Práctica No.

2
NRC 20220
CINETICA ENZIMATICA
Valentina Nuñez Rojas (id: 433581) y María N. Fonseca Santos (id:427764)
Facultad de ingeniería ambiental. Universidad Pontificia Bolivariana
Km 7 autopista a Piedecuesta, Floridablanca – Colombia
Realizado: febrero 23 de 2021 Entregado: marzo 3 de 2021
Resumen: en la presente práctica se detectó y analizó el comportamiento de algunas enzimas como la
amilasa, según algunas variaciones que se realizaron como la alteración del pH y temperatura. Esto se
hizo con el fin de conocer si esta enzima al ser expuesta tendría un cambio considerable en su volumen,
tiempo o velocidad en la que reacciona a la de manera natural, para esto primero se tuvo que detectar la
presencia de esta enzima utilizando lugol, y luego, se puso a prueba con diferentes pH y temperaturas,
de igual manera para complementar se analizó la actividad cinética en la orina.
Palabras clave: amilasa, degradación, enzima, maltosa, pH, temperatura.
Introducción:
La presente práctica de laboratorio se realiza
con el objetivo de comprender la actividad
enzimática en los diferentes procesos
metabólicos, detallando las acciones u
funciones de dichas enzimas en los diferentes
procesos, de esta manera se determina la
dependencia de la actividad enzimática de Figura 1. Materiales.

factores como el pH, la temperatura, la Procedimiento

concentración de sustratos, y entre otras; para
su determinación, se analizarán los efectos en la  Transformación del almidón en maltosa.
cinética de la amilasa en su degradación utilizando lugol como reactivo
Para este procedimiento, marque un vaso
convirtiéndose en maltosa utilizando como con la palabra “Si” y otro “No”
reactivo Lugol para determinar su
comportamiento frente a diferentes parámetros.
Corte el pan en pequeños pedazos y añada
Metodología: una pequeña cantidad en cada vaso

Para el procedimiento de degradación de

Añada muestra de saliva en el vaso marcado
almidón a maltosa se necesitan los siguientes con la palabra “Si”
materiales:
 Vasos (2) Remoje el pan con una pequeña cantidad de
 Pan agua en los dos vasos para ayudar a la
disolución
 Lugol (yodo)
 Muestra de saliva
 Agua Añada dos gotas de Lugol sobre los dos
vasos

1
 Práctica No.2
NRC 20220

Agite el vaso de manera suave y deje en En el software se implementaron los siguientes

reposo por 15 minutos materiales:
 R1 y R2: componentes del reactivo
Después de dejar en reposo, observe la cromógeno; cuando se mezclan en
coloración obtenida en os dos vasos proporción 1:1 el resultado contiene:
Grafica 1. Procedimiento de degradación de almidona maltosa
 100 mM glicilglicina
con lugol.  3 mM γ-glutamil-3-carboxi-4-
nitroanilida
 Influencia del pH sobre la actividad  100 mM tampón Tris, pH=8.25
enzimática.  Muestra de orina en la que se quiere
Para este procedimiento se tome tres deteminar la actividad enzimática.
tubos de ensayo y agregue 2 mL de las
soluciones tampón de pH 4,0, 7,0 y 10

Agregue la amilasa al 1% se tuvo

que agitar hasta homogenizar
mezcla a cada tubo de ensayo

Figura 4. Materiales
para la determinación de la actividad gamma-
glutamiltranspeptidasa en una muestra de orina.

Para la preparación del experimento, añada

Figura 2. Amilasa en los tubos de ensayo. a las tres cubetas 1 mℓ de R1 y 1 mℓ de
R2, y volúmenes distintos de agua

Posteriormente se agito por 10 min

Procedimiento:
para poder agregar 2 mL de almidón
al 0,5% y luego dos gotas de Lugol.

Agite el vaso de manera suave y deje en

reposo por 15 minutos

Calibra el espectrofotómetro tras introducir

Figura 3. Efecto de pH sobre la actvidad la cubeta nº 1: ajusta la longitud de onda a
enzimatica. 405 nm y pulsa el botón “A=0”. Saca la
cubeta.
Grafica 2. Procedimiento de la influencia de pH sobre la
actividad enzimática.

 Determinación de la actividad gamma-

glutamiltranspeptidasa en una muestra
de orina: Figura 5. Preparación del espectrofotómetro.

2
 Práctica No.2
NRC 20220

Añada orina a la cubeta 2 e introdúzcala en

Al realizar la prueba de lugol casera para
el espectrofotómetro determinar si hay presencia de la enzima
amilasa, se obtuvo que en el vaso que marcado
como “no” el color del lugol se intensificó y se
observó una determinada parte de color morado
A los 30 segundos añada orina a la cubeta 3 oscuro o un café intenso, esto determina que
hay presencia de almidón.
Al cumplirse el minuto, registre la Por otro lado, en el vaso que se encuentra
absorbancia en la pantalla, saque la cubeta 2 marcado como “sí” el lugol se coaguló y se
e introduzca la cubeta 3
observó de un color café intenso lo que
determina la degradación del almidón, en esto
Repita cada 30 segundos la amilasa rompió los enlaces y convirtió al
alternando las cubetas, si el almidón en maltosa y glucosa, lo que significa
tiempo no fuera el previsto,
que en el vaso hubo presencia de la enzima.
anote los datos en las tablas
 Influencia de PH sobre la actividad
Al cumplirse los 10 minutos, copie el enzimática:
listado de los valores de la absorbancia - Datos obtenidos de la influencia del pH
en la cinética enzimática:
Grafica 3. Procedimiento de la determinación de la actividad gamma-
glutamiltranspeptidasa en una muestra de orina. Variació Cambio de Observaciones
n de pH Color
Análisis y discusión de resultados: 4,0 Cambio de un
 Proceso de trasformación de almidón en color rosado a
maltosa utilizado Lugol: azul oscuro, es
decir fue
Tras realizar la experimentación del pan junto positivo.
con la saliva en lugol se obtuvieron los Tiempo
siguientes resultados: reacción:
20seg
7,0 Cambio de un
color amarillo
a azul oscuro,
es decir fue
positivo.
Tiempo
reacción: 10
seg
10,0 En este pH se
evidencia muy
poco cambio
en el color,
debido a que la
muestra era
azul, pero si se
Figura 6. Resultados prueba de Lugol.
evidenció un
azul más

3
 Práctica No.2
NRC 20220

oscuro, es pudo detectar de manera positiva a la enzima,

decir fue pues, aunque había una muy cercana, esta
positivo a este también dio negativa, y en la de 25°C se
pH. Tiempo evidencia que al parecer hubo un error, pues
reacción: generalmente daría positivo.
20seg
Tabla 1: Datos obtenidos de la influencia del pH en la cinética  Datos obtenidos en el estudio de la
enzimática.
influencia de la concentración del
Teniendo en cuenta los resultados anteriores, se sustrato sobre la actividad Enzimática.
puede evidenciar que, a pesar de cambiar el pH,
a uno ácido, neutro y básico, en todos los casos 1. Grafica de tiempo vrs concentración del
la prueba dio positiva en mayor o menor sustrato y del producto a un pH= 7.00 y
medida, es decir, que en cualquier variación del temperatura= 3 ˚C:
mismo se encuentra una actividad enzimática.
 Datos obtenidos de la influencia de la
temperatura en la cinética enzimática:
Tempe Cambio Observaciones
ratura de color
4ºC Debido a que la
temperatura optima
de la amilasa es de
37°C, es certero
tener este resultado
negativo para dicha Figura 7. Grafica tiempo vrs concentración de sustrato con pH 7.
temperatura
En la gráfica se observa como a medida que el
25ºC Es inverosímil, ya
que se debió obtener sustrato va disminuyendo el producto va
un resultado aumentando, es decir, son inversamente
positivo, debido a proporcionales. Se observa que en ph ácidos el
que en las pruebas sustrato tarda más en convertirse en producto
anteriores realizadas debido a que no se encuentra en condiciones
a temperatura óptimas para que ocurra esta reacción, sin
ambiente dieron embargo, al pasar el tiempo esta comienza a ser
positivo más rápida.
40ºC No concuerda el
resultado obtenido 2. Grafica de tiempo vrs concentración del
en cuanto a la sustrato y del producto a un pH= 3.00.
temperatura, ya que
este resultado está
muy próximo a la
temperatura optima

Tabla 2. Datos obtenidos de la influencia de la temperatura en la

cinética enzimática.

A partir de los datos se puede determinar que

ninguna de las tres temperaturas empleadas

4
 Práctica No.2
NRC 20220
datos de dos cubetas y se realiza el respectivo
Figura 8. Grafica tiempo vrs concentración de sustrato con pH 3. cálculo de la concentración de actividad
enzimática en la muestra de orina. Cabe resaltar
En la gráfica se observa como el sustrato
que para la preparación del espectrofotómetro y
desciende de manera acelerada y como el
la práctica del software se realiza la preparación
producto por el contrario asciende de la misma
de la siguiente manera:
manera. Se observa que en un ph neutro la
reacción ocurre de manera acelerada pues es el Se calibra el espectrofotómetro ajustando la
momento en que las condiciones son idóneas. longitud de onda a 405 nm y se pulsa el botón
“A=0” al introducir las cubetas con los
3. Grafica de tiempo vrs concentración del
siguientes volúmenes:
sustrato y del producto a un pH= 11.0
Cubeta 1 2 3
Volumen R1 1 1 1 ml
Volumen R2 1 1 1 ml
Volumen 400 200 0 µℓ
agua
Tabla 3. Datos preparación del espectrofotómetro.

Al ingresar la cubeta No.2 la cual contiene 200

µℓ de orina al espectrofotómetro durante 10
minutos, se obtiene los siguientes datos
Figura 9. Grafica tiempo vrs concentración de sustrato con pH 11. tomados cada 1 minuto:
En esta grafica se puede evidencia al tener un Tiempo Absorbancia
pH 11, el sustrato y el producto se estabilizan y (minutos) cubeta 2
se vuelven constantes. Se observa que, en pH 1 0,036
básico, es mucho más tardada pues llega un
2 0,072
punto en el que simplemente no influye en
3 0,113
nada, y no se genera más producto
4 0,150
Como se pudo analizar con los datos obtenidos, 5 0,187
normalmente el sustrato tiende a agotarse de
6 0,225
manera gradual mientras aumenta el producto.
Desde un pH ácido a uno neutro y ya al llegar a 7 0,266
uno básico este obtiene una nivelación y se 8 0,294
vuelve constante. 9 0,334
10 0,374
 Determinación de la actividad gamma- Tabla 4. Datos obtenidos de la cubeta No.2.
glutamiltranspeptidasa en una muestra
de orina: Al ingresar la cubeta No.3 la cual contiene 400
µℓ de orina al espectrofotómetro durante 10
La determinación de la actividad gamma- minutos, se obtiene los siguientes datos
glutamiltranspeptidasa en una muestra de orina tomados cada 1 minuto:
se realiza mediante la medición de la
absorbancia de esta muestra de orina en un Tiempo Absorbancia
espectrofotómetro, para ello se hace la toma de (minutos) cubeta 3

5
 Práctica No.2
NRC 20220

1 0,069
2 0,141 Absorbancia cubeta 3
3 0,227 0.8
0.7 f(x) = 0.08 x − 0.01
4 0,303 0.6 R² = 1

Absorbancia
5 0,366 0.5
0.4
6 0,443 0.3
0.2
7 0,517
0.1
8 0,595 0
0 2 4 6 8 10 12
9 0,677
Tiempo(min)
10 0,752
Tabla 5. Datos obtenidos de la cubeta No.2.
Datos cubeta No.3:
A partir de los datos obtenidos en el Grafica 5. Absorbancia vs tiempo de cubeta No.3.
espectrofotómetro con las dos cubetas se
procede a analizar la gráfica de tiempo vrs A partir de los datos obtenidos en la gráfica se
absorbancia de las dos cubetas para poder puede determinar la concentración de la
analizar la concentración de la enzima en la pendiente de la siguiente mannera.
orina. 0,752−0,069
m= =0,075
10−1
Datos cubeta 2 Siendo su ecuación y = 0,0755x - 0,0063
0.4
0.35 f(x) = 0.04 x − 0 De esto se deduce que la concentración la
0.3 R² = 1 enzima gamma-glutamiltranspeptidasa en 400
Absorbacia

0.25
0.2 µℓ de orina encontrados en la cubeta No.2 es de
0.15 0,075.
0.1
0.05 Al observar dichos resultados se puede
0
0 2 4 6 8 10 12 determinar que la concentración de la enzima
Tiempo(min) gamma-glutamiltranspeptidasa es menor en la
cubeta 2 que en la cubeta 3, esto puede deberse
gracias a que en la cubeta 3 se tiene una mayor
Datos cubeta No.2:
concentración de orina.
Grafica 4. Absorbancia vs tiempo de cubeta No.2.
Conclusiones:
Al determinar la pendiente de la grafiaca
obtenida se tiene que: Se deduce que el pH no altera la presencia y
funcionamiento de la enzima, sin embargo, la
0,374−0,036 temperatura si tiene efectos en esta enzima,
m= =0 ,0 37
10−1 pues si no se encuentra en la temperatura exacta
Siendo su ecuación y = 0,0374x - 0,0005 esta no tendrá ninguna actividad. En cuanto a su
concentración, este si está ligada al pH, al estar
Por lo que se evidencia que la concentración de ácido o neutro disminuye el sustrato, pero
la enzima gamma-glutamiltranspeptidasa en aumenta en la misma medida el producto,
200 µℓ de orina encontrados en la cubeta No.2 mientras que al estar en forma básica se hace un
es de 0,037. equilibrio. Con esto se pudo deducir que la
concentración del sustrato depende del pH y
6
 Práctica No.2
NRC 20220
que si no está a una temperatura adecuada no se
puede producir la actividad de esta enzima.
En cuanto al lugol, se sabe que este reacciona
en presencia de almidón, por lo cual al estar
expuesto a la saliva este no reacciona porque el
almidón ya ha sido digerido por la enzima
amilasa.
Al analizar la concentración de la gamma-
glutamiltranspeptidasa en la enzima se obtuvo
que la mayor concentración de la enzima en la
orina se encuentra en la cubeta 3 la cual es la
cubeta que contiene el doble de concentración
de orina que la cubeta 2, además de ello está
cubeta no confinen agua, de igual manera se
evidencia que el aumento de la absorbancia con
respecto al tiempo es directamente
proporcional.
Bibliografia:
Baez-Suarez, A. J., Ospina-de-Barreneche, N.,
& Zapata-Montoya, j. E. (Diciembre de 2016).
Andrea J. Baez-Suarez, Nelly Ospina-de-
Barreneche y José E. Zapata-Montoya de
Enzima en la Hidrólisis Enzimática . Obtenido
dehttps://scielo.conicyt.cl/pdf/infotec/v27n6/art
07.pdf
Software implementados:
http://www.districalc.com/laboratorio-de-
enzimas-newbyte/
http://biomodel.uah.es/lab/abs/cinetica.htm