TEMA 3.

FOTOLUMINISCENCIA MOLECULAR
Métodos luminiscentes moleculares: fluorescencia, fosforescencia y quimioluminiscencia son
métodos ópticos en los que las moléculas de analito se excitan para dar una especie cuyo
espectro de emisión suministra información para el análisis cualitativo y cuantitativo.
La fluorescencia y fosforescencia se parecen en que la excitación se consigue por absorción de
fotones, a ambas se les denomina fotoluminiscencia.
Las transiciones energéticas electrónicas que causan la fluorescencia no cambian el espín del
electrón, por ello, los estados excitados en los que hay fluorescencia presentan vida corta
(<10-5s); al contrario, las emisiones de fosforescencia están acompañadas por un cambio en el
espín del electrón y los tiempos de vida de los estados excitados son mucho más largos, del
orden de segundos o incluso minutos.
Un tercer tipo de luminiscencia es la quimioluminiscencia que se basa en la radiación que emite
una especie excitada que se forma durante una reacción química. A veces, la especie excitada es
el producto de una reacción entre el analito y un reactivo (generalmente un oxidante fuerte
como el ozono o el peróxido de hidrógeno). El resultado es un espectro de emisión característico
del producto de oxidación del analito o del reactivo, en lugar del espectro del analito. En otros
casos el analito no participa directamente en la reacción.
La medición de la intensidad de la fotoluminiscencia o de la quimioluminiscencia permite la
determinación cuantitativa de una variedad de especies inorgánicas y orgánicas cuando están
presentes en cantidades de trazas.
Los métodos luminiscentes presentan una alta sensibilidad, con límites de detección que suelen
ser de 1 a 3 ordenes de magnitud inferiores a los encontrados en la espectroscopía de absorción.
Otra ventajas son sus amplios intervalos de linealidad.
Debido a su sensibilidad suelen sufrir serios efectos de interferencias por la matriz, por eso se
suelen combinar con técnicas de separación cromatográficas y electroforesis.

3.1. TEORÍA DE LA FLUORESCENCIA Y DE LA FOSFORESCENCIA

Radiación de resonancia o fluorescencia de resonancia: es un tipo de fluorescencia en la cual la
radiación absorbida se vuelve a emitir sin cambio de frecuencia. Por ejemplo, los electrones 3s
de los átomos de Na vaporizados pueden excitarse para pasar al estado 3p cuando absorben
radiación de longitudes de onda de 589.6 y 589.0 nm, despues de 10-8 s, los electrones vuelven al
estado fundamental y emiten radiación de esas dos mismas longitudes de onda en todas las
direcciones.
Desplazamiento Stokes: muchas especies moleculares también muestran fluorescencia de
resonancia, pero lo más frecuente es encontrar bandas de fluorescencia o de fosforescencia
molecular centradas en longitudes de onda más largas que la línea de resonancia. Este
desplazamiento hacia longitudes de onda más largas, o menores energías, se denomina
desplazamiento Stoke.

1
3.1.1. ESTADOS EXCITADOS QUE PRODUCEN FLUORESCENCIA Y FOSFORESCENCIA
Espín del electrón
El principio de exclusión de Pauli establece que no haya más de dos electrones en un orbital y,
además, sus espines deben ser opuestos. Cuando esto ocurre, se dice que sus espines están
apareados. Debido al apareamiento de los espines, la mayoría de las moléculas no presenta un
cambio magnético neto, se dice que son diamagnéticas, no son atraídas ni repelidas por campos
magnéticos estáticos. Por el contrario, los radicales libres que contienen electrones
desapareados poseen un momento magnético, los atrae un campo magnético. Se dice que los
radicales libres son paramagnéticos.

Estados excitados singulete/triplete

Se llama estado singulete a un estado electrónico de una molécula en el cual todos los espines de
los electrones se aparean y cuando la molécula se expone a un campo magnético no se produce
una división de niveles energéticos.
Por otro lado, el estado fundamental de un radical libre es un estado doblete, hay dos
orientaciones posibles que puede tomar el electrón impar en un campo magnético,
proporcionando ligeras diferencias de energía al sistema.
Cuando uno de los electrones de una molécula se excita y pasa a un nivel de energía superior, se
forma un estado singulete o triplete excitado. En el estado singulete excitado, el espín del
electrón promovido continúa emparejado con el electrón del estado fundamental. En el estado
triplete excitado, sin embargo, los espines de los dos electrones ya no forman una pareja y son
paralelos, tienen la misma dirección.
El estado triplete excitado es menos energético que el correspondiente singulete excitado.
Las propiedades de una molécula en cada estado difieren, por ejemplo, una molécula es
paramagnética en el estado triplete y diamagnética en el singulete. Una transición de singulete a
triplete, o viceversa, que también implica un cambio en el estado electrónico, es un suceso
menos probable que la correspondiente transición singulete a singulete. Por tanto, el tiempo de
vida promedio de un estado triplete excitado puede variar desde 10-4 hasta varios segundos,
mientras que el tiempo de vida medio para un estado singulete excitado es de 10-8 s. Además es
baja la probabilidad de que ocurra la excitación inducida por radiación de una molécula en
estado fundamental ha estado triplete excitado. En ciertas moléculas, un estado triplete excitado
puede poblarse a partir de un singlete excitado, con frecuencia la emisión de fosforescencia es el
resultado de dicho proceso.

La figura muestra los estados electrónicos del espín de moléculas. En a) se ilustra el estado
electrónico fundamental, es el estado energético más bajo, donde los espines siempre están
apareados, se dice que el estado es singulete. En b) y c) se muestran los estados electrónicos
excitados. Si los espines siguen apareados en el estado excitado la molécula está en un estado
singulete excitado (b). Si los espines ya no están apareados, la molécula está en un estado
triplete excitado (c).

2
Diagramas de nivel de energía para las moléculas fotoluminiscentes MIRAR LIBRO

3.1.2. VELOCIDADES DE ABSORCIÓN Y DE EMISIÓN

La velocidad a la cual se absorbe un fotón de radiación es enorme, su valor es del orden de 10-14
a 10-15 s. Por otro lado, la emisión fluorescente se produce a una velocidad más baja. La
fluorescencia se presenta en 10-5 a 10-10 s. La velocidad promedio de una transición triplete a
singulete es menor que la transición singulete a singulete. Entonces, para que haya emisión
fosforescente se requieren tiempos comprendidos entre 10-4 y 10 s o más.

3.1.3. PROCESOS DE DESACTIVACIÓN

Una molécula excitada puede volver a su estado fundamental mediante una combinación de
etapas mecánicas. El mejor camino hacia el estado fundamental es el que minimiza el tiempo de
vida del estado excitado. Si la desactivación por fluorescencia es más rápida que los procesos no
radiantes, se observa tal emisión. Si una trayectoria no radiante tiene una constante de velocidad
más favorable, la fluorescencia desaparece o es menos intensa.
La fotoluminiscencia se limita a sistemas con características estructurales y ambientales que
hacen que la velocidad de los procesos de relajación o desactivación no radiantes disminuya
hasta que el proceso de emisión pueda competir cinéticamente con ellos.

Relajación vibracional
Una molécula puede promocionarse a cualquiera de los niveles vibracionales durante el proceso
de excitación electrónico. Sin embargo, en disolución, el exceso de energía vibracional se pierde
como consecuencia de las colisiones entre las moléculas de las especies excitadas y las del
disolvente; el resultado es una transferencia de emergía y un incremento minúsculo de la T del
disolvente. Este proceso de relajación es tan eficaz que el tiempo de vida medio de una molécula
excitada vibracionalmente es de 10-12 s o menos. La fluorescencia de la disolución siempre
incluye una transición desde el nivel vibracional más bajo de un estado electrónico excitado. Sin
embargo, se producen varios picos muy próximos ya que el electrón puede volver a cualquiera
de los niveles vibracionales del estado fundamental.
Una consecuencia de la eficacia de la relajación vibracional es que la banda de fluorescencia para
una transición electrónica dada, se desplaza hacia frecuencias más bajas o longitudes de onda
más largas respecto a la banda de absorción (desplazamiento Stokes).

Conversión interna
El término conversión interna describe los procesos intermoleculares por los cuales la molécula
pasa a un estado electrónico de más baja energía sin emitir radiación
La conversión interna es un cruce entre dos estados de la misma multiplicidad (singulete-
singulete o triplete-triplete). Es eficaz cuando dos niveles de energía electrónicos están lo
suficientemente próximos para que haya un traspase de los niveles de energía vibracional.
La conversión interna puede también dar lugar a la predisociación: el electrón se mueve desde
un estado electrónico más alto hacia un nivel vibracional superior de un estado electrónico más
bajo, en el que la energía vibracional es lo suficientemente grande como para provocar la ruptura
de un enlace; puede ser consecuencia de la absorción por un cromóforo, seguida de la
conversión interna de la energía electrónica a energía vibracional asociada con el enlace débil.

3
La predisociación debe distinguirse de la disociación ya que, en esta última, la radiación
absorbida excita al electrón de un cromóforo para que llegue a un nivel vibracional
suficientemente alto y así producir la ruptura del enlace del cromóforo. En este caso no
interviene la conversión interna.

Conversión externa
La desactivación de un estado electrónico excitado puede implicar la interacción y la
transferencia de energía entre la molécula excitada y el disolvente u otros solutos. Este proceso
se llama conversión externa. El disolvente ejerce un fuerte efecto sobre la intensidad de
fluorescencia de la mayoría de las especies. Los detalles de los procesos de conversión externa
no se conocen bien.

Cruce entre sistemas

Es un proceso en el cual hay un cruce entre estados electrónicos de multiplicidad distinta. El más
común es del estado singulete al triplete (S1 T1). Al igual que con la conversión interna, la
probabilidad del cruce entre sistemas aumenta si los niveles vibraciones de los dos estados se
superponen.
El cruce entre sistemas es más común en moléculas que contienen átomos pesados, como el
yodo o el bromo. Las interacciones espín-orbital aumentan en presencia de tales átomos y se
favorece un cambio en el espin. La presencia de especies paramagnéticas, como el oxígeno
molecular, en la solución también favorece el cruce entre sistemas y por tanto disminuye la
fluorescencia.

Fosforescencia
También puede causar la desactivación de estados electrónicos excitados. Después del cruce
entre sistemas para lograr un estado triplete excitado, la desactivación posterior puede ocurrir
por conversión interna, externa o por fosforescencia.
Las conversiones externas e internas compiten con tanto éxito con la fosforescencia que este
tipo de emisión se observa sólo a bajas temperaturas, en medios altamente viscosos o por
moléculas que están adsorbidas sobre superficies sólidas.

3.1.4. VARIABLES QUE AFECTAN A LA FLUORESCENCIA Y A LA FOSFORESCENCIA

Tanto la estructura molecular como el entorno químico determinan que una sustancia sea o no
luminiscente. Estos factores también determinan la intensidad de emisión cuando ocurre la
luminiscencia.

Rendimiento cuántico
El rendimiento cuántico o la eficacia cuántica de la fluorescencia o la fosforescencia, es la
relación entre la cantidad de moléculas que manifiestan luminiscencia y el número total de
moléculas excitadas. En el caso de una molécula muy fluorescente como la fluoresceína, la
eficacia cuántica, en determinadas condiciones, se aproxima a la unidad. Las especies químicas
que no presentan fluorescencia apreciable tienen eficacias que se aproximan a cero. (LIBRO
ECUACIONES)

4
Tipos de transiciones en fluorescencia
La fluorescencia rara vez es consecuencia de la absorción de radiación ultravioleta de longitud de
onda menor a 250 nm, porque tal radiación es suficientemente energética como para desactivar
los estados excitados por predisociación o disociación.
Una molécula excitada electrónicamente normalmente regresa a su estado excitado más bajo
mediante una serie de relajaciones vibraciones rápidas y conversiones internas que no producen
emisión de radiación. Por tanto, la fluorescencia surge más comúnmente a partir de una
transición desde el nivel vibracional más bajo del primer estado electrónico excitado a uno de los
niveles vibracionales del estado electrónico fundamental.

Eficacia cuántica y tipo de transición

Empíricamente se observa que la fluorescencia se encuentra con más frecuencia en los
compuestos en los que la transición de más baja energía es del tipo π  π* (π, estado singulete
excitado π*) que en compuestos en los que la transición de menor energía es del tipo n  π* (n,
estado singulete excitado π*); es decir, la eficacia cuántica es mayor para las transiciones π *  π.
La mayor eficacia cuántica asociada con el estado π, π* se puede explicar de dos maneras:
primero la absortividad molar de una transición π  π* es de 100 a 1000 veces superior que la de
un proceso n  π*, por tanto, el tiempo de vida inherente asociado con el estado π, π * es más
corto. Asimismo, el cruce entre sistemas es menos probable para estados excitados π, π* que
para estados n, π* porque la diferencia de energía entre los estados singulete y triplete es mayor
y el acoplamiento espín-orbital es menos probable.
En resumen, la fluorescencia se relaciona más con el estado π, π * porque tales estados excitados
manifiestan tiempos de vida relativamente cortos y por qué es menos probable que ocurran los
procesos de desactivación que compiten con la fluorescencia.

Fluorescencia y estructura
La fluorescencia más intensa y útil se encuentran los compuestos que contienen grupos
funcionales aromáticos con transiciones π  π* de baja energía. Los compuestos con grupos
carbonilo en estructuras alifáticas y alicíclicas o estructuras con dobles enlaces altamente
conjugados también presentan fluorescencia pero en menor cantidad.
La mayoría de los hidrocarburos aromáticos no sustituidos son fluorescentes en disolución. La
eficiencia cuántica aumenta de ordinario en relación con la cantidad de anillos y con su grado de
condensación. Heterocíclicos sencillos como la piridina, el furano, el tiofeno y el pirrol no
presentan fluorescencia. Por otro lado, las estructuras de anillo condensado por lo regular si son
fluorescentes.

Efecto de la rigidez estructural

Empíricamente se observa que la fluorescencia se ve particularmente favorecida en moléculas
que poseen estructuras rígidas. También se recurre a la rigidez estructural para explicar el au-
mento de fluorescencia de ciertos agentes quelantes orgánicos cuando forman un complejo con
un ion metálico.

Efectos de la temperatura y el disolvente

La eficacia cuántica de fluorescencia disminuye en la mayoría de las moléculas al subir la porque
al aumentar la frecuencia de las colisiones cuando la temperatura es elevada, aumentan la pro-
babilidad de desactivación por conversión externa. Una disminución en la viscosidad tiene el

5
mismo efecto. La fluorescencia de una molécula disminuye en presencia de disolventes que con-
tengan átomos pequeños o de solutos con dichos átomos en su estructura. Algunos ejemplos son
el tetrabromuro de carbono y el yoduro de etilo.

Efecto del pH en la fluorescencia

La fluorescencia de un compuesto aromático con sustituyentes ácidos o básicos en el anillo de-
pende normalmente del pH. La longitud de onda y la intensidad de emisión son diferentes para
las formas protonadas y no protonadas del compuesto. Los cambios en la emisión surgen del dis-
tinto número de especies resonantes asociadas con las formas ácidas y básicas de las moléculas.
Cuanto mayor es el número de formas resonantes, mayor es la estabilidad del primer estado ex-
citado, la consecuencia es una fluorescencia en la región ultravioleta.
La influencia del pH en la fluorescencia de ciertos compuestos se ha utilizado para la detección
de puntos finales en valoraciones ácido/base. Los procedimientos analíticos basados en las medi-
das de fluorescencia suelen requerir un control minucioso del pH.

Efecto del oxígeno disuelto

La presencia de oxígeno disuelto suele reducir la intensidad de fluorescencia de una disolución.
Este efecto puede ser el resultado de una oxidación de las especies fluorescentes inducida foto-
químicamente. La supresión (quenching) se presenta como consecuencia de las propiedades pa-
ramagnéticas del oxígeno molecular, que favorece el cruce entre sistemas y la conversión de mo-
léculas excitadas en el estado triplete. Otras especies paramagnéticas tienen el mismo efecto.

Efecto de la concentración en la intensidad de fluorescencia

La potencia de la emisión fluorescente F es proporcional a la potencia radiante del haz de excita-
ción absorbido por el sistema:
F= φf K’’ = K’(P0 – P)
Donde:
P0= potencia del haz que incide sobre la solución
P= su potencia después de atravesar una longitud b del medio
K’= cte de la eficacia cuántica de la fluorescencia de un sistema dado

Con el objetivo de relacionar F con la concentración c de la especie fluorescente, se escribe la ley

de Beer:
P0/P= 10-ebc

Donde e es la absortividad molar de las moléculas fluorescentes y ebc es la absorbancia A. Si se

sustituye en la primera ecuación:

F=K’· P0 (1-10-ebc)

Tras el desarrollo matemático, siempre que 2.303 ebc = A < 0.05, se puede escribir F=2.303 K’
ebcP0

O si P es cte, F=Kc
La representación gráfica de la potencia fluorescente de una disolución frente a la concentración
de las especies emisoras debería ser lineal a bajas concentraciones. Si c es elevada los términos
de mayor orden adquieren importancia y la linealidad se pierde.

6
Otros dos factores importantes son la autoamortiguación y autoabsorción. La autoamortiguación
es resultado de colisiones entre moléculas excitadas, se puede esperar que aumente con la con-
centración porque habrá más probabilidad de que haya colisiones. La autoabsorción tiene lugar
cuando la longitud de onda de emisión se solapa con un pico de absorción, la fluorescencia dis-
minuya. Los efectos de estos fenómenos pueden hacer que aparezca un máximo en la represen-
tación gráfica de la potencia fluorescente frente a la concentración.

Supresión (quenching) dinámica

El término supresión o amortiguamiento (quenching) se refiere a la transferencia de energía no
radiante desde una especie excitada hacia otras moléculas. La supresión o amortiguamiento di-
námico, también llamado supresión por colisiones, requiere el contacto entre la especie excitada
y el agente supresor. Este fenómeno se presenta con mucha rapidez, esta velocidad depende de
la temperatura y de la viscosidad.

Otros tipos de supresión

En el caso de supresión estática, el agente supresor y el fluoróforo en estado fundamental, for-
man un complejo llamado complejo oscuro.
En la supresión o amortiguamiento amplio o de Förster, la transferencia de energía ocurre sin
que choquen las moléculas. El acoplamiento dipolo-dipolo entre fluoróforo excitado y el agente
supresor explica la transferencia.

3.1.5. ESPECTROS DE EMISIÓN Y DE EXCITACIÓN

Los espectros de excitación se obtienen midiendo la intensidad luminiscente a una longitud de

onda fija mientras se varía la longitud de onda de excitación.
Un espectro de excitación es prácticamente igual a un espectro de absorción realizado bajo las
mismas condiciones. Los espectros de fluorescencia y de fosforescencia suponen la excitación a
una longitud de onda fija mientras se registra la intensidad d emisión como función de la longi-
tud de onda.
La fotoluminiscencia normalmente tiene lugar a longitudes de onda más largas que las longitudes
de onda de excitación. Las bandas fosforescentes se encuentras a longitudes de onda más largas
que las de fluorescencia. La diferencia de longitudes de onda entre los dos proporciona medida
útil de la diferencia de energía entre los estados excitados.

7
3.2. INSTRUMENTOS PARA MEDIR FLUORESCENCIA Y FOSFORESCENCIA

Los componentes de los instrumentos para la medida de la fotoluminiscencia son similares a los
de los fotómetros o espectrofotómetros UV/visible.

Casi todos los instrumentos de fluorescencia usan ópticas de doble haz, para compensar las fluc-
tuaciones en la potencia de la fuente. El haz de la muestra pasa por un filtro o monocromador
que transmite la radiación que causa la fluorescencia, pero excluye o limita la radiación de la lon-
gitud de onda de emisión de fluorescencia. La fluorescencia se emite desde la muestra en todas
las direcciones, pero lo más conveniente es observar la que forma un ángulo recto con el haz de
excitación.
La radiación emitida atraviesa un selector de longitud de onda de emisión (filtro o monocroma-
dor) que aísla la emisión de fluorescencia. La radiación aislada choca contra un fototransductor,
donde es transformada en una señal eléctrica para poderla medir.

El haz de referencia pasa a través de un atenuador que reduce su potencia a aproximadamente

la radiación fluorescente. El haz de referencia atenuado choca luego contra un segundo trans-
ductor y se convierte en una señal eléctrica. El equipo electrónico y un sistema de datos compu-
tarizados procesan las señales para calcular la relación entre la intensidad de la emisión fluores-
cente y la intensidad de la fuente de excitación, y producen el espectro resultante o los datos de
longitud de onda.

El instrumento es un fluorómetro si solo se utilizan filtros para seleccionar la longitud de onda.

Los espectrofluorómetros están equipados con dos monocromadores para aislar la longitud de
onda. Algunos instrumentos son híbridos porque usan un filtro para seleccionar la longitud de
onda de excitación y un monocromador para elegir la longitud de onda de emisión, a menudo se
les llama espectrofluorómetros. Se pueden comprar espectrofotómetros con adaptadores que
permiten su uso como espectrofluorómetros.

Los verdaderos espectrofluorómetros permiten la producción de un espectro de excitación de la

fluorescencia o un espectro de emisión de fluorescencia.

8
La selectividad que proporcionan los espectrofluorómetros es muy importante en investigacio-
nes relacionadas con características electrónicas y estructurales de las moléculas y valiosa en tra-
bajos analíticos cualitativos y cuantitativos. Para mediciones de concentración es suficiente con
un fluorómetro barato.

3.2.1. COMPONENTES DE LOS FLUORÓMETROS Y DE LOS ESPECTROFLUORÓMETROS

Fuentes
La magnitud de la señal de salida en las mediciones de luminiscencia y en la sensibilidad, es direc-
tamente proporcional a la potencia de la fuente radiante P0. Por ello, se usan fuentes más inten-
sas en los métodos luminiscentes y ya no las lámparas de tungsteno o deuterio que se emplea en
absorción.

a) Lámparas:
la más común para los fluorómetros de filtro es una de vapor de mercurio a baja presión equi-
pada con una ventana de sílice fundida. Produce líneas útiles para excitar la fluorescencia a varias
longitudes de onda. Las líneas individuales se pueden aislar con filtros de interferencia o absor-
ción adecuados. Al menos una de las líneas del mercurio suele resultar adecuada. Si se requiere
radiación continua se suele usar una lámpara de arco de xenón de alta presión.

b) Rayos láser:
se usan varios tipos como fuentes de excitación para medir la fotoluminiscencia. Son de especial
interés rayos láser sintonizables y de colorante que utilizan como sistema de bombeo un láser
pulsante de nitrógeno o un láser de granate de itrio-aluminio dopado con neodimio. Las fuentes
de rayos láser son más caras pero tienen importantes ventajas:
- cuando las muestras son muy pequeñas (de 1uL o menos)
- en los sensores de control remoto
- cuando se requiere una radiación de excitación altamente monocromática para reducir las in-
terferencias fluorescentes

Filtros y monocromadores
Tanto los filtros de interferencia como los de absorción se han usad en los fluorómetros para la
selección de la longitud de onda. La mayoría están equipados con al menos uno y a veces dos
monocromadores de red.

Transductores
Las señales de emisión de luminiscencia normalmente son de muy baja intensidad, se requieren
transductores sensibles. Los tubos fotomultiplicadores son los que más se utilizan en instrumen-
tos de fluorescencia sensibles. Funcionan en la modalidad de recuento de fotones para mejorar
la relación S/R; con este mismo fin a veces se refrigeran. En la espectrofluorometría también se
utilizan los dispositivos de transferencia de carga, como los de acoplamiento de carga.

Celdas y compartimentos para las celdas

Se usan tanto cilíndricas como rectangulares, con vidrio o sílice. Hay que tener cuidado en su di-
seño para reducir la cantidad de radiación dispersada que llega hasta el detector. A menudo se
introducen deflectores en el compartimento. Hay que evitar dejar huellas dactilares y cualquier
tipo de marca, la grasa de la piel suele fluorecer.

9
Organización de la información
Los instrumentos modernos para luminiscencia computacional poseen programas específicos
para manejar los datos. Algunas de sus opciones son la sustracción de la señal blanco, corrigen
espectros de excitación y de emisión, producción de gráficas tridimensionales de luminiscencia
total, cálculos de parámetros estadísticos, entre otros.

3.2.2. DISEÑOS DE INSTRUMENTOS

Fluorómetros
Los de filtro proporcionan una forma relativamente simple y barata de llevar a cabo análisis
cuantitativos por fluorescencia. Para seleccionar longitudes de onda se usan filtros de interferen-
cia y de absorción. Suelen ser compactos, robustos, y fáciles de usar.
En la figura se muestra al esquema de un FOM de filtros característico que utiliza una lámpara de
mercurio para excitarla fluorescencia y un par de tubos fotomultiplicadores como transductores.
El haz que sale de la fuente se divide en un haz de referencia y uno de muestra. El de referencia
se atenúa mediante el disco de apertura hasta que su intensidad sea aproximadamente el de
fluorescencia.
Ambos haces pasan a través del filtro primario y el de referencia se refleja hacia el tubo fotomul-
tiplicador de referencia. El de muestra se enfoca sobre la muestra mediante un par de lentes y
provoca la emisión de fluorescencia. La radiación emitida pasa a través de un segundo filtro que
posteriormente se enfoca sobre un segundo tubo fotomultiplicador.
Las señales de salida eléctricas se dirigen hacia un divisor analógico, para obtener la relación en-
tre las intensidades de la muestra y de referencia, que sirve como parámetro analítico.

Espectrofluorímetros
Utiliza dos monocromadores de red. La radiación del primer cromador se divide en dos, una
parte se dirige hacia el fotomultiplicador de referencia y la otra hacia la muestra. La radiación
fluorescente resultante, después de ser dispersada en el segundo monocromador, se detecta en
un segundo fotomultiplicador. Un instrumento como este suministra perfectamente espectros
válidos para el análisis cuantitativo. Los espectros de emisión obtenidos no son necesariamente
comparables con los de otros instrumentos, ya que la señal de salida, además de la intensidad de
fluorescencia, depende también de lámpara, monocromador… las características instrumentales
varían con la longitud de onda y difieren de un instrumento a otro. Existen métodos para obtener
el espectro corregido.

10
Espectrofluorímetros provistos de detectores en serie
Son espectrofluorímetros con dispositivos de transferencia de carga y diodos en serie que obtie-
nen el espectro de fluorescencia en fracciones de segundo. En su versión más sofisticada, a lo
largo de una cubeta de muestra se irradia un haz de excitación dispersado en el plano xy. El de-
tector s un dispositivo de acoplamiento de carga bidimensional que ve la radiación de excitación
dispersada en el plano xy y la dispersada en yz. Los espectros totales de este tipo se pueden ob-
tener en segundos o menos y son muy útiles en mezclas de especies fluorescentes.

Sensores de fluorescencia de fibra óptica

Se han usado para demostrar que se pueden llevar a cabo disantos análisis por fluorescencia en
posiciones muy alejadas de la fuente y del detector. La radiación viaja a través de una fibra óptica
y provoca fluorescencia en las disoluciones de la muestra. La emisión regresa por una segunda
fibra óptica al detector. Su aplicabilidad se ha extendido a analitos no fluorescentes mediante la
inmovilización de un material fluorescente indicador en el extremo de la fibra óptica.

Fosforímetros
Tienen similar diseño a los fluorómetros y espectrofluorímetros, solo difieren en que requieren
dos componentes adicionales. Uno es un dispositivo que irradia alternativamente en la muestra y
después de un tiempo mide la intensidad de fosforescencia. El retraso es necesario para diferen-
ciar la emisión fosforescente de larga vida de la de corta vida que podría originarse. Se usan dis-
positivos mecánicos y electrónicos y muchos instrumentos de fluorescencia tienen accesorios
para medidas de fosforescencia. Las medidas se suelen hacer a la T del nitrógeno líquido, para
prevenir la degradación de la señal de salida por desactivación ocasional.

Calibrado del instrumento

Debido a las variaciones de la intensidad de la fuente, de la sensibilidad del detector y de otras
variables, es imposible obtener exactamente las mismas lecturas de un día a otro para la misma
disolución. es una práctica habitual calibrar el instrumento y ajustarlo a un nivel de sensibilidad
reproducible. Se suele llevar a cabo con una disolución patrón de un fluoróforo estable, el más

11
común, sulfato de quinina 10-5M.

3.3. APLICACIONES DE LOS MÉTODOS FOTOLUMINISCENTES

Los métodos fluorescentes y fosforescentes tienen límites de detección más bajo (aplicables a in-
tervalos de concentración más bajos) que las mediciones espectrofotométricas de absorción. El
aumento de sensibilidad surge del hecho de que el parámetro relacionado con la concentración
en fluorometría y en fosforimetría, F, es directamente proporcional a la potencia de la fuente ra-
diante P0. La intensidad de la luminiscencia se puede medir en forma independiente de P 0. Por el
contrario, una medición de absorbancia requiere la evaluación de P0 y P ya que la absorbancia es
proporcional a la concentración y depende de estas dos cantidades. La sensibilidad de un mé-
todo fluorimétrico puede mejorar si aumenta P0 o mediante la amplificación adicional de la señal
de fluorescencia. En realidad la señal de luminiscencia no es cero cuando la concentración del
analito es cero; la luminiscencia de fondo y las señales provenientes de la dispersión y otros orí-
genes determinan los límites máximos de detección que se pueden lograr. En espectrofotometría
un aumento en P0 da lugar a un cambio proporcional en P, y por tanto, no afecta a la A. Por ello,
los métodos fluorimétricos tienen casi siempre límites de detección que son de uno a tres orde-
nes de magnitud superiores a los correspondientes a los procedimientos espectrofotométricos.
Por otro lado, la precisión y exactitud de los métodos luminiscentes son más bajas que las de los
espectrofotométricos; la precisión está limitada por el ruido fluctuante de la fuente y la deriva, la
exactitud por partículas presentes en la muestra que causan más fluorescencia o dispersión o
bien, que atenúen la fluorescencia del analito. En resumen, los métodos fosforescentes son me-
nos precisos que sus correspondientes de fluorescencia.
Los métodos luminiscentes también manifiestan mayor selectividad sobre los métodos de absor-
ción porque no muchas moléculas muestran luminiscencia importante cuando absorben radia-
ción y pueden variar las longitudes de onda de la excitación y de la emisión.

3.3.1. DETERMINACIÓN FLUOROMÉTRICA DE ESPECIES INORGÁNICAS

Los métodos inorgánicos fluorimétricos pueden ser de dos tipos, los métodos directos se forma
un quelato fluorescente y se mide su emisión y los que se basan en la disminución de la fluores-
cencia que resulta de la acción amortiguadora de la sustancia en estudio; esta última técnica se
emplea en determinación de aniones.

Cationes que forman quelatos fluorescentes

Existen dos factores que limitan el número de iones de metales de transición que forman quela-
tos fluorescentes. Por un lado, muchos de estos iones son paramagnéticos, lo cual aumenta su
velocidad de cruce entre sistemas hacia el estado triplete. Por tanto, la desactivación por fluores-
cencia es poco probable, aunque puede observarse fosforescencia.
Por otro lado, los complejos de metales de transición se caracterizan por presentar muchos nive-
les de energía poco espaciados por lo que aumenta la probabilidad de desactivación por conver-
sión interna. Por ello las principales aplicaciones inorgánicas de la fluorometría se reservan a los
metales que no son de transición, ya que son menos susceptibles a los procesos de desactiva-
ción, sus cationes son generalmente incoloros y tienden a formar quelatos que también lo son.
Entonces, la fluorimetría a menudo complementa a la espectrofotometría.

12
Reactivos fluorimétricos
Los de más éxito en el análisis de cationes son los que presentan estructuras aromáticas con dos
o más grupos funcionales donadores que facilitan la formación de quelatos con el ion metálico.

3.3.2. MÉTODOS PARA ESPECIES ORGÁNICAS Y BIOQUÍMICAS

Hay muchísimas aplicaciones en especies orgánicas y bioquímicas. Las aplicaciones más impor-
tantes se encuentran en alimentación, farmacia, muestras clínicas y productos naturales. La sen-
sibilidad y selectividad del método hacen que sea muy valiosa en esos campos. Una gran canti-
dad de compuestos importantes desde el punto de vista fisiológico manifiestan fluorescencia. Al-
gunos ejemplos son la cisteína, guanina, proteínas, naftoles, triptófano, etc.

3.3.3. MÉTODOS FOSFORIMÉTRICOS

Los métodos fosforescentes y fluorescentes tienden a ser complementarios, ya que los compues-
tos fuertemente fosforescentes presentan débil fluorescencia y viceversa. La fosforimetría se ha
utilizado para determinar una gran variedad de especies orgánicas y bioquímicas. El método no
ha alcanzado un uso tan extendido como la fluorimetría, por la necesidad de bajas T, y por peor
precisión de las medidas fosforescentes. Por otro lado, es atractiva la mayor selectividad poten-
cial de los métodos fosforescentes. Durante las últimas décadas, se ha dedicado bastante es-
fuerzo al desarrollo de métodos fosforimétricos que puedan hacerse a T ambiente.

Una primera opción se basa en el aumento observado en la fosforescencia de los compuestos ad-
sorbidos en la superficie de sólidos, como un filtro de papel: se dispersa la solución sobre el só-
lido y se evapora el disolvente; la matriz rígida minimiza las desactivaciones por amortiguación
colisional. La segunda opción supone la solubilización del analito en micelas de detergente, en
presencia de iones de metales pesados. Las micelas aumentan la proximidad entre los iones y el
fosforóforo.

3.3.4. DETECCIÓN DE FLUORESCENCIA EN CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA

Las medidas de fotoluminiscencia proporcionan un importante método para la detección y deter-

minación de los componentes de una muestra que eluyen de columnas cromatográficas o en
electroforesis capilar.

3.3.5. MEDICIÓN DEL TIEMPO DE VIDA

Proporciona información relacionada con los procesos de desactivación de colisiones, velocida-

des de transferencia de energía y reacciones de estados excitados. Desde el punto de vista analí-
tico, estas mediciones también se usan para proporcionar más selectividad en el análisis de mez-
clas que contienen especies luminiscentes.
Se aplican dos enfoques para medir el tiempo de vida:
- enfoque del dominio del tiempo: se utiliza una fuente pulsada y se mide el decaimiento de la
fluorescencia en función del tiempo
- enfoque del dominio de la frecuencia: se utiliza una fuente modulada de manera sinusoidal
para excitar a la muestra

13
El desfase y la desmodulación de la emisión de la fluorescencia respecto a la onda de excita-
ción proporcionan la información acerca del tiempo de vida; existen instrumentos para apli-
car ambas técnicas.

3.3.6. MÉTODOS DE IMÁGENES

Es posible combinar la espectroscopia de fluorescencia con la microscopía óptica para gene-

rar imágenes de fluoróforos presentes en matrices de complejos como células únicas. Los in-
dicadores fluorescentes se pueden aprovechar para demostrar hechos biológicos.
Un ejemplo es la sonda iónica que cambia su espectro de excitación o de emisión al unirse a
iones específicos como Ca2+ o Na+. Estos indicadores se usan para registrar fenómenos que
tienen lugar en las neuronas.

3.4. QUIMIOLUMINISCENCIA

La aplicación de la quimioluminiscencia en analítica es de desarrollo reciente. Las reaccions

que producen quimioluminiscencia son pocas. Algunos de los compuestos que reaccionan
dando quimioluminiscencia son componentes importantes del medio ambiente, para estos
casos, la alta selectividad, la sencillez, y la extrema sensibilidad del método son la causa de su
utilización creciente.

3.4.1. EL FENÓMENO DE LA QUIMIOLUMINISCENCIA

Se produce cuando una reacción química genera una especie electrónicamente excitada que
emite luz cuando vuelve al estado fundamental, o que transfiere su energía a otra especie
que, posteriormente, da lugar a emisión.
Las reacciones quimioluminiscencia se producen en varios sistemas biológicos, en los que el
proceso se denomina bioluminiscencia.

En la quimioluminiscencia, la intensidad de radiación I CL (fotones emitidos por segundo) de-

pende de la velocidad de reacción química (d[C]/dt) la eficacia cuántica de quimioluminiscen-
cia φCL (fotones emitidos por molécula que ha reaccionado). El último término es igual al pro-
ducto de la eficacia cuántica de excitación φEX (estados excitados por moléculas que han
reaccionado) y la eficacia cuántica de emisión φEM (fotones por estado excitado):

ICL = φCL · (d[C]/dt)= φEX · φEM · (d[C]/dt)

Los sistemas quimioluminiscentes útiles en análisis presentan valores de φ CL de 0.01 y 0.02.

3.4.2. MEDICIÓN DE LA QUIMIOLUMINISCENCIA

La instrumentación es sencilla y puede consistir en un recipiente de reacción adecuado y un

tubo fotomultiplicador. No es necesario seleccionar la longitud de onda ya que la única
fuente de radiación es la reacción química. La señal característica de un experimento es fun-
ción del tiempo alcanza rápidamente un máximo cuando la mezcla del analito y el reactivo es
completa, a continuación, la señal desciende de manera que se ajusta más o menos a una
función exponencial. Normalmente se integra la señal para un periodo de tiempo fijo y se

14
compara con patrones. Como medida alternativa se puede usar la atura de los picos. A me-
nudo se obtienen relaciones lineales entre señal y concentración.

3.4.3. APLICACIONES ANALÍTICAS DE LA QUIMIOLUMINISCENCIA

Los métodos quimio luminiscentes son muy sensibles porque en ausencia de ruido se pueden
realizar con bajos niveles de luz. Es y necesario atenuar la radiación mediante un filtro o un
monocromador. Los límites de detección vienen determinados por la pureza de los reactivos.
Los límites de detección característicos se encuentran dentro del intervalo de partes por bi-
llón o a partes por millón.

Análisis de gases
Los métodos quimioluminiscentes para analizar gases se originaron por la necesidad de en-
contrar medios muy sensibles para la determinación de contaminantes atmosféricos. Uno de
los más utilizados es la determinación de NO. Se arrastra de forma continua ozono desde un
electrogenerador y muestras de la atmósfera hacia el reactor. Se ha encontrado respuesta li-
neal desde 1 ppb a 10.000 ppm. Es el método más utilizado para la detección de este compo-
nente atmosférico. La reacción del NO también se usa para determinar otros óxidos de nitró-
geno, por ejemplo, en tubos de escape de automóviles. Otros métodos son el control del
ozono atmosférico (se basa en la luminiscencia producida cuando el ozono reacciona con el
colorante rodamina B) y la determinación de compuestos de S en la atmósfera (la muestra se
quema en llama de H para dar un dímero de S que se descompone emitiendo luz).

Análisis de especies inorgánicas en fase líquida

Muchos de los análisis llevados a cabo en fase líquida usan sustancias quimioluminiscentes
orgánicas con el grupo funcional -CO-NH-NHR. Reaccionan con el O2, con el H2O2, y con otros
agentes oxidantes fuertes dando lugar a un producto de oxidación quimioluminiscente. El lu-
minol es el ejemplo más común. Dentro de ciertos límites, la intensidad de quimioluminiscen-
cia del luminol es proporcional a la concentración del oxidante, del catalizador, o del luminol.
Puede ser un método sensible para determinar cualquiera de ellos.

Análisis de especies orgánicas

Para aumentar la selectividad de las reacciones quimioluminiscentes y ampliar la quimiolumi-
niscencia a analitos que no participan directamente en las reacciones quimioluminiscentes,
es común llevar a cabo una reacción enzimática, como etapa previa. El analito es el sustrato y
uno de los productos de la reacción enzimática se detecta por quimioluminiscencia. Este mé-
todo se suele realizar en sistemas de flujo con columnas rellenas de la enzima inmovilizada.

15