Informe 5. Biotecnologia

Facultad de Ciencias Básicas
Coordinación Programa de Química
PRACTICA DE LABORATORIO 5: FERMENTACIÓN DE CARBOHIDRATOS

Daniela Salcedo Ortiz1
1
Estudiante del programa de Química de la Universidad del Atlántico. Puerto Colombia- Atlántico
23605- BIOTECNOLOGIA
RESUMEN
A través de un simulador online se estudió la técnica de fermentación de carbohidratos entre los
cuales se encuentran Manitol, maltosa, sacarosa, lactosa y glucosa, con cultivos de diferentes
bacterias tales como E. coli, Salmonella Typhi y Klebsiella pneumoniae; se estudiaron los
diferentes mecanismos de acción de cada una de ellas con los respectivos carbohidratos.
Palabras claves: Fermentación, bacteria, carbohidratos.
INTRODUCCIÓN
La fermentación la definimos como un proceso que libera energía a partir de azucares u otras
moléculas orgánicas, como aminoácidos, ácidos orgánicos, purinas y pirimidinas; no necesita
oxígeno (pero a veces tiene lugar en su presencia), no necesita recurrir al ciclo de Krebs ni a una
cadena transportadora de electrones, utiliza una molécula orgánica como aceptor final de
electrones, sólo produce pequeñas cantidades de ATP (una o dos moléculas por cada molécula de
material inicial) debido a que una gran parte de la energía original almacenada en la glucosa
permanece en los enlaces químicos de los productos finales orgánicos, como el ácido láctico o el
etanol.
Durante la fermentación los electrones se transfieren (junto con los protones) desde coenzimas
reducidas (NADH, NADPH) al ácido pirúvico o sus derivados. Los aceptores finales de electrones
experimentan una reducción que los convierte en los productos finales. Una de las funciones
esenciales del segundo estadio de la fermentación consiste en garantizar una provisión constante de
NAD+ y NADP+ para que pueda continuar el proceso de glucólisis. En la fermentación el ATP se
produce exclusivamente durante la glucólisis.
Los microorganismos poseen la capacidad de fermentar diversos sustratos; los productos finales
dependen del tipo de microorganismo, del tipo de sustrato y del tipo de enzimas que se encuentran
presentes y en estado de activación. El análisis químico de estos productos finales ayuda a
identificar los microorganismos. [1]
El caldo rojo de fenol es un medio de fermentación de uso general que comprende tripticasa, cloruro
de sodio, rojo de fenol y un carbohidrato. La tripticasa proporciona aminoácidos, vitaminas,
minerales y otras sustancias nitrogenadas, por lo que es un medio nutritivo para una variedad de
organismos. El cloruro de sodio ayuda a mantener el equilibrio osmótico y proporciona los
electrolitos esenciales para el transporte a la célula, mientras que el carbohidrato actúa como fuente
de energía. El rojo fenol es el indicador de pH y es inicialmente neutro (pH 7). Apoya el crecimiento
de la mayoría de los organismos, ya sea que puedan fermentar el azúcar o no. Cuando la bacteria
se inocula en el tubo, la bacteria que fermenta el azúcar dará como resultado la producción de ácido
que cambiará el color del rojo fenol. Las reacciones de fermentación a menudo comienzan con la
Km. 7 Antigua Vía Puerto Colombia PBX: (5) 319 7010 Ext.: 1105- Química@mail.uniatlantico.edu.co
Atlántico- Colombia 1106 www.uniatlantico.edu.co
glucólisis. La glucosa actúa como un donante de electrones en la reacción de fermentación, el

piruvato y el producto metabólico de la glucosa actúan como un aceptor de electrones. Los otros
disacáridos y polisacáridos se hidrolizan en glucosa o se convierten en glucosa y luego se produce
la reacción de fermentación. [2]
METODOLOGÍA
1. Asepsia
Para sembrar cualquier tipo de cultivo, hay que adoptar condiciones de asepsia tanto para tomar el
inoculo, como para depositarlo en el medio, estas condiciones implican flamear el asa en la parte
alta de la llama hasta que se pongan incandescentes, flamear levemente la boca del tubo o matraz
después de quitar el tapón y luego para volver a ponerlo, brevemente manteniendo el tapón de
algodón en la mano, nunca en la mesa.
Los cultivos utilizados, fueron de bacterias como: E. coli, Salmonella Typhi y Klebsiella pneumoniae.
2. Preparación del caldo de fermentación de carbohidratos
Para ello hay que pesar y disolver la tripticasa, el cloruro de sodio y el rojo de fenol en 100 ml de
agua destilada y transferir a matraces cónicos, agregar 0.5% a 1% del carbohidrato deseado en
todos los matraces.
Insertar los tubos de Durham invertidos en todos los tubos, los tubos de Durham deben llenarse
completamente con caldo.
Importante no sobrecalentar el caldo de fermentación de carbohidrato rojo de fenol. El
sobrecalentamiento provocará la descomposición de las moléculas y formará compuestos con un
color y sabor característicos. El proceso se conoce como caramelización de azúcar (el dorado del
azúcar).
Transfiera el azúcar a tubos con tapa de rosca o tubos de fermentación y etiquete adecuadamente.
3. Inoculación de las bacterias en los caldos rojos de fenol
Teniendo en cuenta todas las normas de asepsia; tomamos algún tubo de ensayo con nuestro
cultivo de una bacteria, con el asa totalmente esterilizada tomamos un inoculo, lo llevamos a nuestro
primer tubo de caldo, lo introducimos y lo depositamos en el medio, de nuevo sellamos y repetimos
el procedimiento con los diferentes caldos que contienen diferentes carbohidratos y los mismo para
los diferentes cultivos de bacterias.
Luego de esto, llevamos los tubos a la incubadora por 24 horas a 37°C, luego de esto observamos
los resultados.
RESULTADOS
En la figura 1. Se muestran materiales

utilizados, los tubos a la izquierda son
los caldos de fermentación, y los que
vemos al lado derecho son los cultivos
bacterianos.
Figura 1. Implementos utilizados
TUBO 1.
Figura 2. Resultados de la fermentación con la bacteria del tubo 1.
Teniendo en cuenta cuales carbohidratos fueron fermentados por dicha bacteria, podemos
determinar que estos estuvieron reaccionando con Salmonella typhi. La Salmonella typhi fermentó
glucosa, maltosa y manitol, en todas hubo la producción de gases como se puede observar en los
tubos de Durham.
El género Salmonella pertenece a la familia Enterobacteriaceae. Son bacilos gram negativos, de 0,7-
1,5 x 2-5 µm, anaerobios facultativos, no formadores de esporas, generalmente móviles por flagelos
perítricos (excepto S. gallinarum). Fermentan glucosa, maltosa y manitol, pero no fermentan lactosa
ni sacarosa. Son generalmente catalasa positiva, oxidasa negativa y reducen nitratos a nitritos. [3]
TUBO 2.
Figura 3. Resultados de la fermentación con la bacteria del tubo 2
Teniendo en cuenta los cuales fueron los carbohidratos fermentados por la bacteria, se concluye
que en el tubo 2 había E. coli. Esta bacteria solo fermentó glucosa y hubo producción de gases,
como se puede observar en el tubo de Durham.
La E. Coli cual en medios que contienen fuentes de carbono, se desarrolla como bacteria anaerobia
al comienzo del proceso; desintegra los hidratos de carbono mediante la fermentación, para
después comenzar a asimilar el oxígeno; crece como aerobia y oxida los productos de la
fermentación hasta formar CO2 y H2O por ello en el tubo de Durham se nota la producción de gases.
[4]
TUBO 3.
Figura 4. Resultados de la fermentación con la bacteria del tubo 3
En este caso, todos los carbohidratos fueron fermentados, como los muestran las imágenes
podríamos estar frente a Klebsiella pneumoniae o Shigella dysenteriae; pero como notamos, en los
tubos de Durham hay presencia de gas en todos los casos, entonces podemos afirmar que los
carbohidratos fueron fermentados por Klebsiella pneumoniae. La K. pneumoniae es una bacteria de
forma bacilar, gramnegativa, anaerobia facultativa e inmóvil
Cabe resaltar que es los resultados del tubo 4 se determinó que se estaba trabajando con E. coli,
por ende, se le da la misma explicación que con el tubo 2.
Podríamos decir que, en este caso se trabajó una fermentación acido mixta la cual se fundamenta
en: llevar a la glucosa, por ejemplo, hasta piruvato y este a su vez se lleva hasta un ácido y la
producción de gases en algunos casos.
Figura 5. Ruta de la fermentación de la glucosa.
CONCLUSIÓN
La fermentación es un proceso catabólico que se da en ausencia de oxígeno (anaerobiosis) y el

producto final es un compuesto orgánico. La fermentación es un proceso de óxido-reducción,
equilibrado internamente donde el sustrato fermentable se oxida y reduce a la vez. En la
fermentación la síntesis de ATP se realiza mediante la fosforilación a nivel de sustrato El primer
paso de toda fermentación es la glucólisis, en donde la glucosa es oxidada hasta formar 2 piruvatos.
El proceso de fermentación, es una alternativa para la producción de energía cuando en el medio se

puede dar la respiración, a través de esta prueba se pudo determinar el tipo de microrganismo con
el cual se hizo la fermentación y esto se logró a partir de pruebas de fermentación con
carbohidratos.
CUESTIONARIO
1. ¿Explicar la importancia del rojo de fenol en la prueba de fermentación de carbohidratos?
El rojo de fenol es una sustancia de naturaleza orgánica que tiene la propiedad de cambiar de color
cuando pasa de alcalino a ácido y viceversa. Por esta característica es utilizado como indicador
ácido-base. También se le conoce con el nombre de fenolsulfonftaleína, y su fórmula química es
C19H14O5S. Este indicador de pH es de color amarillo por debajo de 6,8, y de color rojo por encima
de 8,4.[5] La función del indicador es ayudarnos a identificar cualitativamente si ocurrió o no la
fermentación.
2. ¿Qué sucede si sobrecalienta la prueba de fermentación de carbohidratos con fenol

rojo? Explique.
Si se calienta la prueba de fermentación, quizá, se pueden producir gases los cuales los hagan crear
un falso positivo
3. ¿Qué indica la formación de color amarillo y la formación de burbujas en la

fermentación? ¿Cuáles serán los posibles productos durante ese tiempo?
Si el medio cambia a un color amarillo, el organismo fermenta el carbohidrato dado y produce

ácidos orgánicos al reducir el pH del medio a ácido. La producción de gas puede ser detectada
por la presencia de pequeñas burbujas en los tubos invertidos de Durham y esto indica la
formación de gases orgánicos.
4. ¿Todo el microorganismo tiene la capacidad de usar el ácido pirúvico de la misma manera?
Las bacterias que poseen fermentación ácido mixta se las reúne en la familia de las Enterobacterias
estas reducen el piruvato; comienza con una hidrólisis originando ácido fórmico y acetato.
Los microorganismos que tienen fermentación láctica son bacterias de la familia lactobaciláceas. La
fermentación láctica consiste en la producción de ácido láctico por reducción del piruvato que acepta
los e - del NADH generado en la glucólisis.
En la fermentación propiónica se da la producción de ácido propiónico o propionato a partir del

piruvato. La reducción del piruvato se lleva a cabo por un camino poco común. El piruvato es
carboxilado hasta oxalacetato que acepta los e - del NADH producidos en la glucólisis.
Las bacterias con fermentación butírica se engloban dentro del género Clostridium. La fermentación
butírica consiste en la producción de cantidades variables de ácidos (butírico, acético y láctico), de
alcoholes (butanol, etanol e isopropanol) y gases (H 2 y CO2), el ácido butírico se forma por
condensación de 2 acetil-CoA y no de 2 piruvatos. [5]
5. Mientras realiza la prueba de fermentación de carbohidratos, después de la incubación

descubrió que el organismo inoculado no puede fermentar la lactosa. ¿Cuál será su opinión
sobre esta observación?
Podríamos estar inoculando Salmonella, Proteus y Shigella, para determinar con exactitud cuál
bacteria se inoculó se deberían hacer otra serie de pruebas más específicas.
6. Mientras realiza las pruebas de fermentación de carbohidratos, contamina el caldo con

diferentes azúcares. ¿Esperas precisión en tu prueba?
Lo mejor será repetir la prueba para evitar un falso positivo, ya que la contaminación no hace
confiables los datos.
REFERENCIAS
Simuladores utilizados
Disponible en: http://vlab.amrita.edu/?sub=3&brch=73&sim=1139&cnt=1
[1] Tortora, Gerard J. MICROBIOLOGY: an introduction / Gerard J. Tortora; Berdell R. Funke;

Christine L. Case. - 9a ed. - Buenos Aires: Médica Panamericana, 2007
[2] Prueba de fermentación de carbohidratos(Teoria). Disponible en: http://vlab.amrita.edu/?

sub=3&brch=73&sim=1139&cnt=1
[3] Análisis microbiológico de los alimentos. Disponible en:

http://www.anmat.gov.ar/renaloa/docs/Analisis_microbiologico_de_los_alimentos_Vol_I.pdf
[4] García J, et al. Estrategias de obtención de proteínas recombinantes en Escherichia coli.

VacciMonitor 2013;22(2):30-39
[5] Rojo de fenol: características, preparación, aplicaciones. Disponible en:

https://www.lifeder.com/rojo-fenol/
[6] Metabolismo microbiano. Disponible en: http://agro.unc.edu.ar/~microbiologia/wp-
content/uploads/2014/04/unidad-2-metabolismo.pdf

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PRACTICA DE LABORATORIO 5: FERMENTACIÓN DE CARBOHIDRATOS

Palabras claves: Fermentación, bacteria, carbohidratos.

glucólisis. La glucosa actúa como un donante de electrones en la reacción de fermentación, el

2. Preparación del caldo de fermentación de carbohidratos

3. Inoculación de las bacterias en los caldos rojos de fenol

En la figura 1. Se muestran materiales

Figura 1. Implementos utilizados

Figura 2. Resultados de la fermentación con la bacteria del tubo 1.

Figura 3. Resultados de la fermentación con la bacteria del tubo 2

Figura 4. Resultados de la fermentación con la bacteria del tubo 3

Figura 5. Ruta de la fermentación de la glucosa.

La fermentación es un proceso catabólico que se da en ausencia de oxígeno (anaerobiosis) y el

El proceso de fermentación, es una alternativa para la producción de energía cuando en el medio se

1. ¿Explicar la importancia del rojo de fenol en la prueba de fermentación de carbohidratos?

2. ¿Qué sucede si sobrecalienta la prueba de fermentación de carbohidratos con fenol

3. ¿Qué indica la formación de color amarillo y la formación de burbujas en la

Si el medio cambia a un color amarillo, el organismo fermenta el carbohidrato dado y produce

4. ¿Todo el microorganismo tiene la capacidad de usar el ácido pirúvico de la misma manera?

En la fermentación propiónica se da la producción de ácido propiónico o propionato a partir del

5. Mientras realiza la prueba de fermentación de carbohidratos, después de la incubación

6. Mientras realiza las pruebas de fermentación de carbohidratos, contamina el caldo con

Disponible en: http://vlab.amrita.edu/?sub=3&brch=73&sim=1139&cnt=1

[1] Tortora, Gerard J. MICROBIOLOGY: an introduction / Gerard J. Tortora; Berdell R. Funke;

[2] Prueba de fermentación de carbohidratos(Teoria). Disponible en: http://vlab.amrita.edu/?

[3] Análisis microbiológico de los alimentos. Disponible en:

[4] García J, et al. Estrategias de obtención de proteínas recombinantes en Escherichia coli.

[5] Rojo de fenol: características, preparación, aplicaciones. Disponible en:

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