LABORATORIO Nº 3

DESARROLLO EMBRIONARIO

SANDRA VIVIANA MOLANO VOLVERÁS

Profesora:
LUZ ESTELLA HOYOS

UNIVERSIDAD DEL CAUCA

DEPARTAMENTO DE BIOLOGÌA
LICENCIATURA EN MATEMÁTICAS
POPAYÁN
2014
 INTRODUCCIÓN

La gran biodiversidad del planeta tierra, permite encontrar también gran diversidad
de desarrollo embrionario. Es posible hacer el seguimiento a cualquier ser de esa
gran biodiversidad. Pero existe fauna que permite con mayor facilidad la
observación de su desarrollo embrionario.

La fácil observación y manipulación de los embriones de sapos, permite que se

pueda analizar los diferentes estadíos del desarrollo embrionario, que se
identifican en sus etapas: desde la fertilización, pasando por etapa de
segmentación, mórula, gastrulación, neurulación, metamorfosis y llegando a un
individuo adulto.

Sin embargo el estudio inicia con el reconocimiento del habitad de estos anfibios,
reconocimiento hecho en los días que se fue en búsqueda de estos para su
traslado al laboratorio y es donde se inicia la fase de investigación. Se debe
continuar con los procesos de manipulación, y acondicionamiento en el laboratorio
para obtener una buena observación, partiendo con la identificación de género, lo
que nos permitió conocer las fases previas del desarrollo embrionario.

El uso de equipamiento adecuado permitió obtener observaciones de gran interés

para la formación profesional, pues el registro fotográfico generado fue de gran
importancia ya que con ello se pudo registrar en forma escrita todo lo observado y
que se mostrará en el presente informe.

Primero se expondrá los objetivos por alcanzar en esta práctica de laboratorio.

Posteriormente se mostrara la estructura metodológica que se llevó a cabo para la
realización de este laboratorio, donde se tuvo en cuenta el cómo se hizo la
práctica.

Después, se plasmaran los resultados obtenidos en el desarrollo de la experiencia

en el laboratorio, que permitieron llevar un registro de los diferentes estadíos de
los embriones, como también de las diferentes actividades realizadas con los
sapos.

Por último se presentaran las conclusiones obtenidas de esta práctica de

laboratorio con las cuales se finalizará este informe sobre el desarrollo embrionario
en anfibios.
 1. OBJETIVOS

 Identificar las diferentes etapas del desarrollo embrionario de anfibios;

fertilización, segmentación, mórula, gastrulación, neurulación

 Reconocer las diferentes estructuras de los órganos reproductores entre

macho y hembra.

 Reconocer el tipo de huevo que poseen los anfibios.

 Analizar vitalidad de espermatozoides de los sapos para realizar la

fertilización in vitro.
 2. METODOLOGÍA

Uno de los aspectos más importantes para el desarrollo de esta práctica, fue
conseguir sapos por parte de los estudiantes, lo que constituyó un reto ya que no
fue fácil su captura. Se armaron grupos de estudiantes que en compañía de la
profesora asistieron a lugares donde fue posible encontrarlos, los cuales en su
mayoría eran machos. En total se tuvo en cautiverio aproximadamente 10 sapos
los cuales estuvieron en un habitad húmedo con agua del grifo. Los sapos que se
utilizaron para la fertilización artificial, fueron conseguidos por una persona externa
al grupo, 4 machos y una hembra, estos estuvieron en cautiverio durante tres
días.

Antes de cada procedimiento, se comenzó desmedulando cada animal, esta

técnica es utilizada en los laboratorios para inmovilizar una ejemplar, por ejemplo,
en este caso, los sapos. Se inserta una aguja o un punzón a través de la base
posterior del cráneo, en la línea media dorsal para inmovilizar el animal. La
muestra se mantiene viva debido a la respiración pero sin el control cerebral, lo
que le permite ser diseccionado mientras se observa sus órganos vivos tales como
el corazón, los pulmones, etc. sin necesidad de causar dolor en el animal.

2.1 IDENTIFICACIÓN DE MACHOS Y HEMBRAS

Para obtener una muestra adecuada se necesitó reconocer las diferencias entre
machos y hembras; Las hembras no solo crecen más que los machos, sino que
también tiene características diferentes que permiten su identificación, por
ejemplo: Las hembras tiene la piel más suave mientras que los machos (sobre
todo en la época de reproducción) tiene su piel más áspera y su color puede ser
más fuerte, otra diferencia es el callo nupcial que posee el macho el cual es más
pronunciado durante la época de apareamiento ya que le permite aferrarse más a
la hembra, existe otra forma fácil de identificarlos, por medio del cortejo que utiliza
el macho para llamar a la hembra éste emite sonidos los cuales son propios de su
género.

2.2 OBSERVACIÓN DE OVARIO Y TESTÍCULOS

Para este fase se necesitó equipo de disección, toallas desechables y tablas para
colocar los ejemplares, se procedió a abrir tres machos y una hembra realizando
un corte en el abdomen, posterior a ello se exponen los órganos internos para un
reconocimiento de los testículos y ovarios, los cuales se extraen y son llevados al
estereoscopio para una mejor observación. Esto no solo permitió ver los órganos
reproductores sino que también se pudo observar otros órganos como pulmones,
corazón, intestinos, etc.

2.3 OBSERVACIÓN DE ESPERMATOZOIDES Y HUEVOS

Para observar los espermatozoides se necesitó del microscopio, porta objetos,
cubre objetos, azul de metileno y equipo de disección. En primera instancia se
realizó un corte en el abdomen del macho exponiendo los órganos internos, se
ubicaron los testículos y se retiraron dividiéndolos en varias piezas y ubicándolas
en una caja de Petri para ser maceradas; una gota de esta muestra se colocó en
un porta objetos y se le agregó una gota de azul de metileno. Esto permitió el
análisis de los espermatozoides variando desde las células que se encontraban en
proceso de formación a espermatozoides hasta los que ya se encontraban
formados; se pudo observar que poseen una forma y características diferentes a
otros animales.
Para la observación de los huevos, se necesitó de estereoscopio, cajas de Petri y
estiletes. Se inició con la desmedulación de la hembra, posteriormente se hizo la
incisión en el abdomen y se colocaron al descubierto los órganos internos,
mostrando así también los ovarios. Se tomaron los huevos y se llevaron al
estereoscopio, donde se pudieron observar, para hacer un análisis de la forma que
poseen estos.

2.4 INDUCCIÓN A LA OVULACIÓN CON HIPÓFISIS

Dado que algunos anfibios mientras se encuentran en cautiverio les resulta difícil
su reproducción, uno de los métodos usados, hace mucho tiempo, para estimular
este proceso se hace utilizando hormonas. Para nuestra práctica la inducción se
realizó a una hembra, inyectando hormonas extraídas de la hipófisis para una
posterior fertilización. La secuencia de la actividad consta de los siguientes pasos:
 Se procedió a desmedular un macho para la extracción de la hipófisis.
 Se le hizo una incisión, con ayuda de tijeras, al nivel de la mandíbula
inferior para llegar con facilidad al hueso esfenoide.
 Una vez expuesto el hueso se lo corto en cruz donde se identificó la silla
turca, que es donde se encuentra la hipófisis.
 Se retiró con cuidado esta glándula y se llevó a una caja de Petri, que
contenía un mililitro (1 ml) de agua destilada, haciendo una maceración de
las dos sustancias.
 Esta maceración después de homogenizarla bien se colocó en una jeringa.
 Posterior a esto, la profesora inyecto la hembra adulta escogida en el lado
posterior del vientre.
 Se colocó en un estereoscopio y al observar cuidadosamente se pudo ver
como se contraían los ovarios, el cual es un resultado de la aplicación de
las hormonas.

2.5 FERTILIZACIÓN ARTIFICIAL

La hembra que sirvió para la fertilización de los huevos, estuvo en cautiverio cerca
de 3 días; su desove fue de forma natural, cuando fue llevada al laboratorio se
desmedulo inmediatamente, para evitar que siguiera botando los huevos, ya que
cuando la hembra desova totalmente ya no se encuentran ovocitos en la cavidad
celómica, ni tampoco en el oviducto y lo ideal es que los huevos para ser
fertilizados se extraigan de esta parte. Se sacó del macho parte de los testículos,
primero se verificó la motilidad de los espermatozoides en el microscopio posterior
a esto se realizó la maceración de los testículos con solución holtfreter, luego se
untaron constantemente de este preparación los ovocitos se esperó durante cinco
minutos después de esto se lavaron con la solución holtfreter y se guardaron en la
misma solución después fueron colocados en el estereoscopio para la observación
de los cambios en los huevitos fecundados.

2.6 SEGUIMIENTO A LOS DIFERENTES ESTADÍOS DEL DESARROLLO

EMBRIONARIO
Posterior a la fecundación artificial, se pudieron ver los primeros estadios del
desarrollo embrionario, haciendo uso del estereoscopio. Los huevos fecundados
se mantuvieron en recipientes con solución holtfreter, esta solución les protege de
ser atacados por bacterias y los mantiene como en su habitad. Diariamente se
limpiaban los recipientes haciendo cambio de la solución para disminuir la
mortalidad de los huevos. Se asistió al laboratorio en las dos jornadas (mañana y
tarde) Para la observación de los cambios en el proceso de formación de los
embriones. Para la asistencia los fines de semana se nos entregó un horario de
asistencia con el permiso para ingresar al laboratorio y poder continuar con el
proceso. (Anexo horario).

2.7 PREPARACIÓN DE FIJADOR Y SOLUCIÓN  DE HOLTFRETER

Para mantener los embriones se necesita de la solución holtfreter, la cual es
usada en anfibios y está compuesta por:

REACTIVOS CANTIDAD
SOLUCIÓN MADRE:
CINa 3.5 g
Cik 0.05 g
C I 2Ca 0.1 g
H 2 O (bidestilada) 1000 g

SOLUCIÓN DE TRABAJO
Solución de Holtfreter 100 ml
Agua bidestilada 900 ml
CO 3HNa 0.2 g

La preparación consiste en diluir solución madre con agua bidestilada, dejar hervir
y cuando este fría la preparación, se agrega 0.2 g de CO 3HNa por litro.

Para fijar los embriones en diferentes estadíos se necesitó usar una solución de
formol al 4 %.
 3. RESULTADOS

En esta práctica, se llevó acabo el reconocimiento de cada estado del desarrollo

embrionario de sapos, para este hecho se llevaron al laboratorio sapos buffo
marinus o sapos de caña, en este proceso hubo diferentes etapas las cuales serán
descritas en esta sesión.

 se inició con el reconocimiento del aparato reproductor masculino y

femenino de donde se extrajeron los testículos y los ovarios para ser
observados en el estereoscopio. Los testículos son de color amarillo,
poseen una forma alargada los cuales se encuentran en la pared
abdominal. Se observó que los espermatozoides de sapo tienen su cabeza
más larga que la cola y esto se deba posiblemente a la de forma de
reproducción de esta especie.

 en esta práctica se observaron ovarios de hembras maduras reconociendo

el recorrido que hacen los ovocitos a través del oviducto, pasando hasta la
cavidad celomica para luego llegar a la cloaca donde se da la expulsión de
los huevos. Al tomar una pieza de la muestra del ovario y llevarla al
estereoscopio, en una caja de Petri; se observaron diferencias en los
ovocitos, como por ejemplo: se encontraron ovocitos muy maduros los
cuales ya estaban negros totalmente, también habían de color transparente,
los cuales eran ovocitos primarios. Véase fig.
 Los huevos de sapo son heterolecitos, y presentan una coloración
diferencial característica que define dos polos: polo vegetal y polo animal.
El polo animal posee menos vitelo pero más citoplasma, en el polo vegetal
hay mayor concentración de vitelo y poco citoplasma; el núcleo se
encuentra ubicado en el polo animal y es por este polo por donde penetra el
espermatozoide. Los huevos expulsados, cuando hay desove, están
recubiertos de una sustancia gelatinosa, llamada albumina, secretada por el
ovario, que los protege del medio exterior y les permite la entrada de
oxígeno.

 La inducción por hipófisis fue realizada en cuatro ocasiones, sin resultados

positivos para el desove. Por tanto esta situación impidió que se realizar la
fertilización in vitro, en esos ejemplares.

 Se tuvo la oportunidad de observar dos desarrollos embrionarios, una por

medio de la fertilización natural y la otra artificial; la hembra que estuvo en
cautiverio durante tres días, desovo cerca de las cinco de la mañana del día
en que fue realizada la práctica, por tanto pudimos observar a las siete de
la mañana las primeras fases de segmentación.

 La fertilización artificial se inició a las 7:55 de la mañana, realizando el

procedimiento ya expuesto en la metodología; posteriormente a las 9:45 AM
se empieza a notar la primera segmentación. Durante el proceso
embrionario, hubo más avance en unos huevos que en otros y esto se debe
probablemente al espacio en el que se guardaron las muestras, y a la
cantidad de individuos que habían depositados.

 Realmente no se pudo notar diferencias de viabilidad en cuanto a la

fertilización natural y artificial ya que los individuos se revolvieron y tampoco
se encontraban en un mismo estado.

 En las tablas adjuntas se mostraran las diferentes observaciones hechas

durante el proceso de desarrollo embrionario.
 DISCUSIÓN

Cuando se realizó la inducción por hipófisis, uno de los posibles factores, para que
no se obtuvieran los resultados esperados, fue la condición de las hembras
inyectadas ya que se necesita que estas estén maduras sexualmente. Otro factor
posiblemente pueda ser el cautiverio ya que muchos animales no se reproducen
mientras se encuentran en estas condiciones.

La mortalidad de los individuos fue de un 70% durante los primeros estadíos,

situación que obedece a la manipulación, o al uso de estiletes. Posteriormente la
tasa de mortalidad fue creciendo, se puede decir que la exposición a la luz de los
estereoscopios fue otro factor determinante para la muerte de los individuos.

La poca cantidad de individuos depositados en los recipientes permitió mas

avances en el desarrollo de estos, ya que si tienen menor espacio habrá menos
evolución.
 4. CONCLUSIONES

El proceso de la vida en algo sorprendente, pero más aún, cuando este ocurre
ante nuestros ojos. El poder observar este proceso que parece tan simple pero
que en verdad es sumamente complejo, nos permite obtener un aprendizaje
significativo para nuestra vida profesional.

Las técnicas usadas en esta práctica son de fácil desarrollo y proporcionan

bastante conocimiento para los estudiantes en general. Además, se obtuvo
conocimiento sobre estos anfibios desde cómo es su habitad, pasando por la
reproducción, el desarrollo embrionario, los cambios que tiene a medida que van
creciendo, en fin un sin número de procesos, que ocurren en esta especie.

Por otra parte, existen diferentes tipos de cuestionamientos en cuanto a la práctica

en realidad, ya que se podría pensar que es cruel o inhumano o que podría ir en
contra de lo que se considera ético, el usar un animal y someterlo a estos
procedimientos. Pero cabe preguntarse ¿realmente se puede obtener el mismo
aprendizaje cuando se está trabajando con videos o con otras metodologías?
Bueno es una pregunta que necesita de conocimiento y de experiencia para ser
respondida.
 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

Duellman, W. & L. Trueb. 1994. Biology of the Amphibians. The Jhon Hopkins
University Press. 670 pp.

WOLPER, L. PRINCÍPIOS DE BIOLOGIA DO DESENVOLVIMENTO. Artmed

Editora S.A. 2000.

CIENCIA Y DESARROLLO, SEPTIEMBRE-OCTUBRE 2004. Anfibios: auténticos

guardianes de la biodiversidad