CROMATOGRAFÍA

EJERCICIOS

1. Uno de los sistemas empleados para la separación de aminoácidos mediante cromatografía

en papel es butanol/acético/agua (63/10/27). Suponiendo un pH de 4,5 en la fase acuosa,
indíquese los valores de orden decreciente de los R f para los aminoácidos Gly, Val, Asp, Glu,
Lys, Tyr, Ala, Arg y Ser.

2. Se quieren identificar los aminoácidos procedentes de un hidrolizado de un péptido, para lo

cual se realiza una cromatografía en papel. En el laboratorio se dispone de los siguientes
aminoácidos patrones, cuyo Rf en el sistema a utilizar, butanol/acético/agua (25/6/25), son los
siguientes:

Alanina 0,39 Fenilalanina 0,66 Glicocola 033

Arginina 0,19 Serina 0,31 Isoleucina 0,68
Aspártico 0,33 Tirosina 0,53 Leucina 0,72
Glutámico 0,37 Treonina 0,36 Metionina 0,57
Histidina 0,19

Si en el papel pueden aplicarse cuatro puntos además del problema, y en cada punto pueden
aplicarse varios aminoácidos patrones, ¿qué distribución harías con objeto de identificar el
problema y cuál sería el resultado final de la cromatografía? ¿Existiría alguna incertidumbre en
la designación de los aminoácidos problema?

3. La separación de 4 sustancias, A, B, C, D, se quiere llevar a cabo mediante una cromatografía

en capa fina (TLC). Los valores de Rf para cada una de estas sustancias en varios solventes se
detallan en la siguiente tabla:
1
 CH3Cl:MeOH
Sustancia Isopropanol-HCl Etanol Butanol-H2O
(2:1)
A 0,31 0,23 0,09 0,42
B 0,2 0,24 0,62 0,51
C 0,58 0,38 0,64 0,4
D 0,56 0,41 0,1 0,53

En base a esta información, ¿Cuál será la mejor manera de separar A, B, C y D?

4. La sustancias A, B, C y D cromatografiadas en papel presentan los siguientes valores de R f en

los sistemas que se indica a continuación:

Sustancia Butanol:Agua Isopropanol-HCl Etanol Ácido acético

A 0,24 0,20 0,51 0,62
B 0,23 0,31 0,42 0,09
C 0,41 0,56 0,53 0,10
D 0,38 0,58 0,40 0,64

¿Cuál sería la mejor manera de separar A, B, C y D?

5.- Una mezcla de dos compuestos A y B da lugar, después de la migración, a dos manchas de
las siguientes características (distancia de migración X y diámetro de la mancha W):
Compuesto X (mm) W (mm)
A 27 2
B 33 2,5

La migración del frente de disolvente es de 60 mm.

a) Calcular Rf, N y H para cada uno de los compuestos.
b) Calcular el factor de resolución entre los compuestos A y B.
c) Establecer la relación entre el factor de selectividad y el Rf de los dos compuestos.
6. El paracetamol es un antiinflamatorio no esteroideo de uso frecuente. Un método para su
preparación puede ser el siguiente:

2
 a) Un estudiante llevó a cabo una cromatografía en capa fina para analizar los productos
de este método de preparación del paracetamol. Para las fases estacionaria y móvil
empleadas, el valor de Rf para el paracetamol es 0,4. Si el frente de disolvente alcanzó
5 cm durante la separación, representa en un diagrama la posición del centro de la
marca correspondiente al analgésico.
b) El 4-aminofenol se adsorbe menos que el paracetamol a la fase estacionaria en esta
placa de TLC. Prediga si el valor de R f para el 4-aminofenol en este análisis será mayor
o menor que el del paracetamol, justificando su respuesta.

7. En la figura que aparece más adelante se representa el resultado de escanear una placa de
TLC en fase normal (fase móvil: hexano:acetona 80:20) en la que se han separado los
compuestos de estructuras A, B y C:

a) Identifique el compuesto que corresponde a cada pico del registro.

3
 b) ¿Cuál sería el orden de elución de los compuestos A, B y C en una columna de HPLC
que contenga la misma fase estacionaria y la misma fase móvil?
c) ¿Cuál será el orden de elución para los compuestos A, B y C en una columna de HPLC
que contenga una fase C18 y como eluyente una mezca acetonitrilo:metanol (80:20)?
d) Calcula el Rf del compuesto que migra más rápidamente sobre la placa.
e) Para el compuesto al que se refiere el apartado anterior, calcule, a partir del registro y
de la fórmula el número de platos teóricos y la eficacia de la columna (H)
correspondiente.
2
 x 
N  16· 
W 

8. Una columna de Sephadex G-100 (rango de fraccionamiento 4.000 – 150.000) tiene un

volumen total de 100 ml y el volumen de elución del azul de dextrano es 35 ml.
a) Calcular el volumen de elución de la ovoalbúmina sabiendo que su coeficiente de
distribución es de 0,53.
b) Indicar cómo podría calcularse la masa molar de la ovoalbúmina.
c) ¿Cuál será el coeficiente de distribución de la RNA polimerasa sabiendo que su masa molar
es de 500.000 M/g mol?

9. Para separa cuatro proteínas (A, B, C, y D) de tamaños moleculares diferentes se preparó

una columna de 50 mL de volumen total con la resina apropiada. Los volúmenes de elución de
cada una de estas proteínas fueron: A: 21,6 ml; B: 27,6 ml; C: 33,8ml; D: 44,4 ml. El azul de
dextrano eluyó a los 17 ml. Calcular el tamaño molecular de una proteína que tuviese un valor
de Kav=0,4. Los pesos moleculares de las diferentes proteínas son: 68.000, 45.000, 30.000 y
14.800 Da, respectivamente.

10. Se separan por cromatografía una disolución en tetrahidrofurano (THF) de una mezcla de
poliestirenos de masas moleculares conocidas en una columna (longitud: 300 mm, diámetro
4
interno: 7,5 mm) en el cual el intervalo de fraccionamiento abarca entre 400 y 30000 Da. Se
eluye con THF a un caudal de 1 mL/min. La detección UV se efectúa a 254 nm. A partir del
cromatograma reproducido en la gráfica:

a) Calcule el volumen de exclusión y el volumen de los poros de la columna utilizada.

b) Calcule el coeficiente de reparto para el compuesto de masa 3250 Da.

11. Se quiere separar por cromatografía de permeación en gel una mezcla de cuatro patrones
de poliestireno de masas moleculares 9200, 76000, 1100000 y 3000000 Da, respectivamente.
Se dispone de tres columnas de los siguientes intervalos de fraccionamiento:

Columna A: 7x104 a 4x105 Da

Columna B: 105 a 1,2x106 Da
Columna C: 106 a 4x106 Da

¿Cómo se pueden separar los cuatro polímeros en una sola separación, sabiendo que se
pueden colocar varias columnas en serie?

12. Se ha empleado una bureta empaquetada con alúmina en polvo de tamaño de partícula
adecuado para separa los componentes de un extracto vegetal. La alúmina constituye la fase
estacionaria y se empleó agua como fase móvil. Una muestra del extracto vegetal se aplicó
sobre el lecho de alúmina y de forma periódica, se fue añadiendo agua. Los componentes del
5
extracto se separaron dando lugar a tres bandas coreadas como muestra el siguiente
diagrama:

a) ¿En cuál de las tres bandas se encuentra el compuesto más fuertemente retenido por
la fase estacionaria?
b) Justo antes de abandonar la columna, la Banda B comienza a separarse en otras dos
bandas diferentes. Indique qué posible modificación podría hacerse para hacer este
experimento más eficiente y separar correctamente la Banda B en sus componentes.
c) En otro experimento, los componentes de este extracto vegetal se separaron de forma
similar mediante cromatografía en capa fina, empleando una lámina de vidrio cubierta
de alúmina y agua como fase móvil. Cuál de las tres bandas, A, B o c, contienen el
componente asociado al valor de Rf más pequeño. Justifique su respuesta.
d) ¿Cuál de las tres bandas contiene el componente que tendría el menor tiempo de
retención si se llevara a cabo esta separación mediante HPLC empleando alúmina
como fase estacionaria? Justifique su respuesta.

13. Se ha empleado una cromatografía líquida de alta resolución en fase inversa con una fase
estacionaria no polar y una fase móvil polar. ¿Cuál de las siguientes moléculas, mostradas a
continuación, presentará el mayor tiempo de retención en esta separación?

6
14. Supongamos que, tras obtener un determinado cultivo bacteriano, de todas las proteínas
celulares se busca purificar dos proteínas llamadas X e Y. Después de lisar las células mediante
sonicación en un medio tamponado a pH 7, y eliminar los restos celulares (membranas,
paredes celulares,…) mediante centrifugación, llevamos a cabo una primera etapa de
purificación de las proteínas mediante precipitación con (NH 4)2SO4. Los "pellets" que se
obtienen se disuelven en una pequeña cantidad de disolución tampón.

a) Proponga algún método para eliminar el sulfato de amonio para preparar la fracción
proteica obtenida para las etapas de purificación que puedan llevarse a cabo a
continuación.

b) Se puede emplear cromatografía de filtración en gel tanto para purificar proteínas como
para estimar su peso molecular. Se quiere emplear esta técnica para determinar los
pesos moleculares de X e Y y purificarlas.

b1) ¿Cómo podría calcularse el volumen de exclusión de la columna de filtración en

gel?

7
 b2) Si se conoce que el volumen de exclusión de la columna es de 5.2 mL, el volumen
total es de 14 mL y que los volúmenes de elución para diferentes proteínas de
peso molecular son los que aparecen en la tabla siguiente, ¿cuál es el peso
molecular de X e Y?

Proteína Mr (kDa) Ve(mL)

Tiroglobulina 669 7,7
Catalasa 232 9,4
Alcohol deshidrogenasa 150 9,8
Albúmina 67 10
Ovoalbúmina 43 10,7
RNAsa 13,7 12,0
Proteína X ? 9,9
Proteína Y ? 10,3

c) La siguiente gráfica muestra la carga de cada proteína problema en función del pH.

X
Y
+
3 6 9
pH
Si se emplease una cromatografía de intercambio iónico para separar estas proteínas de
la muestra inicial, ¿qué pH sería el adecuado para separar Y con DEAE-agarosa
(intercambiador de aniones)? ¿Qué pH sería el adecuado para separar Y con CM-
Sepharose (intercambiador de cationes)? ¿Qué tipo de intercambiador de iones debería
utilizarse para separar las proteínas X e Y, y cómo se eluirían las proteínas de la
columna?

8
 d) Suponga que se ha generado una proteína de fusión uniendo las secuencias que
codifican para glutatión-transferasa (GST) y para la proteína X. Además, se ha colocado
entre ambas la secuencia que codifica para un pequeño péptido de unión que es
reconocido por una determinada proteasa. Este gen se ha clonado en E. coli para
obtener la proteína de fusión.
¿Qué se necesita para aprovechar la elevada afinidad de GST por glutatión en la
purificación de nuestra proteína de fusión?
¿Cómo podría recuperarse de la columna nuestra proteína de fusión aún unida a GST?
¿Cómo podría recuperarse la proteína X sin estar unida a GST?

15. Se desean purificar tres proteínas de las características siguientes:

Peso molecular (Da) pI Rango de estabilidad

Proteína A 10000 5,0 6,0-7,0
Proteína B 30000 5,0 5,0-7,0
Proteína C 30000 8,0 7,0-9,0

Si únicamente deben emplearse métodos comatográficos para la purificación, ¿qué tipo de

cromatografía/s elegiría? Indicar tipos de tampones para el proceso, pH de trabajo, etc. En el
caso de necesitar realizar cromatografía de intercambio iónico, indicar claramente los valores
de pH a los que se unirían y fluirían las proteínas teniendo en cuenta que solamente se dispone
de un intercambiador catiónico.

16. Se utiliza una Sephadex G-75 (rango de fraccionamiento: 3.000-70.000) para separar las
proteínas globulares de pesos moleculares que se indican a continuación:

A: 1.000 D: 10.000 G: 30.000 J: 120.000

B: 2.000 E: 10.000 H: 50.000
C: 10.000 F: 20.000 I: 100.000

9
a) Indicar el orden de elución de cada una de ellas.
b) ¿Quedarían todas las proteínas separadas?
c) Los puntos isoeléctricos de las proteínas C, D y E son: 5; 7,5 y 10 respectivamente. Se supone
que, hipotéticamente, son estables desde pH=3 hasta pH= 12. S se dispone de un
intercambiador tipo aminoetil-celulosa ¿qué proteínas se unirán a pH= 4? ¿Cómo se llevaría a
cabo la elución utilizando solo gradientes de de pH?
d) ¿Qué proteínas se unirán a pH= 6?¿Cómo se llevaría a cabo la elución utilizando solo
gradientes de pH?
e) ¿Qué proteínas se unirán a pH= 9? ¿Cómo se llevaría a cabo la elución utilizando solo
gradientes de pH?
f) ¿Qué proteínas se unirán a pH= 11? ¿Cómo se llevaría a cabo la elución utilizando solo un
gradiente de pH?

17. Vamos a considerar el cromatograma de la figura, correspondiente al análisis del suero de

un paciente donde se han encontrado una serie de drogas anticonvulsivantes:
a) La altura del pico para el fenobarbital es de 56 unidades. Si un estándar de fenobarbital de
5 mg/dl produce un pico de 93 unidades en idénticas condiciones analíticas ¿Cuál es la
concentración de fenobarbital en el suero del paciente?
b) La altura de pico para la primidona es de 40 unidades. Un estándar de primidona de 3
mg/dl da un pico de 98 unidades en idénticas condiciones analíticas ¿Cuál es la concentración
de primidona en la muestra del paciente?
c) Se quiere determinar la concentración de carbamacepina en el suero del paciente.
Sabiendo que el área de pico es de 29.3 mm 2 después de haber realizado una dilución 1:5 de
la muestra y que el análisis de cinco disoluciones estándares de carbamacepina dieron los
siguientes resultados ¿Cuál es la concentración de carbamacepina en el suero del paciente?

Concentración (mg/dL) Área de pico (mm2)

Blanco 0
1 19.7
2 39.9
3 61.0
4 80.5
5 98.7

10
 Si el primer pico es de un compuesto no retenido ¿Cuál es la retención relativa de la
pirimidona con respecto a la etosuximida?

18. Con los datos que figuran en la siguiente tabla, y para un valor de t o= 1.12 min., calcule:
a) El factor de capacidad o de retención k.
b) La resolución R de los analitos en un sistema cromatográfico por HPLC.

Analito tr, min w, s

Propoxur 1.72 29

Carbaryl 5.52 39

1-naftol 7.34 30

11
 Methiocarb 7.70 65

c) Indicar si los picos cromatográficos de los componentes de la muestra están bien resueltos.
d) calcular el número de platos teóricos efectivos para el 1-naftol.

19. Dar solución a los siguientes problemas experimentales:

a) Aumentar la resolución de una cromatografía que se ha realizado mediante una elución

en gradiente de pH y en la que se obtiene el siguiente cromatograma

b) Aumentar la resolución de una cromatografía que se ha realizado mediante una elución

por pasos y en la que se obtiene el siguiente resultado

c) Después de optimizar la elución y el tipo de matriz a usar en una cromatografía, se siguen

obteniendo dos picos cromatográficos muy anchos, ¿qué puede estar ocurriendo?

d) En una cromatografía de exclusión con una disolución de 2 sustancias se obtiene un

cromatograma con solo un pico de elución. ¿Qué puede estar ocurriendo?

20. En el cromatograma de la figura el pico marcado como “Z” corresponde a un componente

de la mezcla no retenido. Determinar según los datos de la figura lo siguiente:
a) Tiempo muerto
b) tiempo de retención para el componente C
c) factor de capacidad para el componente C
d) factor de selectividad para los componentes C y B
e) Resolución de los componentes C y B

12
21. Un enzima necesita una elevada concentración de Mg 2+ para su actividad. Si se elimina el
ión, la proteína se desnaturaliza de forma irreversible. Supóngase que, al establecer un sistema
de purificación, se intenta emplear cromatografía de intercambio iónico y cromatografía en
gel, y que en los dos casos el enzima pierde su actividad. Explíquese a qué puede deberse esto.
A la vista de la explicación, ¿qué modificaciones se introducirían para mejorar la purificación?

22. Suponga que tiene una columna con una resina cambiadora de catión DOWEX I en la que
aplica una mezcla de los siguientes aminoácidos:

Aminoácido. pK1 pK2 pK3

Asp 1,88 3,68 9,82

Lys 2,18 8,95 10,53

Ser 2,21 9,15

Glu 2,19 4,25 9,67

Gly 2,34 9,60

Tyr 2,20 9,11 10,07

13
Determine el orden de elución teórico que cabría esperar si se realiza el experimento a pH= 3 y
a pH= 6 utilizando un gradiente de fuerza iónica.

¿Esperaría alguna diferencia en el orden de elución teórico de Ser y Tyr con respecto al orden
de elución real? ¿Por qué?

23. Indíquese cuál sería el orden de elución de una mezcla de los péptidos siguientes:

pK

a Asp-Gly-Ala 2,1 4,5 9,0 -

b Ala-Val-His-Gly 3,1 6,5 7,9 -

c Ala-Ile-Lys-Gly-Gly 3,6 8,0 10,4 -

d Val-Gly-Leu 3,3 7,9 - -

e Lys-Gly-Ala-Glu 3,2 4,2 8,3 10,5

obtenidos de un hidrolizado protéico cuando se pasan por una columna de DEAE-celulosa

(cambiador iónico) utilizando como eluyente un tampón Tris de pH= 8,5, en gradiente continuo
hasta pH= 4,0

24. A la empresa en la que trabajas le han solicitado obtener anticuerpos específicos frente a
estructura para la proteína X. Para ello, tú como experto entiendes que es necesario producir
una cantidad elevada de dicha proteína y purificarla. Con este objetivo diseñas un sistema de
producción en E. coli de manera que la bacteria exprese y acumule esta proteína mientras
prolifera en cultivo. Una vez alcanzado el nivel óptimo de crecimiento bacteriano se recogen
las células y se lisan obteniendo un extracto total de proteínas a partir del cual se purificará la
proteína de interés.

El investigador solicita que la proteína le sea entregada junto con una explicación detallada de
los pasos seguidos en el proceso de purificación, un análisis de actividad de la proteína tras
cada paso y finalmente en una solución tampón libre de sales.

Información referente a la proteína:

- Tamaño: 55KDa,
- Actividad enzimática en presencia de insulina
- Posee dos grupos tioles muy próximos
- El gen que se introduce en la bacteria incluye: el gen que codifica para la proteína X
ligado a la información genética que codifica para el péptido E (Val-Pro-Gly-Ala-Gly)
de manera que la proteína se expresa fusionada al péptido E
14
Información referente al péptido E.
- Composición: Val-Pro-Gly-Ala-Gly
- Su solubilidad es dependiente de temperatura: tiene una Temperatura de fusión (T f)
de 30º y a esta temperatura una densidad de 1,15 g/cm3; A T mayor que su Tf es
insoluble en solución acuosa y tiene una densidad de 1,3 g/cm3; A T menor que su Tf
es soluble en solución acuosa y tiene una densidad de 1,0 g/cm3;
- Este pentapétido presenta una elevada afinidad por el tetrapétido de secuencia: Asp-
Glu-Lys-Ala. La afinidad de pentapéptido E con el tratrapétido es dependiente de
concentration salina, (ver tabla)

[ClNa] % Afinidad
3M 0
2M 20
1M 50
0.5 M 100

En base a esta información explica y detalla hasta donde puedas tu diseño experimental para
poder cumplir con el encargo. Como el encargo es prioritario tienes a tu disposición el equipo
necesario para aplicar técnicas de electroforesis, sedimentación y/o cromatografía.

25. En una separación con HPLC dos componentes tienen tiempos de retención que difieren 15
segundos. El primer pico eluye en 9.0 minutos y los anchos de picos son casi iguales. El tiempo
muerto es de 65 segundos. Determina la cantidad mínima de platos teóricos que se necesitan
para alcanzar los siguientes valores de resolución 0.5, 1.0, 1.5, 2.0, 2.5. ¿Cómo afectaría a la
resolución que el segundo pico tuviera el doble de ancho que el primero?

26.La presencia de isoenzimas en suero se considera una prueba rápida y eficiente para el
diagnóstico de algunas patologías. En concreto, la caracterización de la cantidad y actividad de
la conocida como creatina quinasa, CK de las siglas en inglés, se trata de un dato
especialmente útil a la hora de monitorizar y detectar daño muscular. La CK se encarga
de proporcionar a los músculos y ciertos órganos la energía que necesitan porque descompone
la fosfocreatina, sustrato energético de utilización rápida. Los niveles de CK aumentan cuando
hay lesiones musculares, en concreto, después de un infarto de miocardio (indicando que este
músculo está dañado), por lo que su medición es una prueba estándar en el diagnóstico de
esta enfermedad.
15
Existen tres isoformas de la CK, CK-MM que se localiza mayoritariamente en los músculos
esqueléticos, la CK-MB que se localiza primordialmente en el corazón y la CK-BB en el cerebro.

Con el objetivo de estudiar como prueba diagnóstica de diferentes patologías los patrones de
expresión de las tres isoenzimas de la CK en suero humano y además, contrastarla con los
patrones obtenidos en tejido, se ha desarrollado un método cromatográfico que permite
detectar y caracterizar cantidad y actividad de estas isoenzimas de manera rápida, precisa y
reproducible.

A continuación, se detalla la metodología empleada y se muestran los resultados de los

experimentos realizados.
Figura 1: Representación de las cromatografías realizadas tanto a partir de las muestras de
suero como de tejido. Cromatografía en columna: La columna se equilibró con tampón Tris-
HCl, [NaCl] 100 mmol/L. La fase móvil empleada para la elución fue de: Tris-HCl, [NaCl] 100
mmol/L; Tris-HCl, [NaCl] 200 mmol/L; Tris-HCl, [NaCl] 300 mmol/L.
Figura 2: Distribución de las isoenzimas en los tres tejidos estudiados. Extractos de cada tejido
indicado fueron sometidos a cromatografía en columna como se indica en fig.1. Se representa
actividad de las muestras eluídas frente a número de la recogida.
Figura 3: Electroforesis en gel de poliacrilamida de las muestras indicadas en cada panel. Las
bandas se detectan en base a la actividad de las bandas separadas.
Figura 4: Ensayo de termoestabilidad de las muestras indicadas realizado a 56 ºC. Se analizó la
actividad enzimática de las muestras indicadas tras ser mantenidas a 56 ºC durante 1 hora.
Figura 5: Distribución de isoenzimas de CK en suero de pacientes tras sufrir un infarto de
miocardio y en pacientes con otras patologías. Cromatograma obtenido tras pasar por la
columna en las condiciones indicadas en la fig.1 suero de un paciente con infarto de miocardio.
Figura 6. Cambio en la actividad en CK total y en MB con el tiempo tras un infarto de miocardio
Figura 7. Análisis de actividad de CK en 71 pacientes con diferentes patologías (tabla 1) y
análisis de MM y MB en 20 pacientes con infarto de miocardio (tabla 2).

16
 Figura 1. Representación de la
cromatografía realizada.

Figura 2. Distribución de las isoenzimas en

los tres tejidos estudiados

Figura 3 Combinación de electroforesis y ensayo de

actividad de cada isoenzima

17
Figura 4. Ensayo de termoestabilidad
realizado a 56 ºC

Figura 5. Distribución de
isoenzimas de CK en suero de
pacientes tras sufrir un infarto
de miocardio y en pacientes
con otras patologías

18
Figura 6. Cambio en la actividad en CK total
y en MB con el tiempo tras un infarto de
miocardio

Figura 7. Análisis de actividad de CK en

71 pacientes con diferentes patologías
(tabla 1) y análisis de MM y MB en 20
pacientes con infarto de miocardio
(tabla 2)

19
En base a los resultados obtenidos responde a las siguientes cuestiones:
a. ¿Qué tipo de cromatografía se ha realizado? Justifica la respuesta
b. ¿Qué tipo de resina/fase estacionaria se ha empleado? ¿Por qué?
c. Sabiendo que el orden del carácter iónico de las tres isoenzimas es BB>MB>MM, ¿a qué
isoenzima corresponden las muestras recogidas en las fracciones 1-2; 5-6-7; 8-9-10? Justifica la
respuesta.
d. Si se han recogido fracciones de 500 µl y el flujo de fase móvil es de 1ml/min, calcula el tiempo
de retención de la isoenzima con mayor actividad en cada tejido.
e. Calcula el número de platos teóricos para la isoenzima recogida en las fracciones 8-9-10 en
cerebro.
f. La mini columna consiste en una pipeta Pasteur de 12,5 cm, y la altura que alcanza la fase
estacionaria es de 6 cm, ¿cuál será la altura de plato teórico para la isoenzima recogida en las
fracciones 8-9-10 en cerebro?
g. ¿Qué fracciones procedentes de las cromatografías se cargaron en la electroforesis? Justifica la
respuesta.
h. ¿Qué tipo de soporte y qué condiciones se han utilizado en la electroforesis? Justifica la
respuesta
i. ¿Cuál sería el resultado del ensayo de electroforesis si hirviéramos la muestra antes de cargar el
gel?
j. ¿Qué conclusiones podrías extraer de la distribución de isoenzimas de CK en suero de
pacientes tras sufrir un infarto de miocardio y en pacientes con otras patologías (fig. 5)?
k. ¿Qué importancia puede tener el realizar el análisis propuesto en las primeras 24 horas tras
sufrir el infarto?
l. ¿Qué conclusiones podrías extraer de los estudios de actividad en pacientes (fig. 7)?
m. ¿Hasta qué punto consideras que, en efecto este método propuesto permite caracterizar
cantidad y actividad de estas isoenzimas de manera rápida, precisa y reproducible y se podría
utilizar como método de diagnóstico?

20
27. Las inulinasas microbianas o β-(2→1) fructanohidrolasas son enzimas que hidrolizan enlaces β-
(2→1) fructano en la inulina y se utilizan para la producción de fructosa. En concreto, desde un
punto de vista biotecnológico la fructosa se emplea con frecuencia en la industria alimentaria
como edulcorante en alimentos para diabéticos y de otros tipos.

Las posibilidades que ofrece la biotecnología para la optimización de la producción de dicha

molécula suscitan hoy día un gran interés y es objeto de interesantes proyectos de investigación.

El objetivo de nuestro proyecto fue purificar y caracterizar la enzima responsable de la actividad

inulinasa a partir del microorganismo Aspergillus ficuum. Para ello partimos de un extracto total
de enzimas de dicho microorganismo en buffer citrato-fosfato 100 mM, pH 5.0 y se realizaron los
siguientes experimentos:

i) El extracto se sometió a una cromatografía en Sephacryl S-200 (10-1500 KDa) y se

analizó la actividad enzimática en las fracciones recogidas obteniendo el resultado
mostrado en la figura 1.
ii) Las fracciones en las que se recogió el enzima se sometieron a una electroforesis
PAGE-SDS-β-ME 8% obteniéndose una única banda (Al finalizar la electroforesis el gel
se tiñó con Azul Coomassie).
iii) Las mismas fracciones que se cargaron en el experimento anterior se sometieron a
una electroforesis en PAGE 8% obteniéndose el resultado mostrado en la fig 2.
iv) Las bandas obtenidas en el experimento 2 y en el 3 se recortaron del gel y fueron
ensayadas para actividad inulinasa analizando la producción de fructosa en las
condiciones oportunas obteniéndose el resultado de la Tabla 1

D
C

3M
B
F
E
A NaCl

0M
1 6 11 16 21 26 31 36 41 46 51 56 61 66 71 (Nº de fracción)

Figura. 1 Cromatografía en Sephacryl S-200. La elución se realizó con buffer citrato-fosfato 100
mM, pH 5.0 a una concentración de sales (0 to 3 M NaCl) con un flujo de 2 ml/min. Las fracciones
se recogieron cada 5 ml. La concentración de proteínas se monitorizó usando el método Bradford.

Las proteínas patrón que salieron con los picos A, B, C, D, E y F, empleadas fueron:

21
Vitamina B12 (1,355 KDa); tripsina (21,5 KDa); anhidrasa carbónica (31 KDa); ovoalbúmina (45
KDa); Fosforilasa b (97,4 KDa); Azul dextrano (2103 KDa)

Figura 2. Electroforesis PAGE 8%. Carril de la izquierda corresponde al extracto total. Carril de la
derecha corresponde a las fracciones de interés. La flecha indica banda de interés.

Tabla 1.

Actividad específica
Fracción Volumen (ml) Actividad (U/ml)
(U/mg)

Cruda (extracto) 50 117 3929

Banda obtenida Gel PAGE-

10 10 20
SDS+βME

Banda obtenida Gel PAGE 10 120 12300

27.1. En base a los resultados obtenidos, justifica si has purificado la enzima de interés.

27.2 Explica los pasos que has seguido en el proyecto, ¿cómo y por qué has realizado cada uno de
ellos?

27.3 A partir de los resultados obtenidos calcula:

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a) Peso molecular de la enzima purificada.

b) Basándote en la figura 1, define y calcula:

b.1) Tiempo muerto

b.2) Volumen de exclusión

b.3) Volumen total

b.4) Volumen de elución del compuesto B

b.5) Factor de capacidad del compuesto B

b.6) Número de platos teóricos para el compuesto B

b-7) Resolución entre los compuestos B y C y entre los compuestos C y D. Explica el resultado.
Si en alguno de los casos consideras que la resolución no es buena propón una acción para
mejorarla.

27.4 En el supuesto de que no dispusieras de la resina Sephacryl S-200 y con la información de la

que dispones tras finalizar el proceso anterior ¿qué otro tipo de cromatografía diseñarías con el
mismo objetivo de purificar la enzima inulinasa activa? (Detalla tipo cromatografía, fase
estacionaria, composición de la fase móvil, tipo de elución, detección de la muestra…..

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