RESOLUCIÓN PROBLEMAS: TÉCNICAS DE SEPARACIÓN Y ESTUDIO DE PROTEÍNAS (TA Nº3)

1. Explica el fundamento de la cromatografía de filtración en gel y de la electroforesis en gel de

poliacrilamida en presencia de SDS, dos de los métodos más utilizados para separar proteínas en base a sus
tamaños. ¿Qué polímeros se utilizan como soporte?

La cromatografía de exclusión molecular (también llamada filtración en gel o de tamiz molecular) es

una de las técnicas más sencillas de las empleadas en la separación de proteínas y ácidos nucleicos. Este tipo
de cromatografía se realiza en columnas cilíndricas rellenas con algunos de los geles que se fabrican con este
fin y que pueden ser de varios tipos: dextranos con enlaces cruzados (sephadex), agarosa (Sepharose, Bio-gel
A), poliacrilamida (Bio-gel B), etc. Todos estos geles (fase estacionaria) se hallan constituidos por gránulos
(partículas) de un material esponjoso hidratado e inerte, que contiene poros con un tamaño de diámetro
determinado.
Fundamento de la CEM
Cuando se hace pasar una mezcla de moléculas de distinto tamaño, a través de una columna de
filtración en gel; aquellas moléculas con un tamaño mayor que el diámetro de los poros de las partículas, no
serán capaces de ingresar a los mismos y por lo tanto sólo podrán moverse en el espacio que queda entre las
partículas (espacio intersticial) de la fase estacionaria. De tal forma recorrerán una menor trayectoria que las
moléculas de menor peso molecular (más pequeñas) y no se verán retrasadas en su descenso. En cambio
aquellas moléculas capaces de penetrar en los poros de la fase estacionaria recorrerán una mayor trayectoria
y se verán retrasadas por la fase estacionaria; en mayor medida, cuanto menor sea su tamaño. Por lo tanto,
las moléculas eluyen en este tipo de cromatografía por orden decreciente de tamaño molecular. Así, las
moléculas de mayor tamaño eluyen primero y luego las más pequeñas (Figura 1).

Figura 1. Esquema del funcionamiento de una columna cromatográfica de exclusión molecular. La mezcla de analitos ingresa a la
columna y tras el agregado de la fase móvil los mismos comienzan a separarse de acuerdo a su peso molecular (PM). Aquellas moléculas
de mayor tamaño son incapaces de ingresar por los poros de la resina eluyendo en primer lugar. Los analitos de menor tamaño
ingresan por los poros de la fase estacionaria y por lo tanto quedan retenidos por más tiempo eluyendo más tarde.

El cromatograma es el resultado gráfico de la cromatografía (Figura 2). En el caso de separación

óptima, los diferentes picos se corresponden a los componentes de la mezcla. En el eje X se puede representar
el tiempo de retención, número de fracción, volumen de elución o el coeficiente de partición (kav), y en el eje
Y una señal (obtenida, por ejemplo, a partir de un espectrofotómetro, un espectrómetro de masas o cualquier
otro de los diversos detectores) correspondiente a la respuesta creada por los diferentes analitos existentes
en la muestra. En el caso de las proteínas se suele utilizar la como señal la Absorbancia a 280nm.
Figura 2. Cromatograma en el que se emplea Abs a 280nm para monitorear el perfil de elución de las proteínas de una mezcla.

La electroforesis es una técnica de separación de moléculas cargadas por migración en un campo

eléctrico. Las moléculas se separan en función de su carga eléctrica, desplazándose al electrodo de carga
contraria y a mayor velocidad cuanto mayor es la carga de la molécula.
Se pueden utilizar diferentes medios de soporte tales como acetato de celulosa, geles de almidón,
geles de agarosa o geles de poliacrilamida. Los geles de poliacrilamida son el resultado de la polimerización
química de una mezcla de acrilamida y bisacrilamida. Controlando la concentración de ambas obtenemos geles
de diferente grado de reticulación (diferente diámetro de poro). Uno de los métodos de electroforesis más
comúnmente aplicado para proteínas es el que emplea geles de poliacrilamida (PAGE = polyacrylamide gel
electrophoresis) en presencia del detergente aniónico dodecilsulfato sódico (SDS). Esta técnica es conocida
como SDS-PAGE.
Fundamento del SDS PAGE
Gracias al SDS y al tratamiento de las muestras previo a su sembrado en el gel (calentamiento durante
5 min a 100ºC), las proteínas se mantienen desnaturalizadas, perdiendo su conformación tridimensional. El
SDS tiene la propiedad de unirse a las cadenas polipeptídicas en una proporción masa:masa constante, de
modo que en el complejo SDS-proteína la carga de la proteína queda enmascarada por la de las múltiples
moléculas de SDS (carga negativa) y ésta es proporcional al tamaño (nº de aminoácidos).
Sin embargo, a diferencia de la cromatografía de exclusión molecular, en este caso la movilidad
electroforética está dada por la relación carga/masa del analito. De tal forma, si todas las moléculas poseen
carga neta negativa proporcionada por su interacción con SDS nos estaríamos independizando de la carga y la
migración resulta inversamente proporcional a la masa. Cuanto menor tamaño presenta la macromólecula,
mayor distancia recorre. Por el contrario, cuanto mayor es el PM del analito presentarán menor
desplazamiento (Figura 3).

Figura 3. SDS PAGE.

2. El cromatograma de una muestra de proteínas corridas en una columna de Sephadex G-200 (CEM) fue el
siguiente:
 Gliceraldehído
3-P-Deshidrogenasa

Concentración Mioglobina
Aldolasa
de proteína Catalasa
en el eluído
Ovoalbum.

175 213 234 244 285

N° fracción

Las siguientes proteínas marcadoras fueron utilizadas:

Proteína PM (x104 Da) N° de fracción

Aldolasa 16 175
Catalasa 6 213
Ovoalbúmina 4 234
Mioglobina 1,6 285

Se recogieron fracciones de 1,6 ml y el volumen vacío de la columna previamente determinado con azul de
dextrano fue de 200 ml. Vtotal = 500 ml. Con estos datos, determinar el peso molecular de la Gliceraldehído 3-
P-deshidrogenasa.

En primer lugar debemos darnos cuenta que la columna utilizada, Sephadex G-200, corresponde a una
cromatografía de exclusión molecular. Para determinar PM empleando este tipo de columna requerimos de
proteínas marcadoras cuyo peso molecular sea conocido. En este caso las proteínas marcadoras son: la
Aldolasa, la Catalasa, la Ovoalbúmina y la Mioglobina. Entonces lo que se procede a hacer es sembrar estas
proteínas en la columna de Sephadex G-200 y registrar en qué número de fracción eluyen de la columna, en
que volumen de elución lo hacen (Ve=Volumen de elución= número de fracción x el volumen de la fracción) o
el tiempo de retención. Y con los siguientes datos construyo una curva de calibración: Nº de fracción o Ve (en
el eje X) y Log PM en el eje Y. Dicha curva me va a permitir determinar el PM de una proteína incógnita que
haya sido corrida en la misma columna y cuyo Nº de fracción o Ve haya sido previamente determinado.

Curva CEM
2,5

2
Log PM(KDa)

1,5

1
Log PM = -0,009. Nº de fracción + 3,7358
0,5
R² = 0,9895
0
0 50 100 150 200 250 300
Nº de fracción

Una vez obtenida la ecuación de la recta (debe realizarse una regresión lineal)=

Log PM= -0,009. Nº de fracción + 3,7358

Despejo el Log PM para la proteína Gliceraldehído 3-P-deshidrogenasa, cuyo Nº de fracción figura en el

cromatograma del enunciado y corresponde a 244. Con este reemplazo en la ecuación:
Log PM= -0,009. 244 + 3,7358 Log PM= 1,5398 PM=101,5398 PM=35 KDa

3. Se ha purificado la enzima málica NAD-dependiente de una levadura, la cual cataliza la siguiente

reacción: malato + NAD  piruvato + CO2 + NADH. Al sembrar esta proteína en una columna de exclusión
molecular en presencia de 20% glicerol previamente equilibrada y calibrada (ver figura), la proteína eluyó a
los 70 ml (fracción A). Cuando se repitió el procedimiento en ausencia de glicerol se obtuvieron picos en el
cromatograma a 115 y 152 ml (fracciones B y C, respectivamente). La fracción A presentó actividad enzimática,
no así B y C. Por otra parte se analizó mediante una electroforesis en condiciones desnaturalizantes una
alícuota de la proteína purificada tratada con SDS y β-mercaptoetanol, obteniéndose una banda
correspondiente a 70 kDa y otra de 30 kDa. En base a estos resultados caracteriza estructuralmente lo mejor
posible esta enzima.
y = -0.01x + 6
6
5.5
log PM

5
4.5
4
30 50 70 90 110 130 150 170 190
Ve (ml)

En este caso con el fin de caracterizar la estructura de la enzima málica NAD-dependiente, se la siembra
en presencia y en ausencia de glicerol en una columna de exclusión molecular. ¿Qué diferencia una corrida de
la otra? El glicerol es un estabilizante de la estructura cuaternaria de las proteínas con lo cual en presencia de
este último las proteínas van a ser separadas y eluidas de la columna manteniendo su conformación nativa y por
lo tanto el PM calculado bajo dicha condición es el NATIVO. Por otra parte, si la proteína de interés presenta
más de una subunidad (dímero, trímero, tetrámero, etc) y las mismas se encuentran estabilizadas entre sí
mediante interacciones débiles (interacciones hidrofóbicas por ejemplo), la ausencia del glicerol puede provocar
la disociación entre estas subunidades. Esto significa que sembrando una única proteína puedo visualizar 2 o
más picos.
En este ejercicio se observa que en la corrida con glicerol aparece un único pico (fracción A) a Ve=70ml
mientras que sin glicerol se obtuvieron 2 picos en el cromatograma. Esta evidencia sugiere que la enzima de
interés es multimérica.
Por lo tanto en primer lugar hay que determinar el PM nativo (en presencia de glicerol) y luego
determinar el PM de las subunidades (en ausencia de glicerol). Para ello, emplearemos los Ve aportados como
datos y la ecuación de la curva Log PM vs Ve (también dada como dato).
Ecuación de la curva=
Log PM= -0,01.Ve + 6

+ glicerol Ve= 70 ml Log PM= -0,01. 70 + 6 Log PM=5,3 PM=105,3= 200 KDa

- glicerol Ve= 115 ml Log PM= -0,01. 115 + 6 Log PM=4,85 PM=104,85= 70 KDa

Ve= 152 ml Log PM= -0,01. 152 + 6 Log PM=4,48 PM=104,85= 30 KDa

El peso molecular nativo de la enzima málica NAD-dependiente es de 200 KDa. En base a los
resultados arrojados por la CEM y el SDS PAGE, dicha enzima presenta 4 subunidades: 2 de 30 KDa y 2 de 70
KDa, las cuales se encuentran estabilizadas entre sí mediante interacciones débiles. Sólo su conformación
nativa exhibe actividad enzimática, ya que, luego de disociarse, las subunidades resultantes pierden el rol
biológico de la proteína de interés.
Esquema ilustrativo de la estructura de A:

4. Se desea purificar por cromatografía de intercambio iónico una enzima del metabolismo del ADN, cuyo
sustrato es ADN. ¿Seleccionarías una resina de intercambio aniónico o catiónico? ¿Por qué? Explica cuál es
la diferencia entre una cromatografía en columna y una separación en batch.

Breve repaso de la cromatografía de intercambio iónico

La cromatografía de intercambio iónico es un método que permite la separación de moléculas

basada en sus propiedades de carga eléctrica. Se compone de dos fases: la fase estacionaria o intercambiador
iónico, y la fase móvil. La fase estacionaria insoluble lleva en la superficie cargas electrostáticas fijas, que
retienen contraiones móviles. El principio básico de la cromatografía de intercambio iónico es que las
moléculas cargadas se adhieren a los intercambiadores de forma reversible de modo que dichas moléculas
pueden ser asociadas o disociadas cambiando el ambiente iónico. La separación mediante intercambiadores
iónicos se realiza por lo general, en dos fases: en la primera las sustancias a separar se unen al intercambiador
utilizando condiciones que originan una unión fuerte y estable; a continuación, se eluye de la columna con
buffers de diferentes pH o diferente fuerza iónica, compitiendo los componentes del buffer con las moléculas
de la muestra por los sitios de unión. Un intercambiador iónico es, por lo general, un polímero que tiene grupos
cargados unidos. La mayoría de las proteínas son estables dentro de un margen de pH determinado (es decir,
hay un margen en el que no se desnaturalizan), en el que están cargadas positiva o negativamente. Por lo
tanto si una proteína es estable a valores de pH por encima del punto isoeléctrico, se debe utilizar un
intercambiador aniónico. Si es estable a valores de pH situados por debajo del punto isoeléctrico, debe
utilizarse un intercambiador catiónico.
INTERCAMBIADORES ANIÓNICOS: Son portadores de grupos con cargas positivas que unen aniones
de forma reversible.
INTERCAMBIADOR CATIÓNICO: Los intercambiadores catiónicos son portadores de grupos con carga
negativa que unen cationes de modo reversible. (Figura 4)

Figura 4. Esquema del funcionamiento de un intercambiador catiónico. Las moléculas con carga neta positiva son retenidas en la
columna gracias a las interacciones electrostáticas con las partículas de la resina o fase estacionaria. Mientras que las moléculas con
carga neta negativa eluyen en primer lugar debido a la repulsión de cargas entre las mismas y la matriz de la columna.
 Las enzimas del metabolismo del ADN requieren ser capaces de interaccionar con dicha molécula de
naturaleza aniónica para desempeñar su rol biológico. Es por este motivo que estas enzimas suelen presentar
carga positiva (proteínas básicas) de modo de estabilizar su unión al sustrato mediante interacciones
electrostáticas. Con el fin de purificar una enzima de naturaleza catiónica seleccionaría una resina de
intercambio catiónico ya que estos son portadores de grupos con carga negativa y por ello son capaces de
retener moléculas con carga positiva o cationes.

Cromatografía en Batch

Cromatografía en batch. En esta metodología no se utiliza una columna, sino que la fase estacionaria o resina
se encuentra contenida en un falcon o tubo. Una vez que se produce el contacto entre la resina y la solución
de analitos a separar, las mismas deben ser co-incubadas durante un determinado período de tiempo siempre
con agitación leve por inversión de modo de favorecer la unión de las moléculas de interés a la fase
estacionaria. Luego del período de incubación se lleva a cabo una centrifugación de modo de separar las
moléculas que se unen a la resina (quedan en el pellet) de aquellas que no son capaces de interaccionar con
la matriz (quedan resuspendidas). Empleando una pipeta o micropipeta se eliminan las moléculas que no se
necesitan y se prosigue con los lavados hasta obtener al analito de interés. En caso que la macromolécula de
interés no interaccione con la resina, la misma también se puede obtener pura transfiriendo el sobrenadante
en el que se encuentra a otro tubo o falcon receptor.

Cromatografía en Columna
5. Dispones de una mezcla de tres proteínas A, B y C, las cuales poseen un pI de 3,5; 6 y 10, respectivamente,
y deseas separarlas utilizando una columna de DEAE-celulosa. Teniendo en cuenta que el grupo DEAE tiene
un pKa = 9,5. ¿Qué pH(s) del buffer usarías para la separación? ¿Qué orden de elución esperarías encontrar
si eluyeras con un gradiente de KCl entre 0 a 1 M?

En primer lugar debo tener en cuenta que la columna de DEAE celulosa cuyo pKa es 9,5 es un
intercambiador aniónico, es decir debe tener carga neta positiva para ser funcional por lo tanto el pH de
trabajo debe ser menor al pKa de la columna.
En segundo lugar el pH de trabajo seleccionado debe permitir la unión de al menos 2 de las 3
proteínas a la columna para poder purificarlas. ¿Por qué es importante esta última observación? Porque si
elijo un pH que solo permita la retención de una de las proteínas, eso significaría que las otras 2 eluirían juntas
y no cumpliría con la consigna del ejercicio.
Eligiendo un pH= 7 por ejemplo cual es la carga neta de A, B y C?
A pI=3,5 pH>pI qneta de A= - (queda retenida a la columna)
B pI= 6 pH>pI qneta de B= - (queda retenida a la columna)
C pI=10 pH<pI qneta de C= + (eluye primero de la columna)

Entonces, seleccionando un pH de trabajo igual a 7 puedo separar las 3 proteínas de la muestra.

¿Cómo procedería a eluir A y B? Con un gradiente de fuerza iónica de KCl. ¿Qué hace esta sal? Los iones Cl -
compiten con las proteínas retenidas por la unión a la resina (qneta +) haciendo que primero B (menos ácida) y
luego A (más ácida) eluyan de la misma.
IMPORTANTE= Si bien en este ejercicio no se plantea, también hay que tener en cuenta la estabilidad
de las proteínas al elegir un pH de trabajo ya que las necesito en su conformación nativa para seguir
trabajando.

6. Tres proteínas de pI 6, 8 y 10 son sembradas en una columna con carboximetil-celulosa (resina de

intercambio catiónico con un pKa de 4,5). Utilizando un gradiente de pH de menor a mayor eluyeron en el
siguiente orden: B, A, C. Posteriormente, eluyeron de una columna de Sephadex G-100 cómo de un peso
molecular de 50, 75 y 100 kDa, y en el siguiente orden: A, B y C. Finalmente, en un gel con SDS, A y C corrieron
como una única banda de PM 50.000 Da y B corrió dando dos bandas de PM 50.000 y 25.000 Da. Identifica
A, B y C.

Figura 5. Esquema de una columna de CM celulosa.

Como se puede visualizar en la figura 5, al sembrar una mezcla proteica en una columna de CM
celulosa primero eluirán aquellas proteínas con carga neta negativa (más ácidas) bajo el pH de trabajo
mientras que quedarán retenidas aquellas proteínas con carga neta positiva (más básicas).
¿Qué información me da la cromatografía de intercambio iónico? Acerca de la naturaleza de las
proteínas a caracterizar, es decir cuál es la más ácida y básica de acuerdo a su orden de elución. Si las proteínas
de interés eluyen en el siguiente orden: B, A, C; esto indica que B es la más ácida y C la más básica. Por lo tanto
B presenta pI=6, A presenta pI=8 y c presenta pI=10.
¿Qué información me proporciona la CEM? En este punto es importante recordar que el PM
obtenido a partir de una CEM y empleando proteínas marcadoras corresponde al PM nativo de la proteína de
interés (en presencia de glicerol, obvio!). Si al sembrar la mezcla en una columna de Sephadex G-100 las
proteínas eluyeron en el siguiente orden: A, B y C, esto indica que A es la de mayor peso molecular (PM =100
KDa), B posee un PM intermedio (PM =75 KDa) y C es la más pequeña (PM =50 KDa).
¿Qué información me da un SDS PAGE? Indica la presencia de más de una subunidad. Entonces si
en un SDS PAGE, la proteína A corrió como una única banda de PM 50.000 Da esto sugiere que A es un dímero
con subunidades de 50KDa estabilizadas por interacciones débiles. Esto es así ya que a partir de la CEM se
determinó que A presenta un PM=100KDa.
Por otra parte, C corrió también como una única banda de PM 50.000 Da. Este resultado junto a los
datos aportado por la CEM indican que la proteína C es un monómero de 50KDa.
Finalmente, B corrió dando dos bandas de PM 50.000 y 25.000 Da. Este resultado se condice con lo
observado a través de la CEM, la cual arrojo un PM de B igual 75KDa. Ambas observaciones sugieren que B es
un dímero con una subunidad de 25KDa y otra de 50KDa estabilizadas por interacciones débiles.

Conclusión:

A pI=8 PM= 100KDa. Dímero con 2 subunidades de 50KDa estabilizadas por interacciones débiles.

B pI=6 PM= 75KDa. Dímero con subunidades de 50KDa y 25 KDa estabilizadas por interacciones débiles.

C pI=10 PM= 50KDa. Monómero.

7. Tres proteínas de punto isoeléctrico 5,0; 7,3 y 6,5 se denominaron con las tres primeras letras del alfabeto
griego según su posición en un isoelectroenfoque, siendo alfa la más cercana al ánodo y gamma la más
cercana al cátodo. a) ¿Cuál es el pI de cada una? b) ¿Cuál de las proteínas eluirá primero durante una
cromatografía en carboximetilcelulosa a pH 5,8? ¿Por qué? c) Si alguna proteína quedara retenida, ¿cuál o
cuáles serían y cómo las eluirías? d) Durante una electroforesis en poliacrilamida a pH 8, beta presentó la
mayor movilidad electroforética. ¿Es posible? ¿Por qué?

El isoelectroenfoque es un tipo de electroforesis que permite separar los componentes de una

mezcla en función de su pI y se basa en el desplazamiento de las moléculas en un gradiente de pH. La región
del ánodo es ácida y la del cátodo es alcalina. Las sustancias que inicialmente se encuentran en regiones de
pH inferior a su punto isoeléctrico estarán cargadas positivamente y migraran hacia el cátodo, mientras
aquellas que se encuentran en medios con pH más altos que su punto isoeléctrico tendrán carga negativa y
migrarán hacia el ánodo. La migración las conducirá a una región donde el pH coincidirá con su punto
isoléctrico, tendrán una carga neta nula y se detendrán.

a)- α es la proteína más ácida ya que es la más cercana al ánodo y por lo tanto su pI=5
γ es la proteína más básica ya que es la más cercena al cátodo y por lo tanto su pI=7,3
β es la que posee un pI intermedio, por lo tanto su pI=6,5
b y c)- Carboximetil-celulosa (resina de intercambio catiónico con un pKa de 4,5)
A pH= 5,8 la resina tendrá qneta negativa y por lo tanto va a retener cationes.
Entonces para saber si las proteínas de interés eluyen o no hay que evaluar su carga al pH de trabajo 5,8.
α presenta pI=5 pH>pI α tendrá qneta - (anión) por lo tanto eluye de la columna.
γ presenta pI=7,3 pH<pI γ tendrá qneta + (catión) por lo tanto queda retenido en la columna.
β presenta pI=6,5 pH<pI γ tendrá qneta + (catión) por lo tanto queda retenido en la columna.

En base a los pI, la primer proteína en eluir es α.

Para eluir de la columna a β y γ emplearía un gradiente de fuerza iónica de KCl (de 0 a 1M).

d)- En un SDS PAGE, la proteína con mayor movilidad sería la más pequeña ya que me independizo de la carga
por el uso del detergente SDS. En este caso particular no se aclara si la electroforesis es en presencia de SDS.
Por eso es importante aclarar al contestar!
Si nos referimos a un SDS PAGE es posible que beta sea la de mayor movilidad porque debe ser la
más pequeña.

8. Las proteínas denominadas histonas juegan un papel clave en el empaquetamiento del ADN eucariota:
éste se enrolla alrededor de las mismas para formar los nucleosomas, partículas engarzadas como las
cuentas de un collar. Una mezcla de tres proteínas globulares, entre ellas la histona H4, presenta la
composición de aminoácidos mostrada en la tabla. Mediante un isoelectroenfoque se determinaron los
puntos isoeléctricos de las tres proteínas obteniéndose los siguientes valores: 3,0; 5,5 y 9,5 (no en orden).
Los pesos moleculares obtenidos por cromatografía de exclusión molecular fueron de 15 kDa, 11,3 kDa y
21,5 kDa (no en orden). a) lndica el punto isoeléctrico, el peso molecular y el orden de elución de la columna
cromatográfica de las tres proteínas. b) En base a tus conocimientos, ¿podrías decir cuál de las tres proteínas
sería H4? Fundamenta.

El objetivo del ejercicio es caracterizar a las proteínas A, B y C. ¿Qué información debo utilizar para
tal fin? La proporcionada por la tabla.
En base a los datos de la tabla se puede deducir lo siguiente:
Proteína A – Está constituida por 200 residuos aminoácidos (90 + 5 + 105) de los cuales el 45% (90) consiste
en aminoácidos ácidos (Asp y Glu) mientras que sólo presenta un 2,5% (5) de residuos básicos (Arg, Lys e His).
Proteína B – Está constituida por 120 residuos aminoácidos (50 + 10 + 60) de los cuales el 41,67% (50)
corresponde a aminoácidos ácidos (Asp y Glu). Por otra parte, presenta un 8,33% (10) de residuos básicos (Arg,
Lys e His).
Proteína C – Está constituida por 102 residuos aminoácidos (6 + 27 + 69) de los cuales el 5,88% (6) corresponde
a aminoácidos ácidos (Asp y Glu). Por otra parte, presenta un 26,47% (10) de residuos básicos (Arg, Lys e His).

Entonces conociendo el número de residuos aminoácidos de cada proteína y sabiendo que cada
aminoácido pesa aproximadamente 110 kDa, se puede estimar su PM. Sin embargo es sólo una estimación!
El PM real es aquel arrojado por la CEM.
Por otra parte observando la proporción de aminoácidos ácidos y básicos presentes en la secuencia
se puede inferir en su acidez y por lo tanto en su pI.
Proteína A: 110Da x 200= 22KDa. De acuerdo al análisis de la CEM citado en el enunciado, A presenta un
PM=21,5 KDa.
La proteína A es la que mayor proporción de aminoácidos ácidos presenta en su secuencia (45%) por
lo tanto constituye la proteína más ácida de las 3. En base a los resultados del isoelectroenfoque su pI es de
3.

Proteína C: 110Da x 102= 11,22KDa. De acuerdo al análisis de la CEM citado en el enunciado, C presenta un
PM=11,3 KDa.
La proteína C es la que mayor proporción de aminoácidos básicos presenta en su secuencia (26,47%)
por lo tanto constituye la proteína con mayor carácter básico de las 3. En base a los resultados del
isoelectroenfoque su pI es de 9,5.

Proteína B: 110Da x 120= 13,2KDa. De acuerdo al análisis de la CEM citado en el enunciado, B presenta un
PM=15 KDa.
La proteína B presenta mayor proporción de aminoácidos ácidos en su secuencia (41,67%), lo cual
sugiere su naturaleza ácida. En base a los resultados del isoelectroenfoque su pI es de 5,5.

 Dado que la CEM separa en función del tamaño y sabiendo que las proteínas de mayor peso
molecular eluyen primero y luego las más pequeñas el orden de elución es el siguiente:
Primero eluye A, luego B y finalmente C.

b)- Las histonas desempeñan su función mediante la interacción con el ADN. Sabiendo que el ADN
es una molécula de carácter aniónico debido a la presencia de grupos fosfato en su estructura, se deduce que
las histonas tendrían que ser de naturaleza básica de modo de estabilizar su unión. En base a esto, la proteína
candidata a desempeñar un rol de histona es la C por su pI=9,5.

9. Una alícuota de 0,1 ml de una mezcla de triglicéridos y una proteína pura se agitó en benceno:agua (3
ml:2 ml). a) ¿En qué fases se distribuyen los distintos componentes de la mezcla? Se sembró una alícuota
de la fase que contenía la proteína en una columna de Sepharosa 6-B previamente equilibrada y se
recogieron fracciones de 2 ml. Las proteínas marcadoras fueron: A, B, C, D y E con pesos moleculares de 160,
90, 60, 40, 16 kDa, respectivamente. La curva de calibración resultante se muestra a continuación. El valor
de Kav de la muestra se calculó en 0,28. Además, se corrió una electroforesis con SDS en las siguientes
condiciones: I) la proteína se hirvió previamente con DTT (agente reductor), II) la proteína se hirvió sin
agente reductor. El patrón electroforético se muestra en la figura. b) Indicar el peso molecular de la proteína
nativa. c) Inferir la composición cuaternaria de la proteína. Por otro lado se estimó la concentración de
proteína por absorbancia a 280 nm, utilizando un testigo de BSA de 0,5 mg/ml, con una alícuota de 1 ml y
una cubeta de 0,5 cm de paso. Se obtuvo una Abs de 0,4 para el testigo y de 0,295 para la muestra. d)
Teniendo en cuenta que toda la proteína pasó a la fase correspondiente, estimar la concentración de la
misma en la mezcla original. NOTA: HAY UN VIDEO EXPLICATIVO DE ESTE EJERCICIO EN EL QUE SE DETALLA
LA RESOLUCIÓN PASO A PASO.
 a)- Los triglicéridos son lípidos constituidos por un esqueleto carbonado de glicerol esterificado a 3
ácidos grasos, lo cual sugiere que este componente de la mezcla se va a distribuir en los 3 ml fase orgánica:
benceno. Por otra parte, la proteína se va a distribuir en los 2 ml de la fase acuosa: agua.
b)- Para determinar el PM de la proteína debo utilizar los datos aportados por cromatografía de
exclusión molecular. Para ello interpolar el valor de Kav (coeficiente de partición) de la proteína de interés en
la curva de calibración Log PM vs Kav. (Esta curva se construye corriendo proteínas marcadoras de PM conocido
en la columna cromatográfica y registrando sus volúmenes de elución (Ve), los cuales luego servirán para
calcular sus respectivos Kav. Kav=Ve-V0/Vt-V0). Dado que no disponemos de la ecuación de la recta de la curva,
tenemos que definir el Log PM de forma manual.

Empleando la curva observamos que al valor de Kav=0,28 le corresponde un Log PM= 2,15.
Despejando, PM=102,15 PM=140 KDa (PM nativo)
c)- A partir del SDS PAGE en ausencia de agente reductor (II) se observan 2 bandas: una a la altura
de 60KDa y la otra a 40 KDa. Esto Indica la proteína presenta 2 subunidades de 40 KDa y 1 de 60 KDa
estabilizadas entre sí mediante interacciones débiles. Por otra parte, en el pocillo sembrado en presencia de
DTT (I) se visualizan 2 bandas: una a la altura de 40 KDa y la otra a 30 KDa. Esto sugiere que la subunidad de
60 KDa en realidad consiste en 2 subunidades de 30 KDa unidas entre sí por puentes disulfuro intercatenarios.
En conclusión la proteína de interés presenta 4 subunidades: 2 de 30 KDa y 2 de 40 KDa.

Esquema ilustrativo de la estructura de A:

d)- Sabiendo la concentración del testigo= 0,5 mg/ml, su Abs280nm=0,4 y la Abs280nm= 0,295 de la
proteína de interés puedo determinar su concentración en la cubeta de medida.
 0,5 mg/ml testigo 0,4 UA (unidades de absorbancia)
X= 0,368 mg/ml de proteína 0,295 UA

Sin embargo en el enunciado se pide la concentración de la proteína en la mezcla original, que corresponde a
los 0,1ml iniciales.

Dado que la proteína se distribuyó en 2 ml de agua:

1 ml de proteína 0,368 mg de proteína
2 ml de proteína X=0,7375 mg de proteína

0,7375 mg de proteína provienen de 0,1 ml de mezcla original

X=7,375 mg de proteína 1 ml de mezcla original

Concentración= 7,375mg/ml

10. Se copurificaron 2 enzimas ( y ) que catalizan la misma reacción (isoenzimas) y con el fin de separarlas
se utiliza una columna de exclusión molecular (CEM) en las siguientes condiciones: i) en presencia de glicerol
20% y ii) en ausencia de éste. El perfil de elución de estas proteínas se determinó través de absorbancia a
280 nm columna y la columna fue previamente calibrada con diferentes marcadores (ver figuras). a) Indica
cuál sería el peso molecular y la probable estructura de ambas isoenzimas, sabiendo que  es la de mayor
peso molecular. b) ¿Qué otra técnica utilizarías para confirmar este resultado o bien para obtener más
información? Explica. Por otro lado, se determinó el punto isoeléctrico de ambas proteínas (ver figura del
isoelectroenfoque) y se sabe por bibliografía que ambas tienen un rango de estabilidad de pH entre 6 y 11.
c) ¿Podría usarse una columna de CM-celulosa (pKa=4,5) como protocolo alternativo para separar ambas
proteínas? Si es así, explica cómo procederías. NOTA: HAY UN VIDEO EXPLICATIVO DE ESTE EJERCICIO EN EL
QUE SE DETALLA LA RESOLUCIÓN PASO A PASO.

a)- Para determinar el PM nativo de las proteínas de interés debo utilizar los datos proporcionados
por la CEM. Particularmente debo observar los valores de volumen de elución de las proteínas dados en la
corrida en presencia de glicerol, el cual es un estabilizante de la estructura cuaternaria de las proteínas (línea
continua negra y señalada con flechas rojas). Como se aprecia en la figura en presencia de glicerol el Ve de
α=7ml y Ve de β=27ml. Entonces ¿qué hago con estos valores de elución? Los interpolo en la curva de
calibración realizada con proteínas marcadoras cuyo peso molecular es conocido.

dkkan

Interpolando en la curva los Ve de cada proteína:

α le corresponde un Log PM= 2,7 y despejando PM=102,7= 500 KDa (PM nativo)
β le corresponde un Log PM= 1,6 y despejando PM=101,6= 40 KDa (PM nativo)
 Por otra parte también cuento con los Ve de las proteínas  y  corridas en la CEM en ausencia de
glicerol (líneas discontinuas y señaladas con flechas azules). ¿Qué información aporta esto? Dado que el
glicerol es un estabilizante de interacciones débiles entre subunidades que estabilizan la conformación nativa
de una enzima, su ausencia permite detectar la presencia de interacciones débiles entre distintas subunidades.
En este caso, se observa que la proteína β presenta igual Ve en presencia y en ausencia de glicerol, lo cual
sugiere que no posee interacciones débiles que estabilicen su conformación y podría pensarse en α como una
proteína monomérica. Sin embargo, la proteína α presenta un Ve mayor en ausencia de glicerol (19ml) lo cual
indica que posee más de una subunidad y que estas se hallan estabilizadas por interacciones débiles por ej.
Interacciones hidrofóbicas. Al interpolar el valor de 19ml en la curva de calibración se obtiene (en azul):
Log PM=2,1 y despejando PM=102,1= 125 KDa

Este valor indica que α es un tetrámero estabilizado por interacciones débiles

b)- Emplearía la elecroforesis en geles de poliacrilamida en condiciones nativas, en condiciones

desnaturalizantes (SDS PAGE) y en condiciones desnaturalizante con agente reductor (DTT o B-
mercaptoetanol).

c)- El isoelectroenfoque consiste en una técnica de separación en base al pI de las moléculas. Se

utiliza para tal metodología un gel en que se establece un gradiente estable de pH en el gel por adición de
anfolitos adecuados. Se coloca una mezcla de proteínas en un pocillo del gel y se aplica un campo eléctrico.
Las proteínas se distribuyen a lo largo del gel de acuerdo con sus valores de pI. Las proteínas cargadas se
desplazan hasta alcanzar un pH equivalente a su punto isoeléctrico.

Entonces, en base al fundamento de esta técnica y observando la figura se pueden determinar los pI
de  y :
 tiene un pI=8
 tiene un pI=5
Columna de CM celulosa pKa= 4,5 pH de trabajo= 7 (cromatografía de intercambio catiónico=
retiene cationes). Para saber si esta columna permite separar ambas proteínas debo determinar la carga neta
de  y  bajo el pH de trabajo y por ello es importante conocer su pI (Determinado a partir del
isoelectroenfoque).
 pI=8>pH de trabajo qneta = + (positiva) queda retenida a la columna
β pI=5<pH de trabajo qneta = - (negativa) eluye de la columna
La columna de CM celulosa permite la separación de ambas proteínas empleando un pH de
trabajo=7. ¿Por qué elijo este pH de trabajo? En primer lugar dicho pH permite a la columna funcionar como
un intercambiador catiónico y en segundo lugar porque en el enunciado se menciona que rango de estabilidad
de pH de  y  se encuentra entre 6 y 11.
11. Se purificó una proteína estructural a partir de dos bacterias (A y B) aisladas de diferentes fuentes. Con
las proteínas purificadas se corrió una electroforesis de poliacrilamida en presencia de SDS en las siguientes
condiciones: (+) la proteína se hirvió 10 minutos en presencia de 2-mercaptoetanol y (-) la proteína se hirvió
10 minutos sin agente reductor. Luego de la corrida electroforética, el gel se tiño con Coomassie blue y se
observó el patrón indicado en la figura. Por otro lado, las preparaciones proteicas se sembraron en una
columna de exclusión molecular. La masa molecular de los marcadores utilizados para calibrar esta columna
fueron: 30, 100, 210 y 440 kDa. El cromatograma obtenido es mostrado. La proteína de interés eluyó en
ambos casos en la fracción 133. Se recogieron fracciones de 1,5 ml. a) Indicar la masa molecular nativa e
inferir la estructura de ambas proteínas. b) Considerando las estructuras propuestas en el ítem anterior, y
teniendo en cuenta que una de las bacterias fue extraída de una fuente termal, predecir cuál proteína fue
aislada de cada bacteria.

a)- Para indicar el PM nativo de la proteína de interés debo analizar los resultados arrojados por la
CEM. NUNCA debo calcular PM nativo a partir de un SDS PAGE, NUNCA! ¿Por qué? Porque en un SDS PAGE,
el SDS afecta las interacciones débiles entre diferentes subunidades de un polipéptido, por lo tanto, en caso
de que una proteína tenga 2 o más subunidades estabilizadas por interacciones débiles voy a ver más de 1
banda si las subunidades difieren en PM. Y esta observación no va a representar el PM de la conformación
nativa de la proteína.
Entonces, comenzamos construyendo la curva de calibración con los datos de Nº de fracción y PM
de las proteínas marcadoras de la CEM.
Recuerden que el Nº de fracción x Volumen de la fracción = Volumen de elución (Ve).
El gráfico se puede construir de 2 formas. Va a dar igual!

PM Nº fraccion Log PM Ve
440 117 2,64345268 175,5
210 142 2,32221929 213
100 156 2 234
30 190 1,47712125 285

Curva de calibración - Grafico 1 Curva de calibración - Gráfico 2

3
3
2,5 y = -0,0108x + 4,5718 y = -0,0163x + 4,5718
2,5
R² = 0,9927 R² = 0,9927
2 2
Log PM

Log PM

1,5 1,5
1 1

0,5 0,5
0
0
0 50 100 150 200
0 100 200 300
Ve Nº de Fracción
 Al reemplazar el nº de fracción o Ve de la proteína de interés en la ecuación correspondiente
obtenemos el valor del Log PM.

Log PM= -0,0108x(199,5) + 4,5718 (Gráfico 1) Log PM= 2,41 PM= 102,41≈ 260KDa
Ve

Log PM= -0,0163x(133) + 4,5718 (Gráfico 2) Log PM= 2,4

Nº de fracción

 El peso molecular nativo de ambas enzimas A y B es de 260 KDa

Análisis del SDS PAGE – Es necesario para inferir sobre la estructura de ambas proteínas (A y B)

(+) indica la presencia de agente reductor visualizo la presencia de puentes disulfuro entre subunidades
diferentes en caso de que hubiesen
(-) indica la ausencia de agente reductor sólo voy a ver bandas que corresponden a las subunidades
estabilizadas por interacciones débiles

Mediante en análisis arrojado por la CEM determinamos que ambas enzimas presentan igual PM que
corresponde a 260KDa por lo tanto en ambos casos y en base a la presencia de varias bandas de bajo peso
molecular en el SDS PAGE se puede concluir que las 2 enzimas poseen varias subunidades. ES POR ESTO QUE
NO PUEDO DETERMINAR PESO MOLECULAR NATIVO VIENDO ESTE TIPO DE GELES!.
En el caso de la proteína A en ausencia de agente reductor se visualizan 2 bandas: a 50 KDa y a 70
KDa. Esto sugiere que A podría estar constituida por 3 subunidades de 70 KDa y 1 de 50KDa estabilizadas por
interacciones débiles.
Por otra parte en presencia de 2-mercaptoetanol se observan 3 bandas: a 50 KDa, a 40 KDa y a 30
KDa. Esto quiere decir que en realidad cada subunidad de 70 KDa consiste en 2 subunidades de 40 KDa y 30
KDa estabilizadas por puentes disulfuro.

Esquema ilustrativo de la estructura de A:

En el caso de la proteína B en ausencia de agente reductor se visualizan 2 bandas: a 210 KDa y a 50

KDa. Mientras que en presencia de 2-mercaptoetanol se observan 3 bandas: a 50 KDa, a 40 KDa y a 30 KDa.
Esto quiere decir que la subunidad de 210 KDa consiste en 3 subunidades de 40 KDa y 3 de 30 KDa estabilizadas
por puentes disulfuro.

Esquema ilustrativo de la estructura de B:

 b)- En base a las estructuras propuestas en el ítem a, la proteína B es la candidata a ser la aislada a
partir de una fuente termal ya que su conformación nativa se encuentra estabilizada por mayor cantidad de
puentes disulfuro (enlaces covalentes) en relación a la proteína A, los cuales proporcionan una mayor
tolerancia y estabilidad estructural frente a altas temperaturas.

12. Se inyecta una muestra supuestamente pura de la proteína monomérica lactato deshidrogenasa en una
columna de Sephacryl (exclusión molecular= CEM) con el fin de establecer su peso molecular. Se obtiene un
único pico a un Ve de 34 ml, el cual es comparado con los datos obtenidos para las proteínas marcadoras
(figura 1). Para evaluar su pureza, se realiza una electroforesis en dos dimensiones de la muestra y luego de
tinción por azul de Coomassie para proteínas totales, se obtiene el resultado indicado en la figura 2. Para
calcular el pI grafica los valores de pH del gel en función de la distancia desde el ánodo según los datos de
la tabla. En base a estos experimentos: a) ¿Cuál es el peso molecular de la proteína? b) ¿A qué se debe el
resultado obtenido en el gel 2D. ¿Qué puede decir acerca de la muestra? ¿Podría determinarse el pI de la
lactato deshidrogenasa? Calcula un valor probable. c) ¿Agregarías algún paso en la purificación de la lactato
deshidrogenasa? ¿Cuál?
LogPM(KDa)

24 26 28 30 32 34 36 38 40
FIG 1
Ve (ml)

a)- Para determinar el PM de la enzima Lactato deshidrogenasa debo interpolar su valor de Ve

(volumen de elución) en la curva de calibración Log PM vs Ve. (Recordar que esta curva se construye corriendo
proteínas marcadoras de PM conocido en una CEM y registrando los volúmenes de elución correspondientes).
Dado que no disponemos de la ecuación de la recta de la curva, tenemos que definir el Log PM de forma
manual.
 Interpolando, observamos que a un Ve=34ml le corresponde un Log PM=1,6 y despejando PM=101,6=
40 KDa (PM nativo)
b)- La electroforesis en gel bidimensional, abreviada como electroforesis en 2-D, consiste en otra
técnica de separación de biomoléculas basada en 2 propiedades, su pI y su tamaño. En esta metodología se
complementan 2 técnicas ya vistas. En primer lugar, se emplea el IEF (isoelectroenfoque) que constituye la
primera dimensión y mediante el mismo las proteínas se separan en función de su pI. Una vez separadas en
base a su punto isoeléctrico, estas proteínas son sometidas a una segunda dimensión, que consiste en un SDS
PAGE de forma tal de ser separadas de acuerdo a su PM. Debido a que es poco probable que dos moléculas
sean similares en dos propiedades distintas, éstas se separan más eficazmente con electroforesis en 2-D que
en la electroforesis en 1-D (convencional).

A partir del gel 2-D se pueden visualizar 2 bandas con distinto pI pero con igual PM. Dado que en el
enunciado se aporta como dato que la enzima lactato deshidrogensa es monomérica, la presencia de 2 bandas
en vez de 1 indica contaminación de la muestra.
El pI de la enzima lactato deshidrogenasa podría calcularse construyendo una curva con los valores
que se encuentran en la tabla debajo del enunciado. ¿Qué se entiende por estos valores? Indican el pH del gel
empleado para el IEF a lo largo del eje longitudinal y señala a que distancia desde el ánodo (polo postivo) se
detecta este valor de pH. Ver figura 6.

Figura 6.

Entonces conociendo a qué distancia (cm) se encuentran las bandas proteicas del ánodo puedo
determinar el pH de esa zona y por lo tanto el pI de las proteínas. La curva se construye colocando los valores
de Distancia desde el ánodo en el eje X y los valores de pH respectivos en el eje Y. Una vez obtenida la ecuación
de la recta (por regresión lineal) utilizamos lo valores de distancia del enunciado para calcular los valores de
pH respectivos.
 Curva IEF
10

pH
4

2 pH = 1,0035.Distancia(cm) + 2,5303
R² = 0,9948
0
0 1 2 3 4 5 6 7
Distancia desde el ánodo (cm)

- Al valor de 1,7cm le corresponde un valor de pH de 4,24.

- Al valor de 3,7cm le corresponde un valor de pH de 6,24.
En este punto si no tenemos información adicional de la enzima lactato deshidrogenada no
podremos saber cuál de los 2 valores corresponde a su pI correcto porque no sabríamos fehacientemente cuál
de las 2 bandas observadas corresponde a la proteína de interés. Por lo que en este caso podríamos decir que
su pI podría oscilar en el rango de 4,24 – 6,24.
c)- Sabiendo que la muestra no está pura y que las 2 proteínas de la muestra presentan diferente pI
emplearía una cromatografía de intercambio iónico para separarlas. Por ejemplo, una columna de CM celulosa
pKa=4,5 a pH de trabajo=6. Una vez separadas, para detectar la presencia de la enzima de interés llevaría a
cabo ensayos de actividad enzimática. (LO VAN A VER MÁS ADELANTE!)

13. Se aislaron 2 isoenzimas (A y B) a partir de dos especies distintas de leguminosas. Con el fin de
caracterizarlas se llevó a cabo una columna de exclusión molecular en presencia y ausencia de glicerol. En
ambas condiciones la proteína A presentó un volumen de elución (Ve) de 16 ml, mientras que la proteína B
presentó Ve de 16 ml y 26 ml en presencia y ausencia de glicerol, respectivamente. La curva de calibración
obtenida con diferentes marcadores de masa molecular se muestra en el gráfico. Además, se corrió un gel
de poliacrilmida en presencia de SDS hirviendo las proteínas con y sin DTT. El patrón electroforético
obtenido se muestra en la figura. La concentración de ambas proteínas determinada por Bradford fue de
0,25 µM para ambas proteínas. Alícuotas de 1,5 ml de las soluciones proteicas fueron sometidas a oxidación
y reducción, y luego se incubaron con eosin-maleimida (compuesto que reacciona en relación
estequeométrica 1:1 con grupos SH-, 523= 85000 M-1 cm-1). Luego de la diálisis, los valores de Abs de las
preparaciones enzimáticas tratadas con agente oxidante fueron 0,042 para A y 0 para B; mientras que las
formas reducidas de ambas proteínas presentaron un valor de 0,085. En base a estos resultados, determina
las estructuras cuaternarias de A y B, indicando el estado redox de los residuos Cys presentes y la disposición
de los puentes disulfuro.

Para cumplir con el objetivo del enunciado y determinar la estructura cuaternaria debo en primer
lugar determinar el PM nativo de ambas proteínas. ¿Cómo? Empleando la curva de calibración arrojada por la
corrida en la CEM de las proteínas marcadoras. En este caso no se dispone de la ecuación de la recta por lo
tanto vamos a utilizar la misma curva para interpolar el valor de Ve de las proteínas en presencia (rojo) y en
ausencia de glicerol (azul).
De tal forma, buscamos en el eje de las absisas el valor de Ve correspondiente a la proteína A (figura
X), que es el mismo con o sin glicerol= 16 ml. Interpolando en la curva se observa que a dicho valor de Ve le
corresponde un LogPM=1,85.
PM=101,85 PM nativo de A=70 KDa

El mismo procedimiento empleamos para determinar el PM de la proteína B (Figura X). De tal forma,
se visualiza que en presencia de glicerol (rojo) B presenta un Ve de 16 ml al igual que la proteína A por lo tanto
tiene el mismo PM nativo de B=70 KDa. Sin embargo en ausencia de glicero el Ve de B se corre a 26 lo cual
indica la presencia de más de una subunidad.
PM=101,55 PM= 35 KDa. B presenta al menos 2 sunbunidades de 35 KDa establizadas por interacciones
débiles.

Figura x

Luego analizamos el SDS PAGE de ambas proteínas:

En ausencia de DTT, la proteína A presenta una única banda que corresponde al tamaño de 70KDa
lo cual se condice con lo observado por la CEM. En el caso de la proteína B en ausencia de glicerol se aprecia
una única banda a la altura de 35 KDa, lo cual tb se condice con lo visto mediante el análisis de CEM: 2
subunidades de 35 KDa estabilizadas por interacciones débiles.
Por otra parte, en presencia de agente reductor se observa que B mantiene una única banda a la
altura de 35KDa, lo cual indica que no presenta puentes disulfuro intercatenarios. Sin embargo, en el caso de
A, se observa que la banda que antes se encontraba a la altura de 70KDa pasa a estar a 35KDa en presencia
de DTT lo cual sugiere que esta proteína presenta 2 subunidandes de 35KDa estabilizadas por puentes
disulfuro intercaterios.

Estructuras propuestas hasta ahora:

¿Cómo hacemos para saber el estado rédox de los residuos de Cys y la disposición de los puentes
disulfuro? Tal como vimos en el tema de aminoácidos, la Cys es un aminoácido que presenta un grupo SH- en
su cadena lateral, el cual puede estar reducido (protonado) en la forma SH- o bien puede encontrarse oxidado
formando puentes disulfuro (S-S) con otro residuo de Cys que puede encontrase en la misma subunidad
(puente disulfuro intracatenario) o en otra subunidad de una proteína (puente disulfuro intercatenario).
Entonces para que haya puentes disulfuro se requiere la presencia de al menos 2 Cys en la secuencia de una
proteína.
El reactivo eosin-maleimida tiene la capacidad de reaccionar 1:1 con los SH- reducidos de las
proteínas. Es decir reacciona con aquellos grupos SH- que no están involucrados en puentes disulfuro. Con
los grupos que forman puentes disulfuro (S-S) no puede interaccionar a menos que se exponga a la proteína
en un medio reductor que rompa con esos enlaces covalentes generando 2 grupos SH- libres. En medio
oxidante, en el cual la proteína se encuentra en estado nativo, los puentes disulfuro permanecen intactos y
no pueden interaccionar con eosin-maleimida.
Entonces sabiendo esto, ¿qué hacemos? Dado que la eosin maleimida reacciona 1:1 con los SH-, si
empleamos la ecuación de Lambert Beer determinaremos la concentración del complejo que es la misma que
la concentración de grupos SH-. En este punto es importante darse cuenta que el tratamiento con
eosinmaleimida se hace en 2 condiciones: 1- con la enzima en estado oxidado (con todos los puentes disulfuro
intactos – conformación nativa). En este caso el reactivo se va a unir a aquellos SH- libres que estén expuestos.
2- con la enzima reducida (no habrá puentes disulfuro de ningún tipo, todos los SH- estarán libres). En este
caso el reactivo se va a unir a todos los grupos SH- que claramente dependen del número de Cys totales que
presente la proteína en su secuencia.

Enzimas en estado oxidado

A presenta una Abs=0,042 (un valor de Abs positiva indica la presencia de SH- libres)

Abs=Ɛ.b.C 0,042=85000 M-1cm-1. 1 cm. C C=0,5 µM (concentración de SH- libres)

B presenta una Abs=0 (el valor 0 indica que no hay SH- libres en la conformación nativa de B)

Enzimas en estado reducido

A y B presentan una Abs=0,085

Abs=Ɛ.b.C 0,085=85000 M-1cm-1. 1 cm. C C= 1 µM (concentración de SH- totales)

 Habiendo llegado hasta acá ¿Para qué me sirve el dato de la concentración de las proteínas
determinado por Bradford? 0,25 µM
Si relaciono concentración de grupos SH- y concentración de proteína de manera de establecer un
cociente entre ambos voy a obtener el número de SH- por molécula de proteína, lo cual es lo mismo a obtener
el num de cys por molecula de proteína ya que el único aminoácido que provee SH- es la cisteína. Y de esta
forma puedo responder a la pregunta formulada en el enunciado.

Proteína A(oxidada) 0,5 µM (cc de SH- expuestos) = 2 A posee 2 Cys cuyos SH- están libres
0,25 µM (cc de la proteína)

Proteína A(reducida) 1 µM (cc de SH- expuestos) = 4 A posee 4 Cys totales

0,25 µM (cc de la proteína)

Entonces, en base a todos los resultados hasta ahora=

 Puente disulfuro intercatenario

Proteína B(oxidada) no hay SH- libres en la conformación nativa de B

Proteína B(reducida) 1 µM (cc de SH- expuestos) = 4 A posee 4 Cys totales

0,25 µM (cc de la proteína)

Si observamos detenidamente los resultados obtenidos para la proteína B que podemos concluir?
Presenta 4 cys en las secuencia de aminoácidos sin embargo ninguno de los grupos SH- está libre en su
conformación nativa. Llamativamente tampoco detectamos puentes disulfuro intercatenarios para la proteína
B, lo cual lo vemos en el SDS PAGE. Entonces se puede concluir que los 4 grupos SH- se encuentran formando
puentes disulfuro intracatenarios en la conformación nativa de B. Esto que quiere decir que los puentes
disulfuro se encuentran dentro de una misma subunidad, estabilizando cada subunidad.

Entonces, en base a todos los resultados hasta ahora=

Puentes disulfuro intracatenarios

14. Para determinar la concentración de una muestra pura de proteína, se utiliza el método de Bradford.
Para ello, se preparan 2 ml de un testigo de albúmina pesando 2 mg de la misma. Seguidamente, se toman
5 l de esta solución y se la diluye hasta 500 l de agua destilada. Utilizando 150 l de esta solución se
obtiene una absorbancia a 595 nm de 0,22; mientras que para 25 l de la solución proteica en estudio se
obtiene una absorbancia de 0,25. Cuando se realiza una electroforesis en condiciones nativas se obtiene un
PM de 600.000 Da. Cuando se prepara la muestra con cloruro de guanidina o con 2-mercaptoetanol se
obtiene una única banda de 150.000 Da, en ambos casos. Una alícuota de 1,5 ml de la solución proteica se
incubó con eosin-maleimida (523= 85.000M-1 cm-1) obteniéndose, luego de diálisis exhaustiva, un valor de
absorbancia de 0,0384. Posteriormente, se trató una alícuota de 1,5 ml de la proteína con un agente
reductor y luego con eosin-maleimida, obteniéndose, en este caso, un valor de absorbancia de 0,1153. a)
Expresa la concentración de la proteína en M. b) Indica la estructura cuaternaria de la proteína señalando
el estado de óxidoreducción de cada Cys y el número de Cys por molécula.

Para proceder a calcular la concentración de cualquier proteína necesito disponer de alguna de las
siguientes opciones: una curva de calibración (Abs vs. µg) realizada con un testigo de concentración conocida
o bien usando un único valor de Abs de un testigo de concentración conocida. En este ejercicio en particular
se proporciona el valor de Abs a 595 de una solución diluida de testigo de albúmina. Por lo tanto para
relacionar Abs y masa de testigo debo calcular en primer lugar cuantos µg de albumina se utilizaron para hacer
la lectura.

Testigo (2mg/2mL) concentración del testigo 1mg/mL= 1µg/µL

Se toman 5 µL de solución de testigo 1mg/ml, los cuales se procesan como se muestra en la figura X
para obtener el valor de Absorbancia 0,22. En este punto es importante destacar que el valor de absorbancia
arrojado por el espectrofotómetro tiene en cuenta la concentración del testigo presente en la cubeta, el cual
es diferente a la inicial. ¿Por qué es diferente? Porqué se diluyo y luego se tomó una alícuota de dicha dilución
para hacer la medida. Por lo tanto hay que recalcular la concentración del testigo luego de la dilución y la masa
del mismo en la cubeta.

1µL de testigo 1µg de testigo

5µl de testigo x= 5µg de testigo

5µg de testigo 500µl

X=0,01 µg de testigo 1µl (concentración del testigo) 0,01 µg/µL

0,01µg de testigo 1µl

X=1,5µg de testigo (masa de testigo en la cubeta) 150µl (Volumen colocado en la cubeta)

Entonces 1,5µg de testigo 0,22 UA

X=1,7µg de proteína 0,25 UA (lectura arrojada para la proteína de interés)

1,7µg de proteína 25µl (vol de la solución proteica utilizada para la lectura)

X=0,068µg de proteína 1 µl

La concentración de la proteína de interés es de 0,068µg/µl sin embargo en el enunciado dicha

concentración se solicita expresada en µM por lo tanto es necesario en este punto conocer el PM de la
proteína. Esta información se conoce y corresponde a 600000Da. Recuerden que para hacer la relación µg-
µmol debo utilizar el PM en Da
Hay 2 formas de seguir:
1- Empleando la concentración calculada de la proteína en µg/µl
600000 µg de proteína 1µmol
0,068 µg de proteína X=1,136x10-7 µmol

1,136x10-7 µmol 0,001 ml

X=0,114 µmol 1000ml

Concentración de la proteína = 0,114 µM

b)- Por otra parte para inferir sobre la estructura cuaternaria debo analizar las bandas observadas
en presencia del agente desnaturalizante (cloruro de guanidina), del agente reductor (2-mercaptoetanol) y
los resultados arrojados por el tratamiento con eosin-maleimida.
Cloruro de guanidina afecta interacciones débiles (por ejemplo, interacciones hidrofóbicas)
2-mercaptoetanol rompe puentes disulfuro
Bajo el tratamiento con ambos agentes se observa una sola banda a la altura de 150000 Da, lo cual
indica que la proteína es un tetrámero estabilizado por interacciones débiles. Recuerden que el PM es de
600000 Da y figura como dato en el enunciado.

Proteína (en medio oxidante)

Abs=Ɛ.b.C 0,0384=85000 M-1cm-1. 1 cm. C C=0,451 µM
0,451 µM (cc de SH- expuestos)= 4 - posee 4 Cys cuyos SH- están libres
0,114 µM (cc de la proteína)

Proteína (en medio reductor)

Abs=Ɛ.b.C 0,1153=85000 M-1cm-1. 1 cm. C C=1,35 µM
1,35 µM (cc de SH- expuestos)= 12 - posee 12 Cys en total
0,114 µM (cc de la proteína)

Mediante el análisis del SDS PAGE se determinó que la proteína de interés posee 4 subunidades de
150KDa cada una, sin embargo, no se detectaron puentes disulfuro intercatenarios ya que se vio igual número
de bandas en presencia o ausencia del agente reductor. A partir de los resultados arrojados por el tratamiento
con eosin-maleimida se aprecia que de las 12 Cys totales presentes en la proteína, en estado oxidado sólo se
detectan 4 SH- libres lo cual indica que los 8 restantes se encuentran formando puentes disulfuro
intracatenarios.
Esquema de la estructura probable de la proteína=

El esquema muestra una posible estructura. Si ustedes quisieran añadir todas las Cys en una
subunidad o distribuirlas en 2 o en 3 tambien estaría bien. Lo importante es que respeten el número total de
Cys y el estado redox de las mismas: 4 reducidas y 8 oxidadas (formando puentes disulfuro intracatenarios).
15. La tabla describe las características de cuatro proteínas (cada círculo representa un polipéptido y todos
los residuos de cisteínas se encuentran indicados):

a) Esquematiza el cromatograma obtenido para cada una de ellas luego de sembrarlas en una columna
de Sephacryl (rango de exclusión: 25-160 kDa) en las siguientes condiciones: i) con glicerol, ii) sin glicerol y
en presencia de urea, iii) en presencia de urea y 2-mercaptoetanol. Justifica. b) ¿Cómo procederías
experimentalmente para separar D del resto de las proteínas en la mezcla? Para ello, además de la columna
mencionada, se dispone de otra columna de exclusión molecular (rango de exclusión: 70-350 kDa), resinas
de DEAE-celulosa (pKa=9,5) y carboximetil-celulosa (pKa=4,5), y una solución saturada de (NH4)2SO4.
Justifica. c) Grafica el patrón de bandas esperado si una vez purificadas las proteínas son sembradas en un
SDS-PAGE en condiciones reductoras y no reductoras.

Recordemos el significado de rango de exclusión de una columna cromatográfica: 25-160 kDa.

Significa que sólo permite separar proteínas cuyos PM se encuentren en ese rango de PM. En este caso, la
columna utilizada sólo me permitirá separar proteínas o subunidades proteicas que presenten una masa
comprendida entre 25 y 160 KDa. Proteínas que presenten un PM menor a 25 KDa eluirán juntas en el V t
(volumen total) de la columna mientras que proteínas con un PM mayor a 160 KDa también van a eluir juntas
en el V0 (volumen muerto) de la columna. En ambos casos sólo se verá un único pico que contenga a todas las
proteínas.

i) Con glicerol (estabilizante de la estructura cuaternaria). En este caso todas las proteínas
presentarán su conformación nativa y por lo tanto van a eluir de acuerdo a su PM nativo.

Dado que C y D presentan PM mayores a 160 KDa, van a eluir juntas en V0 y por lo tanto se verá un
solo pico. En el caso de A y B, al presentar igual PM también van a eluir juntas y se visualizará 1 sólo pico en el
perfil de elución.

ii) Sin glicerol y en presencia de Urea (desnaturalizante). En este caso se verán afectadas las
interacciones débiles que estabilizan las subunidades de proteínas multiméricas. Por lo tanto bajo
esta condición las proteínas no van a eluir en su conformación nativa si no que hay que tener en
cuenta los PM de las subunidades que la constituyen, en caso de presentar cualquier tipo de
interaccion débil.
 Bajo esta condición las proteínas que presentan interacciones débiles son C y D. Por lo tanto hay que
tener en cuenta que dichas proteínas van a presentar disociación entre las subunidades estabilizadas por este
tipo de unión (que incluye interacciones hidrofóbicas, iónicas). De modo que a partir de D se generaran 2
subunidades: 1 de 300 KDa y otra de 350 KDa; y ambas van a eluir en V0 juntas y se observará un solo pico en
el cromatograma. Por otra parte, a partir de C se obtendrán 4 subunidades de 100 KDa cada una, las cuales
tambien van a eluir juntas en un mismo pico. Finalmente la conformación nativa de A y B no se verá afectada
por la presencia de urea por lo tanto eluiran juntas al igual que en la condición i.

iii) Con urea y 2-mercaptoetanol (agente reductor). En este caso se verán afectadas tanto las
interacciones débiles como los puentes disulfuro que estabilizan las subunidades de proteínas
multiméricas.

En este caso a partir de A se generarán 2 subunidades de 30 KDa cada una, las cuales van a eluir
juntas y se visualizará un único pico en el cromatograma.
B consiste en un monómero por lo tanto no va a eluir igual que en los casos anteriores.
A partir de C se generarán 4 subunidades de 100 KDa cada una las cuales eluirán juntas y se apreciará
un solo pico en el perfil de elución. (idem condición ii)
Finalmente la proteína D dará lugar a 4 subunidades: 2 de 175 KDa, las cuales eluirán juntas en V0 y
se observará un único pico en el cromatograma; y 2 subunidades de 150 KDa que también van a eluir juntas,
visualizandose un único pico.

b). CEM rango de exclusión= 70-350 KDa. Empleando esta CEM no podría separar a la proteína D de
la proteína C ya que ambas eluirían juntas en el V0 de la columna por presentar PM nativos mayores a 350 KDa.

Resina de DEAE-celulosa (pKa=9,5). Dado que se trata de una cromatografía de intercambio aniónico
(retiene aniones ya que la resina posee carga neta positiva) debo evaluar la qneta de las proteínas en el pH de
trabajo seleccionado. pH de trabajo= 7
A presenta pI=6 pH>pI qneta negativa queda retenida en la columna
B presenta pI=4,5 pH>pI qneta negativa queda retenida en la columna
C presenta pI=7,1 pH≈pI qneta entre 0 y + eluye de la columna
D presenta pI=5,2 pH>pI qneta negativa queda retenida en la columna

Empleando esta columna de intercambio si se puede llevar a cabo la separación de las 4 proteínas.
Para ello, debo utilizar un gradiente de fuerza iónica de una sal como el KCl (de 0 a 1 M) y así las proteínas
retenidas a la columna irán eluyendo en el siguiente orden: A, D y por último B.

Resina de carboximetil-celulosa (pKa=4,5) Dado que se trata de una cromatografía de intercambio

catiónico (retiene cationes ya que la resina posee carga neta negativa) debo evaluar la qneta de las proteínas
en el pH de trabajo seleccionado. pH de trabajo= 7
A presenta pI=6 pH>pI qneta negativa eluye de la columna
B presenta pI=4,5 pH>pI qneta negativa eluye de la columna
C presenta pI=7,1 pH≈pI qneta entre 0 y + puede o no quedar retenida
D presenta pI=5,2 pH>pI qneta negativa eluye de la columna

No se puede utilizar esta columna para llevar a cabo la separación de las proteínas ya que A, B y D
eluyen juntas.

Solución saturada de (NH4)2SO4.

Consiste en un método de separación basado en la solubilidad de las macromoléculas. La solubilidad
de las proteínas varía de acuerdo con la fuerza iónica de la solución. A bajas concentraciones de iones (<0.5
M), la solubilidad de las proteínas aumenta al aumentar la concentración de sal. A medida que aumenta la
concentración de sal, la solubilidad de la proteína comienza a disminuir. A una fuerza iónica suficientemente
alta, la proteína precipita. La concentración de sulfato de amonio añadida debe aumentarse a un valor que
precipite la mayor parte de la proteína de interés, dejando al mismo tiempo la cantidad máxima de
contaminantes proteínicos aún en la solución. La proteína de interés precipitada puede recuperarse
posteriormente mediante centrifugación y disolverse en un buffer adecuado para preparar la muestra para la
siguiente etapa de purificación. El inconveniente de este método es que muchas veces pueden precipitarse
diferentes sustancias junto con la proteína, y deben realizarse otras técnicas de purificación. En este caso
desconocemos la solubilidad de las proteínas de interés y por lo tanto no es la mejor opción.
c)-
MPM: marcador de peso molecular
Dado que el gel corresponde a un SDS PAGE, todas las calles cuentan con SDS, sin embargo, las
muestras tratadas a su vez con agente reductor (DTT) son aquellas rotuladas como +DTT.
Las bandas mostradas en cada caso corresponden a las subunidades proteicas que figuran arriba del
respectivo pocillo.