Manual de Práctica de Bioquímica-2022-2

Manual de Práctica de Bioquímica
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BIOQUÍMICA
1
CONTENIDO
Pág.
Introducción 3
Normas generales para el curso 4
Normas para el estudiante del curso de bioquímica en la

Presencialidad 5
Práctica 1. Espectrofotometría 9
Práctica 2. Determinación de proteínas plasmáticas 15
Práctica 3. Determinación sérica de urea 20
Práctica 4. Factores que afectan la actividad enzimática 24
Práctica 5. Técnicas básicas de identificación de biomoléculas 31
Práctica 6. Efecto del ayuno en el glucógeno hepático 38
Práctica 7. Digestión enzimática del almidón 43
Práctica 8. Desnaturalización de proteínas y SDS-PAGE 49
Práctica 9. Cálculo del balance energético 55
Práctica 10. Hidrólisis de lípidos 64
Práctica 11. Determinación de triglicéridos y colesterol en plasma.

Perfil lipídico mínimo 69
Práctica 12. Dosaje de Hormonas 76
Práctica 13. Extracción de pigmentos vegetales y aceites esenciales 81
Práctica 14. Métodos de Extracción del ADN, PCR y electroforesis 86
2
Introducción
La Bioquímica es una ciencia que se caracteriza por estudiar los componentes (reactantes,
enzimas y/ o producto), estructuras y regulaciones de rutas metabólicas catabólicas, anabólicas
y anfibólicas que se desarrollan en los seres vivos a partir de las biomoléculas como proteínas,
carbohidratos, lípidos y ácidos nucleicos con la finalidad de entender los mecanismos
moleculares que ocurren a nivel celular.
La enseñanza de la bioquímica es teórico-práctica, los conocimientos a nivel práctico se

adquieren a partir de trabajo en el laboratorio, en donde se desarrollan diferentes
procedimientos experimentales, con la finalidad de que el estudiante complemente
conocimientos, genere habilidades y destrezas en la manipulación de materiales, equipos e
instrumental de laboratorio, incentivando la adquisición de los hábitos del método científico -
observando los fenómenos que ocurren en los ensayos respectivos y tomando datos necesarios
para obtener resultados y conclusiones confiables.
Bioquímica como curso básico que se imparte a los estudiantes de las diferentes Facultades de
la Universidad Científica del Sur, ha realizado la “GUIA DE LABORATORIO DE
BIOQUÍMICA “ como herramienta de estudio en donde se describen las actividades prácticas
que se llevan a cabo durante el semestre.
Los Autores
3
NORMAS GENERALES PARA EL ESTUDIANTE DEL CURSO DE

BIOQUÍMICA
1. Llegar puntual a las prácticas (tolerancia 5 minutos).

2. Leer con anticipación la práctica a realizar.
3. Cada sesión de Laboratorio genera un informe; el que será entregado en la
siguiente práctica en su respectivo horario. Es la única fecha y la entrega es de
carácter obligatorio. El informe se debe desarrollar de acuerdo con formato que
se encuentra al final de cada práctica descrita en el manual de práctica del
curso.
4. La inasistencia injustificada a cualquier práctica impide al alumno la
presentación del informe correspondiente y por lo tanto tendrá la nota mínima
de cero.
5. El alumno con inasistencia justificada deberá recuperar la práctica durante la
misma semana para lo que recabará de su profesor de prácticas el formato de
autorización correspondiente.
4
NORMAS PARA EL ESTUDIANTE DEL CURSO DE BIOQUÍMICA EN

LA PRESENCIALIDAD
MEDIDAS DE SEGURIDAD EN EL LABORATORIO

a) Higiene personal
1. Queda terminantemente prohibido fumar, comer y/o beber durante las prácticas
en el laboratorio. Así mismo el uso de celulares y otros equipos electrónicos.
2. Se debe lavar las manos al finalizar el trabajo de laboratorio y cada vez que se
sospecha que ha estado en contacto con algún material contaminado.
3. Al entrar en contacto la piel con ácidos o bases fuertes, lavarse inmediatamente
con abundante agua. Para el caso de ácidos aplicarse una solución saturada de
bicarbonato, para las basesutilice una solución al 5% de ácido acético
(vinagre).
4. Para quemaduras leves el área afectada se debe aplicar inmediatamente una
crema de picrato de Butesín.
5. Mantener limpio el área de trabajo. Al derramar alguna sustancia limpiar
inmediatamente. Al final de la práctica dejar todo el material limpio y
ordenado.
b) Comportamiento de los alumnos durante las prácticas

1. Está terminantemente prohibido ingresar a l Laboratorio mochilas, carteras o
bolsos, teléfono celular, animales domésticos, etc.
2. Una vez que el alumno haya ingresado al laboratorio no puedesalir por ningún
motivo.
3. El trabajo con sustancias volátiles se debe realizar haciendo uso de la campana
extractora.
4. Para diluir ácidos, siempre se debe agregar los ácidos al agua, y no en sentido
contrario.
5. Cuidar como propio todo bien que encuentre o utilice en el laboratorio. El
alumno es responsable de los materiales asignados para el desarrollo de la
práctica, el deterioro implicasu reposición obligatoria.
6. El manejo de materiales, reactivos y el desarrollo de los
5
experimentos sólo se realizan con autorización del profesor. Los experimentos

no autorizados están prohibidos.
7. Observar cuidadosamente que los frascos con reactivos estén etiquetados
indicando el contenido y la concentración respectiva, antes de ser usados.
8. Obtener las sustancias químicas de los frascos de reactivos, en un vaso de
precipitados o en un tubo de ensayos limpio, cuidando de no usar
cantidades mayores que las necesarias, está terminantemente prohibido
regresarsustancia alguna no utilizada al frasco original.
9. Al encender el mechero Bunsen, primero encender el fósforoy luego abrir la
llave de gas.
c) Eliminación de residuos
1. Los desechos sólidos, líquidos y las sales solubles, deben ser depositados en los
recipientes indicados por el profesor para su posterior tratamiento.
2. Todo desperdicio de papel o residuo sólido debe dirigirse al respectivo
recipiente de basura situados en ambas paredes laterales de cada Laboratorio
3. No se debe arrojar residuos sólidos al lavadero.
2. ELEMENTOS DE PROTECCIÓN PERSONAL Y DE LOS EQUIPOS

a) Mandil
1. Para cada sesión de prácticas el estudiante debe llevar un mandil
(guardapolvo), el cual es de carácter obligatorio. Cuando el experimento lo
amerite, los estudiantes usarán lentes de seguridad industrial tipo MERCK.
2. Los estudiantes vestirán sus mandiles antes de ingresar al Laboratorio y dejarán

de vestirlos a la finalización de las actividades correspondientes.
b) Lentes de seguridad y respiradores
1. Se debe usar lentes de seguridad cuando sea necesario proteger la cara de

salpicaduras y/o sustancias corrosivas. Igualmente se utilizará respiradores
cuando sea necesario. Enambos casos el estudiante tiene a su disposición estos
materiales y los solicitará al responsable del laboratorio.
6
2. En la parte lateral central del Laboratorio se encuentra la duchaespañola, la

que será usada para casos de salpicaduras o derrames en el cuerpo de la víctima
con sustancias ácidas, básicas o corrosivas. Así mismo a la entrada parte
izquierda se encuentra un kit lavador de ojos que se aplicará directamente al ojo
de la víctima en caso de salpicadura de alguna sustanciadañina al ojo.
c) Extinguidores contraincendios
1. El alumno debe conocer el uso y la ubicación de los extintorescontra incendios
que en caso de emergencia se descolgará de la pared con cuidado. El extintor,
en la parte superior tiene una palanca circular que se saca (se tira) para activar y
se presiona la manija con la mano derecha y con la mano izquierda se coge la
manguera la cual se orientará hacia la fuente de peligro.
2. En el caso de incendiarse la ropa de una persona, se deberá pedir ayuda
inmediatamente, se debe estirar en el piso y rodar sobre sí mismo para apagar
las llamas. No se recomienda utilizar el extintor sobre el cuerpo o rostro de una
persona.
7
d) Botiquín de primeros auxilios

1. Existe un botiquín perfectamente identificado y de fácil accesocono los
elementos necesarios para prestar primeros auxilios en el laboratorio.
2. Será responsabilidad de todos los usuarios del laboratorioconocer la ubicación
y el uso del botiquín y de los elementos de protección personal.
3. TOMA DE DATOS
1. Manipular con habilidad, criterio y en forma adecuada los diferentes materiales
de laboratorio.
2. Desarrollar los experimentos en forma ordenada y con mucha responsabilidad.
3. Observar con mucho cuidado los fenómenos que ocurren durante el desarrollo
de los experimentos.
4. Realizar las mediciones con precisión y efectuar las anotaciones pertinentes,
para obtener resultados satisfactorios disminuyendo el margen de error. “un
error mínimo al principio puede ser máximo al final” (Aristóteles).
5. Todo alumno deberá contar con una calculadora personal que contenga como
mínimo funciones de potencia y logaritmo. No se permitirá usar celulares como
calculadora personal.
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PRÁCTICA N°1
ESPECTROFOTOMETRÍA
Conocimiento el uso y aplicación del espectrofotómetro.
Logro de Aplicación de la ley de Lambert – Beer en el empleo del
aprendizaje: espectrofotómetro.
Determinación de una curva de calibración con la solución de azulde metileno.
MATERIALES
I. MATERIALES EN LA MESA DE LOS ESTUDIANTES
 01 gradilla
 05 tubos de ensayo 13x100mm
 01 piseta con agua destilada
 02 pipeta graduada 10Ml
II. MATERIALES EN LA MESA CENTRAL DEL PROFESOR
 01 solución de azul de metileno 1mg/dL frasco 100 mL

 01 espectrofotómetro
 01 micropipeta 100-1000 µL y/o de 5-50µL
 12 cubetas para espectrofotometría
 12 puntas descartables respectivas
PROCEDIMIENTO
 Solución azul de metileno 1mg/Dl

Pesar en la balanza analítica 1mg de azul de metilo. Mezclar 1mg/Dl de azul de metileno
previamente pesados en 100Ml de agua destilada. Agitar hasta que se disuelva
completamente.
9
INTRODUCCIÓN
PRÁCTICA N°1
EPECTROFOTOMETRÍA
Entre los diversos métodos de análisis de tipo cuantitativo que se utilizan para la determinación de
moléculas o elementos constitutivos de los organismos se encuentra la espectrofotometría, que
utiliza la medición de la intensidad de la luz transmitida y/o absorbida, a determinada longitud de
onda, por compuestos químicos en solución.
Objetivos
 Conocer el uso y aplicación del espectrofotómetro.
 Aplicar la Ley de Lambert y Beer en el empleo del espectrofotómetro
 Determinar una curva de calibración, usando la solución de azul demetileno.
Fundamento teórico
El paso de un haz de luz de una longitud de onda determinada a travésde una solución es reflejado
en parte, mientras que la mayor fracciónde esta es absorbida por la sustancia disuelta. La absorción
esproporcional a la concentración del soluto.
La propiedad de una sustancia para absorber radiación de una determinada longitud de onda es
dependiente de su estructura química. La ley de Lambert y Beer expresa las relaciones antes
mencionadas mediante la siguiente ecuación:
𝐼𝑜
𝐿𝑜𝑔= 𝜀. 𝐼. 𝑐
𝐼𝑡
Io Luz incidente
It Luz transmitida
ɛ Coeficiente de extensión
Distancia recorrida por la luz a través de la
I
solución
c Concentración del absorbente
El log Io/It también se conoce como densidad óptica (D.O.) o absorbancia de la solución y
1
es directamente proporcional a la concentración del soluto.
Para determinar la concentración de una determinada sustancia puede hacerse uso del factor de
calibración o de una curva decalibración.
La preparación de una curva de calibración se realiza utilizando concentraciones conocidas de la

sustancia cuya concentración deseamos conocer. Luego se determina la absorbancia de cada unade
dichas concentraciones y se procede a preparar un gráfico, dondeen el eje de abscisas se disponen
las concentraciones de la sustanciay en el eje de ordenadas la absorbancia.
Factor de calibración
Se define como la relación que existe entre la concentración del estándar y su respectiva
absorbancia. Este factor puede obtenerse de la siguiente manera:
La concentración del estándar puede expresar como: mg/Dl, µg/Dl, mEq/L, U/L, etc. Para encontrar
𝐶𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑐𝑖ó𝑛 𝑑𝑒 𝑒𝑠𝑡á𝑛𝑑𝑎𝑟
la concentración de𝐹𝑎𝑐𝑡𝑜𝑟 𝑑𝑒 𝑐𝑎𝑙𝑖𝑏𝑟𝑎𝑐𝑖ó𝑛
unasustancia problema se =
multiplica el factor de calibración por laabsorbancia
𝐴𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏𝑎𝑛𝑐𝑖𝑎
del problema, operación que se realiza de acuerdo con el siguiente procedimiento que se aplicará en
el desarrollo del experimento.
1
INSTRUCCIONES PARA EL DESARROLLO DE LA

EXPERIENCIA PRÁCTICA
Preparación de una curva de calibración

Para elaborar una curva de absorción se preparará el siguiente sistema:
Solución de azul de metileno 1mg/Dl 1 Ml

Agua destilada 4 Ml
Luego, se procederá a realizar lecturas en el espectrofotómetro a las siguientes longitudes de onda:

560, 580, 600, 620, 640, 660,
680 y 700 nm.
Graficar utilizando papel milimetrado las absorbancias en función de las longitudes de onda y
determinar el pico de máxima absorción de azul de metileno, el cual corresponde al mayor valor de
la absorbancia.
Preparar el experimento de la siguiente manera
1 2 3 4 5
Ml Azul de metileno 0.5 1 2 3 4

Ml Agua destilada 4.5 4 3 2 1
Llevar el espectrofotómetro a cero. Luego leer los tubos a una longitud de onda de 660 nm. Graficar
en un papel milimetrado los resultados, disponiendo las concentraciones en el eje de abscisas en el
eje de las ordenadas,luego trazar una recta a través de los puntos obtenidosexperimentalmente.
Utilizando la curva de calibración o el factor de calibración determinará la concentración de la
sustancia problema en la presente práctica.
1
INSTRUCCIONES PARA EL DESARROLLO DE LOS INFORMES DE

EXPERIENCIA PRÁCTICA SOBRE ESPECTROFOTOMETRÍA
Apellidos Nombres N° Mesa Fecha
INTRODUCCIÓN
OBJETIVOS
RESULTADOS
DISCUSIÓN
CONCLUSIONES
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
1
CRITERIOS QUE SE TOMARÁN EN CUENTA PARA LA EVALUACIÓN DE LOS INFORMES DE

PRÁCTICA
Solución de problemas SP1: Identifica un problema, explicando las variables que lo construyen.
Competencia Investigación I1: Define un problema de investigación, la pregunta y las hipótesis
Niveles de desempeño
Criterios Logrado En proceso No logrado
Realiza una introducción y objetivo (s) de la práctica de Realiza una introducción y objetivo (s) de la Realiza una introducción y objetivo (s) de la
Realiza una introducción y objetivo (s) de la práctica manera correcta práctica de manera parcial práctica de manera incorrecta
3-5 puntos 1-3 puntos 0 puntos
Desarrolla materiales y métodos de manera correcta Desarrolla materiales y métodos de manera Desarrolla materiales y métodos de manera
parcial incorrecta
Desarrolla materiales y métodos
Realiza el procedimiento experimental de manera correcta Realiza el procedimiento experimental de manera
parcial Realiza el procedimiento experimental de manera
Realiza el procedimiento experimental
incorrecta

Realiza la descripción y análisis de resultados de manera Realiza la descripción y análisis de resultados de Realiza la descripción y análisis de resultados de
correcta manera parcial manera incorrecta
Descripción y análisis de resultados
Realiza conclusiones, recomendaciones y referencias de Realiza conclusiones, recomendaciones y
manera correcta referencias de manera parcial
Realiza conclusiones, recomendaciones y
Realiza conclusiones, recomendaciones y referencias referencias de manera incorrecta
2-3 puntos 1 puntos 0 puntos
1
PRÁCTICA N°2
DETERMINACIÓN DE PROTEÍNAS PLASMÁTICAS

Determinación el nivel de las proteínas plasmáticas total en el suero sanguíneo.
Logro de
aprendizaje: Determinación el nivel de albúmina en el suero sanguíneo.
MATERIALES
 01 gradilla
 04 tubos de ensayo 13 x 100mm
 01 piseta de agua destilada
 03 pipetas de 5Ml
 03 propipetas
 01 suero sanguíneo tubo con tapa rosca 1Ml

 01 estándar de proteínas frasco 1Ml
 01 reactivo BCF frasco 11Ml
 01 reactivo EDTA/Cu frasco 11Ml
 01 baño maría 37°C
 01 micropipeta 100-1000 µL y/o de 5-50µL
 01 vórtex
PROCEDIMIENTO
El personal técnico colocará en las mesas TODO el material requerido.
1
INTRODUCCIÓN
PRÁCTICA N°2
DETERMINACIÓN DE PROTEÍNAS PLASMÁTICAS
Las proteínas plasmáticas cumplen diversas funciones que son muy importantespara un apropiado
funcionamiento de los diversos tejidos del organismo. Puedencumplir cuantitativa es muy útil para
el diagnóstico de algunas patologías como:desnutrición, deshidratación, cirrosis, etc.
Competencias
1. Determinar el nivel de las proteínas plasmáticas total en el suerosanguíneo.
2. Determinar el nivel de albúmina en el suero sanguíneo.
INSTRUCCIONES PARA EL DESARROLLO DE LAS EXPERIENCIAS

PRÁCTICAS
Determinación de proteínas plasmáticas total por el Método de Biuret
La determinación de las proteínas totales se realiza utilizando ionescúpricos que en medio alcalino
reacciona con las proteínas formando compuestos de coordinación de color violeta, cuyo pico de
máxima absorción es de 540 nm y su intensidad es proporcional a la concentración de proteínas.
Preparar los siguientes medios de reacción:
B x St
Agua destilada (µL) 50 - -

Suero o plasma (µL) - 50 -
Estándar de proteínas (µL) - - 50
Reactivo EDTA/Cu (Ml) 3.5 3.5 3.5
Incubar durante 15 minutos a 37°C y leer en el espectrofotómetroa 540 nm.
VALORES DE REFERENCIA:
1
Determinación de albúmina
La albúmina reacciona con el bromo cresoldulfonftaleína a Ph 3.8 formando un compuesto coloreado

que absorbe a 625 nm. Preparar el siguiente sistema:
B x St

Estándar de albúmina (µL) - - 10
Reactivo BCF (Ml) 3.5 3.5 3.5
Colocar los tubos en una gradilla a temperatura ambiente durante 10 minutos y leer en el espectrofotómetro a 625
nm.
1
INSTRUCCIONES PARA EL DESARROLLO DEL INFORME DE LA

EXPERIENCIA PRÁCTICA SOBRE DETERMINACIÓN DE
PROTEÍNAS PLASMÁTICAS
INTRODUCCIÓN
OBJETIVOS
RESULTADOS
DISCUSIÓN
CONCLUSIONES
1
CRITERIOS QUE SE TOMARÁN EN CUENTA PARA LA EVALUACIÓN DEL INFORME

DE PRÁCTICA
parcial incorrecta
incorrecta

1
PRÁCTICA N°3
DETERMINACIÓN DE UREA
Determinación de urea en suero sanguíneo.
Logro de
aprendizaje:
MATERIALES
 01 gradilla
 01 pipeta volumétrica o graduada 5 Ml
 01 pipera volumétrica o graduada 10 Ml
 02 propipetas
01 suero tubo de tapa rosca 2Ml

01 estándar de urea (0.60g/L) frasco 1Ml 01
ureasa frasco 1 Ml
01 reactivo de trabajo 1 frasco 12 Ml
01 reactivo de trabajo 2 frasco 12 Ml
01 espectrofotómetro
01 micropipeta 10 – 100 µL y/o de 5 – 50 µL
06 puntas descartables respectivas
06 cubetas para espectrofotometría 01
baño maría 37°C
01 vórtex
PROCEDIMIENTO
2
INTRODUCCIÓN
PRÁCTICA N°3
DETERMINACIÓN DE UREA
La urea es un compuesto nitrogenado que se sintetiza en el hígado a partir del ion amonio,
bicarbonato y ATP. La enzima que cataliza esta primera reacción esel carbamoil fosfato sintetasa I,
cuya actividad es regulada por el N – acetil glutamato. La excreción de urea por la orina depende
fundamentalmente de la ingesta proteica. Un incremento de urea en sangre puede ocurrir a causa de
unaprobable disfunción renal.
Competencia
1. Determinar el nivel de urea en suero.
Fundamento teórico
La determinación de urea en orina se fundamenta en la acción que ejerce la enzima ureasa sobre la
urea, descomponiéndola en anhídrido carbónico y amoniaco. Este amoniaco reacciona con
hipoclorito y fenolen medio alcalino, formando un compuesto coloreado denominada azul de
indofenol, cuya intensidad es proporcional a la concentración de urea.
INSTRUCCIONES PARA EL DESARROLLO DE LA EXPERIENCIA

PRÁCTICA
Preparar el siguiente sistema:
B x St
Estándar de urea (µL) - - 20

Suero (µL) - 20 -
Ureasa (gota) 1 1 1
Mezclar mediante agitación e incubar a 37°C por 5 minutos.
B x St
Reactivo 1 (Ml) 1 1 1
Reactivo 2 (Ml) 1 1 1
Mezclar e incubar 37°C por 5 minutos y leer en el espectrofotómetro a540 nm.
2
INSTRUCCIONES PARA EL DESARROLLO DEL INFORME DE LA

EXPERIENCIA PRÁCTICA SOBRE DETERMINACIÓN DE UREA
INTRODUCCIÓN
OBJETIVOS
RESULTADOS
DISCUSIÓN
CONCLUSIONES
2

DE PRÁCTICA
parcial incorrecta
incorrecta

2
PRÁCTICA N°4
FACTORES QUE AFECTAN LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA

Determinación del efecto de la concentración del sustrato Determinación del
Logro de
aprendizaje: efecto de la concentración de la enzima Determinación del efecto del Ph sobre
la actividad enzimática
MATERIALES
 01 gradilla
 01 hígado de pollo (enzima fosfatasa ácida del hígado)
 01 termómetro
 02 pipetas graduadas o volumétricas 10Ml
 01 propipeta
II. REACTIVOS EN LA MESA DE LOS ESTUDIANTES
 01 albúmina a [1.3] absorbancia 450nm frasco 12Ml

 01 pepsina 2% frasco 3Ml
 01 buffer 24cetate 0.1M Ph 3.6 frasco 5Ml
III. MATERIALES EN LA MESA CENTRAL DEL PROFESOR
 01 baño maría 37°C o plancha de calentamiento

 01 beaker 250 Ml
 01 termómetro
PROCEDIMIENTO
 Buffer Acetato 0.1M Ph 3.6

Para obtener soluciones de buffer acetato 0.1M de Ph 3.6 se deberá preparar:
Solución A (Ácido acético 0.2M) medir 1,15 ml de ácido acético en una pipeta de 2
ml. Colocar en una fiola de 100Ml y aforar con agua destilada.
Solución B (Acetato de sodio 0.2M) pesar 2.72 g de Acetato de sodio en una
balanza analítica. Colocar en una fiola de 100Ml y aforar con agua destilada.
Colocar en una fiola de 100 Ml 46.3 de la solución A + 3.7 Ml de la solución B y aforar con
agua destilada. Ajustar el pH si fuese necesario.
2
 Pepsina al 2%
Pesar 2g de pepsina en la balanza analítica, luego agregar agua destilada hasta
completar un volumen de 100mL.
 Albúmina [1.3] de Absorbancia a 450 nm
Solución madre: Cocer en un beaker de 1000 ml dos huevos (15 minutos

aproximadamente). Separar la clara y licuar con agua destilada a una capacidad
para 250 ml. Luego filtrar 2 veces con papel toalla.
Realizar una dilución de la solución madre de albumina a 3.7x (5.40 ml para cada
20 ml). Verificar con el espectrofotómetro una absorbancia de 1.3
aproximadamente a una longitud de onda de 450 nm.
2
INTRODUCCIÓN
PRÁCTICA N° 4
FACTORES QUE AFECTAN LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA
Las enzimas son compuestos de naturaleza proteica que tienen la propiedad deacelerar las
reacciones químicas sin modificar la constante de equilibrio del sistema. Su actividad es afectada
por diversos factores: concentración de sustrato, pH, concentración de enzima, temperatura,
inhibidores, fuerza iónica, constante dieléctrica, etc.
Competencias
1. Explicar la actividad enzimática de la pepsina sobre la actividad dela pepsina.
2. Explicar el efecto de un factor enzimático sobre la actividad de lapepsina.
3. Determinar el Km y Vmáx experimental de la pepsina para laalbúmina a partir de la
gráfica de Vi contra [S].
4. Determinar el Km y Vmáx experimental de la pepsina para laalbúmina a partir de la
gráfica de dobles recíprocas 1/Vi contra 1/[S].
Fundamento teórico
Los biocatalizadores específicos sintetizados por el organismo, llamados enzimas, son proteínas que
intervienen en las reacciones biológicas, acelerando la velocidad de reacción hasta alcanzar su punto
de equilibrio. Las enzimas son sumamente específicas en las reacciones que catalizan y en los
compuestos (llamados substratos) sobre los que actúan.
La cinética enzimática es el estudio del comportamiento de la velocidad en reacciones catalizadas

por enzimas. Las mediciones de la cinética proporcionan una herramienta bioquímica muy útil para
calcular la concentración de una enzima en una muestra biológica y comparar su actividad catalítica
con la de otras enzimas. Además, lasmediciones cinéticas permiten describir de manera cuantitativa
elefecto de un veneno o medicamento sobre la actividad de una enzima.
La velocidad a la que procede una reacción enzimática está controlada en parte por las
concentraciones de la enzima y el substrato. A medidaque progresa la reacción, aumenta la
concentración de los productos a expensas de la desaparición de los correspondientes substratos,
entanto que la concentración de la enzima no se altera.
2
La actividad enzimática puede expresarse:

 Por la desaparición del Substrato (S)
 Por la aparición de Productos (P)
 Por modificación de Cofactores (C)
El mecanismo de reacción enzima-sustrato puede simbolizarse así:
[E] + [S]  [E] + [P] C C’
Diversos factores modifican la actividad enzimática, tales como:

1. Concentración de Substrato [S]
2. Concentración de la Enzima [E]
3. pH del medio
4. Influencia de la temperatura
5. Efecto de inhibidores y activadores
En las siguientes prácticas estudiaremos el efecto de estos factores sobre la actividad enzimática de
la pepsina en presencia de albúmina.
La pepsina es un enzima proteolítico (proteasa ácida) segregada por las células principales de las
glándulas gástricas, tiene un peso molecular de 34 644 Da. Hidroliza los enlaces peptídicos,
descomponiendo así las proteínas en aminoácidos. La pepsina solo realiza la proteólisis en medio
ácido, actúa a un pH bajo, por lo que esprecisa la presencia de ácido clorhídrico para la realización
de la digestión gástrica de las proteínas. Las células de las glándulas gástricas no producen
directamente pepsina, sino que su producto es el pepsinógeno, sustancia precursora sin capacidad
digestiva que se convierte en pepsina en la luz de la glándula, al entrar en contacto conel ácido
clorhídrico y con la pepsina ya producida.
2

PRÁCTICA
La actividad enzimática se medirá por la desaparición del substrato (disminución de la turbidez en

los tubos que contienealbúmina), la cual se determinará en el Espectrofotómetro a 450nm.
1 2 3 4 5 6 7 8 9
Agua
destilada 4 3.5 3 2.5 2 1.5 1 0.5 -
(mL)
HCl 1N
0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 -
(mL)
Albúmina
5% (MmL) 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 -
Pepsina 2%
P/V - - - - - - - - 4
(mL)
 Leer los tubos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 y 8 en el espectrofotómetro. Considerar las

Absorbancias como Lectura Inicial.
 Luego, Incubar los nueve tubos a 37ºC por 5 min. Añadir
 0.5 ml de pepsina a cada tubo (del tubo 9 a los tubos 1, 2,3, 4, 5, 6, 7 y 8). Incubar a 37ºC
por 5 min o hasta que el tubo 1 este claro.
 Detener la reacción colocando los tubos en un baño dehielo.
 Leer los tubos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 y 8 en el espectrofotómetro. Considerar las
Absorbancias comoLectura Final.
- Hacer la diferencia:
Actividad Enzimática = Lectura Inicial - Lectura Final
El resultado de esta diferencia se considerará como ActividadEnzimática.
- Graficar en papel milimetrado:

Actividad Enzimática en el eje Y versus [S] en el eje X. 1/Actividad Enzimática en el eje Y
versus 1/[S] en el eje X.
- Calcular el Km y Vmáx de la pepsina en cada una de las gráficas,

-
-
-
-
-
-
-
-
2
- INSTRUCCIONES PARA EL DESARROLLO DEL INFORME DE

EXPERIENCIA PRÁCTICA SOBRE FACTORES QUE AFECTAN LA
ACTIVIDAD ENZIMÁTICA
INTRODUCCIÓN
OBJETIVOS
RESULTADOS
DISCUSIÓN
CONCLUSIONES
2
CRITERIOS QUE SE TOMARÁN EN CUENTA PARA LA EVALUACIÓN DEL INFORME DE

PRÁCTICA
parcial incorrecta
incorrecta

3
PRÁCTICA N°5
TÉCNICAS DE IDENTIFICACIÓN DE BIOMOLÉCULAS
Logro de Reconocimiento de distintas biomoléculas aplicando las técnicas básicas de

aprendizaje: identificación de carbohidratos, proteínas, lípidos y ácidos nucleicos
MATERIALES
 01 gradilla
 10 tubos Eppendorf 1.5 mL
 07 pipetas graduadas 1mL
 01 cronómetro o temporizador
Materiales generales
• 01 espectrofotómetro
• 01 micropipeta 10 µL, 20 µL, 100 µL, 1000 µL
• Puntas descartables respectivas
• 20 cubetas para espectrofotometría
• 01 lector de microplaca
Materiales para la detección de glucosa
• 01 solución de glucosa 150 mg/dL
• 01 reactivo enzimático glucosa hexoquinasa
• 01 muestra de suero
Materiales para la detección de proteínas
• 01 solución de albúmina sérica bovina (BSA) 10% p/v
• 01 muestra de suero
• 01 Reactivo de Bradford, frasco 1L
• 01 microplaca de 96 pocillos
• Materiales para la detección de lípidos
• 01 muestra de aceite
• 01 benceno
• Materiales para la detección de ácidos nucleicos
• 01 muestra de ADN purificado
3
PROCEDIMIENTO
 Solución de glucosa 150mg/dL

Pesar en la balanza analítica 15mg de glucosa. Mezclar 15mg de glucosa previamente
pesados en 10mL de agua destilada. Agitar hasta que sedisuelva completamente.
 Solución de albúmina sérica bovina (BSA) 10% p/v

Pesar en la balanza analítica 1mg de azul de metilo. Mezclar 1mg de BSA previamente
pesado en 10mL de agua destilada. Agitar hasta que sedisuelva completamente.
 Solución de albúmina sérica bovina (BSA) 10% p/v

Pesar en la balanza analítica 1mg de azul de metilo. Mezclar 1mg de BSA previamente
pesado en 10mL de agua destilada. Agitar hasta que sedisuelva completamente.
3
INTRODUCCIÓN
PRÁCTICA N° 5
TÉCNICAS BÁSICAS DE IDENTIFICACIÓN DE BIOMOLÉCULAS
Las biomoléculas (carbohidratos, proteínas, lípidos y ácidos nucleicos) están conformadas por distintos
monómeros con diferentes grupos funcionales (grupos químicos) que le otorgan propiedades fisicoquímicas
particulares a cada biomolécula y participan en diferentes reacciones. Al evaluar el comportamiento de
diferentes biomoléculas frente a determinados reactivos, estímulos o solventes podremos distinguirlas e
identificar qué biomolécula está presente en la muestra.
Objetivos
• Reconocer las técnicas de identificación de biomoléculas.

• Aplicar diferentes técnicas para la identificación de biomoléculas.
Identificación de glucosa
Método de la glucosa hexoquinasa
Fundamento teórico
Está basado en dos reacciones sucesivas:
1. La fosforilación de la glucosa, catalizada por la enzima hexocinasa, formándose como producto glucosa-
6-fosfato
Glucosa + ATP Glucosa – 6 – fosfato + ADP
2. Una reacción catalizada por la glucosa-6-fosfato-deshidrogenasa (G6PD), dando 1 mol de NADPH

por cada mol de glucosa reducida. El NADPH formado se puede detectar a 340nm.
Glucosa-6-P + NADP  6-fosfogluconolactona + NADPH + H+
La reacción se mide espectrofotométricamente a 340 nm y el incremento de absorbancia es directamente

proporcional a la concentración de glucosa en la muestra.
Este método ha sido postulado como método de referencia por su elevado grado de especificidad para la
determinación de la glucosa.
Método de Bradford para la detección de proteínas
Se basa en la unión de un colorante, Coomasie Blue G-250 a las proteínas en condiciones ácidas. En
condiciones ácidas, el colorante se encuentra en su forma
3
aniónica e interacciona con las proteínas, principalmente con los residuos de aminoácidos básicos (histidina,
arginina y lisina), y se observa un color azul que absorbe a 595nm. En ausencia de proteínas, el colorante se
observa de color rojo-marrón.
Método de solubilidad para los lípidos
Se basa en la diferente solubilidad de los lípidos en el agua y en solventes orgánicos. Los lípidos son solubles
en solventes orgánicos como el benceno, éter, cloroformo; pero son insolubles en el agua. Al mezclar aceite
con agua se forman dos fases o capas. Al agitar la mezcla, se forma una emulsión de aspecto lechoso. Al
cesar la agitación, luego de unos minutos, el agua y el aceite se separan nuevamente en dos fases o capas.
Método de absorción a 260nm para la detección de ADN
Se basa en que el ADN, en particular sus bases nitrogenadas, pueden absorber luz en el rango ultravioleta
(260nm). La absorción de luz es proporcional a la concentración de ADN, una absorbancia de 1.0
corresponde a una concentración de ADN de 50µg/mL.

PRÁCTICAS
Método de la hexoquinasa
Preparar el experimento de la siguiente manera
1 2 3
Solución de glucosa
- 0,005 -
150 mg/dL (mL)
Muestra (suero) (mL) - - 0,005
Reactivo enzimático (mL) 1 1 1
• Luego se procederá a calibrar el espectrofotómetro y realizar lecturas de los tubos 2 y 3 a

340 nm. de onda: 560, 580, 600, 620, 640, 660,
• Calcular el factor de calibración y la concentración de glucosa en el suero.
3
Método de Bradford
Preparar los estándares de BSA en tubos Ependorff según lo indicado en la tabla a continuación:
1 2 3 4 5 6 7
Concentración del 0 0.1 0.25 0.5 1 1.5 2

estándar (mg/mL)
Solución stock de 0 0.5 1.25 2.5 5 7.5 10
BSA 10mg/mL ( L)
Agua destilada 50 49.5 48.7 47.5 45 42.5 40
Colocar 25µL de los estándares o la muestra, cada uno en un pocillo diferente de la microplaca, luego
agregar 250µL del reactivo de Bradford. Mezclar, incubar 3 – 5 min a temperatura ambiente y leer en el
lector de microplacas a 595nm.
Realizar la curva de calibración graficando la concentración de los estándares (abscisas) vs absorbancia

(ordenadas). Se puede utilizar el método del Fc promedio o la ecuación de la recta para calcular la
concentración de proteínas en la muestra (suero).
Método de la solubilidad
Marcar dos tubos de ensayo A y B respectivamente. En el tubo A colocar 1mL de benceno y en el tubo B
1mL de agua. Luego, agregar 1mL de aceite a cada uno de los tubos, observar la solubilidad del aceite en
benceno y en agua y registrar sus observaciones. Luego, agitar los tubos y observar la formación de una
emulsión en el tubo B. Registrar sus observaciones. Colocar los tubos en la gradilla (sin agitación) e incubar
por unos minutos a temperatura ambiente. Observar la solubilidad del aceite en ambos tubos y registrar sus
observaciones.
Método de absorción a 260nm
Colocar la muestra de ADN purificado y medir la absorbancia en el espectrofotómetro a 260nm. Registrar el

valor obtenido. A partir de la absorbancia, calcular la concentración. Recordar que una absorbancia de 1.0
corresponde a una concentración de 50 µg/mL.
3
INSTRUCCIONES PARA EL DESARROLLO DEL INFORME DE

EXPERIENCIA PRÁCTICA SOBRE TÉCNICAS DE IDENTIFICACIÓN
DE BIOMOLÉCULAS
Este informe debe contener las siguientes partes:

INTRODUCCIÓN
OBJETIVOS
RESULTADOS
DISCUSIÓN
CONCLUSIONES
3
CRITERIOS QUE SE TOMARÁN EN CUENTA PARA LA EVALUACIÓN DE LOS INFORMES DE

PRÁCTICA
parcial incorrecta
incorrecta

3
PRÁCTICA N°6
EFECTO DEL AYUNO SOBRE EL CONTENIDO DE GLUCÓGENO HEPÁTICO

Logro de Identificación del glucógeno en un hígado en ayunas vs con comida.
aprendizaje:
MATERIALES
 01 gradilla
 04 embudos para tubos de ensayo
 01 plancha de calentamiento
 01 beaker 250mL
 03 pipetas graduadas o volumétricas de 5mL
 03 propipetas
 01 estándar de glucosa frasco 1mL

 01 alcohol etílico 5mL
 01 hidróxido de potasio ̴ KOH 30% 15mL

 01 beaker con hielo 250mL (colocar cuando sea solicitado por el docente)
 01 hígado de roedor en ayunas por 24h 3g
 01 hígado de roedor alimentado Ad libitum 3g
 01 kit de quirúrgico
 01 estándar de glucosa frasco 6mL
3
PROCEDIMIENTO
 Hígado de roedor
Se deberán solicitar los roedores con 3 días de anticipación a loscolaboradores de
veterinaria.
 Estándar de glucosa 5mg/dL
En la balanza analítica pesar 0.005g de glucosa (se puede emplear azúcar)y luego
agregar 100mL de agua destilada. Agitar y calentar. Dejar que disuelva
completamente y enfriar.
NOTA: Se debe preparar con al menos 1 día de anticipación.
 KOH 30%
En un beaker de 250mL colocar 75g de KOH y luego agregar agua destilada hasta
llenar los 250mL. Agitar hasta lograr una mezcla completa.
3
INTRODUCCIÓN
PRÁCTICA N° 6
EFECTO DEL AYUNO SOBRE EL GLUCÓGENO HEPÁTICO
El hígado es el órgano que almacena glucógeno como un elemento de particular importancia energética, que
le permite al organismo mantener la glicemia durante los periodos en que no se ingiere alimentos. A
diferencia del tejido muscular, el hígado puede degradar el glucógeno y liberar glucosa a la sangre.
Competencia
1. Identificar el glucógeno en un hígado en ayunas versus con comida.

PRÁCTICA
Parte experimental
1. Preparación de los animales de experimentación

Se dispondrá de 2 ratas en jaulas diferentes, una de las cualesrecibirá su dieta habitual, mientras que la otra
será sometida a un ayuno de 24 horas. A ambas se les proporcionará agua “ad libitum”.
2. Extracción del glucógeno

Se sacrificarán ambos animales previamente anestesiados con cloroformo y se procederá a extraerles el
hígado. Luego, se realizará una observación del tamaño y color del mencionado órgano.
Se pesará 0.5g de hígado de cada animal y se colocarán en tubos de boca ancha, luego se les adicionará 1mL
de KOH 30%.Se colocará en la boca de cada tubo un embudo pequeño y se le someterá a la ebullición por 30
minutos.
Después de enfriar, se les adicionará 3mL de agua destilada y 5mL de alcohol etílico.
NOTA: Se formará precipitado en aquel hígado que contenga glucógeno.
Tubos de ensayos
Reactivos y muestra
1 2 3 4
Disolución de hígado en ayunas (mL)
1.0 - - -
Disolución de hígado normal (mL)
- 1.0 - -
Estándar de glucosa 5mg/dL (mL)
- - 1.0 -
Agua destilada (mL) - - - 1.0
4

EXPERIENCIA PRÁCTICA SOBRE EFECTO DEL AYUNO SOBRE EL
CONTENIDO DEL GLUCÓGENO HEPÁTICO
INTRODUCCIÓN
OBJETIVOS
RESULTADOS
DISCUSIÓN
CONCLUSIONES
4

PRÁCTICA
parcial incorrecta
incorrecta

4
PRÁCTICA N°7
DIGESTIÓN ENZIMÁTICA DEL ALMIDÓN
Logro de Identificar la digestión enzimática del almidón mediante la hidrólisispor efecto de

aprendizaje: la amilasa salival
MATERIALES
 01 gradilla
 02 pipetas graduadas o volumétricas 5mL
 02 pipetas graduadas o volumétricas 10mL
 01 propipeta
 01 tampón fosfato 0.1M pH 6.5 frasco 3mL

 01 almidón 1% frasco 6mL
 01 cloruro de sodio 0.5N gotero 25mL
 01 gotero con solución de Lugol
PROCEDIMIENTO
 Tampón Fosfato 0.1M pH 6.5

Para obtener las soluciones buffer fosfato 0.1M a pH de 6.5, se mezcla 68.5mL de Solución
1 y 31.5mL de la Solución 2. Luego se completa a un volumen total de 200mL con agua
destilada. (Para otro pH y concentración ver el Anexo 1).
Solución 1: 0.2M de NaH2PO4

Disuelva 24g de NaH2PO4 y lleve a un volumen de 1Litro con agua destilada.
Solución 2: 0.2M de Na2HPO4

Disuelva 53.6g de Na2HPO4*7H2O y lleve a un volumen de 1Litro con agua destilada.
4
 Almidón 1%
Colocar 1L de agua en una plancha de calentamiento hasta llegar a ebullición.

Luego, añadir 10 gr de almidón hasta su disolución.
Conservación: Con el objetivo de que el almidón dure más tiempo, luego de la

ebullición se puede agregar 3gr de NaCl, disolver y añadir 10gr de almidón.
Verificación: Colocar en un tubo de ensayo 10 mL de la solución de almidón y

agregar 2-3 gotas de Lugol. La reacción positiva dará una coloración azul-violeta.
 Cloruro de sodio NaCl 0.5N
Medir un volumen de 29.25gr en una probeta, luego llevar a un recipiente y

agregar agua destilada hasta completar un volumen de 1L.
4
INTRODUCCIÓN
PRÁCTICA 7
DIGESTIÓN ENZIMÁTICA DEL ALMIDÓN
El almidón constituye un importante componente de la dieta de los seres humanos. El proceso

de digestión de este nutriente se inicia en la cavidad oral, lugar en que actúa la α
– amilasa salivar, enzima que tiene la propiedad de hidrolizar los enlaces α 1.4 del almidón y forma
polisacáridos de menor peso molecular.
Competencia
1. Hidrolizar el almidón por efecto de la amilasa salival

PRÁCTICAS
Parte experimental
Hidrólisis del almidón por efecto de la amilasa salival

Para realizar el experimento se prepararán los siguientes mediosde reacción:
1 2 3
Tampón fosfato 0.1M pH 6.5 (mL) 1.0 1.0 1.0
Almidón 1% (mL) 2.0 2.0 2.0
Cloruro de sodio 0.5N (mL) - - 1.5
Agua destilada (mL) 2.0 1.5 -
Colocar los tubos de ensayo en el baño maría a 37°C durante 2 minutos, luego adicionar:
1 2 3
Solución de saliva (mL) - 0.2 0.2
Colocar nuevamente los tubos en baño maría y sacar alícuotas de 0.5mL de cada uno de los tubos a los 5, 10, 15
y 20 minutos, y adicionarlos a los tubos previamente preparados que contienen 2.0mL de ácido clorhídrico 0.5N,
de acuerdo con el siguiente esquema:
4
1 2 3
Cloruro de sodio 0.5N (mL) 2.0 2.0 2.0
Luego, adicionar a cada tubo:
1 2 3
Solución de Lugol (gota) 1 1 1
Dejar en reposo durante 1 minuto y observar el color formado, Durante el desarrollo del experimento se
observaránmodificaciones del color inicial de los tubos como consecuenciasde la acción de la α – amilasa
salival. El experimento concluye cuando uno de los tubos muestre un colorpardo claro.
4

EXPERIENCIA PRÁCTICA SOBRE DIGESTIÓN ENZIMÁTICA DEL
ALMIDÓN
INTRODUCCIÓN
OBJETIVOS
RESULTADOS
DISCUSIÓN
CONCLUSIONES
4

PRÁCTICA
parcial incorrecta
incorrecta

4
PRÁCTICA N°8
Desnaturalización de proteínas y SDS-PAGE
Reconocer la desnaturalización de proteínas para la electroforesis en gel de

Logro de Poliacrilamida con dodecilsulfato sódico
aprendizaje:
Identificar los componentes y conocer los pasos de la electroforesis en gel de
Poliacrilamida con dodecilsulfato sódico
MATERIALES (para extracción de ADN)
 01 piceta con agua destilada

 Tubos Ependorff 1.5mL
 Muestra de proteínas
 01 tubo Ependorff con tampón para cargar muestras 5X
 Gel de poliacrilamida 10%

 Sistema de electroforesis
 Fuente de poder
 Buffer de corrida
 Marcador de peso molecular para proteínas
 Termobloque para tubos de ensayo
 Cronómetro
 Solución de tinción
 Solución de des-tinción
 Agitador
PROCEDIMIENTO
Preparación de Tris 1M pH 6.8 / pH 8.8

Disolver 121 g de Tris Base en 800 mL de agua destilada. Una vez disuelto,
completar con agua destilada (csp 1000mL) y ajustar el pH a 6.8 o 8.8
respectivamente.
Preparación de la solucion stok de acrilamida (100 mL)

30% (p/v) acrilamida, 0,8% (p/v) bis-acilamida.
Preparacón del tampón de gel de separación 4x (100 mL)

75 mL 2 M Tris-HCl (pH 8,8)
4 mL 105 SDS
21 mL de H2O
4
Preparación del tampón de gel concentrador (100 mL)

50 mL 1M Tris HCl (pH
6,8) 4 mL 10% SDS
46 mL H2O
Preparación del persulfato de amonio 10%, 5 mL

0,5 g de persulfato de amonio
5 mL de agua destilada
Preparación del tampón de electroforesis:

3 g de Tris
4,4 g de
glicina 1 g
SDS
1 L de agua destilada
Preparación del tampón de carga de muestra 5X

0,6 mL 1 M Tris-HCl (pH 6,8)
5 mL de glicerol 50%
2 mL SDS 10%
0,5 mL 2- mercaptoethanol
1 mL azul de bromofenol 1%
0,9 mL de agua destilada
Preparación de la solución de tinción:

Coomassie blue, 1 L
1,0 g de Coomassie blue R-250
450 mL metanol
100 mL de ácido acético glacial
(Agitar por 10-20 min)
Solución de des-tinción:
100 mL metanol
100 mL de ácido acético glacial
800 mL de agua destilada
5
INTRODUCCIÓN
PRÁCTICA N° 8
DESNATURALIZACIÓN DE PROTEÍNAS Y SDS-PAGE
La electroforesis es un método que permite separar diferentes moléculas en función de su carga, su tamaño y
su peso. Esta técnica se ha utilizado para el estudio de proteínas, con la finalidad de conocer su peso
molecular, conocer la cantidad y peso de las proteínas que componen una muestra, entre otras. Su aplicación
ha tenido un aporte para el diagnóstico de ciertas patologías, así como también para el desarrollo de fármacos
y monitoreo de la respuesta del paciente al tratamiento.
• Competencias
1. Desnaturalización de proteínas
2. Migración electroforética en gel de Poliacrilamida con dodecilsulfato sódico (SDS-PAGE)
• Fundamento teórico
Se basa en la separación de moléculas (proteínas) en un gel por acción de un campo eléctrico. Existen dos
tipos de electroforesis: nativa (sin desnaturalización de la proteína, la separación se da en función de su carga
y tamaño) y desnaturalizante (con desnaturalización previa de la proteína, la separación se da en función de
su peso molecular). La SDS-PAGE es una electroforesis desnaturalizante donde se utiliza un detergente
aniónico, el dodecil sulfato de sodio (SDS), como agente desnaturalizante. El SDS desnaturaliza a las
proteínas y recubre la proteína desnaturalizada aportándole cargas negativas en toda su superficie. Asimismo,
se utiliza el β-mercaptoetanol para romper puentes disulfuro entre cadenas proteicas que conforman una
proteína, con lo cual las subunidades quedan separadas. Dado la carga negativa que aporta el SDS a las
proteínas, estas se desplazarán hacia el polo positivo. En su estructura, el gel de poliacrilamida tiene poros.
Las moléculas más grandes tendrán mayor dificultad para pasar por los poros, por lo tanto, van a migrar más
lento y no avanzarán una gran distancia. Por otro lado, las moléculas más pequeñas pasarán a través de los
poros con mayor facilidad y migrarán más rápido, por lo tanto, recorrerán una distancia mayor.

PRÁCTICAS
Parte experimental
Electroforesis en gel de agarosa

1. Colocar el gel de poliacrilamida en el sistema para electroforesis
2. Retirar el peine (si lo tiene)
3. Colocar el sistema en el tanque de electroforesis
4. Agregar tampón de electroforesis hasta que cubra el gel
5. Lavar los pocillos con el buffer de electroforesis para eliminar cualquier acrilamida residual
6. Medir la concentración de proteína en la muestra
7. Calcular, en función de os pocillos y la concentración de proteína, el volumen de muestra a
5
preparar. Si es necesario, se puede diluir una alícuota de la muestra

8. En tubos Eppendorf 1.5mL, combinar la muestra de proteínas y el tampón de muestra 5 x (ej. 20 µL +
5 µL). Mezclar
9. Llevar al termobloque precalentado a 95oC por 5 min.
10. Dar un spin por un segundo
11. Cargar las muestras y el marcador de peso molecular para proteínas en los pocillos.
12. Colocar la tapa al sistema
13. Encender la fuente de poder
14. Configurar el voltaje constante a 100 V
15. Comenzar la migración
16. Verificar el avance del frente de migración
17. Detener la migración cuando el frente de migración esté cercano al final del gel
18. Apagar la fuente de poder
19. Retirar la tapa del sistema
20. Retirar las placas de vidrio que contienen el gel
21. Separar las placas de vidrio
22. Cortar el gel de acumulación
23. Retirar cuidadosamente el gel y llevarlo a un recipiente con la solución de tinción
24. Incubar a temperatura ambiente por 15 min con agitación suave
25. Retirar la solución de tinción
26. Colocar la solución de des-tinción
27. Incubar a temperatura ambiente con agitación suave hasta observar la aparición de bandas azules en
un fondo muy claro o transparente
28. Si se satura, puede requerir cambiar la solución de des-tinción
29. Tomar una imagen
30. En la imagen, en la parte donde superior del gel, colocar el contenido de cada pocillo, o
identificar cada pocillo con un número y colocar el contenido en la leyenda
31. Colocar M para el pocillo que contiene el marcador de peso molecular, y colocar el peso
molecular de cada banda
32. Colocar el peso molecular de cada una de las proteínas en la muestra
5

EXPERIENCIA PRÁCTICA DESNATURALIZACIÓN DE PROTEÍNAS
Y SDS-PAGE
INTRODUCCIÓN
OBJETIVOS
RESULTADOS
DISCUSIÓN
CONCLUSIONES
5

DE PRÁCTICA
parcial incorrecta
incorrecta

5
PRÁCTICA N° 9
CÁLCULO DEL BALANCE ENERGÉTICO

Cálculo de las propias necesidades energéticas (gasto energético)del alumno
Logro de Cálculo de la ingesta energética del alumno Determinación del

aprendizaje:
balance energético del alumno Determinación del % de adecuación de
la dieta del alumno
Esta práctica no requerirá de materiales ni reactivos de Laboratorio.Únicamente del

Manual de práctica de Bioquímica.
El docente podrá solicitar materiales adicionales, previo requerimientoanticipado.
5
INTRODUCCIÓN
PRÁCTICA N°9
CÁLCULO DEL BALANCE ENERGÉTICO
Los lípidos de la dieta son hidrolizados a nivel del yeyuno por acción de la lipasapancreática. En este proceso juegan
un papel muy importante las sales biliares, compuestos que tienen la propiedad de emulsionar los lípidos para una
eficienteacción de la lipasa pancreática.
El Balance Energético es el equilibrio que debe existir entre el gasto energético y diario de un individuo, de acuerdo
con su metabolismo basal, edad, sexo,actividad física y la ingesta energética diaria a través de los macronutrientes
de los alimentos consumidos.
Si predomina el gasto energético sobre la ingesta energética, en un tiempo prolongado, el individuo tiende a perder
sus reservas, y como consecuencia se adelgaza. Por otro lado, si predomina la ingesta, el exceso de energía
seacumulará en el cuerpo, en forma de triglicéridos, en el tejido adiposo, observándose un aumento de peso.
Para realizar este balance, es necesario, calcular, en forma independiente, el gasto energético en las 24 horas de
cualquier día rutinario, de acuerdo con la tasametabólica basal (TMB) y la actividad física realizada, luego
compararlo con la ingesta energética que proporcionaron los alimentos consumidos el mismo día, utilizando la Tabla
de composición química de los alimentos peruanos y Tabla auxiliar de alimentos peruanos.
Competencias
1. Calcular las propias necesidades energéticas (gasto energético)del alumno
2. Calcular la ingesta energética del alumno
2. Determinar el balance energético del alumno
3. Determinar el % de adecuación de la dieta del alumno

PRÁCTICA
Parte experimental
1. Calcular la ingesta energética, utilizando:
2. Tabla de trabajo
3. Listado de alimentos consumidos en 24 horas
4. Tabla de composición química de alimentos peruana
5
5. Tabla auxiliar de alimentos peruana
DISPONIBLE EN:
-Tablas Auxiliares para la Formulación y Evaluación de Regímenes Alimentarios (CENAN) pdf
- Tablas Peruanas de Composición de Alimentos (CENAN)
CÁLCULO DE LA INGESTA ENERGÉTICA”
a. En la lista de consumo de alimentos, desglosar las preparaciones detodo el día en cada uno de sus
constituyentes. En columnas ordenadascalcular mediante regla de tres el contenido de proteínas, grasas y
carbohidratos de cada alimento respectivamente, según la cantidad quese haya consumido.
Ejemplo 1:
• Ingesta de leche fluida de vaca = 250 mL
• Leche fluida de vaca en 100 mL contiene 3.1gr de proteínas Para calcular la
cantidad de proteína que existe en 250 mL de lechefluida de vaca:
Leche fluida de vaca en 250 mL “x”

Leche fluida de vaca en 100 mL 3.1gr de proteínas
Ejemplo 2: X = 7.75gr de proteínas
• Ingesta de pulpa de carne vacuno = 90gr

• Pulpa de carne vacuno en 100gr contiene 21.3gr de proteínas
• Para calcular la cantidad de proteína que existe en 90gr de pulpa de carne de vacuno:
Pulpa de carne de vacuno en 90gr “x

”
Pulpa de carne de vacuno en 100gr 21.3gr de proteínas
X = 19.17gr de proteínas
La tabla de Composición química de los alimentos indica

losvalores en 100 g de porción comestible cruda (a menos que indique los valores en cocido).
5
a) Totalizar luego de cada una de las tres columnas, y el valor obtenidoen gramos de cada
macronutriente se multiplica por el factor respectivo.
Proteína x 4.0 Kcal
Grasa x 9.0 Kcal
Carbohidratos x 4.0 Kcal
b) Sumar los totales, y el resultado obtenido corresponde a la cantidad deenergía (Kilocalorías) que
aportan los alimentos consumidos ese día.
TABLA DE TRABAJO
Cantidad Proteína Grasa CHO

ALIMENTO Cantidad Energía
en medida (gr) (gr) (gr)
(gr) (Kcal)
casera
Desayuno
SUB – TOTAL
ALMUERZO
SUB – TOTAL
CENA
SUB – TOTAL
MERIENDAS
SUB – TOTAL
FACTOR x4 x9 x4
TOTAL (Kcal)
Ingesta Energética = Ʃ (kcal)/d
 Calcular el gasto energético, utilizando:

- Ecuaciones para calcular la tasa metabólica basal (TMB)
- Tabla de categorías y factores de la actividad física
“CÁLCULO DEL GASTO ENERGÉTICO”
G.E. = TMB x FACTOR DE ACTIVIDAD
5
a) Se calcula la tasa metabólica basal (TMB) o gasto en reposo, aplicandola fórmula de la siguiente
tabla:
Ecuaciones para calcular la tasa metabólica basal (TMB) a partir delpeso corporal (P).
RANGO DE EDAD (años) Kcal/día
HOMBRES
0–3 60.9 (P) – 54
3 – 10 22.7 (P) + 495
10 – 18 17.5 (P) + 651
18 – 30 15.3 (P) + 679
30 – 60 11.6 (P) + 879
> 60 13.5 (P) + 487
MUJERES
0–3 61.0 (P) – 51
3 – 10 22.5 (P) + 499
10 – 18 12.2 (P) + 746
18 – 30 14.7 (P) + 496
30 – 60 8.7 (P) + 829
> 60 10.5 (P) + 596
Fuente: Organización Mundial de la Salud (OMS). 1985.
5
Ejemplo 1:
La TMB para una estudiante de 19 años, con 55 kg. de peso,será:
TMB = 14.7 (P) + 496

TMB = 14.7 (55) + 496
TMB = 1305 Kcal/d
b) Con la lista de actividades, se agrupan éstas por categorías, tomandoen cuenta el tiempo empleado (en
minutos) y multiplicándolas por el múltiplo de la TMB o factor de actividad (o gasto de energía promedio por
actividad). Las categorías de actividad física son las siguientes:
ACTIVIDAD FÍSICA CATEGORÍA MÚLTIPLO DE LA TMB o

FACTOR DE ACTIVIDAD
Dormir, descansar Reposo 1.0
Manejando automóvil, escribiendo
a máquina, atendiendo a clase,
trabajando en laboratorio, viendo Muy ligera 1.5
TV, cocinando, planchando,
jugando
cartas, tocando un instrumento
musical
Caminando a 4 – 5km/h,
atendiendo al público, limpieza Ligera 2.5
de la casa, cuidando niños,
trabajo de carpintería y
electricidad, jugar tenis de mesa
Caminando a 5.5 – 6.5km/h,
manejando bicicleta, bailando, Moderada 5.0
trabajando en jardinería,
cargando bultos pesados
Jugando fútbol, vóley, básquet,
caminando con carga pesada Pesada 7.0
cuesta arriba, cortando árboles,
trabajo de excavación manual
* Asignar 1/3 de hora para el mantenimiento cardiovascular y

muscular. Recomendación FAO/OMS 1985.
1) Ordenar las actividades de acuerdo al tiempo empleado:
HORA ACTIVIDAD TIEMPO

6:00 – 6:15 a.m. Aseo personal 15´
6:15 – 6:45 a.m. Tomar desayuno 30´
Caminar para tomar el
6:45 – 7:00 a.m. 15´
bus
7:00 – 8:00 a.m. Viajar en bus 60´
8:00 – 10:00 a.m. Asistir a clase 120´
6
etc. (Debe completar 1440 minutos).
2) Agrupar por categoría de actividad:
CATEGORÍA TIEMPO MÚLTIPLO DE FACTOR DE

EMPLEADO LA TMB O TMB
DE ACTIVIDAD FACTOR DE
(HORA) ACTIVIDAD PONDERADO
En reposo 8 1.0 8.0

Muy ligera 14 1.5 21.0
Ligera 2 2.5 5.0
TOTAL 34.0
Promedio / hora
(Factor 1.417
TMB/24h)
Gasto energético
(1.417 x TMB) 1850.0
Gasto Energético = 1850 Kcal/d
 Calcular el balance energético:
Balance Energético = Ingesta Energética – Gasto Energético
Obtener la respuesta respetando el signo (+) (exceso) o (-)(déficit)

EQUILIBRIO Ingesta energética = Gasto energético
BALANCE (+) Ingesta energética > Gasto energético
BALANCE (-) Ingesta energética < Gasto energético
 Calcular el porcentaje de adecuación de la dieta
𝐸𝑛𝑒𝑟𝑔í𝑎 𝑖𝑛𝑔𝑒𝑟𝑖𝑑𝑎
% 𝑑𝑒 𝑎𝑑𝑒𝑐𝑢𝑎𝑐𝑖ó𝑛 = 𝐸𝑛𝑒𝑟𝑔í𝑎 𝑟𝑒𝑞𝑢𝑒𝑟𝑖𝑑𝑎 𝑥 100
Energía ingerida = Ingesta de alimentosEnergía requerida =

Gasto energético
Analizar el % de adecuación de la dieta obtenido, según lossiguientes parámetros:
VALORES NORMALES 90 – 110%

DÉFICIT < 90%
EXCESO > 110%
6
INSTRUCCIONES PARA EL DESARROLLO DEL INFORMES DE

EXPERIENCIA PRÁCTICA CÁLCULO DEL BALANCE ENERGÉTICO
INTRODUCCIÓN
OBJETIVOS
RESULTADOS
DISCUSIÓN
CONCLUSIONES
6

PRÁCTICA
parcial incorrecta
incorrecta

6
PRÁCTICA N°10
HIDRÓLISIS ENZIMÁTICA DE LOS LÍPIDOS

Logro de Comprender la acción hidrolítica de las enzimas sobre los lípidos.
aprendizaje:
MATERIALES
 01 gradilla
 01 bureta de 25Ml
 01 soporte universal con pinza mariposa
 01 fenolftaleína gotero 25mL

 01 hidróxido de sodio ̴ NaOH 0.05N gotero 25mL
 01 solución de pancreatina 1% frasco 100 mL

 01 sales biliares 1% frasco 50 mL
 01 aceite vegetal 30 mL
 01 tampón fosfato 0.1M pH 7.8 frasco 5 0mL
PROCEDIMIENTO
 Fenolftaleína
Pesar 1.25gr de fenolftaleína y diluir con etanol al 95% hasta un volumende
250mL.
 Hidróxido de sodio NaOH 0.05N
Pesar 1.9g de NaOH en la balanza analítica, luego agregar agua destiladahasta completar un
volumen de 1L. (¡PRECAUCION!, la reacción es exotérmica, es decir que desprende calor).
Es recomendable almacenar en envases de plástico para mayor duracióndel reactivo.
 Pancreatina al 1%
En un beaker de 1L colocar 10gr de Pancreatina y luego agregar aguadestilada hasta
llenar 1L. Agitar hasta lograr una mezcla completa.
 Sales biliares al 1%
En un beaker de 1L colocar 10gr de Sales Biliares y luego agregar aguadestilada hasta
llenar 1L. Agitar hasta lograr una mezcla completa.
Tampón fosfato 0.1M pH 7.8

Para obtener las soluciones buffer fosfato 0.1M a pH de 7.8, se mezcla 8.7mL de
6
Solución 1 y 91.3mL de la Solución 2. Luego se completa a un volumen total de

200mL con agua destilada.
Solución 1: 0.2M de NaH2PO4

Disuelva 24g de NaH2PO4 y lleve a un volumen de 1Litro con agua destilada.
Solución 2: 0.2M de Na2HPO4

Disuelva 53.6g de Na2HPO4*7H2O y lleve a un volumen de 1Litro con agua
destilada.
6
INTRODUCCIÓN
PRÁCTICA 10
HIDRÓLISIS ENZIMÁTICADE LOS LÍPIDOS
Los lípidos de la dieta son hidrolizados a nivel del yeyuno por acción de la lipasapancreática. En este proceso
juegan un papel muy importante las sales biliares, compuestos que tienen la propiedad de emulsionar los lípidos
para una eficienteacción de la lipasa pancreática.
Competencia
1. Hidrolizar a los lípidos por la lipasa pancreática.

PRÁCTICA
Parte experimental
Para la demostración experimental de la acción hidrolítica de esta enzima, se prepararán los
siguientes medios de reacción;
B 1 2 3
Tampón fosfato 0.1M (mL) 2.0 2.0 2.0 -

Aceite (mL) 1.0 1.0 1.0 1.0
Sales biliares 1% (mL) 2.0 2.0 - 2.0
Agua destilada (mL) 5.0 - 2.0 2.0
Añadir 2 gotas de fenolftaleína a cada uno de los tubos, luego adicionar gota a gota una solución de NaOH 0.05N
hasta que aparezcauna coloración débilmente grosella estable, luego adicionar:
B 1 2 3
Pancreatina 1% (mL) - 5.0 5.0 5.0
Volver a incubar los tubos a la misma temperatura durante 1 hora, agitándolos cada 5 minutos.
Al finalizar el tiempo de incubación, adicionar nuevamente a cada tubo2 gotas de fenolftaleína y proceder a titular,
utilizando una bureta, conuna solución de NaOH 0.05N hasta que aparezca nuevamente la coloración ligeramente
grosella.
Los resultados se expresarán como miliequivalentes de ácido esteárico liberado por acción de la lipasa pancreática.
6

EXPERIENCIA PRÁCTICA SOBRE HIDRÓLISIS ENZIMÁTICA DE
LOS LÍPIDOS
INTRODUCCIÓN
OBJETIVOS
RESULTADOS
DISCUSIÓN
CONCLUSIONES
6

PRÁCTICA
parcial incorrecta
incorrecta

6
PRÁCTICA N°11
DETERMINACIÓN DE TRIGLICÉRIDOS Y COLESTEROL EN SUERO

Determinación del nivel de triglicéridos en suero sanguíneo. Determinación del
Logro de
aprendizaje: nivel de colesterol en suero sanguíneo.
MATERIALES
 01 gradilla
 03 propipetas
 01 suero tubo de tapa rosca 2mL

 01 estándar de triglicéridos frasco 2mL
 01 reactivo de trabajo para triglicéridos frasco 36mL
 01 estándar de colesterol frasco 2mL
 01 reactivo de trabajo para colesterol frasco 36mL
 01 micropipeta 10 – 100 µL y/o de 5 – 50 µL
 01 vórtex
PROCEDIMIENTO
6
PRÁCTICA N°11
DETERMINACIÓN DE HDL Y LDL EN PLASMA

Determinación del nivel de HDL en plasma sanguíneo.Determinación del nivel
Logro de
aprendizaje: de LDL en plasma sanguíneo.
MATERIALES
 01 gradilla
 03 propipetas
 01 suero tubo de tapa rosca 2mL

 01 estándar de colesterol frasco 2mL
 01 reactivo de trabajo para HDL frasco 18mL
 01 reactivo de trabajo para LDL frasco 18mL
 01 reactivo de trabajo para colesterol frasco 10mL
 01 micropipeta 10 – 100 µL y/o de 5 – 50 µL
 01 vórtex
PROCEDIMIENTO
7
INTRODUCCIÓN
PRÁCTICA N° 11
DETERMINACIÓN DE TRIGLICÉRIDOS Y COLESTEROL EN PLASMA.

PERFIL LIPÍDICO MÍNIMO
La determinación de triglicéridos en plasma constituye un dato muy importante en el manejo de ciertas

dislipidemias. Su incremento en el plasma constituye unfactor de riesgo positivo para aterosclerosis.
Competencia
1. Determinar el nivel de triglicéridos en suero sanguíneo.
Fundamento teórico
Los triglicéridos del plasma son hidrolizados por una lipoproteína lipasa (LPL) que forma como productos
glicerol y ácidos grasos. Elglicerol en presencia de ATP por acción del glicerol quinasa es convertido en
glicerol – 1 – fosfato, compuesto que es convertido porel glicerol fosfato oxidasa (GPO) en dihidroxiacetona
fosfato y peróxidode hidrógeno, este compuesto en presencia de 4 – aminofenazona (4 – AF), clorofenol y
peroxidasa (POD) es transformado en una quinonimina de color rojo.
LPL
Triglicérido Ácido graso + Glicerol
Glicerol quinasa
Glicerol + ATP
GPO
Dihidroxiacetona fosfato + H2O2
POD
Quinonimia roja
7
INSTRUCCIONES PARA EL DESARROLLO DEL EXPERIENCIA

PRÁCTICA
Parte experimental
B x St

Estándar de TGC (µL) - - 20
Reactivo de trabajo (mL) 2 2 2
Mezclar e incubar durante 5 minutos en baño maría a 37°C, luego leeren el espectrofotómetro a 505 nm.
< 150 mg/dL
2. Determinar el nivel de triglicéridos en suero sanguíneo.
El colesterol es una sustancia cuyos niveles en la sangre mantienen una estrecha relación con diversas
patologías, por cuyo motivo su determinación puede contribuir al diagnóstico de: aterosclerosis, mixedema,
diabetes mellitus, nefrosis, hipertiroidismo, etc.
Competencia
1. Determinar el nivel de colesterol en suero sanguíneo
Fundamento teórico
La técnica utilizada para la determinación se fundamenta en la hidrólisis previa de los ésteres de colesterol
por el colesterol esterasa,la posterior acción de la enzima colesterol oxidasa que formará peróxido de
hidrógeno en cantidades estequiométricas y finalmente laparticipación de la peroxidasa que en presencia de
reactivos químicosformará un compuesto coloreado proporcional a la cantidad de colesterol existente en la
muestra de sangre.
Colesterol esterasa
Esteres de colesterol + H2O Colesterol + AGNE
Colesterol oxidasa
Colesterol + O2
Peroxidasa
Quinonimia coloreada + 4 H2O
7
INSTRUCCIONES PARA EL DESARROLLO DEL EXPERIENCIA

PRÁCTICA
Parte experimental
B x St

Estándar de colesterol (µL) - - 20
Reactivo de trabajo (mL) 2 2 2
Incubar durante 5 minutos en baño maría a 37°C y leer en elespectrofotómetro a 540
7

EXPERIENCIA PRÁCTICA DETERMINACIÓN DE
CONCENTRACIÓN DE TRIGLICÉRIDOS Y COLESTEROL-
PERFIL LIPÍDICON MÍNIMO
INTRODUCCIÓN
OBJETIVOS
RESULTADOS
DISCUSIÓN
CONCLUSIONES
7
CRITERIOS QUE SE TOMARÁN EN CUENTA PARA LA

EVALUACIÓN DEL INFORME DE PRÁCTICA
Criterios Logrado En proceso No log
Realiza una introducción y objetivo (s) de la práctica de Realiza una introducción y objetivo (s) de la Realiza una introducci
ealiza una introducción y objetivo (s) de la práctica manera correcta práctica de manera parcial práctica de man
3-5 puntos 1-3 puntos 0 pu
Desarrolla materiales y métodos de manera correcta Desarrolla materiales y métodos de manera Desarrolla materiales
parcial incorr
3-4 puntos 1-2 puntos 0 pu
parcial Realiza el procedimiento
manera incorrecta

Realiza la descripción y análisis de resultados de manera Realiza la descripción y análisis de resultados de Realiza la descripción y a
Realiza conclusiones, rec
ealiza conclusiones, recomendaciones y referencias referencias de manera in
7
PRÁCTICA N°12
DETERMINACIÓN DE HORMONAS TIROIDEAS

Entender el método de ELISA para determinar la concentración de TSH.
Logro de Determinación del nivel de TSH en suero sanguíneo.
aprendizaje:
MATERIALES

 Beaker de 20 -50 mL
 Kit ELISA TSH

 Lector de placas de micropocillos
 Micropipetas de dif. Precisión
 Pipetas automáticas de 50 µL
 Pipetas automáticas de 200 µL
 Papel absorbente
PROCEDIMIENTO
7
INTRODUCCIÓN
PRÁCTICA N° 12
DETERMINACIÓN DE HORMONAS TIROIDEAS
Las hormonas son sustancias secretadas por ciertas células con el objetivo de producir un efecto en la célula
blanco. Estas permiten la regulación de funciones en el cuerpo. Las hormonas pueden clasificarse según su
composición química en esteroideas, glucoproteicas, polipeptídicas y derivadas de aminas. Son producidas y
secretadas por células especializadas, comúnmente en glándulas como la tiroides, la paratiroides, la hipófisis,
el hipotálamo, las glándulas suprarrenales; las gónadas, el tejido glandular endócrino del páncreas, etc.
El perfil hormonal es una prueba diagnóstica que se realiza en muestras de sangre y mide la cantidad de
diversas hormonas para evaluar el funcionamiento de las glándulas correspondientes. En el caso de la
glándula tiroides, produce las hormonas tiroideas que son la tiroxina (T4) y la triyodotironina (T3), y es
estimulada por la hormona estimulante de la tiroides (TSH). En el perfil tiroideo se cuantifican la T4 (total y
libre), T3 (total y libre) y TSH para determinar si hay algún problema en el funcionamiento de la tiroides.
Competencias
1. Entender el método de ELISA para determinar la concentración de TSH.

2. Determinación del nivel de TSH en suero sanguíneo.
Fundamento teórico
La técnica de ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay) consiste en la detección del complejo antígeno-
anticuerpo, donde el antígeno es la molécula a detectar (por ejemplo, la hormona TSH) y el anticuerpo
reconoce de manera específica a ese antígeno y está asociado a un sistema de detección que permite su
visualización. Existen dos formas de ELISA: directa cuando detecta los antígenos en la muestra, e indirecta
cuando detecta los anticuerpos en la muestra.

PRÁCTICAS
Parte experimental
a. Determinación de TSH:
1. Preparar la cantidad de pocillos deseados.
2. Colocar 15 L de Estándar, Control y muestra (con diferentes puntas

desechables) en los pocillos correspondientes.
7
3. Incubar por 10 minutos a temperatura ambiente
4. Colocar 100 µL de enzima conjugada en cada pocillo. Mezclar minuciosamente la mezcla por 10
segundos.
5. Incubar 90 minutos a temperatura ambiente.
6. Sacudir fuertemente el contenido de los pocillos. Enjuagar los pocillos 5 veces con la
solución de lavado (300µL por pocillo). Colocar el papel absorbente para remover gotas.
7. Añadir 100 µL de sustrato en cada pocillo
8. Incubar por 20 minutos a temperatura ambiente.
9. Detener la reacción enzimática añadiendo 100 µL de la solución “stop” en cada pocillo.
10. Determinar la absorbancia de cada pocillo con el lector de placa de micropocillos.
11. *Se recomienda leer los resultaos después de 5 minutos de añadir la solución ”stop”.
7

EXPERIENCIA PRÁCTICA SOBRE DETERMINACIÓN DE
HORMONAS TIROIDEAS
INTRODUCCIÓN
OBJETIVOS
RESULTADOS
DISCUSIÓN
CONCLUSIONES
7

PRÁCTICA
parcial incorrecta
incorrecta

8
PRÁCTICA N°13
EXTRACCIÓN DE PIGMENTOS VEGETALES Y ACEITES ESENCIALES

Reconocer los principales pigmentos vegetales.
Logro de Reconocer los métodos para la extracción de aceites esenciales. Extraer
aprendizaje: pigmentos vegetales y aceites esenciales.
MATERIALES

 01 barra de manteca vegetal natural
 02 frascos de vidrio con tapa
 01 con mortero con pilón
 01 recipiente de vidrio con tapa
 01 muestra de beterraga* en trozos, 1kg

 01 muestra de clavo de olor, 200g **
 01 muestra de pétalos de rosas***
 02 frascos de alcohol 96o1L
 02 frascos de aceite vegetal, 1L
PROCEDIMIENTO
Preparación de la muestra de beterraga:

Pesar aproximadamente 1kg de beterraga, pelarla y cortarla en trozos.
*Alternativamente, se puede utilizar zanahoria, cúrcuma, espinaca, arándanos, etc.

**Alternativamente, se puede utilizar canela, romero, albahaca, orégano, etc.
*** Alternativamente, se puede utilizar pétalos de jazmín, lavanda, etc.
8
INTRODUCCIÓN
PRÁCTICA N° 13
EXTRACCIÓN DE PIGMENTOS VEGETALES Y ACEITES ESENCIALES
Los pigmentos vegetales son compuestos químicos producidos por diferentes órganos de las plantas que dan
una coloración característica al órgano donde son sintetizados. Los pigmentos vegetales se clasifican en tres
grandes grupos: la clorofila (color verde), los carotenoides y flavonoides (color amarillo), los carotenoides
(color naranja), y las antocianinas y carotenoides (color rojo). La clorofila y los carotenoides son liposolubles
mientras que los flavonoides y las antocianinas son hidrosolubles. Los pigmentos cumplen diferentes
funciones: producción de energía (vía la fotosíntesis), protección contra los rayos UV, atracción de los
polinizadores, entre otras. Asimismo, tienen aplicación en industria textil, industria alimentaria, cosmética, y
tienen propiedades curativas. Uno de los métodos más utilizados para extraer pigmentos vegetales es la
maceración.
Los aceites esenciales son, por lo general, mezcla de 1 – 4 compuestos químicos producidos por ciertos
órganos de la planta y se caracterizan por aportar un aroma característico al órgano que lo produce. Su
naturaleza química es muy variable, siendo las moléculas más abundantes los terpenos, sesquiterpenos y
fenilpropanos. Los aceites esenciales tienen aplicación en perfumería y cosmética, en la industria de la
alimentación, licorería y confitería. Por sus propiedades antisépticas, son utilizados en industrias
alimentarias. También son utilizados en medicina tradicional y en aromaterapia por sus propiedades
antibacterianas, antifúngicas, antiinflamatorias, digestivas, analgésicas, depurativas, relajantes, tonificantes,
equilibrantes, entre otras. Entre los métodos para extraer los aceites esenciales se encuentran la destilación
por arrastre con vapor, el prensado, la maceración, el rozamiento o enfleurage, la extracción con solventes,
entre otros.
1. Competencias
1. Reconocer los principales pigmentos vegetales.

2. Reconocer los métodos para la extracción de aceites esenciales.
3. Extraer pigmentos vegetales y aceites esenciales.
Fundamento teórico
1. La maceración es una técnica basada en la transferencia del aceite esencial desde el órgano vegetal hasta un
medio líquido en el cual se encuentra sumergido. Para facilitar la transferencia, previamente se debe
machacar el órgano vegetal para romper las estructuras en las cuales puede estar almacenado el aceite y
facilitar su liberación.
2. La técnica de enfleurage consiste en la transferencia del aceite esencial a la grasa purificada (por ejemplo,
manteca vegetal).
8
INSTRUCCIONES PARA EL DESARROLLO DE LOS INFORMES DE

EXPERIENCIAS PRÁCTICAS
Parte experimental
Extracción de pigmento vegetal de beterraga

a. Pesar 200g de trozos de betarraga y colocarlos en un frasco con tapa. Cubrir con alcohol. Tapar y
dejar macerar.
b. Extracción de aceite esencial de clavo de olor
Pesar 50g de clavo de olor y triturarlos / machacarlos con el mortero con pilón. Colocar la muestra en un
frasco de vidrio con tapa. Cubrir con aceite vegetal, idealmente precalentado a 37oC. Tapar y dejar macerar,
idealmente a 37oC.
c. Extracción de aceite esencial de pétalos de rosas o de jazmín
Colocar la manteca en el recipiente con tapa y esparcir hasta formar una capa de espesor intermedio lo más
uniforme posible. Machacar ligeramente los pétalos de rosas y colocarlos sobre la manteca. Tapar y dejar
que el aceite se difunda en la manteca.
8

EXPERIENCIA PRÁCTICA SOBRE EXTRACCIÓN DE PIGMENTOS
VEGETALES Y ACEITES ESENCIALES
INTRODUCCIÓN
OBJETIVOS
RESULTADOS
DISCUSIÓN
CONCLUSIONES
8

PRÁCTICA
parcial incorrecta
incorrecta

8
PRÁCTICA N°14
Métodos de extracción del ADN, Reacción de Cadena de la Polimerasa y

electroforesis en gel de agarosa
Reconocer el método de CLOROFORMO: ALCOHOL ISOAMÍLICO para la
Logro de extracción del ADN
aprendizaje:
Reconocer la Reacción de Cadena de la Polimerasa y electroforesis en gel de
agarosa.
Identificar los componentes y procedimientos de cada uno de los métodos.

MATERIALES (para extracción de ADN)

 4 tubos Ependorff 1.5mL
 Mezcla de alcohol:fenol:cloroformo
 Muestra
 Buffer de lisis
 Micropipetas
 Puntas para micropipetas correspondientes
 Alcohol 96º
 Buffer TE
 Centrifuga para tubos Ependorff
 Vortex
PROCEDIMIENTO
Preparación de Tris 1M
Disolver 121 g de Tris Base en 800 mL de agua destilada. Una vez disuelto,
completar con agua destilada (csp 1000mL)
Preparación de EDTA 0,5M

Disolver 93.05 g de EDTA en 300mL de agua destilada. Una vez disuelto, completar
con agua destilada (ccp 500mL)
Preparación de NaCl 1M
Disolver 29.22 g de NaCl en 300 mL de agua destilada. Una vez disuelto, Completar
con agua destilada (csp 500mL)
8
Preparación de sucrosa 1M
Disolver 171.15 g de sucrosa (sacarosa) en 300ml de agua destilada. Una vez disuelto,
agregar agua destilada (csp 500mL)
Preparación del buffer de lisis

Mezclar 5 ml de NaCl (1 M), 5 ml de Sucrosa (1 M), 5 ml de Tris (1 M), 5 ml de EDTA
(0,5 M) y 2,5 ml de SDS (10 %). Agregar agua destilada (csp 30mL)
Preparación de la mezcla alcohol:fenol:cloroformo

Mezclar 25 mL de fenol saturado en Tris con 24 mL de cloroformo y 1 mL de alcohol
isoamílico.
Se pueden preparar volúmenes mayores respetando dicha proporción.
Preparación del buffer TE

Mezclar 5mL de Tris 1M y 1mL de EDTA 0,5M. Agregar agua destilada (csp
500mL). Mexclar y ajustar el pH a 8 agregando NaOH o HCl gota a gota.
Autoclavar y preservar refrigerado.
MATERIALES (para electroforesis en gel de agarosa)

 Muestra de ADN purificado
 Tubo Ependorff con buffer para muestras 6X
 Parafilm
 Gel de agarosa 1% con colorante
 Sistema de electroforesis
 Fuente de poder
 Buffer TAE
 Marcador de peso molecular para ADN
 Transiluminador
PROCEDIMIENTO
Preparación del buffer TAE 50X

Combinar 242,28 g de Tris con 18,61 g de EDTA disódico. Disolver en 750 mL de agua
destilada. Agregar 57.1 mL de ácido acético glacial. Mezclar y agregar agua (csp
1000mL).
8
Preparación del gel de agarosa 1% con colorante:

En un matraz Erlenmeyer, colocar 1 mL de buffer TAE 50X y 49 mL de agua destilada.
Se obtiene buffer TAE 1X. Pesar 0.5 g de agarosa. Disolver la agarosa en el buffer TAE.
Calentar sin llevar a ebullición hasta su completa disolución. Dejar atemperar un poco
(pero no dejar que solidifique), agregar unas gotas de colorante y verter el contenido en la
base para preparar el gel.Colocar el peine para la formación de pocillos y dejar
polimerizar.
Preparación del buffer para muestras 6X

Pesar en la balanza analítica 0.025 g de azul de bromofenol; 0.025 g de xileno cianol y 3 g
de glicerol. Mezclar los materiales previamente pesados.Agregar agua destilada (csp 10
mL). Mezclar y almacenar.
MATERIALES (para PCR)
 Buffer para PCR 10X

 MgCl2
 ADN molde
 Primers
 Taq polimerasa
 Tubos para PCR
 Tubos Epebdorff 1.5mL
 Termociclador
 Vortex
 Centrífuga
PROCEDIMIENTO
El equipo técnico colocará todos los materiales necesarios en la mesa del docente
8
INTRODUCCIÓN
PRÁCTICA N° 14
Métodos de extracción del ADN, Reacción de Cadena de la Polimerasa y

electroforesis en gel de agarosa
El descubrimiento del ADN y la elaboración y refinamiento de técnicas para el estudio del ADN han
permitido grandes avances en el conocimiento del ADN y el análisis de su secuencia con fines de
investigación y de conocer, entre otros, las causas genéticas y moleculares de ciertas patologías. Dichas
técnicas han mostrado ser bastante versátiles, teniendo aplicación en investigación, diagnóstico, ingeniería
genética, análisis forense, entre otros.
Competencias
1. Extraer ADN utilizando el método del fenol:cloroformo:alcohol isoamílico a partir de un
homogenizado
2. Realizar la migración de una muestra de ADN en gel de agarosa
3. Reconocer la Reacción de Cadena de la Polimerasa, identificar sus componentes y etapas
Fundamento teórico
 Extracción de ADN
Se basa en la separación del ADN de los demás componentes de la célula. Para ello, primero se requiere de
una etapa de lisis para liberar el contenido de la célula y del núcleo celular, Luego, se agrega una mezcla de
fenol:cloroformmo:alcohol isoamílico para la formación de dos fases :una superior (acuosa) y una inferior
(orgánica). Los componentes de la célula se separan en dichas fases, donde el ADN está en la fase acuosa y
las proteínas y los lípidos en la fase orgánica. Luego, el ADN de la fase acuosa se recupera por precipitación
con etanol.
 Electroforesis en gel de agarosa
Se basa en la separación de moléculas (ADN) por acción de un campo eléctrico en un gel según su tamaño,
su peso y su carga. Las moléculas de ADN tienen carga negativa, por lo tanto, se desplazarán hacia el polo
positivo. En su estructura, el gel de agarosa tiene poros. Las moléculas más grandes tendrán mayor dificultad
para pasar por los poros, por lo tanto, van a migrar más lento y no avanzarán una gran distancia. Por otro
lado, las moléculas más pequeñas pasarán a través de los poros con mayor facilidad y migrarán más rápido,
por lo tanto, recorrerán una distancia mayor.
 Reacción en cadena de la polimersa (PCR) (sólo demostrativo)
Consiste en la producción de un gran número de copias (amplificación) de un determinado fragmento de

ADN (ADN molde). Dicho fragmento es delimitado por los primers o cebadores y es copiado por la
polimerasa. Este proceso se da en tres etapas:
1. La desnaturalización (95oC), durante la cual se separan las cadenas de ADN

2. Hibridación, anillamiento o annealing (55 – 65oC), durante la cual los primers se unen al ADN molde
3. Elongación (72oC), durante la cual la ADN polimerasa extiende los primers agregando uno a uno los
nucleótidos. Así se sintetiza la nueva cadena de ADN.
8

PRÁCTICAS
Parte experimental
a. Extracción de ADN
1. Colocar la muestra en buffer de lisis y realizar el homogenizado. De ser necesario, tomar sólo una
alícuota de la muestra para la extracción de ADN.
2. Agregar a la muestra la mezcla fenol:cloroformo:alcohol isoamílico. Se agrega el mismo
volumen de mezcla que de muestra
3. Mezclar con ayuda del vortex
4. Centrifugar a 15000g por 1 min. Se observa la formación de dos fases: una superior (acuosa) que
contiene el ADN y otra inferior (orgánica) que contiene lípidos y proteínas
5. Recuperar la fase acuosa en un tubo nuevo
6. Agregar etanol a -20oC. El volumen de etanol a agregar debe ser el doble que el volumen de la muestra.
7. Incubar a -20oC por 30 min
8. Centrifugar a 15000g por 5 min
9. Eliminar el sobrenadante. El precipitado es el ADN
10. Resuspender el precipitado con etanol
11. Agitar con el vortex
12. Incubar a -20oC por 30 min
13. Centrifugar a 15000g por 5 min
14. Eliminar el sobrenadante. El precipitado es el ADN
15. Resuspender el precipitado con buffer TE
16. Medir la concentración del ADN
b. Electroforesis en gel de agarosa

1. Colocar el gel de agarosa en el sistema para electroforesis
2. Retirar el peine (si lo tiene)
3. Agregar buffer TAE 1X hasta que cubra el gel y el nivel de buffer quede aproximadamente 0.5 cm por
encima del gel. Dejar que el buffer entre a los pocillos y los llene
4. Medir la concentración de ADN en la muestra
5. Si es necesario, diluir la muestra con buffer TE
6. Sobre el parafilm, o en un tubo Ependorff 0.5 mL, agregar 1 l de la muestra y 5 L del buffer
para cargar muestras 6X
7. Cargar las muestras y el marcador de peso molecular para ADN en los pocillos del gel
8. Colocar la tapa al sistema
9. Encender la fuente de poder
10. Configurar el voltaje constante a 90 V
11. Comenzar la migración
12. Verificar el avance del frente de migración
13. Detener la migración cuando el frente de migración esté cercano al final del gel
14. Apagar la fuente de poder
15. Retirar la tapa del sistema
16. Retirar el gel y tomar una imagen del gel con un transiluminador
9
c. PCR (sólo demostrativo)
1. Descongelar los materiales y reactivos

2. Mezclar con el vortex y dar una breve centrifugación
3. Preparar las pre-mezclas (materiales comunes a todos los tubos excepto la ADN polimerasa)
4. Mezclar y distribuir las pre-mezclas en los tubos para PCR
5. Agregar en cada tubo los elementos faltantes. La enzima se agrega al último
6. Mezclar y dar una breve centrifugación
7. Colocar en el termociclador
8. Cerrar la tapa del termociclador
9. Programar, en el termociclador, los ciclos de temperatura para cada etapa de la PCR
10. Comenzar el programa
11. Al final, verificar la obtención del producto esperado por ejemplo por electroforesis en gel de agarosa
9

EXPERIENCIA PRÁCTICA MÉTODOS DE EXTRACCIÓN DEL ADN,
REACCIÓN DE CADENA DE LA POLIMERASA Y ELECTROFORESIS
EN GEL DE AGAROSA
INTRODUCCIÓN
OBJETIVOS
RESULTADOS
DISCUSIÓN
CONCLUSIONES
9

PRÁCTICA
parcial incorrecta
incorrecta

9
REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS
OBLIGATORIAS
Bittencourt, J. (2018). The Power of Carbohydrates, Proteins, and Lipids. Disponible en:
https://www.researchgate.net/publication/322473648
Macías Alvia, A., Hurtado Astudillo, J. R., Cedeño Holguín, D. M., Cedeño Holguín, F. A., Scott ÁLava,
M., Vallejo Valdivieso, P. A., Macías Alvia, M. J., Santana Sornoza, J. W., Espinoza Macías, M. J.,
Ubillús Saltos, S. P., Arteaga Espinoza, S. X., Torres Macías, O. E., Pigüave Reyes, J. M., Pigüave
Reyes, Chavarría Cedeño, D. I., & Intriago Sánchez, K. J. (2018). Introducción al estudio de la
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Salazar, J., Salazar, Y. y Sotelo, J. (2021). Manual de prácticas de Bioquímica. Universidad

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Cuadros Trillos, G. (2019). Mapas conceptuales en bioquímica.

http://elibro.net.cientifica.remotexs.co/en/lc/ucsur/titulos/128368
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https://elibro.net/es/ereader/ucsur/127790
Müller-Esterl, W. (2020). Bioquímica: fundamentos para medicina y ciencias de la vida.

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Bioquímica de Laguna y Piña (7.a ed.). Editorial El Manual Moderno.
Pulido Villamil, X. C. (2019). Prácticas de bioquímica y estudios de casos en ciencias de la salud.

Simes, L. E. (2020). Introducción a la bioquímica: interpretación de análisis clínicos.

94

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Manual de Práctica de Bioquímica

Normas generales para el curso 4

Normas para el estudiante del curso de bioquímica en la

Práctica 2. Determinación de proteínas plasmáticas 15

Práctica 3. Determinación sérica de urea 20

Práctica 4. Factores que afectan la actividad enzimática 24

Práctica 5. Técnicas básicas de identificación de biomoléculas 31

Práctica 6. Efecto del ayuno en el glucógeno hepático 38

Práctica 7. Digestión enzimática del almidón 43

Práctica 8. Desnaturalización de proteínas y SDS-PAGE 49

Práctica 9. Cálculo del balance energético 55

Práctica 10. Hidrólisis de lípidos 64

Práctica 11. Determinación de triglicéridos y colesterol en plasma.

Práctica 12. Dosaje de Hormonas 76

Práctica 13. Extracción de pigmentos vegetales y aceites esenciales 81

Práctica 14. Métodos de Extracción del ADN, PCR y electroforesis 86

La enseñanza de la bioquímica es teórico-práctica, los conocimientos a nivel práctico se

NORMAS GENERALES PARA EL ESTUDIANTE DEL CURSO DE

1. Llegar puntual a las prácticas (tolerancia 5 minutos).

NORMAS PARA EL ESTUDIANTE DEL CURSO DE BIOQUÍMICA EN

MEDIDAS DE SEGURIDAD EN EL LABORATORIO

b) Comportamiento de los alumnos durante las prácticas

experimentos sólo se realizan con autorización del profesor. Los experimentos

2. ELEMENTOS DE PROTECCIÓN PERSONAL Y DE LOS EQUIPOS

2. Los estudiantes vestirán sus mandiles antes de ingresar al Laboratorio y dejarán

b) Lentes de seguridad y respiradores

1. Se debe usar lentes de seguridad cuando sea necesario proteger la cara de

2. En la parte lateral central del Laboratorio se encuentra la duchaespañola, la

d) Botiquín de primeros auxilios

I. MATERIALES EN LA MESA DE LOS ESTUDIANTES

II. MATERIALES EN LA MESA CENTRAL DEL PROFESOR

 01 solución de azul de metileno 1mg/dL frasco 100 mL

 Solución azul de metileno 1mg/Dl

c Concentración del absorbente

es directamente proporcional a la concentración del soluto.

La preparación de una curva de calibración se realiza utilizando concentraciones conocidas de la

INSTRUCCIONES PARA EL DESARROLLO DE LA

Preparación de una curva de calibración

Solución de azul de metileno 1mg/Dl 1 Ml

Luego, se procederá a realizar lecturas en el espectrofotómetro a las siguientes longitudes de onda:

Preparar el experimento de la siguiente manera

Ml Azul de metileno 0.5 1 2 3 4

INSTRUCCIONES PARA EL DESARROLLO DE LOS INFORMES DE

Apellidos Nombres N° Mesa Fecha

CRITERIOS QUE SE TOMARÁN EN CUENTA PARA LA EVALUACIÓN DE LOS INFORMES DE

3-4 puntos 1-2 puntos 0 puntos

2-3 puntos 1 puntos 0 puntos

DETERMINACIÓN DE PROTEÍNAS PLASMÁTICAS

I. MATERIALES EN LA MESA DE LOS ESTUDIANTES

II. MATERIALES EN LA MESA CENTRAL DEL PROFESOR

 01 suero sanguíneo tubo con tapa rosca 1Ml

El personal técnico colocará en las mesas TODO el material requerido.

DETERMINACIÓN DE PROTEÍNAS PLASMÁTICAS

INSTRUCCIONES PARA EL DESARROLLO DE LAS EXPERIENCIAS

Determinación de proteínas plasmáticas total por el Método de Biuret

Preparar los siguientes medios de reacción:

Agua destilada (µL) 50 - -

La albúmina reacciona con el bromo cresoldulfonftaleína a Ph 3.8 formando un compuesto coloreado

Suero o plasma (µL) - 10 -

INSTRUCCIONES PARA EL DESARROLLO DEL INFORME DE LA