ENZIMOLOGÍA DIAGNÓSTICA

Análisis bioquímico. Laboratorio clínico y biomédico

I - DEFINICION Y ESTRUCTURA
Las enzimas son catalizadores que funcionan aumentando la velocidad de las
reacciones químicas (de 106 a 1012 veces en comparación con las reacciones no catalizadas).
La determinación de enzimas en el laboratorio es muy frecuente y puede servir para el
diagnóstico, tratamiento o pronóstico de una enfermedad.
Las enzimas se sintetizan en las células y están presentes en todos los tejidos, aunque
no todos los tejidos tienen las mismas enzimas ni en igual cantidad. Es precisamente el
conocimiento de su función y ubicación en los tejidos lo que permite utilizarlas como
verdaderos marcadores de ciertas patologías. La determinación en plasma o en otro líquido
biológico de una enzima o de un grupo de enzimas nos informa sobre el tejido o células de las
que provienen.
Las enzimas son proteínas de alto peso molecular: en condiciones normales, no se
filtran en los glomérulos renales. Poseen todas las propiedades de las proteínas, incluida la
posibilidad de desnaturalizarse, en cuyo caso pierden su actividad. También pueden ionizarse
según el pH del medio, por lo que se puede aprovechar esta cualidad para hacer una
electroforesis.
Algunas enzimas son proteínas conjugadas. En este caso, a la porción proteica la
llamamos APOENZIMA y a la no proteica la llamamos COFACTOR. El conjunto se llama
HOLOENZIMA, que es la que tiene actividad catalítica.
Los cofactores pueden ser:
a) compuestos inorgánicos o iones metálicos (Zn++, Fe++, Mg++, etc.). Se les llama
activadores enzimáticos.
b) compuestos orgánicos, como el NAD, NADP o el piridoxal-5-fosfato. En este caso
se llaman coenzimas.

En el laboratorio clínico las enzimas interesan desde 3 aspectos:

1º) como componentes presentes en las muestras, ya que su detección puede ayudar al
diagnóstico de ciertas enfermedades (Enzimología diagnóstica)
2º) como reactivos útiles para analizar otras sustancias (Técnicas enzimáticas)
3º) como responsables de diferentes trastornos metabólicos congénitos (Enzimopatías)

II – FUNCION
- Las enzimas catalizan reacciones en las que se transforman una o más moléculas de
SUSTRATO (S) en una o más moléculas de PRODUCTO (P). S P
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- Las enzimas funcionan como catalizadores biológicos y disminuyen la energía de activación
del sustrato. Permiten así que la reacción se haga a la temperatura normal del cuerpo, sin un
aporte extra de calor.

La enzima se une al sustrato y forma

un complejo enzima-sustrato (ES).
Una vez que se efectúa la catálisis, el
sustrato se transforma en producto y la
enzima permanece sin cambio y queda
en libertad para catalizar otras
reacciones. La reacción general es:

E+S E-S P+E

Las propiedades de las enzimas son:

 son eficaces en muy pequeñas cantidades
 no se alteran ni se consumen durante la reacción
 aceleran la velocidad de la reacción química, pero no alteran la constante de equilibrio
ya que no cambia la cantidad de producto formada a partir del sustrato.
 son específicas para cada sustrato o grupo de sustratos

- La enzima tiene una o varias regiones llamadas SITIOS ACTIVOS por donde se une al
sustrato. Es la parte principal de la enzima. El resto de la molécula sirve como soporte
estructural a fin de mantener la configuración de los componentes del sitio activo.
- Sólo los sustratos compatibles con el sitio activo pueden enlazarse con la enzima. De este
modo, cada enzima cataliza sólo determinadas reacciones, porque puede unirse sólo a
determinados sustratos.
- La mayoría de las enzimas presentan especificidad absoluta (catalizan sólo una reacción
específica con un sustrato específico) pero otras muestran especificidad de grupo (varios
sustratos con estructura similar pueden reaccionar con la enzima). Algunas son específicas de
un determinado enlace y otras son estereoespecíficas y sólo reaccionan con ciertos isómeros
ópticos.

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III - ISOENZIMAS
Existen formas moleculares de una determinada enzima que pueden catalizar una
misma reacción química. Estas formas diversas de una misma enzima se llaman isoenzimas.
Con técnicas apropiadas se pueden separar las isoenzimas de una enzima. Por
ejemplo:
 como muchas isoenzimas presentan variaciones de carga, pueden separarse por
técnicas electroforéticas.
 también pueden separarse por sus diferencias a la inactivación por calor (podemos
provocar que se inactiven aplicando calor, pero cada isoenzima se inactiva a una
temperatura distinta).
 adsorción selectiva a diferentes soportes
 incubación con diferentes sustratos o con inhibidores selectivos

La aplicación en el laboratorio de las determinaciones de isoenzimas es que cada una

puede provenir de un tipo celular distinto y podemos así detectar el tejido u órgano afectado.

IV - CLASIFICACION DE LAS ENZIMAS

La Comisión de Enzimas de la Unión Internacional de Bioquímica elaboró unos
principios generales de nomenclatura y clasificación de enzimas.
El nombre de la enzima tiene 2 partes: la primera nombra al sustrato y la segunda
termina en "asa" e indica el tipo de reacción que cataliza.
Sin embargo, se tiende a utilizar cada vez más un código para cada enzima. Consta de
las siglas EC y de 4 números separados por puntos. Esos 4 números significan, en este orden,
lo siguiente:
o Primer número: la clase de enzima (hay 6 posibles clases)
o Segundo número: subclase
o Tercer número: subsubclase
o Cuarto número: número de serie específico de la enzima.

Ejemplo: LDH (LACTATO DESHIDROGENASA)

Código: EC 1.1.1.27
Primer nº: 1. Indica que la clase es oxidorreductasa
Segundo nº: 1. Indica subclase oxidasa
Tercer nº: 1. Indica que la subsubclase es citocromo oxidasa
Cuarto nº: 27. El número de esta enzima dentro de la subsubclase.

Las 6 CLASES de enzimas son:

1- Oxidorreductasas: catalizan reacciones de oxidación y reducción entre 2 sustratos. Se
transfieren electrones.
2- Transferasas: transfieren grupos (amino, fosfato, etc.) de una molécula a otra.
3- Hidrolasas: rompen enlaces (C-O, C-N, C-C, etc.) en un medio acuoso.
4- Liasas: rompen enlaces eliminando grupos químicos de una molécula. Se forman
entonces dobles enlaces.
5- Isomerasas: un isómero se transforma en otro.
6- Ligasas: catalizan la unión entre 2 moléculas.

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V - ENZIMAS PLASMATICAS
Todas las enzimas se sintetizan en el interior de las células (en los ribosomas) y la
mayor parte de ellas realizan sus funciones intracelularmente. Sin embargo, en sangre se puede
detectar la actividad de diversas enzimas que, para su estudio, se clasifican en 3 grupos:

1- Enzimas plasma-específicas: cumplen su función en sangre. Son producidos en el hígado y

se secretan a la circulación en forma inactiva. Un ejemplo de enzimas de este tipo son las que
intervienen en la coagulación y en la fibrinolisis.

2- Enzimas secretados: realizan su función en líquidos extracelulares, como los jugos

digestivos. Ejemplos de enzimas de este tipo son las enzimas digestivas (amilasa, tripsina,
etc.). Una pequeña parte puede pasar a sangre.

3- Enzimas intracelulares “escapados”: en condiciones normales se encuentran en la sangre en

muy pequeña cantidad y en niveles constantes. Proceden de la renovación de los tejidos.
Este último grupo es el que más interesa desde el punto de vista diagnóstico, ya que en
determinadas situaciones patológicas, su actividad aumenta o disminuye, bien por fallos en su
síntesis o por variaciones en el número de células que las producen.

Los factores de los que dependen los cambios en la actividad enzimática sérica son:

1º) Los que afectan a la liberación de las enzimas desde las células:
Las enzimas permanecen en las células donde se han sintetizado porque la membrana
plasmática no permite su salida en masa. Esta membrana es parte metabólicamente activa
de la célula y su integridad depende de la producción de energía de la misma. Por eso, si
hay un trastorno en el metabolismo celular se deteriora la membrana y, si la lesión es
irreversible, la célula muere.

a) Al deteriorarse la membrana, se altera su permeabilidad y salen primero las pequeñas

moléculas, después las moléculas algo más grandes (como las enzimas) y, por último, si la
célula se necrosa, sale todo el contenido celular. Las enzimas del citosol (líquido
citoplasmático) salen antes que las enzimas intramitocondriales. Estas últimas necesitan
una lesión mayor para salir a la circulación.

b) Cuando hay una sobreproducción de una enzima aumenta el escape al líquido

extracelular, aunque la membrana celular permanezca íntegra, debido a que la salida de las
enzimas también está condicionada por el gradiente de concentración que se establece entre
el interior y el exterior de la célula.

c) Por último, si el número de células productoras de una enzima aumenta, por ejemplo
por un tumor, aunque el escape enzimático sea el normal para cada célula, el total liberado
se verá incrementado.

2º) Los que afectan a la entrada en sangre:

Cuando las enzimas salen de las células pasan primero al líquido intersticial y de ahí al
torrente circulatorio, según la irrigación de este tejido. Por ejemplo, el hígado es un órgano
muy vascularizado y con capilares muy permeables, por lo que cualquier escape enzimático
se reflejará pronto en los niveles séricos. Por el contrario, los capilares del músculo

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esquelético son poco permeables y, por tanto, las enzimas alcanzan más difícilmente la
circulación general.

3º) Los que afectan a la depuración de las enzimas de la sangre:

La mayor parte de las enzimas no pasan el glomérulo renal y son inactivadas en plasma.
Después son captadas por las células del sistema reticuloendotelial donde son degradadas.
La vida media de una enzima varía desde pocas horas a varios días. El promedio es de 24 a
48 horas. Puede variar por alteraciones del SRE, del funcionamiento renal, etc.

VI - CINETICA ENZIMATICA

VI.1- CONCENTRACIÓN DE SUSTRATO

Las enzimas reaccionan ofreciendo su sitio activo al sustrato con el cual se acoplan y
forman un complejo enzima-sustrato. Después se libera el producto transformado sin que en
esta reacción se altere la enzima, que queda libre para fijar otra molécula de sustrato. La
actividad enzimática es una medida de la conversión de sustrato en producto.

Si mantenemos
constantes las condiciones de la
reacción (pH, temperatura, cofactores y
concentración de enzima) la velocidad
de la reacción aumenta a medida que
aumentamos la concentración de
sustrato, hasta que llegamos a una
velocidad máxima a partir de la cual la
velocidad es constante aunque siga
aumentando la concentración de
sustrato.
Esto se explica porque al
aumentar mucho la cantidad de sustrato,
la enzima se satura (no quedan
moléculas de enzima disponibles para
unirse al sustrato ya que todas están
ocupadas) y se alcanza la mayor
velocidad de reacción que es posible.
Después, a medida que se consume el sustrato, se acumulan productos que pueden ser
inhibidores y también empieza a hacerse notar la reacción en sentido inverso. Por tanto, la
velocidad de reacción disminuye haciéndose además dependiente de la concentración de
sustrato.

La CONSTANTE DE MICHAELIS (Km) es la concentración de sustrato en moles/litro con la

cual la velocidad de reacción es la mitad de la velocidad máxima. Esta constante es
característica de cada reacción enzimática, y nos informa sobre la afinidad de la enzima por su
sustrato. Si una enzima tiene un Km elevado, la mitad de la velocidad máxima se alcanzará
con una concentración alta de sustrato, lo cual quiere decir que la afinidad de la enzima por ese
sustrato es baja y la velocidad de la reacción es lenta. Si, por el contrario, una enzima tiene un
Km bajo, la mitad de la velocidad máxima se alcanza con poca concentración de sustrato, lo
que indica que la enzima tiene mucha afinidad por el sustrato y la velocidad de la reacción está
siendo rápida.
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A bajas concentraciones de sustrato, la velocidad de la reacción es directamente

proporcional a la cantidad de sustrato. Se dice entonces que la reacción sigue una CINÉTICA
DE PRIMER ORDEN. Es la primera fase de la curva.
Si sigue aumentando la concentración de sustrato, llega un momento en que la
velocidad de la reacción es independiente del sustrato, ya que se ha alcanzado la velocidad
máxima. Se dice entonces que la reacción sigue una CINÉTICA DE ORDEN CERO. Es la
segunda fase de la curva. Cualquier incremento de sustrato ya no aumenta más la velocidad.
Esto ocurre porque todas las moléculas de enzima están saturadas.
Al efectuar determinaciones de la actividad enzimática en el laboratorio, LAS
REACCIONES DEBEN TENER CINÉTICA DE ORDEN CERO, para que la velocidad
de la reacción no dependa de la concentración de sustrato, sino sólo de la concentración
de enzima (que es precisamente lo que en el fondo queremos saber).
En la práctica, si mantenemos constante la temperatura y el pH para que no se afecte la
enzima, con una concentración de sustrato que sea unas 10 veces superior a la Km (constante
de Michaelis), o más, podemos estar seguros de que la reacción va a ser de cinética de orden
cero. La mayoría de los reactivos comercializados para análisis enzimático incluyen una
concentración de sustrato de al menos 100 veces el valor de Km, para evitar que el sustrato se
agote durante la reacción.

Ecuación de Michaelis-Menten: v = Vmax · [S] / Km + [S]

Si S es mucho mayor que Km, el valor de Km se hace despreciable y entonces, se

podría transformar la ecuación así: v = Vmax · [S] / [S] = Vmax. Es decir, la velocidad a la
que se está produciendo la reacción es la máxima y la cinética es de orden cero. Esto es lo que
queremos cuando estamos provocando esta reacción en el laboratorio.

LA ECUACIÓN DE LINEWEAVER-BURK es la misma que la anterior, pero

1 Km 1 1
invirtiendo las fracciones: = · +
V Vmax S Vmax

Su utilidad radica en que se puede

representar gráficamente por una
recta. (y = a·x + b)

Sabiendo la Km de la enzima,
podemos calcular rápidamente la
velocidad de la reacción y cuál es
la velocidad máxima.

VI.2.- OTROS FACTORES QUE INFLUYEN EN LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA:

1) CONCENTRACIÓN DE LA ENZIMA:
Este debe ser el único factor limitador para que una determinación enzimática en el
laboratorio sea válida. La velocidad de reacción aumenta cuando la concentración de enzima

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es mayor y se reduce cuando es menor. Sin embargo, el valor de Km es independiente de la
concentración de enzima.
Si la concentración de enzima es muy alta, llega un momento en que no hay sustrato
disponible para ocupar a todas las moléculas de enzima. Se agota el sustrato antes de que
finalice la observación de la reacción. En ese momento la reacción deja de ser lineal (cinética
de orden cero) y no refleja la actividad enzimática. Este momento es el límite de linealidad de
una determinación enzimática.
La mayoría de las determinaciones enzimáticas necesitan varias lecturas a tiempos
determinados (monitorización) que nos confirmen que la reacción no ha perdido la linealidad.

2) TEMPERATURA:
La velocidad de las reacciones aumenta a medida que la temperatura aumenta, hasta
que se alcanza un valor óptimo. Si se sobrepasa, la enzima se desnaturaliza, pierde actividad y
la velocidad disminuye.
La desnaturalización comienza a temperaturas superiores a 40ºC, variando según la
enzima. Es irreversible. La mayoría de los análisis enzimáticos se hacen a 25, 30 ó 37 ºC.
Por otro lado, en muestras congeladas y recongeladas varias veces, las enzimas pueden
perder su actividad.
Es muy importante que todas las soluciones requeridas para un test enzimático sean
mantenidas a la temperatura prescrita para el test. La solución tampón y otras soluciones que
no dependen de la temperatura, se mantienen en un baño María a la temperatura del test. Otras
soluciones, tales como soluciones de coenzimas y enzimas, se conservan en un baño de hielo y
se llevan a la temperatura del test cada vez en porciones pequeñas.

3) pH:
Cada enzima tiene un pH al que su actividad es máxima. La mayoría tiene un pH
óptimo entre 6 y 8. Hay que añadir soluciones tampones a las muestras en las que se quiere
hacer una determinación enzimática, para evitar que el pH varíe.

4) ACTIVADORES ENZIMATICOS:
Hay sustancias que incrementan la velocidad de la reacción. En general, son iones
metálicos (como Mg++, Fe++, etc.). Es necesario que estén presentes para que funcionen
aquellas enzimas que los requieran. Si no están presentes, la actividad enzimática no será
óptima. Las coenzimas como NAD y NADP funcionan igual que los activadores.
Un exceso de complementos inorgánicos puede inhibir la reacción, por lo que las
concentraciones deben ser fijadas cuidadosamente.

5) INHIBIDORES:
Son sustancias que inhiben la actividad de determinadas enzimas y que pueden variar
la velocidad de la reacción o el valor de Km.
Existen inhibidores naturales en los tejidos y en el suero, pero que no suelen afectar
significativamente los tests enzimáticos en el laboratorio. Sólo en la orina se han detectado
inhibidores que interfieren en la determinación cuantitativa de ciertas enzimas, por lo que se
recomienda dializar la orina antes de proceder a la determinación enzimática.
Algunos anticoagulantes inhiben reacciones enzimáticas. Los inhibidores también
pueden introducirse accidentalmente en la solución reactiva. Los más frecuentes son los restos
de detergentes empleados en la limpieza del material de vidrio así como los inhibidores que se
forman en soluciones NADH y NADPH. Por ello deben prepararse siempre soluciones de
coenzima frescas.

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Inhibición competitiva: Cuando el inhibidor
se une en el centro activo de la enzima
impidiendo que el sustrato se una a él. Si
aumenta la concentración de sustrato, podemos
desplazar al inhibidor, por lo que evitamos la
inhibición de la enzima. La velocidad máxima
es la misma con o sin inhibidor, pero
necesitamos más concentración de sustrato para
llegar a ella y que la cinética sea de orden cero.
El valor de Km es más alto.

Inhibición no competitiva: Cuando el

inhibidor se une reversiblemente a un punto
diferente del centro activo pero con su actuación
lo modifica lo suficiente para que, aunque se
puedan unir la enzima y el sustrato, la catálisis
no se produce o la velocidad de ésta disminuye.
La velocidad máxima de la reacción queda
disminuida, y esto no se puede contrarrestar
aunque aumentemos la cantidad de sustrato. El
valor de Km no cambia sustancialmente. Un
ejemplo de inhibidores no competitivos son
algunos detergentes que contaminan el material de vidrio del laboratorio.

Inhibición alostérica: Cuando el inhibidor se une en un punto también diferente al centro activo
pero con su actuación lo modifica de tal manera que impide la unión de la enzima y el substrato.

Envenenadores: Son moléculas que se unen irreversiblemente al centro activo de la enzima

impidiendo permanentemente que esta actúe. Muchos tóxicos y venenos tienen este modo de
actuación.

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VII - DETERMINACION DE LA ACTIVIDAD ENZIMATICA

VII.1.- MÉTODOS

El estudio de las enzimas en el laboratorio se basa en la demostración in vitro de la actividad

catalítica que una enzima tiene in vivo. No nos interesa la cantidad o concentración (que no se
puede medir directamente con los métodos habituales) ni el peso de la enzima, sino su
ACTIVIDAD.
La actividad de una enzima se mide
mediante la determinación de la cantidad de
sustrato que se transforma en producto por
unidad de tiempo, en condiciones definidas y
controladas. Si no ponemos sustrato, la enzima
no actúa porque no hay reacción y no podremos
detectarla aunque estuviera en grandes
cantidades en la muestra.

Según la forma de medir la velocidad de las

reacciones enzimáticas hay 3 tipos de métodos:

1) MÉTODOS A PUNTO FINAL O A

TIEMPO FIJO: Se determina la cantidad de
sustrato transformado en un tiempo
definido, después de detener la reacción. El
tiempo elegido para la incubación tendrá
que estar necesariamente en la zona que
corresponda a una velocidad constante.

2) MÉTODOS DE PUNTOS
MÚLTIPLES: Se va detectando a intervalos
regulares de tiempo el cambio (aumento o
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disminución) de alguno de los compuestos que participan en la reacción, a medida que ésta
se va produciendo.
El aumento o disminución de la absorbancia por unidad de tiempo es directamente
proporcional a la actividad enzimática, que es lo que se quiere medir en la muestra. Con el
método espectrofotométrico de puntos múltiples, se hace una lectura basal y después varias
lecturas más a intervalos iguales de tiempo, a medida que se va desarrollando la reacción
enzimática. En esas lecturas se va observando cómo va disminuyendo o aumentando la
absorbancia de una forma constante. Las diferencias entre cada lectura y la anterior
(incrementos de absorbancia) deben ser iguales a lo largo de la reacción.

3) MÉTODOS DE MONITORIZACIÓN CONTINUA: El espectrofotómetro va

conectado a un registrador que detecta de manera continuada el cambio de la concentración de
alguno de los compuestos que participan en la reacción a lo largo de un intervalo de tiempo
determinado.

Los dos últimos tipos de métodos son preferibles siempre que las características de los
reactivos y del aparataje lo permitan. Tienen la ventaja de que permiten identificar el momento
a partir del cual la velocidad deja de ser constante.

VII.2.- MUESTRAS
Generalmente, la determinación de la actividad enzimática se realiza mejor en suero
que en plasma, ya que los anticoagulantes utilizados más frecuentemente inhiben la actividad
de muchas de ellas.
Las enzimas séricas se encuentran también en el interior de los hematíes, pero en
concentraciones muy superiores, por lo que las muestras hemolizadas no pueden utilizarse
para la determinación de actividad enzimática, ya que los valores resultarán falsamente
elevados.

VII.3.- UNIDADES DE ACTIVIDAD ENZIMÁTICA

La unidad de actividad enzimática es el katal/litro, que equivale a un mol/l de sustrato
catalizado por segundo. Sin embargo, en la mayoría de los laboratorios se sigue usando la
unidad/litro de actividad enzimática (U).
1 U = 1 micromol/l de sustrato catalizado por minuto (a 25ºC y pH y concentración de sustrato
controlados).
1 U = 16´7 · 10-9 katales = 16´7 nanokatales.

VII.4.- MÉTODOS ESPECTROFOTOMÉTRICOS PARA LA

DETERMINACIÓN DE ACTIVIDAD ENZIMÁTICA
Aunque se pueden utilizar diversos procedimientos para medir las variaciones en la
concentración del sustrato, cofactor o producto, el método que más se utiliza en el laboratorio
clínico es la espectrofotometría UV-V. Para ello, la reacción enzimática ha de producir un
cambio en la absorbancia de alguno de los componentes de la reacción.
Si la reacción enzimática no contiene un componente con absorbancia a una
determinada longitud de onda, se puede acoplar otra reacción usando el producto de la primera
reacción como sustrato de la segunda. Se pueden encadenar así 2 ó más reacciones.

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Los métodos que más se utilizan miden la variación de la concentración de los
cofactores NADH o NADPH, ya que ambos presentan un máximo de absorción a 340 nm que
no poseen las formas oxidadas NAD y NADP.

Por tanto, si en una reacción enzimática se forma NAD o NADP, se observará una
disminución de la absorbancia a medida que se va efectuando la reacción. Si se forma NADH
o NADPH, se observará que aumenta la absorbancia a medida que va progresando la reacción.
Según el número de reacciones químicas implicadas, nos podemos encontrar 3 casos:

1) Métodos simples. en la reacción catalizada por la enzima que queremos determinar

interviene un compuesto con absorbancia detectable. Por ejemplo:
LDH
Lactato + NAD Piruvato + NADH.
(La reacción en el sentido indicado ocurre si se lleva a cabo a pH 8´9. La reacción inversa se hace añadiendo
un tampón de pH 7´5).
La actividad de la LDH se determina midiendo el aumento de absorbancia por unidad
de tiempo a 340 nm, debido a la formación de NADH.

2) Métodos con reacción indicadora: si no hay ningún componente de la reacción

catalizada por la enzima que queremos determinar que presente cambios de absorbancia, se
enlaza con una segunda reacción, que será la reacción indicadora. Por ejemplo:
ALT
REACC. PRINCIPAL: Alanina + alfacetoglutárico glutamato + pirúvico
LDH
REACC. INDICADORA: Pirúvico + NADH Láctico + NAD

En este método para determinar la actividad de la ALT, el pirúvico que se obtiene en la

reacción principal se utiliza como sustrato de una reacción en la que interviene el NADH.
Como las reacciones son equimoleculares, la variación en la concentración de NADH por
unidad de tiempo es directamente proporcional a la actividad de la primera enzima.

3) Métodos con reacción auxiliar y reacción indicadora: se utilizan cuando no se puede

acoplar directamente la reacción principal con la indicadora. Por ejemplo:
CK
REACC. PRINCIPAL: Fosfato de creatina + ADP creatina + ATP
HK
REACC. AUXILIAR: Glucosa + ATP glucosa-6-fosfato + ADP
G6PDH
REACC. INDICADORA: Glucosa-6-P + NADP 6-fosfogluconato + NADPH

Para determinar la actividad de la CK, se mide el incremento de absorbancia del

NADPH en la tercera reacción.
Para que no limiten la velocidad de la primera reacción, las enzimas de las reacciones
auxiliares e indicadoras han de tener mayor actividad que la enzima que se va a medir y, por
eso los reactivos deben llevar concentraciones en exceso de estas enzimas. En caso contrario,
la falta de estas enzimas frenaría el proceso y se obtendría un valor erróneo de la actividad de
la enzima que se analiza.
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En algunos casos, antes de empezar a medir la absorbancia, hay que dejar unos minutos
de incubación previa de la mezcla de reacción para activar la enzima a medir (por ejemplo, la
CK) o para eliminar una reacción paralela que pueda interferir (por ejemplo, el piruvato sérico
podría falsear la actividad de la ALT y para evitarlo se deja tiempo para que se transforme
previamente en láctico).

VII.5.- CÁLCULO DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA

Para calcular la actividad enzimática se aplica la fórmula:

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ΔA 1 Vt
Actividad (en U/l) =    10
ε·d t Vm
A = incremento de la absorbancia
= coeficiente de extinción molar del NADH. Se mide en l / mol x cm.
d = anchura de la cubeta de medida(longitud de la trayectoria luminosa en centímetros).
Vt = volumen total de mezcla
Vm = volumen de la muestra que se quiere analizar

Para unas determinadas condiciones del test, los factores  , d, volumen de reactivo y
volumen de muestra son constantes, y por tanto se resumen en un FACTOR válido para cada
técnica (siempre que se mantengan las mismas condiciones). La fórmula queda entonces asÍ:
Actividad enzimática (en U/l) = A x factor
Hoy en día, los aparatos destinados a la medida de actividad enzimática son capaces de
conservar en memoria los factores correspondientes a cada técnica que realizan. Miden el
incremento de absorbancia y lo multiplican por el factor.
Además, también señalan si ha existido algún problema en la cinética de la reacción
(generalmente esto ocurre porque se ha agotado el sustrato y se pierde entonces la linealidad
de la reacción o cinética de orden cero).

Si no aparece NADH o NADPH en la reacción indicadora, puede calcularse la

actividad enzimática con una solución patrón:
ΔAx 1 Vt
Actividad enzimática = ΔAp  Cp  t  Vm

VIII - ENZIMAS CON SIGNIFICADO CLINICO

1) FOSFATASAS ALCALINAS (ALP) EC 3.1.3.1.

Pertenecen a la clase de las hidrolasas. Su pH óptimo es de 9 a 10.
Para su DETERMINACION sérica se usa como sustrato el p-nitrofenilfosfato (pNPP),
que se transforma en un compuesto amarillo por acción de la enzima.

Fuentes tisulares: Tiene 5 ISOENZIMAS diferentes, que en conjunto forman el total de la

fosfatasa alcalina sérica. Provienen de estos tejidos:
- hígado
- osteoblastos (en el tejido óseo)
- placenta, intestino, riñón, etc.
Los 2 primeros tejidos son los principales.

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Estas isoenzimas se pueden separar mediante:

-ELECTROFORESIS: es el método más frecuente. La fracción hepática migra con mayor
rapidez hacia el ánodo que el resto de las fracciones.
-inactivación por calor.
-inhibición con fenilalaninas o con urea.
-métodos inmunoquímicos, usando antisueros específicos.

Significado clínico: Un aumento sérico puede deberse a:

a) Enfermedades de hígado:
- Colestasis intrahepáticas, ya que la enzima se encuentra en la membrana de los canalículos
biliares y regurgita a sangre cuando la excreción de bilis está dificultada.
- Otras afecciones, como obstrucción biliar extrahepática, cáncer o cirrosis.

b) Enfermedades óseas con actividad aumentada de los osteoblastos:

- Enfermedad de Paget, osteomalacia por falta de vitamina D, hiperparatiroidismo, etc.
- Desarrollo óseo durante el crecimiento o tras una fractura (en niños y adolescentes es normal
un nivel de fosfatasas alcalinas doble o triple al de los adultos).

2) FOSFATASAS ACIDAS (ACP) EC 3.1.3.2.

Pertenecen a la clase de las hidrolasas. Su pH óptimo es de 4´5 a 6.
Fuentes tisulares:
- próstata (es la principal)
- hígado, riñón, eritrocitos, plaquetas, osteoclastos, etc.
Significado clínico: Se eleva en sangre en enfermedades prostáticas, sobre todo en el
carcinoma prostático. Se eleva aún más si el carcinoma prostático ha dado metástasis en
huesos, ya que entonces aumenta la actividad de los osteoclastos.
Isoenzimas: Se puede detectar sólo la isoenzima prostática en vez de la fosfatasa ácida
total.
Métodos de determinación:

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Se emplea un sustrato como el 1-naftil-fosfato + agua, que por acción de la enzima se
convierten en 1-naftol + fosfato. El 1-naftol se une a otro compuesto para colorearse.
Otro sustrato que también puede emplearse es el monofosfato de timolftaleína, que es
más específico para la fracción prostática que para las otras isoenzimas. Al reaccionar, da un
compuesto coloreado. La reacción se hace una vez sin añadir tartrato y otra vez añadiendo
tartrato, porque este anión inhibe la actividad de la fracción prostática (se observa la diferencia
de actividad antes y después de añadir tartrato).
Actividad de la fosfatasa ácida total (sin añadir tartrato) menos Actividad tras añadir
tartrato = Actividad de la isoenzima prostática.

3) TRANSAMINASAS O AMINOTRANSFERASAS
Pertenecen a la clase de las transferasas. Hay 2 tipos:

a) Aminotransferasa aspártica (AST) o transaminasa glutámicooxalacética

(GOT). EC 2.6.1.1.
Cataliza la siguiente reacción: aspártico + alfa-cetoglutárico oxalacético +
glutámico. Necesita una coenzima llamada pridoxal-5-fosfato.

Fuentes tisulares: -citoplasma de las células miocárdicas

-mitocondrias de los hepatocitos
-citoplasma de las cél. musculares esqueléticas
-riñón, etc.
Significado clínico: Aumenta en suero en:
- infarto de miocardio
- hepatitis vírica (pero se eleva proporcionalmente menos que la ALT)
- necrosis hepática
- cirrosis hepática (se eleva más que la ALT)
- mononucleosis infecciosa (por la afectación del hígado)
- distrofias musculares

Disminuye en suero en la deficiencia de vitamina B6 (o piridoxamina)

En general, una elevación sérica de una enzima mitocondrial supone mayor daño
celular que el de una enzima citoplasmática. El hepatocito está más dañado cuando libera
AST que cuando libera ALT.
En el infarto de miocardio se eleva en sangre a las pocas horas (pero después que la
enzima creatinquinasa), alcanza su pico máximo a las 36 horas y se normaliza al 5º día. La
enzima no se eleva tanto en otras afecciones cardíacas con síntomas similares, por lo que sirve
para el diagnóstico diferencial.

b) Alanina aminotransferasa (ALT) o transaminasa glutámicopirúvica (GPT) (EC

2.6.1.2.)
Cataliza esta reacción: alanina + alfa-cetoglutárico pirúvico + glutámico
La coenzima necesaria es también el piridoxal-5-fosfato.

Fuentes tisulares: - citoplasma de las células hepáticas

- citoplasma de las células del miocardio
- riñón

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Significado clínico: generalmente, los aumentos séricos de GPT son paralelos a los de GOT
(se elevan las dos juntas). Sin embargo, hay que resaltar que en las hepatitis víricas se eleva
más la GPT que la GOT, mientras que en las cirrosis, en las que el daño celular es más grave,
se eleva más la GOT.
Métodos de determinación:
En una 1ª reacción se emplean los sustratos alanina + alfa-cetoglutárico que dan como
productos glutámico + pirúvico.
En una 2ª reacción (reacción apareada) se emplea el pirúvico + NADH, que por acción
de la enzima LDH se convierte en Láctico + NAD. Este NAD es el que nos interesa porque da
lugar a una disminución de la absorbancia.

4) CREATINA QUINASA (CK) EC 2.7.3.2.

Pertenece a la clase de las transferasas. Necesita al Mg como cofactor.
Cataliza la reacción: Creatina + ATP Fosfato de creatina + ADP
Esta reacción es muy importante para las células, sobre todo las musculares, porque los
productos que se forman son la fuente de energía para ellas.
Fuentes tisulares: Está en las mitocondrias y citoplasmas de muchas células, pero es
más abundante en músculo esquelético, miocardio y cerebro.
Isoenzimas: Cada enzima CK está formada por 2 subunidades, que pueden ser del tipo
M (inicial de músculo) o B (inicial de "brain",que significa cerebro). Estas subunidades se
pueden combinar de 3 formas distintas, por lo que hay 3 isoenzimas, que son:
CK-BB (o CK-1): está sobre todo en cerebro.
CK-MB (o CK-2): está sobre todo en el miocardio.
CK-MM (o CK-3): está en músculo esquelético y también en miocardio.
Significado clínico: La separación y análisis de las isoenzimas tiene mayor significado
clínico que la determinación de niveles totales de CK.
La CK total se eleva en el infarto de miocardio, enfermedades musculares y después de
un shock circulatorio.
La isoenzima CK-BB sólo se encuentra en suero si está alterada la barrera
hematoencefálica. Si se encuentra, indica mal pronóstico de ciertos tumores.
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La isoenzima CK-MM es la más abundante en suero (alrededor del 94% de la CK total
en individuos sanos). Se eleva por problemas musculares, como traumatismos, y también en el
infarto de miocardio.
La ISOENZIMA CK-MB es un marcador de daño miocárdico. Durante mucho tiempo
ha sido la determinación más utilizada para el diagnóstico de IAM. Más información en el
anexo de marcadores bioquímicos miocárdicos.

Métodos de determinación:
- Para determinar CK total: se provocan las siguientes reacciones apareadas:
FOSFATO DE CREATINA + ADP CREATINA + ATP
ATP + GLUCOSA GLUCOSA 6-FOSFATO + ADP
GLUCO 6-P+ NADP 6-FOSFOGLUCONATO + NADPH

En el reactivo deben ir todas las enzimas necesarias (menos la CK). Se mide el

incremento de absorbancia a punto final o por métodos cinéticos producido por el NADPH.

Para determinar isoenzimas se pueden emplear estos métodos:

 Electroforesis en gel de agarosa, a pH 8´6. La CK-BB es la que migra con mayor
rapidez hacia el ánodo, después la CK-MB y la última en migrar es la CK-MM.
 Cromatografía de intercambio iónico
 Inmunoinhibición: se utilizan anticuerpos anti-M que inutilizan a las subunidades
M de las isoenzimas.
 Radioinmunoanálisis: más caro.

MARCADORES BIOQUÍMICOS MIOCÁRDICOS:

La pérdida de integridad de la membrana como resultado de la necrosis celular debido a la
isquemia provoca la liberación de proteínas (biomarcadores cardiacos) a la linfa y de ahí a la
sangre, siendo su detección útil tanto para el diagnóstico como para el pronóstico del daño
miocárdico. Además, en caso de que la reperfusión sea eficaz tras el tratamiento trombolítico,
la concentración plasmática, su ritmo de aparición y de elevación se ve aumentada. Durante
varias décadas, los marcadores bioquímicos empleados para la confirmación de daño
miocárdico han sido la CPK y su fracción MB. Ambas, aunque útiles, son de poca utilidad
para establecer el diagnóstico temprano que permita discriminar con prontitud a los pacientes
de alto riesgo.

La isoenzima CK-MB es el 6% de la CK total sérica. Es muy útil para detectar precozmente un

infarto de miocardio, porque se eleva a las 4 ó 6 horas tras el infarto, alcanza su punto máximo
a las 24 horas y se normaliza en sangre a las 72 horas. Se analiza de rutina en enfermos con
sospecha de infarto de miocardio, ya que es el marcador enzimático más precoz.

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Actualmente se conocen otros marcadores de isquemia cardíaca más precoces, pero no

son enzimas: son las troponinas y la mioglobina.
La mioglobina es el marcador más sensible en las primeras 6 horas pero es muy
inespecífico y no se usa para el diagnóstico cardíaco.
Las troponinas son de 2 tipos: I y T. La I es más precoz y la T es de elección para los
infartos de larga evolución, en los que han transcurrido más de 48 horas desde su inicio.
Aunque es de más tardía aparición, esta troponina tiene la ventaja de que tiene una gran
ventana diagnóstica (permanece elevada mucho tiempo en suero).
Actualmente se están implantando en el laboratorio otros marcadores en pacientes con
sospecha de un síndrome coronario agudo.
Los péptidos natriuréticos, denominados hormonas cardíacas, también son utilizados como
marcadores de daño miocárdico. Estos incluyen al péptido natriurético cerebral (BNP, por sus
siglas en inglés), secretado por el miocito ventricular. La utilidad del BNP en la IC es muy útil
en pacientes con disnea para descartar su origen cardíaco, por lo que se incluye actualmente en
el algoritmo diagnóstico inicial de la IC en la guías de práctica clínica.
Los nuevos biomarcadores que han recibido mayor atención son los relacionados con
la respuesta inflamatoria: (mieloperoxidasa, PCR, interleucina-6, interleucina-8, TNF- y
el dímero-D).

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5) LACTICO DESHIDROGENASA (LDH) EC1.1.1.27.

Pertenece a la clase de las oxidorreductasas. Cataliza de forma reversible esta reacción:
PIRUVICO + NADH LACTICO + NAD

Fuentes tisulares: está en los citoplasmas de casi todas las células, sobre todo en miocardio,
eritrocitos, músculo esquelético, hígado y riñón.

Isoenzimas: La LDH es la enzima en la que mayor importancia tiene la separación de sus

isoenzimas, dada la variedad de fuentes tisulares de la enzima total.
La LDH está compuesta por 4 subunidades, que pueden ser del tipo H ("heart",
corazón) o del tipo M (que viene de músculo). Las combinaciones de estas subunidades dan
lugar a 5 posibles isoenzimas:

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LDH-1 (HHHH): está presente sobre todo en corazón y eritrocitos.
LDH-2 (HHHM): " " " " " " " "
LDH-3 (HHMM): muy distribuida por todo el organismo.
LDH-4 (HMMM): abunda en músculo esquelético e hígado.
LDH-5 (MMMM): " " " " " "

La numeración va en el mismo orden que su velocidad de migración en la

electroforesis (La LDH-1 es la más negativa y por tanto la que migra antes, etc).

Significado clínico: La LDH total se eleva en el infarto de miocardio, en las anemias

megaloblásticas y en enfermedades del hígado, pero no permite hacer un diagnóstico definitivo
de ninguna enfermedad.
La indicación más frecuente para medir la actividad de la LDH en el laboratorio es el
infarto de miocardio. En este caso, se elevan sobre todo las isoenzimas LDH-1 y LDH-2. Se
elevan unas 8 ó 12 horas después del infarto (después de la CK y de la GOT), y se mantienen
altas durante 6 ó más días (cuando el resto de enzimas ya se han normalizado).
En el suero normal hay más LDH-2 que LDH-1. En el infarto, esto se invierte y hay
más LDH-1.
En enfermedades hepáticas se eleva la LDH-5 dando valores muy altos si son
enfermedades graves como cáncer.

Métodos de determinación:

- Para la LDH total: Sustratos necesarios: Pirúvico y NADH. Se convierten en láctico + NAD.
Nosotros medimos la disminución de absorbancia producida. La reacción puede hacerse
también a la inversa (con láctico y NAD como sustratos), pero resulta más lenta.

- Para separar isoenzimas:

- Electroforesis: es el método más frecuente.
- Cromatografía de intercambio iónico
- Inmunoprecipitación: con anticuerpos anti-M se hacen precipitar todas las isoenzimas
menos la LDH-1 que no tiene subunidad M.

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6) GAMMA GLUTAMIL TRANSPEPTIDASA (GGT) EC 2.3.2.2.

Pertenece a la clase de las transferasas.
Fuentes tisulares: se encuentra en los microsomas y membranas de muchas células,
sobre todo del riñón e hígado. La mayor parte de la actividad en suero se debe a la fracción
producida en el hígado.
Significado clínico: Su elevación en suero indica enfermedades hepatobiliares. Se
eleva sobre todo en casos de obstrucción biliar (colestasis). Se incluye en el perfil básico
hepático, pues es bastante específica de este órgano.
El ALCOHOL y algunos fármacos favorecen su síntesis, por lo que su elevación en
suero puede servir de indicador del alcoholismo. Se puede utilizar para vigilar la abstinencia
de alcohol en alcohólicos que se están rehabilitando, porque los niveles de la enzima en suero
se normalizan unas 5 semanas después de haber dejado el alcohol, pero aumentan mucho en
cuanto se vuelve a tomar.
Métodos de determinación: Se provoca la siguiente reacción:
Gammaglutamil-p-nitroanilina + glicilglicina g-glutamil de glicilglicina + p-nitroanilina.
La p-nitroanilina está coloreada y puede leerse en el espectrofotómetro.

7) ALFA-AMILASA: EC 3.2.1.1.
Pertenece a la clase de las hidrolasas. Necesita calcio como cofactor.
Cataliza la reacción consistente en romper los enlaces alfa (1-4) de los polisacáridos,
transformándolos en moléculas más pequeñas (sobre todo en maltosa, que es un disacárido).
Fuentes tisulares: Acinos de las glándulas salivares y del páncreas.
Una pequeña parte de la amilasa puede filtrarse en el riñón y aparecer en orina.
Isoenzimas: Hay 2 isoenzimas: La P, que viene del páncreas, y la S, que viene de las
glándulas salivares y otros tejidos.
Significado clínico: Ayuda al diagnóstico de la pancreatitis aguda. Se eleva en suero y
orina. Otras enfermedades abdominales también pueden producir hiperamilasemia, por lo que
a veces este dato no es suficiente para asegurar un diagnóstico, por lo que se puede confirmar
la pancreatitis midiendo la enzima lipasa.

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Métodos de determinación: Se aporta un sustrato (por ejemplo, maltotetraosa) para que
actúe la enzima. Después se aparea una 2ª reacción obteniéndose como producto NADH o p-
nitrofenol, que pueden leerse en el espectrofotómetro. No merece la pena separar isoenzimas.

8) OTRAS ENZIMAS DE INTERÉS DIAGNÓSTICO EN LABORATORIO:

 COLINESTERASA: baja en suero cuando hay insuficiencia hepática grave o

intoxicaciones con pesticidas e insecticidas. Sube en diabetes
 LIPASA: aumenta en suero en pancreatitis agudas. A diferencia de la amilasa, nunca
está en orina.
 ALDOLASA: entra en el perfil básico de patología muscular, junto con AST y CK.
 LEUCINAMINOPEPTIDASA: enfermedades hepáticas
 GLUCOSA-6-FOSFATO DESHIDROGENASA: anomalías eritrocitarias.

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