Guía de Laboratorio 6.

Laboratorio 6.
Extracción ADN genómico de células eucariotas vegetales
Nombres, apellidos y código de los estudiantes:

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Introducción
La extracción de ácidos nucleicos de buena calidad libres de inhibidores es el primer paso

en Biología Molecular. Para manipular el ácido desoxirribonucleico (ADN) es necesario
eliminar o disminuir la cantidad de componentes celulares como proteínas, ARN y lípidos
que lo acompañan, sin dañar el ADN. En 1869, el químico suizo Johann Friedrich Miescher
aisló varias moléculas ricas en fosfatos a partir del núcleo de los glóbulos blancos, las
cuales llamó “nucleínas” (ácidos nucleicos). La contaminación con proteínas fue un
problema, por lo que modificó su protocolo agregando pepsina, una proteasa para digerir
las proteínas presentes. Actualmente existen varios métodos para la extracción y
purificación del ADN (Sambrook et al., 2012), los cuales son seleccionados según:
• El tipo de ADN a extraer (ADN genómico, mitocondrial, plasmídico, cloroplástico).
• El organismo de donde se extraerá por ejemplo células animales, plantas, levaduras,
bacterias, virus, entre otros.
• El material de donde se va a extraer (órganos completos, tejidos, cultivos celulares,
sangre, muestras ambientales).
• La utilidad que se le va a dar al ADN extraído.
La obtención de ADN a partir de materiales biológicos requiere la homogeneización de los

tejidos, en su caso, el lisado de las células y la inactivación de las nucleasas celulares que
podrían digerir el ADN. Esto asegura que la cantidad de ADN intacto obtenido sea la
máxima. La homogeneización y la lisis celular deben ser lo suficientemente fuertes para
romper el tejido, la pared y las membranas celulares, pero ser suave para preservar el ADN.
Los procesos más comunes son:
• Disrupción mecánica, por ejemplo, molienda, ruptura hipotónica o congelación
descongelación.
• Tratamiento químico, por ejemplo, la lisis con detergentes o agentes caotrópicos.
• Digestión enzimática, con enzimas hidrolíticas para romper la pared celular, como son
lisozima, mutanolisina, zimolasa, liticasa o proteinasa K.
La ruptura celular y la inactivación de las nucleasas intracelulares deben ser simultáneas. Se

puede utilizar una solución con detergentes para solubilizar las membranas celulares y sales
caotrópicas fuertes para inactivar las nucleasas. El ADN y otros componentes celulares
como lípidos, azúcares y proteínas, se disuelven en la solución de lisis. El ADN tiene carga
negativa debido a los grupos fosfato de su estructura, y esta carga eléctrica es lo que hace
soluble a esta molécula.
Uno de los métodos más comunes combina la separación de biomoléculas de acuerdo a su

polaridad mediante extracción orgánica y la precipitación de biomoléculas mediante la
adición de alcoholes:
• Extracción con solventes para eliminar contaminantes como proteínas y lípidos.
• Precipitación de los ácidos nucleicos con isopropanol o etanol, dado que el ADN es
insoluble en altas concentraciones de sal y alcohol se puede observar unas finas hebras
blancas.
Objetivos
- Identificar diferencias en los protocolos de extracción de ADN.

- Obtener ADN libre de inhibidores a partir de células vegetales.
Materiales y equipos
Centrífuga Revco -20°C

Racks con puntas para micropipeta Etanol 90%
Baño serológico Isopropanol (-20°C)
Gradillas para tubos de 1.5ml Tubos eppendorf de 1.5 ml
Vórtex RNAsa
Micropipetas volumen: 1000, 100 y 10µL Cloroformo
β-mercaptoetanol Fenol 85%
Buffer TE: Tris-HCl 100 mM, EDTA 1 mM, pH 8.0 NaCl 2M
Buffer de extracción: CTAB 2%: Para preparar 100 ml pesar 2 gramos de CTAB y diluirlos
en 60 ml de agua, adicionar NaCl 1.5 M, EDTA 50 mM y Tris HCl 250 mM pH 8.0
Hoja joven de zea mays* Marcador indeleble*
Guantes* Toallas absorbentes*
Nota: Los materiales marcados con asterisco (*) deben ser llevados por los estudiantes
para la práctica.
Metodología
1. Corte tres fragmentos de hoja de 1 cm 2 y colocarlos en un tubo eppendorf de 1,5 mL.

2. Adicione 200 µl de buffer 2x CTAB y macere.
3. Adicionar 600 µl de buffer 2x CTAB y agite en vórtex por 5 segundos.
4. Centrifugue a 12000 rpm por 6 minutos.
5. Elimine el sobrenadante.
6. Agregue 500 µl de 2x CTAB y 7 µl de β- mercaptoetanol
7. Mezcle en vórtex durante 5 segundos.
8. Coloque los tubos en baño serológico a 60°C por 15 minutos, agitando en vórtex por 5 segundos
cada 5 minutos.
9. Agregue 50 µl de fenol y 50 µl de cloroformo, agite en vórtex por 5 segundos.
11. Rescate la fase superior sin tocar la interfase blanca que tiene las proteínas y colóquela en un
tubo limpio.
12. Coloque 100 µl de cloroformo, mezcle en vórtex por 5 segundos.
14. Rescate la fase superior a un tubo limpio.
15. Adicione 10 µl de NaCl (2M) y 250 µl de isopropanol, deje reposar la muestra a -20°C durante
10 minutos.
16. Centrifugue por 10 minutos a 12000 rpm y 4°C
17. Elimine el sobrenadante.
18. Lave el precipitado con 1 mL de etanol al 90% frío.
19. Deje secar y resuspenda en 100 µl de buffer TE.
20. Adicione 2 microlitros de RNAsa.
Preguntas pre laboratorio.
- ¿Para qué se utiliza el fenol y el cloroformo en biología molecular?

- ¿Qué tipo de compuestos son el CTAB y β- mercaptoetanol y para qué los utilizan en biología
molecular?
Resultados
1. Observe cada paso de la extracción y responda:

- ¿Por qué elimina el sobrenadante en el paso 5?
- ¿Para qué agrega CTAB y β- mercaptoetanol en el paso 6?
- ¿Para qué agrega el fenol y el cloroformo?
- ¿Qué contiene la fase superior del paso 14?
- ¿Cuál es la función del isopropanol y el NaCl en el paso 15?
- ¿Qué es lo que resuspende en el paso 19?
Preguntas
1. Descargue el siguiente artículo científico

https://portlandpress.com/bioscirep/article/39/2/BSR20182271/110910/A-modified-SDS-
based-DNA-extraction-method-from, léalo atentamente y responda las siguientes
preguntas:
- ¿Cuál es el problema que quieren resolver?
- ¿Qué métodos utilizaron para extraer ADN, con qué modificaciones y por qué
modificaron las metodologías?
- ¿Qué metodología utilizaron para cuantificar y analizar pureza del ADN?
- ¿Qué quieren mostrar los autores con la figura 1?
- ¿Para qué utilizaron el ADN que obtuvieron?
- ¿Cuál es la conclusión del estudio?
Discusión
Conclusiones
Referencias bibliográficas

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La extracción de ácidos nucleicos de buena calidad libres de inhibidores es el primer paso

La obtención de ADN a partir de materiales biológicos requiere la homogeneización de los

La ruptura celular y la inactivación de las nucleasas intracelulares deben ser simultáneas. Se

Uno de los métodos más comunes combina la separación de biomoléculas de acuerdo a su

- Identificar diferencias en los protocolos de extracción de ADN.

Centrífuga Revco -20°C

1. Corte tres fragmentos de hoja de 1 cm 2 y colocarlos en un tubo eppendorf de 1,5 mL.

Preguntas pre laboratorio.

- ¿Para qué se utiliza el fenol y el cloroformo en biología molecular?

1. Observe cada paso de la extracción y responda:

1. Descargue el siguiente artículo científico

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