UNIVERSIDAD NACIONAL AGRARIA LA MOLINA

MESA
FACULTAD DE CIENCIAS
DEPARTAMENTO ACADÉMICO DE QUÍMICA N° 5

LABORATORIO DE BIOQUÍMICA

PRÁCTICA N° 5

ESPECTRO DE ABSORCIÓN – DETERMINACIÓN DE Λ ÓPTIMO

Integrantes:

1. Anampa García, Estrella Mayté (20151425)

2. Arias Ospina, Jenny Isabel (20151427)

3. Castillo Arispe, Meybi Ani (20151435)

4. Mollyk Montes, Anwar Rael (20151447)

Grupo: A* (martes/11am a 1pm)

Fecha de la práctica: 2 de mayo del 2017

Fecha de entrega de informe: 9 de mayo del 2017

2017-I
 INTRODUCCIÓN

Se denomina espectrofotometría a la medición de la cantidad de energía radiante que

absorbe un sistema químico en función de la longitud de onda de la radiación, y a las mediciones
a una determinada longitud de onda.

La teoría ondulatoria de la luz propone la idea de que un haz de luz es un flujo de cuantos
de energía llamados fotones; la luz de una cierta longitud de onda está asociada con los fotones,
cada uno de los cuales posee una cantidad definida de energía (Brunatti y Martín, 2016).

Los métodos espectrométricos son un amplio grupo de métodos analíticos que se basan
en las espectroscopias atómica y molecular, así mismo en la capacidad de las sustancias de
absorber o emitir radiación electromagnética, y tales métodos se pueden emplear para determinar
la concentración de un reactivo o producto durante una reacción.

La espectrofotometría es el método de análisis óptico más usado en el área de

investigación ya que se utilizan para la detección específica de moléculas. Es la medida de la
cantidad de energía radiante absorbida por las moléculas de una muestra en función de las
longitudes de onda específicas.

Se caracteriza por su precisión, sensibilidad y su aplicabilidad a moléculas de distinta

naturaleza (contaminantes, biomoléculas) y estado de agregación (sólido, líquido, gas). Los
fundamentos físico-químicos de la espectrofotometría son que las moléculas pueden absorber
energía luminosa y almacenarla en forma de energía interna. Esto permite que se inicien ciclos
vitales de muchos organismos, entre ellos el de la fotosíntesis en plantas y bacterias [CITATION
Que13 \l 10250 ].

OBJETIVOS
 Aprender el manejo de un espectrofotómetro.
 Aplicaciones de la ley de Lambert y Beer, Preparación de curvas de calibración de
soluciones coloreadas.
 Determinar la concentración de las sustancias azul de bromofenol y naranja de metilo.
RESULTADOS DE CALIBRACIÓN

AZUL DE BROMOFENOL

Gráfica 1: Espectro de absorción del azul de bromofenol

0.35 Chart Title

0.3 0.3
0.3

0.25

0.19
Absorbancia

0.2

0.15

0.1 0.07

0.05

0
500 520 540 560 580 600 620 640 660
Longitud de onda (nm)

Fuente: Elaboración propia

NARANJA DE METILO 

Gráfica 2: Espectro de absorción del naranja de metilo

0.35
0.31
0.3 0.29
0.28

0.25 0.24
Absorbancia

0.2 0.17

0.15

0.1

0.05

0
380 400 420 440 460 480 500 520
Longitud de onda (nm)

Fuente: Elaboración propia

 DISCUSIONES

AZUL DE BROMOFENOL

Según Harris (2007) el máximo de absorción para el azul de bromofenol es a una

longitud de onda de 591 nm. Cabe decir que la longitud de onda de máxima absorbancia para
soluciones que manifiestan el color azul está en el rango de 580 a 620 nm.

Tabla 1: Espectro de absorción del azul de bromofenol

λ 520 nm 560 nm 580 nm 600 nm 620 nm 640 nm

%T 84.53 64.86 50.12 50.58 -- --

A 0.073 0.188 0.300 0.296 -- --

Fuente: Elaboración Propia

En la práctica se calculó una absorbancia de 0.188 a 560 nm, 0.300 a 580 nm y 0.296 nm
a 600 nm, por tanto, se tomó 580 nm como la longitud de onda óptima para la solución
estudiada. No se llegó al verdadero valor de longitud, ya que, por falta de tiempo, no se hizo un
seguimiento en el rango entre 580 y 600 nm.

Sin embargo, se puede observar que no hay mucha diferencia entre las absorbancias a
580 y 600 nm, lo que nos hace suponer que el azul de bromofenol se manifestaba en la longitud
de onda citada anteriormente, lo que significa que estaba en solución neutra. La absorbancia
depende mucho del pH en el que se encuentre esta sustancia, ya que, el azul de bromofenol tiene
dos conformaciones y, por tanto, un valor de pKa definido (Fernandes et. al., 2006).
 Ilustración 1: Conformaciones del azul de bromofenol

Fuente: (Fernandes et al., 2006)

Según Fernandes et al. [CITATION Fer06 \n \t \l 10250 ] , el espectro obtenido a pH 6,7

presenta una banda a 590 nm atribuidos a transiciones de las especies aniónicas AB - (azul). A
medida que se baja el pH, esta banda desaparece y una banda a 440 nm asociados con la
formación de la especie neutral AB (amarillo). Se sabe que, en cada valor de pH, la relación
entre las concentraciones de las especies AB y AB varía de acuerdo a la expresión de
Henderson-Hasselbalch, que se puede escribir en términos de absorbancia. La presencia de un
punto isosbéstico (aquella longitud de onda a la cual las dos especies en equilibrio presentan la
misma absortividad [ CITATION Ols90 \l 10250 ] ) a 496 nm confirma la existencia de un equilibrio
entre las especies simples.

Tabla 2: Absorbancias junto a conformaciones ácida y básica

del azul de bromofenol (7,2 x 10-6 ml/L) en agua juntamente con pKa calculados
 Fuente: (Fernandes et al., 2006)

Gráfica 3: Principio del punto isosbéstico con respecto a la longitud de onda y la absorbancia

Fuente:
https://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/8/8d/Bromocresol_green_spectrum.png

Por tanto, la solución usada en la práctica está en la conformación AB- de la ilustración 1

y definitivamente a un pH casi neutro (no se puede asegurar que fue neutro ya que no se hizo uso
del potenciómetro).

El rango de longitud de onda usado en la práctica fue efectivo. A un rango menor al

usado era probable que se hubiese obtenido una longitud de onda óptima menor a 400 nm, ya
que, el comportamiento del azul de bromofenol a un pH de 6.7 es de doble cresta (Gráfica 4) en
el rango de 0 a 700 nm. Gracias al conocimiento de que el espectro de luz visible es de 380 a 780
nm no se ha tomado en cuenta un rango menor. Esto último hubiese significado que la práctica
se trabajaba en la región del espectro UV y no en el visible [ CITATION Har07 \l 10250 ]. En la
gráfica 4 se puede observar una cresta en el espectro UV y otra más pronunciada en el espectro
visible.
Gráfica 4: Espectros de absorción en la región UV/visible del colorante azul de bromofenol en
agua (7,2x10-6 mol/L) T = 30°C.
(a) pH = 6.70; (b) pH = 4.81; (c) pH = 4.11; (d) pH = 3.43; (e) pH = 2.23

Fuente: (Fernandes, 2006)

Gráfica 5: Espectro electromagnético

Fuente: https://ka-perseus-images.s3.amazonaws.com/01f944ab4471010d09766560f4d1c6da4846d97d.png
 En la práctica se analizaron cinco concentraciones de azul de bromofenol (0.0008,
0.0016, 0.0024, 0.0032 y 0.004 mg/mL). La concentración del analito en la muestra es
directamente proporcional a la absorbancia, ya que, una mayor cantidad de moles de azul de
bromofenol absorben más fotones del haz de luz monocromática y, por tanto, el haz que emerge
es cada vez más tenue (ley de Lambert y Beer) [ CITATION Ols90 \l 10250 ]. Esta ley se aplica a la
radiación monocromática, funciona muy bien con disoluciones diluidas de la mayoría de
sustancias [ CITATION Har07 \l 10250 ].

Gráfica 6: Relación entre concentración, absorbancia (A) y transmitancia (%T)

Fuente: http://www.equiposylaboratorio.com/userfiles/2.png

Ilustración 2: Explicación gráfica de concentración del analito en la muestra proporcional a la

absorbancia
 Fuente: http://2.bp.blogspot.com/-gvoZAfuF_hE/Uuh5RYfVxEI/AAAAAAAAAhM/lywGofmQ5FA/s1600/Figura_11.png

Tabla 3: Resultados de absorbancias a diferentes concentraciones de azul de bromofenol

CONCENTRACIÓ (mg/mL
0.0001 0.0008 0.0016 0.0024 0.0032 0.0040
N )

M1 0.000 0.059 0.123 0.188 0.248 0.303

ABSORBANCIA M2 0.000 0.084 0.140 0.228 0.288 0.365

M3 0.000 0.080 0.157 0.229 0.307 0.371

Fuente: Elaboración propia

Como se puede observar en la tabla 3, las absorbancias de M1 más bajas que las
absorbancias de M2 y M3, por tanto, no tomaremos en cuenta estos datos (este error puede ser
debido a una mala calibración del equipo, debido a que se usó una longitud de onda diferente del
óptimo).

Gráfica 7: Resultados de absorbancias a diferentes concentraciones de azul de bromofenol en M2

0.400 0.365
0.350
0.288
0.300

0.250 0.228
Absorbancia

0.200
0.140
0.150

0.100 0.084

0.050
0.000
0.000
0.0000 0.0005 0.0010 0.0015 0.0020 0.0025 0.0030 0.0035 0.0040 0.0045
Concentración (mg/mL)

Fuente: Elaboración propia  

Gráfica 8: Resultados de absorbancias a diferentes concentraciones de azul de bromofenol en M3

0.400 0.371

0.350
0.307
0.300

0.250 0.229
Absorbancia

0.200
0.157
0.150

0.100 0.080

0.050
0.000
0.000
0.0000 0.0005 0.0010 0.0015 0.0020 0.0025 0.0030 0.0035 0.0040 0.0045
Concentración (mg/mL)

Fuente: Elaboración propia  

En las gráficas 7 y 8 se puede observar la relación entre concentración y absorbancia de

M2 y M3. En el caso de M3 se puede verificar que los datos siguen una tendencia más lineal (y,
por tanto, mejor proporcionalidad entre los datos de los ejes) que los de M2, ya que, se
superpone mejor a la línea de tendencia lineal (línea punteada). Por tanto, se verifica mejor la ley
de Lambert y Beer con el azul de bromofenol en el experimento de M3.

NARANJA DE METILO

El naranja de metilo (NM) es una sustancia orgánica utilizada como colorante en la

industria textil y como indicador ácido – base. Es un colorante azoderivado, con cambio de color
de rojo a naranja-amarillo entre pH 3,1 y 4,4. El nombre del compuesto químico del indicador es
sal sódica de ácido sulfónico de 4-Dimetilaminoazobenceno [ CITATION Mar07 \l 3082 ].
 Ilustración 3: Estructura básica del naranja de metilo

Fuente: http://gmnmaster.blogspot.pe/2011/05/la-vida-tiene-un-color-especial.html

Durante la determinación de absorbancia naranja de metilo, se calibro el

espectrofotómetro a una longitud de onda de 400nm de longitud de onda inicial, para hallar la
absorbancia. Obteniéndose los siguientes datos:

Tabla 4: Espectro de absorción del naranja de metilo

λ 400 nm 420 nm 440 nm 460 nm 480 nm 500 nm

%T 66.99 58.08 53.09 49.32 51.76 --

A 0.174 0.236 0.275 0.307 0.286 --

Fuente: Elaboración propia

La relación directamente proporcional existente entre la absorbancia a la concentración

de la sustancia e inversamente proporcional a la luz transmitida o transmitancia, se obtuvo
mediante la siguiente fórmula:

A = - log T

Se observa en la tabla 4 la absorción máxima del colorante naranja de metilo se encuentra

en la longitud de onda de 460nm, sin embargo, no se puedo afirmar que sea esta longitud de
onda la que contenga la absorbancia máxima, debido a que hay un rango de 460nm y 480nm en
el que podría encontrarse la absorción definitiva.

Un indicador ácido – base, como el naranja de metilo, es una sustancia cuyas formas
conjugadas ácido – base tienen diferentes espectros de absorción. Si se entrecruzan los espectros
de absorción tanto del ácido como de la base. La absorción de ambos llega a un punto en el que
se entrecruzan, llamado punto isosbéstico. La longitud de onda correspondiente al punto
isosbéstico de un equilibrio es característico de las dos especies que contribuyen al espectro y,
por lo tanto, se utiliza como dato para su identificación. En la gráfica 9 se observa la absorbancia
máxima a una longitud de onda de 470nm [ CITATION Ken81 \l 3082 ].

Gráfica 9: Espectros de absorción del anaranjado de metilo en soluciones acuosas

Fuente: [ CITATION Ken81 \l 10250 ]  

Se evidencia la diferencia de máxima absorción entre la práctica realizada en clase y la

real, esto debido a que la diferencia de longitud de onda no permitió poder observar la máxima
absorción exacta por motivos de tiempo, y la inexperiencia de los alumnos, que desconocían el
tema.
 Además, se realizó las lecturas de absorbancia a la longitud de onda determinada,
expresado en diferentes concentraciones en los diferentes tubos de ensayo en las unidades
indicadas:

Tabla 5: Resultados de absorbancias a diferentes concentraciones de naranja de metilo

(mg/mL
CONCENTRACIÓN 0.0001 0.0008 0.0016 0.0024 0.0032 0.0040
)
M4 0.000 0.067 0.123 0.176 0.242 0.302

ABSORBANCIA M5 0.000 0.061 0.123 0.182 0.244 0.303

M6 0.000 0.060 0.123 0.184 0.242 0.306
Fuente: Elaboración propia

Gráfica 10: Resultados de absorbancias a diferentes concentraciones de naranja de metilo en

M4
0.35
0.3
0.3
0.24
0.25
Absorbancia

0.2 0.18

0.15 0.12

0.1
0.07
0.05
0
0
0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
Concentración (mg/mL)

Fuente: Elaboración propia  

 Gráfica 11: Resultados de absorbancias a diferentes concentraciones de naranja de metilo en
M5

0.35
0.3
0.3

0.24
Absorbancia 0.25

0.2 0.18

0.15 0.12

0.1
0.06
0.05
0
0
0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
Concentración (mg/mL)

Fuente: Elaboración propia  

Gráfica 12: Resultados de absorbancias a diferentes concentraciones de naranja de metilo en M6

0.35
0.31
0.3
0.24
0.25
Absorbancia

0.2 0.18

0.15 0.12

0.1
0.06
0.05
0
0
0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
Concentración (mg/mL)

Fuente: Elaboración propia  

Es posible observar una aparente linealidad en la gráfica 10, en donde aumenta la

absorbancia a medida que la concentración aplicada a los tubos de ensayo aumenta. Sin
embargo, en la gráfica 11, la linealidad es mucho más visible que en la anterior. Lo mismo se
puede concluir en la gráfica 12. La linealidad en esta gráfica es más marcada que en la primera
gráfica. Lo que significa que, por diversos factores, como el mal uso del espectrofotómetro, la
mala calibración del mismo, entre otros, fue impedimento para no lograr las absorbancias
adecuadas y exactas.

CONCLUSIONES

 Se supo manejar adecuadamente el espectrofotómetro, calibrando la longitud de onda a la

cual se va a trabajar e insertando la solución de manera que el haz de luz atraviese la
parte lisa y no la parte rugosa de la celda.
 Se determinó el lambda óptimo de absorción de la solución de azul de bromofenol y
naranja de metilo verificando que la absorción de cada solución a diferentes longitudes
de onda aumente, y llegue a su punto máximo.
 Tanto en la práctica con azul de bromofenol como en la de naranja de metilo, se
evidenció la relación lineal entre absorbancia y concentración propuesta por la ley de
Beer con concentraciones ascendentes de cada colorante leídas a la misma λ.
 Se logró confeccionar las curvas de calibración con soluciones de azul de bromofenol y
naranja de metilo con los datos resultantes de la práctica.

CUESTIONARIO

1. Hallar la concentración de un metabolito en una muestra de suero si su absorbancia es de

0.280 y las absorbancias del estándar son:

Tubo Absorbancia CONCENTRACION (mg/dL)

1 0.100 10
2 0.200 20
3 0.300 30
 A= a × b × c… (1)
A: absorbancia
a: coeficiente de extinción molar
b: ancho de la cubeta
c: concentración de muestra

*Usando datos de la tabla en (1):

A=a×b×c
0.1 = a × 1 × 10
a = 0.01 (constante para la misma sustancia)

*Entonces teniendo el valor constante de a:

A = a × b× c
0.280 = 0.01 × 1 × c
c = 28 mg/dL

2. El coeficiente de extinción molar del NADH es 6220 cm-1 M-1 ¿Cuál será la
concentración de una muestra que tiene una absorbancia de 0,720 diluida la mitad y
puesta en una cubeta de 1 cm de espesor?

A = 0,720 b = 1 cm a = 6220 cm-1 M-1

A=a×b×c
0,720 = 6220 cm-1 M-1× 1 cm × c
c = 1.16 × 10-4 M

3. Una solución que contiene 2g/L de una sustancia que absorbe en una cubeta de 1cm
transmite el 75% de luz incidente. Calcular la transmitancia de una solución que
contiene: a)4 g/L, b) 1g/L, d) 5.4 g/L, e) Si el peso molecular de compuesto es 250.
Calcule el coeficiente de extinción molar.

e) A = 2 – log(T%)
A = 2 – log(75%)
A = 2 - (-1.25)
A = 3.25
 Hallando concentración:
1 mol----- 250g
x--------- 2g
x = 8x10-3 moles
c = 8x10-3 M

 A=axbxc
3,25 = a × 1 × 8×10-3
a = 406.25

a) 4g/L (0.016M)

A=a×b×c
A = 406.25 × 1 × 0.016
A = 6.5

A = -logT
6.5 = -logT
3.16×10-7 = T

b) 1g/L (4x10-3M)

A=a×b×c
A = 406.25 × 1 × 4×10-3
A = 1.625

A = -logT
1.625 = -logT
0.024 = T

d) 5.4g/L (0.0216M)

A=axbxc
A = 406.25 x 1 x 0.0216
A = 8.775

A = -logT
8.775 = -logT
1.68 × 10-9 = T
4. Una solución 10-5 M de ATP tiene una transmitancia de 0.702 (70.2%) a 260mm en una
cubeta de 1cm. Calcular.

A=axbxcA = -log(T)

0.1535=a x 1 x 10−5 A = -log (0.702)

15360 x cm−1 x M −1=a A = 0.1536

a) La transmitancia de la solución en una cubeta de 3cm.

A=axbxc A = -log(T)

A = 15360x3x10-5 0.4608 = -log (T)

A = 0.4608 0.346 =T

La transmitancia de la solución a una cubeta de 3cm es de 0.346

b) La absorbancia de una solución en cubeta de 1cm o 3cm.

Cubeta 1 cm Cubeta 3 cm

A=axbxc A=axbxc
A = 15360x3x10-5 A = 15360x1x10-5
A = 0.4608 A = 0.1536

c) La absorbancia de una solución 5x10-5

A=axbxc

A = 15360x1x5x10-5

A = 0.768

5. Con los siguientes datos graficar en un solo papel milimetrado las tres curvas de
absorción de la Hb en su estado de desoxihemoglobina, oxihemoglobina, y
cianometahemoglobina indicando cada curva con diferente color o marca. Grafique un
sistema (XY) longitud de onda D.O respectivamente, identificar para cada curva el o los
puntos de máxima absorción.
 a) ¿Qué importancia tiene la longitud de onda?
La longitud de onda es la distancia que existe entre dos puntos sucesivos que se
encuentran en el mismo estado de vibración (misma elongación, velocidad, aceleración…). Se
simboliza mediante la letra griega λ (lambda) y se expresa en unidades de longitud (m).

Los máximos de amplitud se denominan crestas; los mínimos, valles. La distancia entre
dos crestas o dos valles consecutivos se corresponde con la longitud de onda [CITATION Cas16 \l
2058 ].

b) ¿Por qué en las gráficas no coinciden los puntos de máxima absorción a pesar de
pertenecer las tres gráficas a la Hb?

Cómo podemos ver en el gráfico, las curvas de absorción varían por la cantidad de luz
que absorben los distintos tipos de hemoglobinas en función de la longitud de onda de la
radiación incidente. La absorción de la oxihemoglobina es diferente al del resto de las
hemoglobinas.

La ley de Lambert-Beer establece que la cantidad de luz absorbida (A) por una muestra
es proporcional a la concentración (c) de la sustancia que absorben la radiación incidente.

Los parámetros alfa y ele son el coeficiente de absorción molar y la distancia del camino
recorrido por el rayo incidente. De modo que midiendo la cantidad de luz absorbida se puede
conocer la concentración del compuesto activo a esa longitud de onda (Arenas y López, 2004).
 6. A partir de una solución de stock de sulfato de cobre de 10g% se preparó la siguiente
batería.

Tubo N° 1 N°2 N°3 N°4

Sol. Stock CuSO4 (ml) 0.25 0.5 2.0 4.0
H2O destilada (ml) 9.75 9.5 8.0 6.0

Exprese las concentraciones de cada uno de los tubos en ppm y en mg% (en forma
tabular)

Tubo ppm mg%

N°1 2500 250
N°2 5000 500
N°3 20000 2000
N°4 40000 4000

BIBLIOGRAFÍA
 Arenas, I., & López, J. L. (2004). Espectofotometría de Absorción. Cuernavaca:
Universidad Nacional Autónoma de México.

 Brunatti, C., & Martín, A. M. (4 de marzo de 2016). Introducción a la

Espectroscopía de Absorción Molecular Ultravioleta, Visible e Infrarrojo
Cercano. Recuperado el 6 de mayo de 2016, de FIUBA | Facultad de Ingenieria -
UBA: http://materias.fi.uba.ar/6305/download/Espectrofotometria.pdf

 Castaños, E. (2016). Parámetros del Movimiento Ondulatorio. Burgos.

 Connors, K. A. (1981). Curso de Analísis farmacéutico. España: REVERTÉ.

 Fernandes, B. A., Rodrigues, F., Tessaro, A. L., de Souza, V. R., & Hioka, N.
(junio de 2006). Química Nova. O pKa de indicadores ácido-base e os efeitos
coloidais, 29, 3° ed. Maringá, São Paulo, Brasil: Departamento de Química,
Universidade Estadual de Maringá. Recuperado el 6 de mayo de 2017, de SciELO
- Scientific Electronic Library Online: http://dx.doi.org/10.1590/S0100-
40422006000300032

 Harris, D. C. (2007). Análisis Químico Cuantitativo (3° ed.). Barcelona, España:

Editorial Reverté, S. A.

 Marín, J. M. (2007). Degradación de naranja de metilo en un nuevo fotorreactor

solar de placa plana con superficie corrugada. Universidad Tecnologica de
Pereira.

 Olsen, E. O. (1990). Métodos Ópticos de Análisis. Barcelona, España: Editorial

Reverté, S. A.

 Quezada, S. (2013). Manual de experimentos de laboratorio de Bioquímica.

Costa Rica: Universidad Estatal a Distancia.