Tema 7 – Técnicas de valoración de la hemostasia y la coagulación

1. Hemostasia

> El conjunto de procesos que tienen por objetivo detener una hemorragia se denomina
hemostasia y se desarrolla en distintas fases:
× Vasoconstricción total → el primer paso es la vasoconstricción del vaso lesionado para
reducir el flujo de sangre, limitando su pérdida.
× Formación de un agregado plaquetario → las plaquetas se unen y forman un agregado
que tapona rápidamente la zona lesionada.
× Formación del coágulo → el agregado se transforma en un coágulo gracias a la
transformación del fibrinógeno en fibrina.

2. Hemostasia secundaria o coagulación

> Hemostasia secundaria o coagulación → proceso enzimático en cadena que conduce a un cambio de estado
físico del plasma.
> Cambio debido a que una proteína soluble (fibrinógeno) se transforma en insoluble (fibrina) y se estructura en
forma de red, consolidando el agregado plaquetario y originando el coágulo.
> Intervienen dos tipos se proteínas:
× Procoagulantes o factores de la coagulación → que estimulan la formación del coágulo.
× Anticoagulantes → que actúa como reguladoras para evitar un exceso de coagulación.

2.1. Fases de la hemostasia secundaria

a) La visión clásica: la cascada de coagulación

> En los años sesenta se propuso un modelo de reacciones con una activación
secuencial de factores plasmáticos de coagulación, que da como resultado la
activación de una enzima llamada trombina, que cataliza la transformación de
fibrinógeno en fibrina.
> Los factores plasmáticos de coagulación son proteínas procoagulantes que
circulan inactivas en el plasma y que se activan durante el proceso de
coagulación.
> Se identificaron dos vías para esta activación → la extrínseca y la intrínseca, con una vía común final.

Tipo Factores Vía

II (trombina) Común
VII Extrínseca
Proteasas IX Intrínseca
zimógenos de
serina X Común
XI Intrínseca
XII Intrínseca
V Común
Cofactores VIII Intrínseca
III (factor tisular, FT) Extrínseca
Fibrinógeno I Común
Transglutaminasa XIII (factor estabilizante de la fibrina) Común

 La vía intrínseca
> La vía intrínseca se descubrió al observar que la sangre coagulaba por sí misma al contactar con un
tubo de vidrio.
> En vivo se inicia cuando la sangre contacta con superficies de carga negativa que quedan expuestas
debido a una lesión endotelial; en esta situación, el factor XII se une al colágeno expuesto y se produce
su activación.
> En la activación del factor XII unido al colágeno intervienen dos proteínas:
× Precalicreína (PK).
× Quininógeno de alto peso molecular (QAPM, o HMWK en la terminología inglesa).
> La unión de estas dos proteínas al factor XII origina el complejo de iniciación.
> Seguidamente, el factor XIIa junto al HMWK y calcio iónico, activan el factor XI que, a su vez, activa al
IX en presencia de calcio iónico.
1
 > El calcio iónico se denomina también factor IV.
> El paso siguiente es la activación del factor X, que es una reacción que se produce en las dos vías,
pero que se activa por distintos mecanismos. En la vía intrínseca, la reacción está catalizada por el
factor IXa, y requiere la presencia de fosfolípidos (PL), calcio iónico y el factor VIII activado.

 La vía extrínseca
> La vía extrínseca se inicia cuando se produce una lesión en la pared vascular que provoca la
exposición de células no vasculares.
> Estas células presentan una glicoproteína transmembrana llamada factor tisular (TF) o factor III.
> La presencia de factor tisular activa el factor VII, que a su vez activa al factor X.
> Por su parte, el factor VIIa también activa el factor IX (vía intrínseca), lo cual supone un punto de cruce
entre ambas vías.

 La vía común
> Las dos vías convergen en la activación del factor X a Xa. El factor Xa hidroliza y activa la protrombina
(factor I) a trombina (factor Ia).
> La trombina es la molécula clave del proceso trombótico, con múltiples acciones:
× Convertir el fibrinógeno (factor II) en fibrina (factor IIa).
× Activar el factor XIII a XIIIa, que estabiliza la malla de fibrina, estableciendo enlaces entrecruzados
entre los polímeros de fibrina y solidificando así el coágulo.
× Estimular la activación del factor XI y de los factores VIII y V, lo cual ayuda a amplificar la cascada.
× Inhibir la fibrinolisis. En presencia de la trombomodulina, una glicoproteína presente en el endotelio
vascular, activa al TAFI (inhibidor de la fibrinolisis activado por trombina).
× Activar la proteína C, también en presencia de trombomodulina.
× Promover la liberación de t-PA (activador tisular del plasminógeno).

b) Actividades de la trombina

2
2.2. Control de la coagulación. Inhibidores

> La cascada de coagulación se va amplificando ya que se va retroalimentando, y es necesario que haya

mecanismos que la regulen y eviten un exceso de formación de trombina y la posible oclusión del flujo
sanguíneo.
> Para llevar a cabo esta regulación existen sistemas fisiológicos inhibidores que modulan la producción y la
actividad de la trombina.
> La antitrombina (AT, antes denominada antitrombina III) es el inhibidor de la coagulación más importante.
> La actividad inhibidora de la AT afecta fundamentalmente a las enzimas IIa, Xa y IXa.

Inhibidores
de la
coagulación

2.3. La fibrinolisis

> Fibrinolisis → proceso mediante el cual se degrada el coágulo, una vez reparada la lesión.
> El sistema fibrinolítico está constituido por plasminógeno que por acción de un activador se transforma en
plasmina, que degrada fibrina y activa enzimas que degradan la matriz extracelular.
> Los activadores más importantes son el u-PA (activador tipo urokinasa) y el t-PA (activador tisular del
plasminógeno).
> Por su parte, el PAI-1 (inhibidor del activador del plasminógeo-1) es el principal inhibidor de la fibrinólisis;
actúa a dos niveles:
× Inhibe a los activadores (u-PA y t-PA).
× Activa a la alfa 2-antiplasmina o inhibidor de la plasmina → la alfa 2-antiplasmina es el principal
inhibidor de la plasmina y actúa sobre el FXIIa, FXIa, trombina y calicreína.

Regulación de
la fibrinolisis

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3. Patologías asociadas a la hemostasia secundaria

3.1. Alteraciones hemorrágicas

> Se deben a una insuficiente coagulación, lo que hace que cualquier pequeña lesión provoque una hemorragia
que el organismo es incapaz de contener. La causa de estas alteraciones puede ser congénita o adquirida.

a) Alteraciones hemorrágicas congénitas: hemofilias

> Las hemofilias son el grupo clínicamente más destacado de enfermedades debidas a defectos congénitos
de factores con actividad coagulante.
> La hemofilia A afecta a la fracción coagulante del factor VIII.
> La hemofilia B, al factor IX.
> Ambas se trasmiten de forma recesiva ligadas al cromosoma X.

b) Alteraciones hemorrágicas adquiridas

 Déficit de vitamina K
> Es imprescindible para la síntesis de los factores II, VII, IX y X y proteínas C y S.
> La carencia de esta vitamina, por ingestión de ciertos fármacos o por malabsorción, provoca
alteraciones en todos estos compuestos dependientes de vitamina K. El tratamiento consiste en la
administración de vitamina K.
 Coagulación intravascular diseminada
> La coagulación intravascular diseminada o CID es un síndrome en el cual se produce coagulación
dentro de los vasos, con formación de depósitos de fibrina y una reacción de hiperfibrinolisis
secundaria que conduce al consumo de varios factores, por lo que también se denomina coagulopatía
de consumo.
 Hepatopatías
> Muchos de los factores, cofactores y reguladores de la coagulación se sintetizan en el hígado. Por
tanto, una patología hepática puede provocar un fallo de la coagulación a distintos niveles. Además, en
el hígado se produce la síntesis y degradación de componentes del sistema fibrinolítico, lo que produce
unas alteraciones complejas y difíciles de tratar.

3.2. Alteraciones trombóticas

> La hipercoagulabilidad de la sangre puede dar lugar a la formación de coágulos que permanecen adheridos a
los vasos sanguíneos (trombos arteriales y venosos), pero que también pueden desprenderse y ser
arrastrados por la corriente sanguínea (émbolos).
> Los trombos reducen la luz del vaso sanguíneo, lo cual dificulta la circulación.
> La trombosis venosa afecta con mucha frecuencia al sistema venoso profundo de las extremidades y puede
provocar embolismo pulmonar con una elevada morbimortalidad.
> Los émbolos, por su parte, pueden quedar atrapados en vasos pequeños y obstruirlos, causando una
embolia. El cuadro clínico que se derivará dependerá de la zona afectada, es decir, de la zona que se quede
sin irrigación.
> Los factores de riesgo que predisponen a alteraciones trombóticas son la inmovilización de las extremidades
inferiores, la cirugía, el síndrome antifosfolípido, el cáncer, los anticonceptivos orales, el tratamiento hormonal
sustitutorio y otros.
> El tratamiento farmacológico de la trombosis se basa en la administración de fármacos fibrinolíticos y
anticoagulantes y tiene como objetivo disolver la fibrina, restaurando el flujo de un vaso (arterial o venoso)
ocluido por un trombo recientemente.

a) Trombofilia
> En algunos casos, los factores de riesgo son familiares y a menudo se presentan trombosis recurrentes en
localizaciones atípicas, edades precoces y sin factores desencadenantes.
> Las personas que tienen esta predisposición genética (familiar) a desarrollar trombosis se dice que tienen
trombofilia hereditaria.
> Puede también existir una predisposición adquirida a la hipercoagulabilidad, por ejemplo, en pacientes
oncológicos y con trastornos autoinmunes.
> La trombofilia implica un desequilibrio entre la formación y la destrucción de fibrina. Esto puede ser debido
a la alteración de algún sistema inhibidor de la coagulación o al exceso de algún factor procoagulante.
> El tratamiento de los pacientes con trombofilia requiere, en ocasiones, una profilaxis con anticoagulantes
(antivitamina K y heparinas).
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 b) Síndrome antifosfolípido (SAF)
> El SAF es una trombofilia adquirida caracterizada por la presencia de autoanticuerpos dirigidos contra
fosfolípidos y glicoproteínas asociadas.
> Uno de los criterios diagnósticos del SAF es la presencia de anticoagulante lúpico (AL), así llamado por su
capacidad in vitro de alargar los tiempos de coagulación de las técnicas que requieren fosfolípidos.
> A pesar de su nombre («anticoagulante»), no implica un riesgo elevado de hemorragias, sino que se
asocia a una formación excesiva de coágulos sanguíneos.

4. Técnicas de estudio de la coagulación

> En la obtención de muestras de sangre para el estudio de la coagulación, la extracción debe ser limpia y los
tubos deben ser de cristal.
> El anticoagulante adecuado es el citrato sódico en proporción 1:9 (tubos de tapón azul). La mezcla de la sangre
con el anticoagulante debe realizarse inmediatamente por inversión suave.
> También se deben adoptar precauciones en el transporte: la sangre se debe mantener a una temperatura de
entre 5ºC y 20ºC.
> La centrifugación para obtener PPP (plasma pobre en plaquetas) debe realizarse lo antes posible. A veces es
preciso usar doble centrifugación para evitar la contaminación plaquetaria.
> Finalmente, la determinación analítica debe hacerse en un plazo breve para evitar que se deterioren los factores
de la coagulación. Si las muestras no pueden ser procesadas en este periodo, el PPP debe ser congelado.

4.1. Métodos manuales

> Las pruebas de coagulación manual se realizan mejor en tubos de ensayo de vidrio.
> El tamaño conveniente es de 75 mm × 10 mm (tubos de hemolisis) y es preferible, en la medida de lo posible,
no reutilizar estos tubos.
> Debido a las muchas variables y posibles fuentes de contaminación asociadas con las técnicas manuales,
estas pruebas se deben hacer por duplicado.
> En cualquier caso, si los tiempos de coagulación de las pruebas por duplicado difieren en más del 10%, la
prueba se debe repetir.
> La técnica manual más utilizada es la técnica del tubo inclinado. Es una prueba cronométrica en la que se
detecta visualmente la formación del coágulo de fibrina.
> Requiere un baño de agua a 37ºC y en su realización es importante tener en cuenta los siguientes aspectos:
× Los reactivos y el plasma se deben precalentar en el baño a 37°C durante al menos cinco minutos antes
de usarlos en pruebas de coagulación.
× En el caso de los reactivos, se calienta solo una alícuota proporcional al volumen total que se va a usar en
el conjunto de pruebas, ya que ciclos de calentamiento y enfriamiento sucesivos hacen que los reactivos
pierdan actividad.
× Del plasma, se dispensa el volumen requerido para una prueba individual en tantos tubos como pruebas
se vayan a realizar.
× En el momento en que se añade al tubo de hemolisis con el plasma precalentado, el reactivo que
desencadena la coagulación, se pone en marcha simultáneamente un cronómetro.
× El plasma y el reactivo se deben mezclar inmediatamente, agitando el tubo de hemolisis de manera rápida
y controlada 1-2 segundos sin sacarlo del baño de agua.
× El tubo con la mezcla se mantiene dentro del baño hasta que falten 3-5 segundos para el tiempo normal
de coagulación de la prueba que se esté realizando.
× A partir de ese momento, cogiendo el tubo por la parte superior, se inicia un movimiento continuo de
vaivén, con una inclinación máxima del tubo de aproximadamente 90º y una
frecuencia de alrededor de una inclinación por segundo.
× Durante este movimiento hay que procurar que el tubo se mantenga dentro del
agua del baño el mayor tiempo posible para que la temperatura de la reacción se
mantenga lo más próxima posible a 37ºC.
× Una vez iniciado el movimiento de vaivén, hay que visualizar atentamente la
mezcla de reacción para detectar la formación del coágulo de fibrina. Inicialmente,
la mezcla líquida se desliza ligeramente por las paredes del tubo al inclinarlo.
× Al formarse el coágulo, se observa un enturbiamiento y la solidificación de la
mezcla. Simultáneamente a la detección visual del coágulo se detiene el
cronómetro y se anota el tiempo de coagulación.
× Es conveniente que el baño esté bien iluminado bajo una lámpara de luz blanca o
similar.
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4.2. Sistemas automatizados

> La automatización es la forma de trabajo habitual en casi todo el mundo para los estudios de coagulación.
> Contribuye a mejorar la estandarización y la simplificación de pruebas que requieren una capacitación
específica, de manera que los laboratorios pueden mejorar su eficiencia y la variedad de pruebas que
ofrecen.
> Por otra parte, las pruebas de coagulación manuales presentan coeficientes de variación muy altos por lo
que, deben hacerse siempre por duplicado.
> Los equipos automatizados mejoran la precisión y la exactitud, lo cual permite realizar pruebas únicas, sin
duplicar, y reduce los costes.

a) Características de los equipos de coagulación automatizados

> En el mercado actual existen soluciones automatizadas para la realización de técnicas de coagulación que
se adaptan a cualquier laboratorio de hematología, independientemente del volumen de muestras que se
procesen.
> Estas soluciones abarcan desde pequeños coagulómetros de sobremesa, basados en una única
tecnología, diseñados para la realización semiautomática de las pruebas básicas, hasta grandes
autoanalizadores de coagulación totalmente automatizados, que engloban y combinan varias tecnologías y
permiten la realización de un amplio panel de pruebas.
> Los autoanalizadores de coagulación automatizados presentan las siguientes características:
× Trabajan con tubos cerrados primarios, que se introducen y almacenan directamente en el equipo,
obteniendo alícuotas de plasma mediante muestreadores automáticos que perforan el tapón y aspiran
la muestra. Esta característica es importante en relación con la bioseguridad, ya que reduce la
posibilidad de exposición del operador a aerosoles o derrames de las muestras.
× Tienen unidades refrigeradas para preservar la integridad de las muestras almacenadas y de los
reactivos.
× La identificación de las muestras se realiza mediante códigos de barras o matrices de puntos.
× Incorporan la función de «urgencia», para el análisis inmediato de las muestras urgentes.
× Realizan de manera automatizada las pruebas programadas y presentan los resultados mediante
informes diferenciados para el operador y para el solicitante. Los informes para el operador incluyen las
gráficas o curvas de formación del coágulo o las curvas de monitorización de la reacción, dependiendo
de la tecnología empleada.
× Almacenan los resultados, incluidas las gráficas, permitiendo la consulta, comparación y evolución de
muestras y pacientes.
× Disponen de programas integrados de control de calidad que gestionan este aspecto fundamental de
cualquier técnica.
× Tienen un sistema de alarmas para alertar al operador de posibles incidencias, como:
» Indicador de muestras → advierte sobre problemas referidos a la integridad de la muestra.
» Sensor de nivel de líquido → advierte de que el volumen disponible de muestra es insuficiente
para realizar la prueba.
» Control del volumen de los reactivos → advierte si la cantidad de reactivo resulta insuficiente
para las pruebas programadas.
× Permiten programar repeticiones o diluciones, o bien hacer pruebas adicionales en función de los
resultados.
> Los diferentes equipos se diferencian, entre otras cosas, por las tecnologías que emplean y por su
capacidad de trabajo y en concreto, por:
× Su capacidad de almacenamiento de muestras → indica el número máximo de muestras que
pueden cargarse en el analizador en cualquier momento.
× Su capacidad de procesamiento → se refiere a la cantidad de pruebas que el analizador puede
realizar en un determinado tiempo (número de pruebas/hora).
> Todos los equipos requieren un mantenimiento técnico regular, capacitación permanente para manejarlos
y un sistema de control.

b) Principios que aplican los sistemas automatizados

 Métodos electromagnéticos
> Se basan en la detección del aumento de la viscosidad del plasma que se produce a raíz de la
formación de fibrina en él.
> Actualmente, se aplican dos variantes de este principio. En ambos casos se usa una esfera de acero
inoxidable, que se coloca dentro de una cubeta que contiene la muestra de plasma en la que se realiza
la prueba.

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 > En la primera variante se aplica un campo electromagnético a la cubeta, de manera que la esfera
adquiere un movimiento pendular, balanceándose de un lado a otro. Una vez que está en marcha, se
dispensa en la cubeta el reactivo desencadenante de la coagulación y se activa un cronómetro.
> En un principio, la esfera se mueve libremente, inmersa en la mezcla líquida de reacción, pero a
medida que se forma fibrina aumenta la viscosidad del medio y los movimientos de la esfera se van
retardando, hasta detenerse por completo. Finalmente, la bola acaba englobada en el coágulo de
fibrina.
> Cuando el movimiento oscilatorio disminuye hasta un nivel predeterminado, se detiene el cronómetro y
se obtiene así el tiempo de coagulación del plasma.
> En la segunda variante, la esfera se coloca en una localización determinada en el fondo de la cubeta,
mientras que la cubeta se hace girar continuamente por un mecanismo de rodillos. El cronómetro se
pone en marcha al dispensar el reactivo que desencadena la
coagulación.
> Un sensor magnético detecta la posición de la esfera, que será
fija mientras la mezcla de reacción esté fluida.
> Cuando se forma fibrina, el coágulo captura la esfera y la
desplaza de su posición original debido al giro de la cubeta; una
vez que la esfera queda fuera del alcance del sensor, el circuito
se interrumpe y se detiene el cronómetro.
 Métodos ópticos y espectrofotométricos
> Fotoóptico
× Los sistemas ópticos se basan en el principio de que la formación del coágulo genera un cambio en
la densidad óptica del plasma.
× A medida que se forma el coágulo, se producen cambios en las características ópticas respecto de
la lectura inicial de la mezcla de reacción (plasma + reactivos):
» Inicialmente, durante la activación de los factores de coagulación, la mezcla de reacción no
experimenta cambios de absorbancia.
» En una segunda fase de fibrinoformación, el fibrinógeno se transforma en fibrina y la densidad
óptica de la mezcla aumenta rápidamente.
» Finalmente, tiene lugar la estabilización del coágulo, con cambios mínimos en la absorbancia.
× La monitorización en el tiempo de estos cambios se traduce en una curva de formación del coágulo
o curva coagulométrica.
> Inmunológico o inmunoturbidimétrico
× Estas técnicas se basan en el uso de micropartículas de látex recubiertas con un anticuerpo
específico dirigido contra el factor o inhibidor concreto que se desea evaluar.
× Cuando el antígeno (es decir, el factor o inhibidor que se desea evaluar) está presente en la
muestra, se adhiere al anticuerpo específico que está fijado sobre las microesferas y estas se
aglutinan, lo cual hace que aumente la turbidez del medio.
× La reacción se valora midiendo la variación de la absorbancia que se produce: cuanto más antígeno
hay en la muestra, más complejos antígeno-anticuerpo se forman, más aglutinación se produce y,
en consecuencia, más aumenta la absorbancia.
× Con esta metodología, la variación de la absorbancia en el tiempo origina una gráfica curva
cóncava.

5. Valoración de la hemostasia secundaria

5.1. Tiempos globales de coagulación

> Se valoran tres parámetros:

× Tiempo de protrombina (TP) → mide la eficacia global de la vía extrínseca.
× Tiempo de tromboplastina parcial activada (TPPA) → mide la eficacia global de la vía intrínseca.
× Tiempo de trombina (TT) → valora la fase común.

a) Tiempo de protrombina (TP)

> El TP valora globalmente el funcionamiento de la vía extrínseca de la coagulación. Estudia los factores V,
VII y X y, en menor medida, el factor II (protrombina). En consecuencia, el TP se alargará en casos de:
× Deficiencias congénitas de los factores implicados.
× Deficiencia factorial adquirida (déficit de síntesis). Dado que todos los factores implicados son de
síntesis hepática, el TP es una prueba útil en el estudio de la insuficiencia hepática.
× Coagulación intravascular diseminada (CID), debido al consumo de factores.
> El TP, además, es una técnica muy sensible a la anticoagulación oral con fármacos antivitamina K, ya que
los factores II, VII y X son vitamina K dependientes, por lo que se usa para el control de esta terapia.
7
 > Fundamento
× La prueba consiste en activar la vía extrínseca de la coagulación mediante un reactivo denominado
tromboplastina cálcica, que contiene factor tisular (activa el factor VII), fosfolípidos y cloruro cálcico
(necesarios en varios pasos de la vía) y medir el tiempo que tarda en formarse el coágulo de fibrina.
> Procedimiento manual
× Pipetear 0,1 ml de plasma en un tubo de hemolisis e incubarlo en un baño a 37ºC durante dos minutos.
× Añadir 0,2 ml del reactivo de tromboplastina, precalentado a 37 ºC. Simultáneamente, poner en marcha
un cronómetro.
× Seguir el procedimiento descrito en la técnica manual del tubo inclinado (agitación rápida, tiempo de
espera y movimiento de vaivén), parar el cronómetro al detectar la formación del coágulo y registrar el
tiempo de coagulación.
× Repetir la prueba.
× Anotar los dos resultados, en segundos. Los tiempos de coagulación duplicados no deben diferir entre
sí en más del 10%.
× El resultado de la prueba se podría reportar solo en segundos, pero eso supone un problema de
interpretación, puesto que las tromboplastinas de los diferentes fabricantes tienen distintas
sensibilidades y eso se traduce en variaciones del valor normal de hasta dos segundos (el tiempo de
protrombina normal suele oscilar entre 11 y 13 segundos).
× Para evitar este problema y poder comparar resultados, el TP en segundos de la muestra problema se
acompaña de uno de los siguientes valores:
» El TP en segundos de un plasma control comercial o de un pool de plasmas normales y el cociente
(ratio) entre ambos tiempos. El valor normal de la ratio es de 0,8 a 1,2.
» Porcentaje de actividad de protrombina.
 Para calcularlo hay que elaborar una curva de calibración de protrombina o curva de actividad.
Para ello se prepara una batería de diluciones a partir de un plasma control normal comercial o
de un pool de plasmas normales (20 plasmas mínimo).
 El plasma control sin diluir se considera el 100% de actividad. Las diluciones deben incluir los
valores de actividad de 75%, 50%, 33%, 25% y 10%. Cada dilución se somete a la prueba del
tiempo de protrombina (por duplicado) y con los tiempos obtenidos y las actividades
correspondientes se construye en papel milimetrado la curva de actividad de la protrombina.
 Los tiempos obtenidos con las muestras problema se interpolan en la curva de calibración para
calcular los porcentajes de actividad. La curva de calibración hay que realizarla cada vez que se
cambie de lote de tromboplastina.

b) Tiempo de tromboplastina parcial activada (TTPA)

> La prueba de TTPA (o APTT en la terminología inglesa) explora las vías intrínseca y común de la
coagulación. Cuando se ha obtenido un TP normal, el TTPA resulta una prueba de despistaje útil para
detectar la deficiencia de los factores VIII, IX, XI y XII.
> Al igual que ocurre con el TP, el resultado de la prueba TTPA se expresa en segundos y en forma de ratio,
relacionando el TTPA del paciente con el TTPA de referencia (plasma control o pool de plasmas). Los
valores normales de esta ratio se encuentran entre 0,8 y 1,2.
> El TTPA aumenta ante:
× Deficiencia de proteínas (PKK y HMWK) y factores de la vía intrínseca (XII, XI, IX y VIII).
× Deficiencia de factores de la vía común (V, X, II y, en menor medida, de fibrinógeno).
× Exceso de inhibidores fisiológicos de la coagulación.
× Presencia de anticoagulante lúpico.
× Presencia de inhibidores terapéuticos de la coagulación, como heparinas.
> Fundamento
× La prueba se basa en activar por contacto el factor XII con caolín, sílice o ácido elágico. El reactivo
activador contiene también fosfolípidos, como la cefalina, que son necesarios en varios pasos del
proceso de coagulación.
× El reactivo se incuba con el plasma un tiempo suficiente para garantizar la activación completa del
factor XII y, a continuación, se dispara la cascada de reacciones enzimáticas, recalcificando la mezcla
de reacción por adición de cloruro cálcico.
> Procedimiento manual
× Preparar un tubo con cloruro cálcico 25 mM y otro con reactivo TTPA y ponerlos en un baño a 37 °C,
de manera que estén a esta temperatura cuando se realicen las pruebas (mínimo cinco minutos antes).
× Pipetear 0,1 ml de plasma en un tubo de hemolisis e incubarlo en un baño a 37 ºC durante dos
minutos.
× Pipetear en el tubo 0,1 ml de reactivo de TTPA precalentado y agitar para mezclar bien con el plasma.
× Incubar el tubo con la mezcla en el baño a 37 ºC durante el tiempo recomendado por el fabricante del
reactivo (generalmente entre dos y cinco minutos).

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 × Añadir 0,1 ml de cloruro cálcico precalentado al tubo de reacción y, simultáneamente, poner en marcha
un cronómetro.
× Seguir el procedimiento descrito en la técnica manual del tubo inclinado (agitación rápida, tiempo de
espera y movimiento de vaivén), parar el cronómetro al detectar la formación del coágulo y registrar el
tiempo de coagulación.
× Repetir la prueba.
× Anotar los dos resultados, en segundos. Los tiempos de coagulación duplicados no deben diferir entre
sí en más del 10%.
× La prueba se realiza también con un plasma control comercial o un pool de plasmas normales. El
resultado se informa como tiempo en segundos de la muestra problema, tiempo en segundos del
control y ratio entre ambos.

c) Tiempo de trombina (TT)

> El tiempo de trombina explora la fase final de la vía común de la coagulación, valorando la reacción de
fibrinoformación por la acción directa de la trombina sobre el fibrinógeno.
> Se prolonga cuando:
× El nivel de fibrinógeno es muy bajo (inferior a 1,0 g/l).
× El fibrinógeno es anormal en términos cualitativos (disfibrinogenemia), lo que incluye tanto defectos
congénitos cuanto adquiridos como consecuencia de una enfermedad hepática.
× En presencia de heparina y de anticoagulantes similares a la heparina. La heparina se une a la
antitrombina y potencia su acción inhibidora de la trombina.
× En presencia de otros inhibidores, como por ejemplo, los productos de degradación de fibrina y
fibrinógeno (PDF).
> Fundamento
× La prueba se basa en inducir la coagulación del plasma con trombina (factor IIa) diluida con solución
salina a baja concentración.
> Procedimiento manual
× Pipetear 0,2 ml de plasma en un tubo de hemolisis de vidrio e incubar dos minutos a 37 ºC.
× Añadir 0,2 ml de solución de trombina a 37 ºC y poner en marcha un cronómetro.
× Seguir el procedimiento descrito en la técnica manual del tubo inclinado. Parar el cronómetro al
detectar la formación del coágulo y registrar el tiempo de coagulación.
× Repetir la prueba.
× Anotar los dos resultados, en segundos. Los tiempos de coagulación duplicados no deben diferir entre
sí en más del 10%.

5.2. Factores de coagulación

> Los resultados de algunas de las pruebas anteriores son indicativos de una posible alteración en los factores
de coagulación.
> Para confirmarlo se realiza la determinación de factores de la vía extrínseca, de la vía intrínseca, o del factor
XIII, según corresponda.

a) Factores de la vía extrínseca

> La determinación de los factores II, V, VII y X suele realizarse por técnicas coagulativas que miden la
actividad del factor mediante un tiempo de protrombina modificado.
> El plasma problema se mezcla con un plasma comercial que contiene todos los factores excepto el factor
en estudio. De esta forma se insensibiliza la técnica a los factores que no son de interés (si el plasma
problema es deficitario en otro factor, el déficit queda neutralizado por el plasma comercial, que lo contiene
en exceso) y se sensibiliza al factor que se va a medir (ya que la única fuente del factor en estudio en la
mezcla es el plasma problema).
> El ensayo consiste en mezclar a partes iguales el plasma comercial carente del factor y una dilución
tamponada 1/10 del plasma problema y medir el tiempo de protrombina de la mezcla resultante.
> La técnica manual se realiza mediante el método del tubo inclinado y la técnica automatizada mediante
método coagulométrico con detección fotoóptica.
> En ambos casos, para transformar el tiempo de protrombina en segundos en actividad del factor se
requiere una curva de calibración, que se obtiene a partir de diluciones seriadas de un plasma de
referencia con una actividad conocida del factor en UI/ml, que se considera que corresponde a una
actividad del 100%.
> Cada dilución del plasma de referencia se trata como si fuese un plasma problema y con los tiempos
obtenidos y la concentración del factor en UI/ml de cada dilución (o los porcentajes de actividad) se
obtiene la curva de calibración.

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 > Los tiempos obtenidos con las muestras problema se extrapolan en la curva de calibración y se traducen
en concentración del factor en estudio o en porcentaje de actividad de ese factor.

b) Factores de la vía intrínseca

> Los estudios para la determinación de los factores de la vía intrínseca (VIII, IX, XI, y XII) son semejantes a
los que aplican para el estudio de la vía extrínseca, pero utilizando el tiempo de tromboplastina parcial
activada (TTPA), en lugar del tiempo de protrombina.
> En las hemofilias por defecto de factores VIII (hemofilia A) y IX (hemofilia B) el nivel del factor es tan
importante a nivel pronóstico, que hay que usar curvas apropiadas y calibradores con garantías.
> En los coagulómetros automatizados, el método de elección para determinar el factor VIII es el método de
sustratos cromogénicos.
> La prueba se desarrolla en dos fases:
× Mezcla de una dilución del plasma problema con un reactivo que aporta factor IXa, factor X, fosfolípido
y calcio. En consecuencia, la única fuente de factor VIII es el plasma problema. Durante la incubación
de esta mezcla se genera una cantidad de factor Xa proporcional a la de factor VIII.
× Medición de la actividad del factor Xa generado sobre un sustrato cromogénico.

c) Factor XIII
> Es el único factor que no se detecta a partir de los tiempos generales de rutina que hemos estudiado
previamente. Ya que es el factor estabilizante de la fibrina, tradicionalmente los estudios se realizaban
valorando la solubilidad del coágulo.
> Este procedimiento consta de dos fases:
× Coagulación del PPP, que se provoca mediante recalcificación con cloruro cálcico y una incubación
durante una hora para que el coágulo se estabilice.
× Tratar el coágulo con una solución de urea 5 M o de monocloroacético al 1% e incubar. En déficits
pronunciados de factor XIII, el coágulo no resiste esta incubación y se observa cómo disminuye de
tamaño o se fragmenta. Si tras 24 horas el coágulo se mantiene, el resultado se considera normal.

5.3. Control de los tratamientos anticoagulantes

a) Anticoagulantes orales
> Los anticoagulantes orales antivitamina K tienen una acción variable en cada paciente y su actividad se
ve influida por numerosas circunstancias, como el metabolismo del paciente o la medicación que esté
tomando. Por lo que necesitan un control de su actividad, que se realiza mediante el tiempo de
protrombina (TP).
> Pero los reactivos de tromboplastina existentes en el mercado poseen diferente sensibilidad al defecto de
factores de coagulación dependientes de la vitamina K, lo cual hace que se produzca una variabilidad en
los resultados que dificulta el seguimiento de la actividad y la comparación de los valores obtenidos.
> Para definir los márgenes terapéuticos de los anticoagulantes orales y poder comparar los resultados entre
diferentes laboratorios y países se definió una ratio internacional normalizada denominada INR
(International Normalized Ratio), que estandariza los valores obtenidos a través del tiempo de protrombina.
> Cada fabricante asigna un valor de ISI (índice de sensibilidad internacional) a las tromboplastinas que
comercializa. El ISI compara la sensibilidad de la tromboplastina comercializada con la que tiene una
tromboplastina de referencia de la OMS. Es recomendable usar tromboplastinas con un ISI próximo a 1.
> INR se calcula dividiendo el tiempo de protrombina del plasma del paciente por el tiempo de protrombina
de un plasma control, y elevando el resultado al valor de ISI de la tromboplastina usada.
> El rango de INR normal para una persona sana está entre 0,9 y 1,3 y para personas que siguen
tratamiento con anticoagulantes orales, entre 2 y 3,5 dependiendo de la patología. Un nivel elevado indica
que existe riesgo de hemorragias, mientras que un nivel bajo indica riesgo de formación de coágulos.

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