debido a la naturaleza ondulatoria de la luz, cuando

La más importante aplicación de este concepto está en cámaras y telescopios. Debido a la

Tamaño del disco de Airy

donde λ es la longitud de onda y d es el diámetro de la apertura. El criterio que se utiliza para

Se estima que la mejor resolución de un microscopio óptico es cerca de 0.2 µm.

En los microscopios de luz reflejada el brillo es mas dependiente de la NA

1.1.2 Profundidad de Campo.

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