Practica de Actividad Enzimatica

PRACTICA DE BIOTECNOLOGIA: DETERMINACION DE ENZIMAS EN DETERGENTES
Objetivo: Detectar la presencia de las enzimas en la formulación de detergentes de lavadora

en polvo. En particular se va a determinar la actividad amilasa siguiendo la reacción de
hidrólisis del almidón.
(Almidón)n + Agua + α-amilasa (Almidón )n-1 + Maltosa
Materiales
- Balanza
- Espectrofotómetro
- Agitador magnético termostatizado
- Baño termostático
- Tubos de ensayo y gradilla
- Pipetas y propipetas de 1 y 5 mL
Reactivos
- Disolución de almidón en agua: 10 g/L
Para conseguir disolver el almidón es necesario calentar la disolución.
- Disolución de detergentes de lavadora en agua: 10 g/L (1 g/ 100 mL)
Se pueden utilizar varios detergentes de lavado de ropa en polvo a modo comparativo,
eligiendo aquellos en cuya composición aparezcan enzimas, y a ser posible que sean
glicosidasas (amilasas). Es preferible que el detergente no contenga en grandes cantidades
blanqueantes oxigenados, pues en ese caso seria necesario utilizar mayores cantidades de
reactivo de yodo que dejen yodo libre en disolución.
- Disolución de povidona yodada diluida 10 veces (betadine: disolución de povidona y
yodo molecular en un 10%).
- Reactivo DNS (dinitrosalicílico) Disolver 1 g. de ácido 3,5-dinitrosalicílico en 20 mL de
NaOH 2 N, y 50 mL de agua. Añadir 30 g. de tartrato sódico-potásico 4 H 2O (sal de
Rochelle) y llevar a 100 mL. Proteger de la luz y del dióxido de carbono.
- Disolución de maltosa 4 mM en agua.
Propuesta experimental: Medida de actividad α-amilasa

En esta práctica se plantean utilizar dos protocolos de medida de actividad amilasa. El
primero es el método del DNS, que detecta la aparición del producto de reacción maltosa, y
el segundo es el método del yodo que mide la desaparición de un complejo azul con el
almidón con el transcurso de la reacción. El primero es el más adecuado pues permite
cuantificar de una manera sencilla la actividad enzimática, mientras que el segundo método
puede ser más cualitativo.
Los distintos ensayos que se proponen realizar son:
- Medidas de actividad amilasa con diferentes detergentes comerciales de lavado de ropa.
¿Qué detergente ha utilizado más enzima en su formulación?
- Medidas de actividad amilasa a distintas temperaturas (20, 40 y 60 ºC) con un mismo
detergente (efecto de la temperatura en la actividad). ¿A qué temperatura muestra mayor
actividad la enzima y se lava por tanto mejor?.
- Medidas de actividad amilasa a diferentes tiempos de incubación de la disolución de
detergente (efecto de la temperatura en la estabilidad de la enzima, termoestabilidad). Se
incuba el detergente a 60 ºC, y se mide la actividad sin incubar (tiempo 0), y tras incubar
15, 30 y 60 min. Estudio de cinéticas de desactivación. ¿Pierde actividad la enzima durante
1 hora de lavado a 60 ºC?
Protocolo de medida α-amilasa en detergentes comerciales de lavado de ropa.

En primer lugar se deber preparar la disolución de detergente (1g / 100mL agua)
a) Método del DNS
El fundamento del método utilizado para medir la actividad amilasa se basa en determinar
la concentración de los productos de reacción (maltosa fundamentalmente) con el tiempo.
Para ello se utiliza un reactivo de color en el que los grupos reductores liberados del
almidón son medidos por reducción del ácido 3,5-dinitrosalicílico [7].
La reacción tiene lugar en un tubo de ensayo con la temperatura controlada a 40 ºC. Los
resultados son mejores si se calienta la reacción a 30-40 ºC, atendiendo a que el lavado de
la ropa se realiza a esas temperaturas.
Para realizar la reacción enzimática se adiciona a un tubo de ensayo:
Volumen de disolución de detergente: 1,0 mL; Volumen de disolución de almidón: 4,0 mL.
En el momento que se pone en contacto la disolución de detergente (que contiene la
enzima) y la disolución de almidón (el sustrato de la enzima) se inicia la reacción y se
considera como tiempo cero. En ese instante se anota la hora, se toma 1 mL de la mezcla y
se pone en contacto con 1 mL del reactivo de color DNS. Esta operación se repite a los 15,
30 y 60 minutos. Una vez transcurrido ese tiempo se calientan todos los tubos durante 15
minutos a 85-90 ºC por inmersión en un baño termostático. Finalmente se adicionan 4 mL
de agua, y se mide la absorbancia a 540 nm frente a la muestra de reacción a tiempo cero.
Mientras procede la reacción enzimática y se toman las muestras, se va a realizar la recta de
calibrado del método DNS utilizando la disolución patrón de maltosa. Para ello rotulamos 5
tubos de ensayo, y adicionamos lo siguiente:
TUBO 1 2 3 4
Volumen de disolución de maltosa (mL) 0,0 0,3 0,6 1,0
Volumen de agua (mL) 1,0 0,7 0,4 0,0
Volumen de reactivo DNS (ml) 1,0 1,0 1,0 1,0
Una vez mezclados los tubos se incuban en un baño a 90 ºC durante 15 minutos. Al final de
este tiempo los tubos toman el color marrón-rojizo.
Finalmente estos tubos se miden también en el espectrofotómetro a 540 nm.
Absorbancia (540 nm) = 0,2385 [Maltosa] (mM)
Esta recta de calibrado nos va a permitir relacionar los valores de absorbancia determinados
con la concentración de maltosa de las muestras.
Cálculo de actividades:
Se realiza una gráfica de absorbancia frente al tiempo de reacción, que da una recta de
pendiente positiva que pasa por el origen de coordenadas y con un coeficiente de regresión
superior a 0.999. Se define la actividad enzimática como la cantidad de enzima que se
necesita para producir un μmol de maltosa por minuto, en las condiciones de ensayo
especificadas anteriormente.
Δ Absorbancia/min∗5 mL
Actividad= µmoles /min
0,2454
El valor de la medida de actividad obtenido de los ensayos con distintos detergentes

comerciales de lavado de ropa nos va a permitir conocer si las empresas han adicionado la
enzima amilasa en su formulación de lavado.
b) Método de medida con yodo

El fundamento del método se basa en que una disolución de yodo que con almidón produce
un complejo de color azul intenso. El almidón está compuesto aproximadamente por un
25% de amilosa, y un 75% de amilopectina. La amilosa , el componente del almidón de
cadena lineal, forma hélices donde se incluyen las moléculas de yodo, formando un color
de azul oscuro a negro. La amilopectina , el componente del almidón de cadena ramificada,
forma hélices mucho más cortas, y las moléculas de yodo son incapaces de incluirse,
conduciendo a un color ámbar, entre naranja y amarillo. Al romperse o hidrolizarse el
almidón en unidades más pequeñas de carbohidrato, el color azul-negro desaparece. En
consecuencia, esta prueba puede determinar la hidrólisis de la amilosa por la enzima
amilasa asociando la pérdida del color azul-negro con la actividad de la enzima.
Se procede como en el caso anterior realizando la reacción con la temperatura controlada a
40 ºC, adicionando al tubo de ensayo 1 mL de disolución de detergente y 4 mL de
disolución de almidón.
En el momento que se pone en contacto la disolución de detergente (que contiene la
Enzima) y la disolución de almidón (el sustrato de la enzima) se inicia la reacción y se
considera como tiempo cero.
En ese instante se anota la hora, se toma 1 mL de la mezcla y se pone en contacto con 4 mL
de agua y 0,2 mL de reactivo de yodo (betadine diez veces diluido). Esta operación se
repite a los 15, 30 y 60 minutos. Una vez transcurrido ese tiempo se mide la absorbancia a
590 nm frente a un blanco con agua.
Los valores obtenidos con el detergente ensayado se reportan en una tabla de tiempos vs.
Absorbancias.
6. REFERENCIAS
[1] BANET, E. Innovación curricular y enseñanza de las ciencias en educación
secundaria. Editorial:
Murcia: Universidad de Murcia, 2000.
[2] GOÑI ZABALA, J.M. El Espacio Europeo de Educación Superior: competencias,
tareas y
evaluación, los ejes del currículum universitario. Editorial: Barcelona: Octaedro:
Universitat de
Barcelona, Institut de Ciéncies de l'Educació, 2005.
[3] SILVERO MIRAMÓN, M. Motivación y calidad docente en la universidad. Editorial:
Pamplona:
EUNSA, 2006.
[4] http://www.scienceinthebox.com/es_ES/main/index_es.html
[5] http://www.novozymes.com
[6] BORCHERT, T.V., LASSEN, S.F., SVENDSEN, A. y FRANTZEN, H.B. Oxidation
stable
amylases for detergents. Progress in Biotechnology , 10, 1995, pp. 175-179.
[7] ARIKAN, B. Highly thermostable, thermophilic, alkaline, SDS and chelator resistant
amylase
from a thermophilic Bacillus sp. isolate A3-15. Bioresource Technology, 99, 2007, pp.
3071–
3076.

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Propuesta experimental: Medida de actividad α-amilasa

Protocolo de medida α-amilasa en detergentes comerciales de lavado de ropa.

El valor de la medida de actividad obtenido de los ensayos con distintos detergentes

b) Método de medida con yodo

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