Tecnología en regencia de farmacia Junio de 2018 1

MARCHA FITOQUIMICA Y TECNICAS

CROMATOGRAFICAS
Julián S. Cifuentes1, Derly J. Delgado2 e Ingrid Y. Quintana3
Corporación tecnológica de Bogotá - CTB
Estudiantes de Fitoquímica – profesor. Oscar J. Yépez
Bogotá DC – 13 junio 2018

RESUMEN

Las plantas en general son organismos fotosintéticos que poseen metabolitos vegetales primarios o
secundarios, donde los primarios intervienen directamente en sus procesos de supervivencia, mientras que
los secundarios, tienen la capacidad de producir sustancias que no intervienen de manera directa en su
desarrollo, siendo estos últimos vitales en el proceso de una marcha fitoquímica preliminar. El presente
artículo describe, los metabolitos encontrados en la especie vegetal del Rosmarinus Officinialis, por medio
de pruebas específicas para cada metabolito secundario, dependiendo de sus características químicas y
estructurales.
Se da a conocer la metodología empleada para la separación de Metabolitos secundarios presentes en el
extracto etanolito de Rosmerinus Officinialis por medio de técnicas de cromatografía en capa delgada la
cual da como resultado la presencia de manchas de color verde y rojo en las placas de cromatografía y
cromatografía de columna de la cual se obtuvieron fracciones que fueron nuevamente analizadas por
cromatografía de placa delgada, dando como resultado la presencia de color verde y rojo en las placas,
determinando de esta manera cuál de las fases móviles propuestas en el desarrollo del laboratorio era la que
presentaba un mejor arrastre y separación de los compuestos presentes en el extracto etanolito.

Palabras clave: Adsorción, Absorción, Cromatografía en capa delgada, Cromatografía en columna, Fase
Móvil, Fase estacionaria.
ABSTRACT

Plants in general are photosynthetic organisms that have primary or secondary plant metabolites, where the
primary ones intervene directly in their survival processes, while the secondary ones, have the capacity to
produce substances that do not intervene directly in their development, the latter being vital in the process of a
preliminary phytochemical march. The present article describes the metabolites found in the plant species of
Rosmarinus Officinialis, by means of specific tests for each secondary metabolite, depending on its chemical
and structural characteristics.
The methodology used for the separation of secondary Metabolites present in the ethanolito extract of
Rosmerinus Officinialis is disclosed by means of thin layer chromatography techniques which results in the
presence of green and red spots on the chromatography plates and column chromatography from which fractions
were obtained that were again analyzed by thin-layer chromatography, resulting in the presence of green and red
in the plates, thus determining which of the proposed mobile phases in the development of the laboratory was
the that presented a better entrainment and separation of the compounds present in the ethanolito extract.

Keywords: Adsorption, Absorption, Chromatography in thin cap, Chromatography in column, Mobile

Phase, stationary Phase.
INTRODUCCIÓN máximo de la parte superior de la placa. El
revelado de la placa tiene como finalidad
La Cromatografía fue generada por el ruso evidenciar el estado en el cual queda cada uno de
Michael Tswett en 1906, quien le dio el nombre de los analitos en la placa cuando estos no generan
cromatografía que en griego significa escritura a ningún tipo de coloración visible, se pueden
color, este método lo empleo inicialmente para emplear métodos de revelado con procesos
separar los compuestos de distintos colores de químicos donde la placa es pulverizada en un
extractos de hojas verdes de las plantas, de esta recipiente y se agrega un reactivo que reaccione
manera pudo determinar que no solo la clorofila es con el analito generando compuestos visibles o se
la encargada de dar pigmentos a las plantas. puede trabajar con procesos de revelado físico
La Cromatografía es una técnica de separación por como irradiar con luz U.V para detectar la
medio de la cual los componentes de una muestra presencia de compuestos fluorescentes.
se distribuyen en dos fases de diferente naturaleza, Por último, se genera el análisis cuantitativo o
generando una diferencia en la velocidad en la que cualitativo, este se realiza contemplando las
cada sustancia es arrastrada por una fase móvil distancias recorridas por analitos por la placa con
(Fase liquida o gaseosa) que fluye a través de una respecto a la de los patrones, este parámetro es
fase estacionaria (Fase Sólida) donde son llamado factor de reparto o de retraso (RF).
retenidos.
Las primeras técnicas de cromatografía que se
emplearon fueron la Cromatografía en capa
delgada y la Cromatografía de Columna.

La Cromatografía en capa delgada es una técnica

analítica y sencilla, empleada principalmente en
laboratorios de química orgánica, consiste en la
utilización de una placa para cromatografía de
Imagen 1 tomada de Google
capa delgada, esta placa por lo general de aluminio
tiene adherida la fase estacionaria polar (Sílica
gel),se realiza la siembra de la muestra problema
en la parte inferior de la placa donde previamente
se traza una línea horizontal de lado a lado de la
placa, esta placa es depositada en una cubeta
cromatografía , de manera que la parte inferior de
la placa entre en contacto con la fase móvil
teniendo en cuenta que los puntos que se
sembraron no queden inmersos en esta. La fase
móvil recorre la placa de manera ascendente
generando separación de los compuestos presentes
de la muestra problema, se diferencia con la Imagen 2 tomada de Google

cromatografía en columna en que en la La cromatografía en columna está caracterizada

cromatografía de capa delgada el analito no por que la fase estacionaria está formada por
abandona el lecho cromatográfico si no que se pequeñas partículas que rellenan un tubo o
detiene antes de que la fase móvil llegue al columna. La columna puede ser de vidrio o de
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cualquier material inerte, la fase estacionaria es gran cantidad de aportaciones científicas que
preparada de manera manual, el flujo de la fase brindan amplia información de las aplicaciones del
móvil es por gravedad, la muestra se aplica de romero más allá de sus usos culinarios.
manera manual, requiere de un tiempo prolongado De manera general, la composición química del
para generar la separación de los analitos y se aceite esencial de romero ha sido descrita en
recogen fracciones las cuales son analizadas con la trabajos que indican el tipo de moléculas activas
aplicación de otras técnicas. presentes. Se ha identificado la presencia de α-
La eficiencia en esta técnica es baja, razón por la pineno, β-pineno, canfeno, ésteres terpénicos
cual ha sido reemplazada casi en su totalidad por como el 1,8-cineol, alcanfor, linalol, verbinol,
la cromatografía liquida de alta eficiencia (HPLC). terpineol, carnosol, rosmanol, isorosmanol, 3-
octanona, isobanil-acetato y β-cariofileno; los
ácidos vanílico, caféico, clorogénico, rosmarínico,
carnósico, ursólico, oleanólico, butilínico,
betulínico, betulina, α-amirina, β-amirina,
borneol, y acetato de bornilo (Ruiz 2000, Almela
2006, Montes de Oca 2010, Tschinggeri & Bucar
2010).

PARTE EXPERIMENTAL

1. Materiales

MATERIAL CANTIDAD
Imagen 3 tomada de Google
CARACTERISTICAS
Tubos de hemolisis 10
En los últimos años se ha estudiado el efecto en la
salud de los posibles compuestos bioactivos Pipetas Pasteur 3
presentes en las plantas y es posible asegurar que Micro espátulas 1
existe más información sobre sus propiedades Beaker de 100 ml 2
funcionales, medicinales y/o toxicológicas
Agitador de vidrio 1
(Shahidi et al. 1992). Un ejemplo de ello es el
romero (Rosmarinus officinalis L.), planta rica en Vidrio de reloj 1
principios activos y con acción sobre casi todos los Vaso de precipitados 1
órganos de cuerpo humano. Al tener un alto Gradilla 1
contenido en aceites esenciales, cuyos ingredientes
Placa excavada 1
activos son flavonoides, ácidos fenólicos y
principios amargos, genera una acción tónica y
estimulante sobre el sistema nervioso, circulatorio 2. Metodología
y corazón, además de ser colerético, colagogo,
antiespasmódico, diurético, emenagogo y Lavado de Clorofilas: Si el extracto etanolico
antigodanotrópico (Musa & Chalchat 2008). Por lo obtenido tiene una fuerte coloración verde se debe
que en los últimos años se han desarrollado una decolorar mediante un lavado de clorofilas.
Agregue una pequeña cantidad de carbón activado
seguida de calentamiento suave (40°C) con METABOLITO PRUEBAS REACTIVOS
SECUNDARIO QUÍMICA
agitación durante 5 minutos y posterior filtración.
FeCl3 FeCl 1%
Taninos Acetato de plomo Acetato de plomo
Fraccionamiento con éter de petróleo: Gelatina – sal- Gelatina-Sal
Flavoides Shinoda HCl 10% y Mg
Una vez decolorado el extracto se realiza un
Leucoantocianidas HCl 10 %
fraccionamiento en embudo de decantación con 10 Quinonas Comportamiento Zinc, HCl {}.
mL de éter de petróleo para separar la fracción de ante ácido y NaOH 40%
donador de
baja polaridad. A ese extracto obtenido aplicar las electrones
pruebas A y B. Saponinas Espuma H 2O
Cardiotonicos Antrona Reactivo de molish
Molish Reactivo de
Lavado con HCl 5% Antrona
Sesquiterpenos Hidroxomato Sln metalonica 2N
Después del fraccionamiento, tome 5 mL del Férrico de clorhidrato de
hidroxilamina,
extracto etanólico y llévelo a sequedad calentando KOH 2N
a 40°C. A este residuo seco agregue 5 mL de agua Cumarinas Hidroxomato Sln metalonica 2N
destilada y 5 mL de HCl 10% agitando durante 2 Férrico de clorhidrato de
hidroxilamina,
minutos. Si se forma precipitado filtre o decante y KOH 2N
sobre este extracto ácido aplique las pruebas Erlich Reactivo de Erilch
descritas. Alcaloides Valser Reactivo de Valser
Mayer Reactivo de Mayer
Dragendorff Reactivo de
Extracto etanólico: A partir del extracto etanólico dragendorff
restante aplique las pruebas descritas de la C a la I. Schleiber Reactivo de
Schleiber
Wagner Reactivo de
Wagner

3. RESULTADOS

Grupo de Metabolito
Prueba Química/Resultado
Secundario
Cloruro Férrico Acetato de Plomo Gelatina-Sal

Taninos

Positivo Positivo Positivo

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Shinoda Leucoantocianidinas

Flavonoides

Positivo Positivo
Espuma

Saponinas

Positivo
Antrona Molish
Cardiotónicos

Hidroxamato Férrico

Sesquiterpenlactonas

Negativo

Hidroxamato Férrico Erlich

Cumarinas

Negativo Negativo
 Schielber, Wagner, Valser,
Dragendorff
Mayer

Alcaloides

Positivo Positivo

DISCUSIÓN DE RESULTADOS La prueba realizada para la identificación de

sesquiterpenolactonas mediante la prueba de
De acuerdo con las pruebas realizadas para taninos hidroxamato férrico, permitió determinar que la
(cloruro férrico, acetato de plomo, gelatina-sal), se planta no contiene este tipo de metabolito
observó que en los tres casos el resultado es secundario o que la concentración en la que se
positivo, lo cual se evidencia con la presencia de encuentra este compuesto en la planta no tiene una
precipitados y cambio de coloración en la muestra, concentración relevante, por tal razón la prueba
este resultado se comparó con la literatura tiene resultado negativo. Cabe resaltar que no se
consultada (Colombia, n.d.) y de acuerdo con encuentra evidencia bibliográfica que establezca
análisis realizados con anterioridad se establece que la planta en estudio presenta este tipo de
que en la planta de estudio hay presencia de metabolito.
taninos.
Para la identificación de cumarinas en el extracto
En las pruebas realizadas al extracto etanolico para etanolico se emplearon dos pruebas que fueron la
flavonoides (Shinoda, Leucoantocianidinas), se de hidroxamato férrico y la de Erlich, mediante la
observó el cambio de coloración, lo cual arrojo un aplicación de estas pruebas no se observó cambio
resultado positivo para la prueba. En la literatura en la coloración del extracto por lo cual se
consultada se evidencia que en estudios anteriores determina que la prueba es negativa para este
se ha determinado la presencia de flavonoides en metabolito. En la literatura consultada no se
la planta de Romarinus Officinialis (Colombia, encuentra evidencia que sustente la presencia de
n.d.). este metabolito en la planta de estudio.

Mediante la prueba de espuma empleada en la En la prueba de identificación de alcaloides se

identificación de saponinas, se observó la emplearon las pruebas de Dragendorff, Schielber,
persistencia de la presencia de espuma en el Wagner, Valser y Mayer, las cuales arrojaron
extracto luego de determinado tiempo, esto resultado positivo mediante la observación de la
corrobora la información obtenida de la revisión formación de precipitado que presentaba el
bibliográfica (Colombia, n.d.) Realizada con extracto, resultado comparado con la literatura
anticipación acerca de la planta en estudio, la cual (Cuba. Comisión Nacional Asesora en
establece que el Romarinus Officinialis tiene Investigaciones de Plantas Medicinales.,
presencia de saponinas. Rodríguez Ferradá, & Acosta de la Luz, 1996) la
cual también dispone de resultados positivos para
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este metabolito en la planta de estudio del presente estudio del Romarinus Officinialis, además se
artículo. debe tener en cuenta que todas las pruebas
Cabe resaltar la importancia de realizar marchas realizadas en el presente artículo son de tipo
fitoquímicas preliminares a los extractos en cualitativo lo cual nos da indicios para conocer la
estudio, esto con el fin de determinar la presencia composición del extracto mas no a cuantificar el
de diferentes tipos de metabolitos secundarios, contenido de los metabolitos presentes en dicha
siendo un punto de partida fundamental en el sustancia.

capa delgada en la cual se depositaron las fases

PARTE EXPERIMENTAL móviles que se emplearon, se dejó la cámara
ambientar por 15 minutos.
1. Materiales Las fases móviles que se trabajaron y sus
proporciones fueron:
MATERIALES  Tolueno: Acetato de Isotrópico. (1,5:3,5)
Capilares para cromatografía capa  Éter de petróleo: Etanol. (2:3)
delgada
 Éter de petróleo: Acetato de isotrópico.
Vaso de precipitado 250 mL
Vidrio Reloj (2:3)
Placas para cromatografía capa Se realizó este procedimiento empleando para tal
delgada fin placas de cromatografía de capa fina, se trazó
Probetas graduadas de 10 mL una línea a un centímetro de distancia del borde de
Pipetas graduadas de 10 mL la placa, se sembró la muestra de extracto etanolico
Pipetas Pasteur sobre la línea trazada. La placa fue introducida en
Soportes Universales la cámara y se tuvo cuidado que la fase móvil no
Pinzas Fisher tapara los puntos de siembra y se dejó correr la fase
Tubos eppendorf
móvil por la placa hasta un centímetro antes de
Gradillas para eppendorf
Pipeteadores terminar la placa. Este procedimiento se realizó de
Agitadores de vidrio manera individual con cada uno de la fase móvil.

REACTIVOS
Éter de Petróleo
Acetato de Isopropilo
Etanol
Sílica para cromatografía en columna
Vinillina en ácido Fosfórico
EQUIPOS
Plancha de Calentamiento

2. Metodología

Cromatografía en capa delgada

Imagen 4 tomada de Google

Se empleó para el desarrollo de esta técnica Cromatografía en columna

cromatografía una cámara de cromatografía de
Se tuvo en cuenta para el desarrollo de esta técnica
cromatográfica los resultados obtenidos en la
Técnica de cromatografía de capa delgada, de esta
manera se trabajó con la fase móvil de Tolueno: 3. RESULTADOS
Acetato de Isopropilo que fue la que mayor
separación presento. Se obtuvieron cuatro cromatogramas de placa, tres
Se empleó una pipeta Pasteur de vidrio a la cual se placas se sembraron por triplicado y se llevaron a
le introdujo un trozo de algodón para tapar el diferentes fases móviles. En las corridas se
orificio de salida, se llenó con la medida necesario definieron una mancha verde y una roja a las
de silica dejando un espacio libre de 3 cm, se cuales se les aplico calor con plancha de
solubilizo la silica con la fase móvil escogida hasta calentamiento hasta la intensificación de las
que se vio uniforme, se realizó la siembra de la manchas. También se realizó una separación por
muestra y se recogieron 10 fracciones de esta en cromatografía de columna donde se recogieron
tubos eppendorf, de estas 10 fracciones se tomaron tres fracciones donde en cada una se evidenciaba
3 para realizar nuevamente la técnica de diferentes tonos. En la cuarta placa se sembró un
cromatografía en capa delgada. punto de cada fracción donde en las más oscuras
se separan las manchas rojas y verdes, en la
fracción más clara de las tres, solo aparece la
mancha verde.
A cada placa se le adiciona revelador de vainillina,
pero no se reportaron cambios perceptibles a
simple vista, por lo cual no fue una prueba
relevante para estos ensayos.
Las placas de 6 cm de alto y 2,5 cm de ancho se
dejan correr hasta que el frente solvente alcanza la
línea que marca 0,5 cm en la parte superior.

Imagen 5 tomada de Google

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Tabla n° 1: Ensayos de las diferentes fases móviles.

Tolueno: Acetato de isopropilo Éter de petróleo: Etanol Éter de petróleo: Acetato de

Ensayo
(3.5:1.5) (3.0-2.0) isopropilo (3:2)

Placas

Distancia Verde Roja Verde Roja Verde Roja

Manchas 5,5 cm 5,0 cm 5,0 cm 4.7 cm 5.3 cm 5,0 cm
Distancia
5,5 cm 5,5 cm 5,5 cm
Solventes
RF 1,00 0,90 0,90 0,85 0,96 0.9
Resolución 1,67 0,75 1,0

Tabla n° 1: Ensayo de la purificación por Cromatografía de Columna.

Ensayo Cromatografía Placa
Placas Columna Fracciones Placa

Valores Medidos Cuarta placa

Fracciones 1 2 3
Verde Roja Verde Roja Verde Roja
Distancia Manchas
5,0 4,5 5,0 4,5 5,0 ND
Distancia
5,5 cm 5,5 cm 5,5 cm
Solventes
RF 0,9 0,83 0,9 0,83 0,9 N/A
Resolución 1,66 1,66 N/A
DISCUSIÓN DE RESULTADOS CONCLUSIONES

En las tres primeras placas los resultados 1. Se logró determinar la presencia de

fueron similares, aunque la mejor diferentes tipos de metabolitos
separación de obtuvo en la fase de acetato secundarios presentes en el extracto
de isopropilo y tolueno. (Placa 1) y el etanolico del Romarinus Officinialis.
cromatograma que presentó menos 2. Es importante realizar la marcha
resolución fue la de éter de petróleo-etanol fitoquímica preliminar con el fin de
(placa 2). tener un indicio de la composición
química del extracto en análisis.
El resultado obtenido en la cuarta placa 3. Se evidencia que los resultados
demuestra que si hubo una purificación de obtenidos durante la práctica son
metabolitos en la cromatografía de iguales a los que reporta la literatura
columna porque la fracción más clara al consultada, sin embargo, algunas
ser sembrada y corrida refleja la aparición pruebas aún no se reportan y por tanto
de una sola mancha verde en el no hay parámetro de comparación
cromatograma. (Placa 4). 4. Se obtuvieron dos clases de
El presente ensayo se realizó sin metabolitos, los cuales se pueden
estándares de referencia, estos estándares identificar en las placas por su
nos indican relación de la posición de las coloración verde y roja.
manchas y determinar con precisión qué 5. La cromatografía en columna separó
clase de metabolito se obtuvo a partir de en su fase más clara un tipo de
cada mancha. metabolito que se distingue por el
color verde en la cuarta placa.
Tampoco se realizó identificación con 6. La mejor fase móvil para la separación
cámara UV, la mayoría de placas llevan un de metabolitos es acetato de isopropilo
indicador que permite revelar más y tolueno 3.5-1.5
compuesto a los que se ven a simple vista, 7. Los compuestos de la mancha verde
esta revelación se ve con ayuda de luz UV. son menos polares que los compuestos
Los compuestos que se obtuvieron son de de la mancha roja.
polaridad baja, deducida por el RF y por la 8. Los compuestos presentados son de
fase móvil utilizada en estas todas las baja polaridad.
placas.
Los compuestos de la mancha verde tienen
menos polaridad que los compuestos BIBLIOGRAFIA
contenidos en la mancha roja. Los
compuestos más polares tendrán más
interacción por puentes de hidrogeno lo  Avery, H. E. Cinética química
que aumentarán la afinidad y serán básica y mecanismos de reacción -
retenidos con mayor facilidad. - Google Libros; Reverte S.A., Ed.;
España, 2002.
 1
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 (2) Riaño, N. Fundamentos de https://es.scribd.com/document/27

química analítica básica. Análisis 4409541/Articulo-Fitoquimica
cuantitativo - Google Libros,  Carolina, A., & Pulido, C. (n.d.).
Segunda Ed.; Caldas, E. U. de, Ed.; ESTUDIO FITOQUÍMICO DE
Manizales, Caldas, 2007. LAS HOJAS DE LA ESPECIE
 (3) Peter, W. Principios de VEGETAL Croton schiedeanus
química: los caminos del (Euphorbiaceae). Retrieved from
descubrimiento- Google Libros, http://www.bdigital.unal.edu.co/1
Tercera Ed.; Panamericana, E., 2799/1/197578- 2013.pdf
Ed.; Madrid, España, 2007.  Colombia, universidad nacional
 (4) Barreiro, G. T. Ingeniería de. (n.d.). Extracción de
de las reacciones químicas - compuestos vegetales. Extraccion
Google Libros, Octava edi.; Material Vegetal. Retrieved from
Reverté S.A., Ed.; Barcelona, http://catarina.udlap.mx/u_dl_a/tal
2005. es/documentos/lqf/barranco_l_sl/c
 (5). https://www.plantas- apitulo7.pdf
medicinal-  Cuba. Comisión Nacional Asesora
farmacognosia.com/temas/método en Investigaciones de Plantas
s-de-análisis-de- Medicinales., C. M., Rodríguez
droga/cromatografía-en-capa- Ferradá, C. A., & Acosta de la Luz,
delgada. L. (1996). Revista cubana de
 (6). plantas medicinales. Revista
https://www.uam.es/docencia/jppi Cubana de Plantas Medicinales
d/ (Vol. 6). Editorial Ciencias
documentos/practicas/actuales/gui Médicas. Retrieved from
on-p6.pdf. http://scielo.sld.cu/scielo.php?pid
=S1028-
 Articulo Fitoquimica. (n.d.). 47962001000300001&script=sci_
Retrieved November 13, 2017, arttext&tlng=en
from