Determinación de bilirrubina.

I-Introducción

Se conoce como bilirrubina a un pigmento de origen biliar y tonalidad amarillenta que surge como
resultado de la descomposición de la hemoglobina. Se trata de una biomolécula nacida tras la rotura
de la membrana celular del eritrocito y la liberación de hemoglobina, que es fagocitada por los
macrófagos del organismo. Poco después, los macrófagos se encargan de liberar el hierro de la
hemoglobina, que queda almacenado en el hígado o es conducido hasta la médula ósea. Este
hierro se mantiene como reserva para casos de extrema necesidad. Los macrófagos de los tejidos
se encargan de transforman la porfirina de la hemoglobina en bilirrubina, la cual circula por
la sangre hasta el hígado. Con la acción de la bilis, la bilirrubina llega a degradarse.

Existen dos tipos de bilirrubina en la sangre:

 No conjugada (indirecta): la bilirrubina es insoluble en agua. Esta es la bilirrubina antes de
que pase por el hígado
 Conjugada (directa): la bilirrubina ha sido convertida en bilirrubina soluble en el hígado. A
continuación va a la bilis para ser almacenada en la vesícula biliar o enviada al intestino.
Los análisis de sangre rutinarios miden la bilirrubina total, suma de conjugada y no conjugada.

II-Uso clínico.

El examen de bilirrubina en sangre se usa para examinar la salud del hígado. También se usa
comúnmente para diagnosticar ictericia en recién nacidos. Muchos bebés saludables tienen ictericia
porque el hígado no ha madurado para eliminar suficiente bilirrubina. La ictericia en el recién nacido
suele ser inofensiva y se resuelve en pocas semanas. Pero en algunos casos, los niveles altos de
bilirrubina pueden causar daño cerebral. Por este motivo, esta prueba se hace comúnmente como
precaución en bebés.

III-Valores de referencia

 Bilirrubina en suero o plasma

- Adultos:
Directa: hasta 2 mg/l
Total: hasta 10 mg/l
- Recién nacidos:
Nacidos a término Prematuros
Sangre de cordón 25 mg/l
Hasta las 24 hs 60 mg/l 80 mg/l
Hasta las 48 hs 75 mg/l 120 mg/l
Del 3º al 5º día 120 mg/l 240 mg/l
Los valores comienzan luego a disminuir para alcanzar el nivel promedio del adulto al mes del
nacimiento. En los prematuros, los niveles de bilirrubina tardan más en alcanzar la normalidad,
dependiendo del grado de inmadurez hepática.

 Bilirrubina en líquido amniótico

Valores menores de 1 mg/l son considerados normales, mientras que entre 1 y 2,7 mg/l sugieren
la posibilidad de un feto afectado. Los niveles por encima de 2,7 mg/l sólo se encuentran en
presencia de eritroblastosis fetal. Si la cantidad de bilirrubina es superior a 4,7 mg/l el feto ya se
encuentra afectado y tiene probablemente algún tipo de falla circulatoria. Si la cantidad de bilirrubina
sobrepasa los 9,5 mg/l la muerte fetal es inminente.
Interpretación de la prueba
Hiperbilirrubinemia: aumento del nivel de bilirrubina en sangre por arriba de los valores normales.
Hipobilirrubinemia: disminución del nivel del bilirrubina en sangre por debajo de los valores
normales.
IV-Determinación de Bilirrubina en suero de niños en laboratorio privado
Determinar los niveles de bilirrubina en sangre, en niños, en un laboratorio privado.
 V-Metas Prácticas
 Tamaño de la muestra: se busca obtener suero de los pacientes de la manera más
simplificada y menos perjudicial para los mismos, y más aún si los pacientes son niños.
Por lo que sería necesario la extracción normal y usual de sangre y en cantidades
mínimas.

 Tiempo de ejecución: sería conveniente para el paciente que la determinación y

cuantificación del analito en cuestión sea llevado a cabo en el menor tiempo posible.

 Un periodo de acondicionamiento, familiarización, adaptación y entrenamiento previo del

operador con el método elegido sería de total necesidad para poder realizar
posteriormente de manera correcta el procedimiento de la determinación del fósforo.

 Sería beneficioso reducir al mínimo el costo de la ejecución del método candidato.

Metas Analíticas:
 La elección de un método que posea un rango analítico extenso, que incluya los valores
de referencia del analito, sería primordial para la determinación del mismo.

 Por lo que es de carácter significativo que el método para la evaluación del fósforo posea
una sensibilidad y especificidad analítica elevada.

Decisión médica del analito Error Total permitido (mg/dL)

(mg/dL)

Bilirrubina Total <2mg/dL 20% o 0,04mg/dL

 Métodos con valores bajos de desviación estándar (Sa) y de coeficientes de variación

(C.V %), lo que refleja un mayor grado de precisión; son indispensables para la evaluación del
fósforo. Tanto los ensayos de repetibilidad como de precisión intermedia son de utilidad para
desarrollar este parámetro.

Para la determinación del analito se realizó la búsqueda de diferentes métodos que cumplan con
los requisitos analíticos planteados.

1 Método para determinación de bilirrubina total espectrofotométricamente con ácido

sulfanilico diazotado.

 Fundamento
La bilirrubina se convierte en azobilirrubina mediante el ácido sulfanílico diazotado midiéndose
fotométricamente. De las dos fracciones presentes en suero, bilirrubin-glucurónido y bilirrubina libre
ligada a la albúmina, sólo la primera reacciona en medio acuoso (bilirrubina directa) precisando la
segunda la solubilización con dimetilsulfóxido (DMSO) para que reaccione (bilirrubina indirecta). En
la determinación de la bilirrubina indirecta se determina también la directa, correspondiendo el
resultado a la bilirrubina total. La intensidad del color formado es proporcional a la concentración de
bilirrubina presente en la muestra ensayada.
 Muestra
Suero o plasma libre de hemolisis (separado lo antes posible de los hematíes). Proteger de la
luz. Estabilidad de la muestra separada ya los hematíes: 4 dias a 2-8°C o 2 meses a -20°C.
Reactivos
R1 (D) Ácido Sulfanilico 30mmol/L
Ácido Clorhidrico 150mmol/L
R2 (T) Ácido Sulfanilico 30mmol/L
Ácido Clorhidrico 50mmol/L
Dimetilsulfoxido 7mol/L
R3 Sodio nitrito 29mmol/L
  Material adicional
- Espectrofotómetro o analizador para lecturas a 555 nm.
- Cubetas de 1,0 cm de paso de luz.
- Equipamiento habitual de laboratorio.

 Cálculos

- Con Calibrador:
(A)Muestra − (A)Blanco Muestra
× [Calibrador] = mg⁄dL de bilirrubina
(A)Calibrador − (A)Blanco Calibrador

- Con Factor:
[(A)Muestra − (A)Blanco Muestra] × Factor ∗ = mg⁄dL de bilirrubina

*Factor:
[Calibrador]
(A)Calibrador − (A)Blanco Calibrador

Factor de conversión: mg/dL x 17,1 = μmol/L.

 Rango de medida
Desde el límite de detección de (T) 0,00526 mg/dL (D) 0,07 mg/dL hasta el límite de linealidad de
18 mg/dL (T) y 20 mg/dL (D).
Si la concentración de la muestra es superior al límite de linealidad, diluir 1/2 con ClNa 9 g/L y
multiplicar el resultado final por 2.

 Precisión

 Sensibilidad analítica
1 mg/dL = 0,05074 A (T).
1 mg/dL = 0,06856 A (D).
Exactitud: Los reactivos SPINREACT no muestran diferencias sistemáticas significativas cuando
se comparan con otros reactivos comerciales.
Los resultados obtenidos con 50 muestras para Bilirrubina D fueron los siguientes:
Coeficiente de correlación (r)2: 0.96
Ecuación de la recta de regresión: y=0,71177x – 0,05267
Los resultados obtenidos con 50 muestras para Bilirrubina T fueron los siguientes:
Coeficiente de correlación (r)2: 0.991
Ecuación de la recta de regresión: y=0,82743x – 0,0382
Las características del método pueden variar según el analizador utilizado.
Interferencias
La presencia de hemólisis disminuye el valor de bilirrubina.
Se han descrito varias drogas y otras substancias que interfieren con la determinación de
bilirrubina.
 2 Método DPD para la determinación de bilirrubina total en suero o plasma

 Fundamento del método

La bilirrubina indirecta, unida a la albúmina, es liberada por un tensioactivo. La bilirrubina total
reacciona con la sal de diclorofenildiazonio (DPD) formando un azocompuesto de color rojo en
solución ácida.
 Muestra
Suero o plasma
a) Recolección: obtener de la manera habitual. Proteger de la luz natural o artificial envolviendo
el tubo con papel negro.
b) Aditivos: en caso de que la muestra sea plasma, debe usarse heparina o EDTA para su
obtención.
c) Sustancias interferentes conocidas: no se observan interferencias por hemólisis hasta una
concentración de hemoglobina de 500 mg/dl (0,5 g/dl) ni lipemia hasta una concentración de 500
mg/dl (5 g/l) de triglicéridos. No obstante, muestras hiperlipémicas o con hemólisis moderada
pueden conducir a resultados erróneos.
d) Estabilidad e instrucciones de almacenamiento: la muestra debe ser preferentemente fresca.
En caso de no efectuarse el ensayo en el momento, la muestra puede conservarse hasta 48 horas
en refrigerador (2-10oC).
La acción de la luz es capaz de destruir hasta un 50% de la bilirrubina presente en la muestra,
por lo que debe protegerse cuidadosamente.
 Material requerido (no provisto)
- Espectrofotómetro
- Micropipetas y pipetas para medir los volúmenes indicados
- Cronómetro
- Analizador automático
 Condiciones de reacción
- Longitud de onda: 546 nm (520 - 550 nm)
- Temperatura de reacción: 25oC (30oC o 37oC)
- Tiempo de reacción: 5 minutos 30 segundos
- Volumen de muestra: 80 ul
- Volumen final de reacción: 1,28 ml
 Reactivos provistos
A. Reactivo A: solución acuosa conteniendo ácido clorhídrico 150 mmol/l y tensioactivo.
B. Reactivo B: solución acuosa conteniendo sal de diclorofenildiazonio 1,5 mmol/l en ácido
clorhídrico 150 mmol/l.
 Reactivos no provistos
Calibrador A plus de Wiener Lab.

 Reproducibilidad
Se aplicó el protocolo EP15-A del CLSI. Se analizaron tres niveles de concentración, cada uno
por cuadruplicado durante 5 días. Con los datos obtenidos, se calcularon la precisión intraensayo y
total.
  Linealidad
La reacción es lineal hasta 250 mg/l de bilirrubina. Para valores superiores, repetir la
determinación empleando muestra diluida 1:2 ó 1:4 con solución fisiológica, multiplicando el
resultado obtenido por 2 ó 4 según el caso.
 Límite de detección
Depende del fotómetro empleado y de la longitud de onda. En espectrofotómetros con cubetas
de caras paralelas de 1 cm de espesor, para un ΔA de 0,001 el mínimo cambio de concentración
detectable será de 0,031 mg/dl.

3 Método de determinación de bilirrubina total por medición transcutanea con

bilirrubinometro BiliCheck

 Fundamento
El funcionamiento de los bilirrubinómetros transcutáneos se basa en dirigir luz blanca hacia la
piel del recién nacido y medir la intensidad de las longitudes de onda específicas devueltas.
Conociendo las propiedades espectrales de los componentes de la piel se restan de los
componentes que causan interferencia y se determina la concentración de bilirrubinas. En los
últimos años las mejoras en los bilirrubinómetros transcutáneos han permitido incrementar la
precisión en sus resultados.
 Muestra
Los recién nacidos elegibles para incluirse en el estudio deben tener edad gestacional entre 30 y
42 semanas, peso al nacer igual o mayor de 1,000 g y cuantificación de bilirrubinas séricas.
 Material
Se utilizó BiliChek para la medición de BTc. Las determinaciones se obtienen a partir de la frente
o esternón de los recién nacidos mientras están en un estado tranquilo. Cada medición debe ser
calculada por el bilirrubinómetro promediando 5 lecturas.
 Cálculos de los resultados.
OD = OD + OD + OD + OD

OD = OD − OD − OD − OD
 Metas analíticas
Para estos niños, el valor predictivo negativo de la BiliChek fue 100 % y el valor predictivo
positivo fue 86 %, sensibilidad 100 % y especificidad 88.1 %. Estos datos concordaban con las
mediciones de TsB y, por lo tanto, demuestran la exactitud y la reproducibilidad de las mediciones
de BiliChek antes del alta hospitalaria para bebés en término y prematuros de diversas razas y
etnias. Los autores concluyeron que los niños con valores de BiliChek antes del alta hospitalaria
sobre el percentil 75 de TsB en el nomograma de bilirrubina en horas específicas pueden
considerarse de alto riesgo para la hiperbilirrubinemia excesiva posterior.
VI-Selección del método
De acuerdo a los resultados analíticos obtenidos por los diferentes métodos, la determinación de
bilirrubina total por medición transcutanea utilizando el bilirrubinometro BiliCheck es el método
seleccionado en nuestro laboratorio privado. Él cuál cumple con los criterios planteados al comienzo
del informe, destacando las siguientes ventajas: es práctico, de tipo no invasivo, alta sensibilidad y
especificidad, tiempo de medición breve y económico.
Para poder ejecutar el método elegido debemos verificar las siguientes metas analíticas:

Metas analíticas Implementación

Rango analítico Calibración de Múltiples Puntos
Límites de detección y cuantificación Calibración de Múltiples Puntos

Precisión Ensayo de repetibilidad

Veracidad Comparación de Métodos

 VII-Control de calidad
Uno de los objetivos del control estadísticos de procesos es detectar con rapidez la presencia de
causas asignables o de tendencias o corrimientos del proceso, de modo que pueda efectuarse una
investigación y emprender una acción correctiva. Se utilizó también para estimar los parámetros de
un proceso de producción y eventualmente para eliminar la variabilidad. El control estadístico no
constituye un fin en sí mismo; una vez que se ha establecido, se puede comenzar un duro trabajo
para mejorar la calidad y la economía de la producción. En relación a la interpretación de una carta
de control, aun cuando todos los puntos de una carta se encuentran dentro los límites de control, si
se comporta de manera sistemática o no aleatoria, entonces es un indicador de que el proceso está
fuera de control. Si el proceso está bajo control, todos los puntos de la gráfica deben seguir un
patrón aleatorio.

VIII-Conclusiones

 El grupo llego a la conclusión de que la variedad de métodos de medición de bilirrubina

son indispensables al momento de abordar la selección y evaluación de los mismos.
 Además se cumplió eficazmente con las metas prácticas propuestas.
 Se logró seleccionar un método candidato, él cuál cumple con las expectativas practicas
analíticas y clínicas.

IX-Bibliografía

 http://cobico.com.ar/wp-content/archivos/2018/05/COMPARACI%C3%93N-ENTRE-UN-
M%C3%89TODO-TRANSCUT%C3%81NEO.pdf
 http://www.murciasalud.es/preevid.php?op=mostrar_pregunta&id=19924&idsec=453
 https://latamisrael.com/medicion-de-bilirrubina-transcutanea-de-manera-no-invasiva/
 https://www.aeped.es/sites/default/files/anales/50-4-12.pdf
 https://medlineplus.gov/spanish/labtests/bilirubinbloodtest.html
 https://es.wikipedia.org/wiki/Bilirrubina
 https://kidshealth.org/es/parents/test-bilirubin-esp.html
 http://www.wiener-
lab.com.ar/VademecumDocumentos/Vademecum%20espanol/bilirrubina_sp.pdf
 http://www.wiener-
lab.com.ar/VademecumDocumentos/Vademecum%20espanol/bilirrubina_total_aa_liquida
_sp.pdf
 https://es.slideshare.net/Alejoalta/determinacin-de-bilirrubina
 https://latamisrael.com/medicion-de-bilirrubina-transcutanea-de-manera-no-invasiva/
 http://www.spinreact.com.mx/public/instructivo/QUIMICA%20CLINICA/LIQUIDOS/100104
4%20BILI%20T&D.pdf
 http://www.biosimex.com.mx/pdf/insertos/QUIMICA%20CLINICA/11515%2011511%2011
510.pdf
 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3700058/
 https://www.philips.com.ar/healthcare/articles/conexion-salud/articulo-bilichek
 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5754796/