UNIVERSIDAD CATÓLICA DE SANTA MARÍA

FACULTAD DE CIENCIAS FARMACÉUTICAS, BIOQUÍMICAS Y

BIOTECNOLÓGICAS

PROGRAMA PROFESIONAL DE FARMACIA Y BIOQUÍMICA

“EVALUACION DEL CONTENIDO DE l-MENTOL, l-MENTONA Y l-ACETATO

DE MENTILO EN EL ACEITE ESENCIAL DE Mentha piperita L.”

TESIS PRESENTADA POR EL BACHILLER EN FARMACIA Y BIOQUIMICA:

SANTOS BENAVIDES JOSE MIGUEL

PARA OPTAR EL TITULO PROFESIONAL DE:

QUIMICO FARMACEUTICO

ASESOR:

PhD. JAIME CARDENAS GARCIA

AREQUIPA - PERÚ

2013

1
 ÍNDICE

I. CAPÍTULO I: GENERALIDADES
INTRODUCCIÓN.............................................................................................. 1
OBJETIVOS ....................................................................................................... 3
HIPÓTESIS ........................................................................................................ 4

II. CAPÍTULO II: MARCO TEÓRICO

2.1.ACEITES ESENCIALES ......................................................................... 5
2.1.1. Breve Reseña Histórica ...................................................................... 5
2.1.2. Definición .......................................................................................... 5
2.1.3. Características Físicas de los Aceites Esenciales............................... 6
2.1.4. Usos de los Aceites Esenciales. ......................................................... 6
2.1.5. Tipos de Aceites Esenciales ............................................................... 8
2.1.6. Factores que Influyen sobre la Composición y Rendimiento
de los Aceites Esenciales ................................................................... 8
2.1.7. ComposiciónQuímica ........................................................................ 9
i. No Terpenoides ............................................................................. 9
ii. Terpenoides ................................................................................... 9
2.1.8. Biogénesis de los Aceites Esenciales................................................. 12
2.1.9. Obtención de los Aceites Esenciales.................................................. 15
a) Destilación..................................................................................... 15
b) Expresión de Pericarpio ................................................................ 15
c) Dilución en Grasa (enfleurage) ..................................................... 16
d) Extracción con Disolventes Orgánicos ......................................... 16
e) Extracción con Gases en Condiciones Supercríticas .................... 16
2.1.10. Método de Destilación de Aceites Esenciales…………………....17
a) Destilación por Arrastre a Vapor .................................................. 17
b) Hidrodestilación ............................................................................ 17

c) Hidrodestilaciòn Clevenger ............................................................ 17

2.1.11. Rectificación de Aceites Esenciales................................................... 21

2
 2.1.12. Fraccionamiento .......................................................................................... 21
2.1.13. Desterpenado de los Aceites Esenciales ...................................................... 21
2.2. Mentha piperita L.. ................................................................................................ 22
2.2.1. Taxonomía ................................................................................................... 22
2.2.2. Nombres Vulgares ....................................................................................... 22
2.2.3. Etimología ................................................................................................... 23
2.2.4. Origen .......................................................................................................... 23
2.2.5. Descripción Botánica................................................................................... 23
2.2.6. Composición Química ................................................................................. 23
2.2.7. Aceite Esencial de Mentha piperita L. ........................................................ 23
2.2.8. Propiedades funcionales del AE. De Mentha piperita L. ............................ 24
2.2.9. Genotoxicidad y precauciones ..................................................................... 24
2.2.10. Constitución Química del AE. De Mentha piperita L. ................................ 24
a) Mentol .................................................................................................. 26
b) Mentona ............................................................................................... 26
c) Acetato de Mentilo............................................................................... 26
2.3. ANÁLISIS Y CONTROL DE CALIDAD DE LOS ACEITES ESENCIALES
2.3.1. Drogas Vegetales Aromáticas como Materia Prima .................................... 27
2.3.2. Objetivos de Control de Calidad de Drogas Vegetales Aromáticas ............ 27
2.3.3. Normas de Calidad para Aceites Esenciales ................................................ 28
a) Para Fragancias .................................................................................... 28
b) Para Sabores o Alimentación ............................................................... 28
c) Para Industria Farmacéutica y Cosmética ............................................ 28
d) Para Uso Industrial............................................................................... 29
2.3.4. Análisis de la Composición de los Aceites Esenciales ................................ 29
2.3.5. Evaluación de la Concentración de los Aceites Esenciales ......................... 30
2.3.6. Análisis Realizados para el Control de Calidad de AE………………..30
2.4. TÉCNICAS CROMATOGRÁFICAS
2.4.1. Cromatografía de Capa Fina. ....................................................................... 32
a) Eluyentes más comunes para cromatografía en capa fina.................... 32
b) Reveladores más comunes para cromatografía en capa fina................ 33
c) Adsorbentes más comunes para cromatografía en capa fina ............... 33
d) Concepto de Rf. ................................................................................... 33
2.4.2. Cromatografía de Gases ......................................................................... 33

3
 A. Antecedentes/Historia ................................................................. 33
B. Fundamentos Teóricos ................................................................ 35
i. Teorías de las Placas Teóricas ............................................. 35
ii. TeoríaCinética...................................................................... 35
iii. Teoría de las Columnas Capilares ....................................... 36
C. Terminología ................................................................................. 37
D. Funcionamiento de un Cromatógrafo de Gases ............................ 38
E. Características de las Muestras para que puedan ser Analizadas
por GC……………………………………………………………39
F. Componentes de un Cromatógrafo de Gases ................................ 40
1. Gas Carrier................................................................................ 40
2. Sistemas de Inyección .............................................................. 42
3. Columna ................................................................................... 45
4. Programación de la Temperatura.............................................. 51
5. Detectores ................................................................................. 52
a) Detector de Conductividad Térmica (TCD) ....................... 53
b) Detector de Ionización de Flama (FID) .............................. 53
c) Detector Fotométrico de Flama (FPD) ............................... 54
d) Detector de Captura de Electrones (ECD).......................... 55
e) Detector de Fotoionización (PID) ...................................... 56
f) Espectrómetro de Masas ..................................................... 57
6. Cromatografía de Gases y Espectrometría de Masas ............... 59
a) Muestras para GC-MS ........................................................ 61
b) Sistemas de Muestreo GC-MS ........................................... 61
c) Cuantificación GC-MS ....................................................... 62

III. CAPÍTULO III: MATERIALES Y MÉTODOS ........................................... 65

IV. CAPÍTULO IV: RESULTADOS Y DISCUSIÓN ........................................ 86
V. CONCLUSIONES ......................................................................................... 113
VI. BIBLIOGRAFÍA ........................................................................................... 114
VII. ANEXOS ....................................................................................................... 117

4
 AGRADECIMIENTOS

A Dios por haber iluminado mi camino en los momentos de frustración y desesperanza.

Al Doctor Jaime Cárdenas García, quien me asesoro en este trabajo de investigación,

impartiéndome sus conocimientos, concejos y apoyo.

A mis padres.

A mis amigos, en especial a Cynthia y Janeth.

5
 RESUMEN

El presente trabajo de investigación fue realizado en los Laboratorios de Química

Orgánica y Control de Calidad de la Universidad Católica de Santa María durante los
meses de abril a diciembre del 2012.

Se obtuvo tres muestras de Aceite Esencial por Hidrodestilaciòn con trampa Clevenger
a partir de hojas y tallos Mentha piperita L. correspondientes a: Muestra A , Muestra B
y Muestra C, muestras que se encontraban desecadas previamente por razones de
terreno de cultivo, tiempos de siembra y cosecha, obtenidas de lotes distintos pero de un
mismo proveedor y lugar de origen. Obteniéndose porcentajes de rendimiento de aceite
esencial: 1.18% (Muestra A), 0.61% (Muestra B) y 0.88% (Muestra C).

Obtenidas las muestras de aceite esencial de Mentha piperita L. Se procedió a

determinar sus principales características fisicoquímicas, llevando acabo los siguientes
ensayos: Características organolépticas (olor característico, sabor picante y color verde
traslucido) parar las tres muestras A, B y C, Poder Rotatorio ( A: -30°, B: -27.5° y C:-
27.5°) , Densidad ( A: 0.8991 g⁄ml, B:0.8994 g⁄ml y C:0.8987 g⁄ml), Índice de
Refracción (A: 1.4643, B: 1.4573 y C:1.4622) e Índice de Acidez ( A. 1.6715 mg
KOH/g de aceite, B: 1.6881 mg KOH/g de aceite, y C: 1.5759 mg KOH/g de aceite, ).

Luego se sintetizó y purificó los estándares de l-Mentona, y l-Acetato de Mentilo a

partir del Estándar de l-Mentol, obteniendo sus Perfiles Cromatográficos y respectivas
estructuras químicas por GC-MS, para comprobar que la síntesis y purificación se
llevaron adecuadamente siguiendo el protocolo estipulado. Posteriormente se procedió

realizar un análisis cualitativo de los estándares de l-Mentol, l-Mentona y l-Acetato de

Mentilo versus las tres muestras de AE. De Mentha piperita L. obtenidos, por CCF,
obteniendo similaridad en los Rf, y las manchas respectivas a cada componente químico: Rf
0.48 con mancha azul violeta para Mentol, Rf. 0.64 con mancha amarilla para Mentona y
Rf.0.82 con mancha azul violeta para Acetato de Mentilo.

Se procedió a realizar la cuantificación por método de patrón externo de l-Mentol, l-

Mentona yl-Acetato de Mentilo en las tres muestras de AE. de Mentha piperita L.,
utilizando como técnica Cromatografía de Gases acoplada a Espectrómetro de Masas marca
Shimadzu modelo QP Plus 2010, columna RTX-5MS (5% fenil / 95% dimetilpolisiloxano)
de 30 m de longitud, 0.25 um de espesor y 0.25 mm de diámetro, utilizando como gas
6
carrier Helio y temperaturas programadas de 40 °C el horno y 240°C el inyector en una
rampa de 40-110-200 y 240°C , con un flujo de columna de 1.06 ml/mi con soluciones de
aceite esencial disuelto en diclorometano grado GC. y un volumen de inyección de 2 ul. Se
Obtuvo los perfiles cromatográficos, tiempos de retención y áreas bajo la curva
correspondientes a cada componente químico.

Finalmente se obtuvieron los siguientes resultados: Muestra A (l-Mentol 10.93%, l-

Mentona 22.64% y l-Acetato de Mentilo 43.00%), Muestra B (l-Mentol 10.16%, l-
Mentona 15.97% y l-Acetato de Mentilo 62.67%) y Muestra C (l-Mentol 9.07%, l-
Mentona 11.19% y l-Acetato de Mentilo 50.03%). Resultados que fueron evaluados
considerando los factores que son determinantes en la composición y concentración del
Aceite Esencial de Mentha piperita L. como son factores edafológicos, climáticos, fecha de
recolección, edad de la planta, fertilización, etc.

7
 ABSTRACT

This research was conducted in the Laboratory of Organic Chemistry and Quality Control
at the Catholic University of Santa Maria during the months of April to December 2012.

Three samples were obtained by hydrodistillation of essential oil with Clevenger trap from
leaves and stems Mentha piperita L. for: Sample A, Sample B and Sample C , samples were
dried reasons previously cultivated land, planting and harvest times, obtained from the
same place of origin. Obtained percentages of essential oil yield: 1.18% (Sample A), 0.61%
(Sample B) and 0.88% (Sample C).

Samples obtained essential oil of Mentha piperita L. We proceeded to determine their main
physicochemical characteristics, carrying out the following tests: organoleptic
characteristics (odor characteristic spicy flavor and translucent green) stop the three
samples A, B and C, the optical rotation (A: -30 °, B: - and 27.5 ° C: -27.5 °) Density (A:
0.8991 g / ml, B: 0.8994 g / ml and C: 0.8987 g / ml), refractive index (A: 1.4643, B:
1.4573, C: 1.4622) and acid number (A. 1.6715 mg KOH / g oil, B: 1.6881 mg KOH / g of
oil, and C: 1.5759 mg KOH / g oil).

Then was synthesized and purified standards of l-menthone, l-menthyl acetate from l-
Menthol Standard, obtaining their respective chromatographic profiles and chemical
structures by GC-MS to check that the synthesis and purification were carried adequately
following the protocol provided. Then we proceeded to perform a qualitative analysis of the
standards of L-menthol, l-menthone and l-menthyl acetate versus the three samples AE.
Mentha piperita L. obtained by TLC, obtaining similarity in Rf, andthe respective spots
each chemical component: Rf 0.48 with Menthol violet blue stain, Rf. 0.64 with a yellow
stain menthone and Rf.0.82 with violet blue stain menthyl acetate.

The procedure to perform the method of quantification by external standard of l-

menthol, l-menthone and l-menthyl acetate in the three samples AE. Mentha piperita L.,

8
using technique coupled Gas Chromatography Mass Spectrometer model Shimadzu QP
brand Plus 2010, RTX-5MS column (5% phenyl / 95% dimethyl polysiloxane) 30 m long,
0.25 um thick and 0.25 mm in diameter, using helium as carrier gas and temperature
programmed from 40 ° C oven and the injector 240 ° C at a ramp 40-110-200 and 240 ° C,
with a column flow of 1.6 ml / mi solutions of essential oil dissolved in dichloromethane
GC grade. and an injection volume of 2 ul. Profiles was obtained chromatographic retention
times and areas under the curve for each chemical component.

Finally we obtained the following results: Sample A (l-Menthol 10.93%, l-menthone

22.64% and l-menthyl acetate 43.00%), Sample B (l-Menthol 10.16%, l-menthone 15.97%
and l-acetate menthyl 62.67%) and Sample C (l-Menthol 9.07%, l-menthone 11.19% and l-
menthyl acetate 50.03%). Results were evaluated by considering the factors that determine
the composition and concentration of essential oil of Mentha piperita L. such as soil
factors, climate, harvest date, plant age, fertilizer, etc..

9
 CAPÍTULO I

GENERALIDADES

INTRODUCCIÓN

En los últimos años se ha venido incrementando significativamente el interés por los

productos naturales, principalmente por las plantas medicinales y hierbas aromáticas, por
sus variados usos y aplicaciones, convirtiéndolas en la elección preferida de consumo en el
mercado nacional y mayoritariamente a nivel mundial.

Y siendo hoy en día los Aceites Esenciales, que son metabolitos secundarios producidos
por las plantas, en uno de los productos con alto crecimiento de exportación peruana desde
el año 2002 (más de 12.2 millones de dólares al año) (fuente estadística de
EXPORTACIONES PERUANAS VERITRADE LTD). Y entre ellos el aceite esencial de
Mentha piperita L. con gran importancia comercial por sus diferentes usos como son:
preparados para tos como inhaladores nasales, pastas dentífricas, en la industria de los
licores, confitería, perfumería, cosmética, industria farmacéutica,etc.

Pero en la actualidad, las industrias nacionales e internacionales están sometidas a las reglas
de mercado, que imponen una exigencia de calidad, sin las cuales un determinado producto
no sería utilizado por los consumidores.

Por lo que la Evaluación de Calidad de estos aceites esenciales es una tarea de vital
importancia en las industrias, y también como criterio de factibilidad de emprender el
negocio de producción natural de aceites esenciales, a través de una serie de ensayos de
calidad con la finalidad de caracterizar el aceite obtenido, cumplir con las normas de
calidad, detectar adulteraciones, discriminar calidades, como base de datos, determinar
concentraciones de los compuestos químicos, conocer sus estructuras químicas,etc.

Es así que este trabajo de investigación tiene como objetivo principal evaluar el contenido
de l-mentol, l-mentona y l-acetato de mentilo, componentes mayoritarios del aceite esencial

1
de Mentha piperita L, de mayor relevancia comercial, y que se encuentran en diferentes
concentraciones.

Llevando a cabo un protocolo ordenado de obtención del aceite esencial de Mentha piperita
L. por hidrosdestilaciòn, determinando las características fisicoquímicas del aceite
obtenido, para finalmente cuantificar el contenido de los componentes ya mencionados,
utilizando una técnica moderna como es la Cromatografía de Gases acoplada a un
Espectrómetro de Masas. Teniendo en cuenta los diversos factores que intervienen directa o
indirectamente en su rendimiento, composición, concentración, en favor o en contra de las
exigencias del mercado.

2
 OBJETIVOS

I. Extraer Aceite Esencial de Mentha piperita L. por Hidrodestilación con Trampa

Clevenger.

II. Determinar las principales características fisicoquímicas del Aceite Esencial de

Mentha piperita L.

III. Sintetizar y Purificar los Estándares de l-Mentona y l-Acetato de Mentilo a partir

del Estándar de l-Mentol.

IV. Evaluar el Contenido de l-Mentol, l-Mentona y l-Acetato de Mentilo en el Aceite

Esencial de Mentha piperita L.por GC-MS.

3
 HIPÓTESIS

Ya que el Aceite Esencial de Mentha piperita L. es un producto natural constituido por una
mezcla de sustancias diversas, es probable evaluar su contenido de l-Mentol,l-Mentona y l-
Acetato de Mentilo que son sus componentes químicos de mayor importancia industrial.

4
 CAPÍTULO II

MARCO TEÓRICO

2.1. ACEITES ESENCIALES

2.1.1. Breve Reseña Histórica

Los aceites esenciales, son conocidos y utilizados desde la antigüedad en gran número de
aplicaciones: perfumes, ambientadores, cosméticos, medicinas, etc. Existen referencias en
manuscritos egipcios y chinos y alrededor de 200 citas en la biblia.1

Aceite esencial fue un término utilizado por primera vez en el siglo XVI por Paracelso
(famoso médico y farmacéutico) que los utilizó con medicamentos y los consideró como la
quinta esencia o elemento inmaterial presente en todo ser.1

En los siglos XVI y XVII se prepararon por primera vez en las farmacias de todo el mundo.

En el siglo XIX su demanda creció hasta ser necesaria la industrialización de la producción

debido a su uso masivo en perfumes y sabores para alimentación.1

En 1850 el fuerte impulso de la química orgánica sintética y el análisis de algunos aceites

esenciales llevó a la producción de aceite aromático sintético que imitaban a los originales.1

En la actualidad los métodos analíticos modernos nos permiten identificar de manera

exhaustiva los componentes presentes en los aceites esenciales.1

Por otra parte el uso de los aceites esenciales como sustancias medicinales vive un nuevo
impulso, al quedar englobada dentro del gran auge que experimentan los productos
naturales desde hace algunas décadas en los países más desarrollados.1

2.1.2. Definición

Los aceites esenciales son mezclas de sustancia obtenidas de las plantas que presentan
como características principales su compleja composición química.2

5
Es así que los aceites esenciales no son compuestos puros si no mezclas de multitud de
sustancias que se encuentran en distintas proporciones y que en conjunto proporcionan al
aceite esencial sus características propias.1

Entre los componentes de los aceites esenciales, una familia de los hidrocarburos, los
terpenos es la mayoritaria, llegando alcanzar concentraciones del 75% al 90%,
proporcionando su carácter volátil e inflamable y sus propiedades físicas como la densidad
y viscosidad.1

2.1.3. Características Físicas de los Aceites Esenciales

a) Líquidos a temperatura ambiente. 1,2

b) Volátiles. 1,2
c) Aromáticos. 1,2
d) Incoloros o amarillentos. 1,2
e) Menos densos que le agua (canela y clavo: más denso que le agua). 1,2
f) Insolubles en el agua. 1,2
g) Solubles en disolventes orgánicos. 1,2
h) Solubles en alcoholes de alta graduación.1, 2
i) Extraíbles por arrastre de vapor de agua o expresión. 1,2
j) Poder rotatorio. 1,2

2.1.4. Usos de los Aceites Esenciales

El tipo de AE. y su calidad, determina en que producto final será incorporado un aceite. Los
aceites esenciales son ampliamente utilizados como materia prima en diferentes tipos de
industria. Como la farmacéutica, cosmética, alimenticia, etc.3

La tabla 2.1 muestra los usos y aplicaciones de los aceites esenciales en distintas industrias.

6
Tabla 2.1: Usos y Aplicaciones de los Aceites Esenciales en distintas Industrias

INDUSTRIAS APLICACIONES

Salsas
Condimentos
Alimenticias
Bebidas
Alimentos procesados y enlatados

Aperitivos
Licorería
Saborizantes

Perfumes
Dentífricos
Cosmética
Cremas
Lociones

Antisépticos
Analgésicos
Farmacéutica
Saborizantes
Homeopatía

Bioinsecticidas
Agroquímica
Alelo químicos

Textil Elaboración de enmascaradores de olor

Utiliza esencias o terpenos derivados de

Petroquímica y minería ellas como vehículos flotantes y lubricantes

Enmascaradores de olores
Pinturas
Disolvente biodegradable

7
2.1.5. Tipos de Aceites Esenciales

a) AE.s Crudos: Son directamente aislados de la planta, sin procesamiento adicional

alguno.1
b) AE.s Refinados: Tienen mayor valor agregado y se utilizan en industria
farmacéutica, alimenticia, cosmética y de perfumes. 1

2.1.6. Factores que Influyen sobre la Composición y el Rendimiento de los Aceites

Esenciales

La formación de los aceites esenciales en las plantas ha sido objeto de muchos esquemas
propuestos como la biogénesis, reacciones químicas, clima, edad de la planta, etc. Siendo
entonces estos factores de vital importancia en le proceso de producción de un aceite
esencial, por lo que el criterio de calidad de este viene definido mayoritariamente por su
composición química y rendimiento. Criterios que necesariamente tiene que ser evaluados.4

Los siguientes son los factores que influyen sobre la composición química y el rendimiento
del aceite esencial:

a) Métodos de cultivo: fertilizante, abono, distancia de siembra, etc. 5

b) Condiciones geobotánicas: El clima (cálido y luminoso, lluvioso), altitud
(determinante del rendimiento), tipo de suelo (arenosos – arcillosos, humiteros,
calcáreos, pH, etc. Por ejemplo en un suelo arcilloso, compacto y seco, el
crecimiento de la planta resulta defectuoso y su rendimiento en esencia disminuye),
luminosidad, temperatura, etc. 5
c) Época de la recolección: pre floración, plena floración o floración tardía, factor que
determina el bajo contenido o ausencia de precursores químicos de los aceites
esenciales, así como el aumento significativo de otros compuestos quimicos.4, 5
d) Partes de la planta de donde se extrae el aceite esencial: tallos, hojas, flores, raíces.
Se sabe que en ciertas familias de plantas en las hojas se encuentra mayor
porcentaje de rendimiento de los aceite s esenciales.4,5

8
 e) Edad de la planta, factor predeterminante en la composición química de un aceite
esencial, determina la edad de un aceite.4,5
f) Temperatura y formas de secado (al ambiente o temperaturas mayores a los 50 °C
producidas por maquinas industriales) de las plantas.4, 5
g) Método de extracción del aceite: destilación, extracción con solventes, extracción
con fluido supercrítico, etc.4,5

2.1.7. Composición Química

Considerando al aceite esencial como un producto de aroma característico y clasificando su

composición sobre la base de esta propiedad, se puede afirmar que un aceite esencial es una
mezcla de sustancias constituida fundamentalmente por una base integrada por
hidrocarburos terpénicos. En menor concentración se encuentra un número no muy alto de
sustancias químicas volátiles que son responsables principales del aroma global del aceite
esencial.1

La composición química de los aceites esenciales depende también de factores como el

origen botánico, condiciones ambientales, características de cultivo, etc.5

De manera general los compuestos presentes en los aceites esenciales pueden agruparse en:

a) No terpenoides: En este grupo tenemos sustancias alifáticas de cadena corta,

sustancias aromáticas, sustancias con azufre y sustancias nitrogenadas. No son tan
importantes como los terpenoides en cuanto a sus usos y aplicaciones.1
b) Terpenoides: Son los más importantes en cuanto a propiedades y comercialmente.
Los terpenos derivan, de unidades de isopreno (C5) unida en cadena. Los terpenos son
una clase de sustancia química que se halla en los aceites esenciales, resinas y otras
sustancias aromáticas de muchas plantas. Principalmente encontramos en los
aceites monoterpenos (C10), aunque también son comunes los sesquiterpenos
(C15) y los diterpenos (C20). Pueden ser alifáticos, cíclicos o aromáticos.1,
Lo que se expresa en la tabla 2.2.

9
 Tabla 2.2: Grupos Funcionales de los Compuestos Químicos de los AE.

COMPUESTO GRUPO FUNCIONAL EJEMPLO PROPIEDADES

Antimicrobiano
Alcohol OH Mentol Antiséptico
Tonifícate
Espasmolítico
Aldehído CHO Citral Sedante
Antiviral
Mucolítico
Cetona Alcanfor Regenerador celular
Neurotóxico

EspasmolíticoSedativo
Ester Metil salicilato
Anti fúngico

Éteres Cineol Expectorante

Diurético,
Éter fenólico Anetol Carminativo
Estomacal
O CH3

OH

Antimicrobiano,
Fenol Timol Estimulante
Inmunológico

Descongestionante,
Hidrocarburo Solo contiene C y H Pineno Antivírico,
Antitumoral.

10
a. Hidrocarburos Monoterpénicos3

Son los compuestos más abundantes en los aceites esenciales, y precursores de los
más complejos, que son los terpenos oxidados. Se denominan terminando en – eno.

Por ejemplo el limoneno es el precursor de los principales componentes de la esencia

de las mentas (Mentha spp., F. Lamiaceae), como carvona y mentol. El limoneno se
encuentra también en cítricos y en el eneldo, Anethum graveolens (F. Apiaceae).

b. Alcoholes3

Los alcoholes llevan el grupo hidroxilo (- OH) unido al esqueleto C10. Se denominan
terminados en (- ol). Son muy apreciados por su aroma.

Por ejemplo, el linalol, que tiene dos formas, el R-linalol se encuentra en la rosa y la
lavanda y es el componente mayoritario de la Mentha arvensis. La forma S-linalol en
el aceite de lavanda con un contenido > 5% indica adulteración.

c. Aldehídos3

Los aldehídos son compuestos muy reactivos. Se nombran acabados en (– al).

Muchos de ellos, por ejemplo los encontrados en los cítricos, se corresponden con su
respectivo alcohol, por ejemplo, geraniol – geranial o citronelol – citronelal.

Son abundantes en los cítricos, responsables del olor característico, principalmente

los isómeros geranial (α citral) y neral (β citral) juntos conocidos como citral.

d. Fenoles3

Sólo se encuentran en unas pocas especies pero son muy potentes e irritantes.Los más
importantes son el timol y el carvacrol, que se encuentran en los tomillos (g.
Thymus) y oréganos (g. Origanum), ambos de la Fam. Labiatae.

11
 e. Éteres fenólicos3

Son los componentes principales de especias como el apio y el perejil (apiol), anís
(anetol), albahaca (metilchavicol) y estragón (estragol).

f. Cetonas3

Se producen por la oxidación de alcoholes y son moléculas bastante estables.

Terminan en – ona. La carvona está presente en la Mentha spicata.

La tuyona (aislada por primera vez en la Tuya, Thuja occidentalis, F. Cupressaceae) y

pulegona son bastante tóxicas y nunca deben usarse en el embarazo.

h. Ésteres3

La mayoría de los éteres se forman por reacción de un alcohol terpénico con ácido
acético. Su aroma caracteriza a los aceites en los que se encuentran.

Por ejemplo, el aceite de lavanda contiene linalol y su éster, acetato de linalilo. La

abundancia relativa de estos dos compuestos es un indicador de buena calidad.

2.1.8. Biogénesis de los aceites esenciales

En las plantas se presentan unas vías metabólicas particulares, no existentes en los

animales, por las cuales se pueden producir grandes cantidades de compuestos de
naturaleza química conocida. El conjunto de estas vías metabólicas recibe el nombre de
metabolismo secundario.1, 7

a) Cabe señalar que, los productos de este proceso de biosíntesis, en general cumplen
con las siguientes funciones:1
‐ No juegan rol en el metabolismo primario.
‐ Tiene una distribución restringida.
‐ La principal función de algunos de ellos es la defensa contra el ataque de
insectos y patógenos.

12
 ‐ Se acumulan en grandes cantidades sin efectos negativos en las células o en
las plantas.
b) Metabolismo de las plantas: el metabolismo secundario se puede definir como la
biosíntesis, trasformación y degradación de los compuestos endógenos mediante
proteínas.7
‐
Según las vías biosintéticas que les dan su origen, los metabolitos se dividen
en tres grupos: (1) Terpenos, (2) Compuestos fenólicos (3) Nitrogenados,
que se obtiene a partir de vías de síntesis relacionadas con rutas
degradativas del metabolismo primario de las plantas.7

13
 ‐

CO2 + H2O
Fotosíntesis

Metabolismo Primario del Carbono

Eritrosa-4-fosfatoFosfoenol piruvato Piruvato 3Fosfoglicerato

Ruta del ácido Shiquimico Ruta del MEP

Ciclo de Krebs (acido cítrico) AcetilCoA

Aminoácido alifático

Ruta ácido mevalónico

Aminoácidos Aromáticos Ruta ácido malónico TERPENOS

COMPUESTOS NITROGENADOS

COMPUESTOS FENOLICOS

Fig. 2.1: Interconexión de los principales grupos de metabolitos secundarios y su

relación con la fotosíntesis.7

c) Compuestos Terpénicos: La biosíntesis de los terpenos depende de un número

variable de condensaciones del isopreno (2-metil-1,3-butadieno).7
Existen dos rutas biosintéticas para la formación de terpenos:7
i. Ruta del Ácido Mevalónico: Se lleva a cabo en el citosol.

El intermediario en esta vía es el ácido mevalónico, el cual es formado por la

reducción enzimática de la 3-hidroxi-3-metilglutaril coenzima A (HMG-
CoA), la cual es a su vez formada por la condensación de la acetil coenzima

14
 A y acetoacetil coenzima A. Dos fosforilaciones sucesiva del ácido
mevalónico, y la posterior eliminación del grupo hidroxil y carboxil dan
lugar al IPP5.

Esta vía biosintéticas se muestra a continuación en la figura 2.2.

Acetoacetil CoA HMG-CoA Acido Mevalónico

Acetil CoA

DMAPP IPP

Fig. 2.2: Ruta del Ácido Mevalónico para la formacion de terpenos

ii. Ruta del MPE (metileritritol-4-fosfato): Se lleva a cabo en los plastidios.

El IPP proviene de la 1-deoxixilulosa-5-fosfato (1-DXP), esta ultima proviene
de lo intermediarios glicoliticos; gliceraldehido-3-fosfato y piruvato. El paso
fundamental en esta via, es la reducción y reordenamiento de 1-DXP para
formar 2C-metileritritol-4-fosfato (MEP) usando como cofactor al NADH.7

15
 MEP se convierte en IPP por una serie de reacciones quimicas que llevan a la
formación del intermediario(E)-4-hidroxi-3-metilbut-2-enil pirofosfato
(HMBPP) y la remoción de agua.7

2.1.9. Obtención de Aceites Esenciales

Los aceites esenciales se extraen de los tejidos mediante diversos procedimientos físicos y
químicos, en función, principalmente de la parte de la planta en las que se encuentran
(pétalos, raíces, tallo, ramas, semillas, savia, hojas), así como la posibilidad de
descomponer estos compuestos.1

a) Destilación: La destilación es una de las principales técnicas para separar mezclas

de líquidos. La separación se fundamenta en la diferencia de la presión de vapor de
los diferentes componentes de la mezcla. Al calentarse la mezcla los componentes
se evaporan para condensarse posteriormente y durante el proceso, el vapor (y por
lo tanto el condensado) se enriquece con los componentes mas volátiles. 8
De manera general la destilación es una técnica general usada para remover un
solvente, purificar un líquido o separar los componentes de una mixtura de
liquidos.9
Los tipos de destilación más común son destilación simple, destilación fraccionada
y destilación por vacío. 9
b) Expresión del pericarpio: Esta técnica se aplica a los frutos de los cítricos para
conseguir el aceite esencial, lugar donde se encuentran las glándulas que contiene
las células productoras del aceite rellenas con protoplasma, la materia proteínica
responsable de los procesos químicos en el interior de las células.1,7

La técnica tiene como variantes la escarificación y la presión superficial lateral o

expresión de la corteza, ambas de aplicación manual. Cada uno de estos procesos
libera aceite esencial y protoplasma desde las glándulas rotas, la cual
posteriormente es lavada medianamente con una corriente de agua o sometida a la
centrifugación para recuperar el aceite. Además durante la producción, la
concentración de un aceite cítrico exprimido, inevitablemente, entran en contacto
con el agua, con el oxígeno del aire, y con enzimas capaces de acelerar
enormemente diversas reacciones oxidativas e hidrolíticas.7

16
 c) Disolución en grasa (enfleurage): Los aceites son solubles en grasas y alcoholes
de alta graduación. Sobre una capa de vidrio se coloca una fina película de grasa y
sobre ella los pétalos de flores extendidas. La esencia pasa a la grasa, así hasta
saturación de la grasa. Posteriormente con alcohol de 70º, se extrae el aceite
esencial. Se emplea para flores con bajo contenido en esencias pero muy preciadas
(azahar, rosa, violeta, jazmín).1,7
d) Extracción con disolventes orgánicos: que penetran en la materia vegetal y
disuelven las sustancias, que son evaporadas y concentradas a baja temperatura.
Después, se elimina el disolvente, obteniendo la fracción deseada. La selección del
disolvente pretende que sea capaz de disolver rápidamente todos los principios y la
menor cantidad de materia inerte, que tenga un punto de ebullición bajo y uniforme
que permita eliminarlo rápidamente, pero evitando pérdidas por evaporación,
químicamente inerte, para no reaccionar con los componentes de los aceites, no
inflamable y barato. Este disolvente ideal no existe, y los más empleados son el éter
de petróleo, con punto de ebullición de 30 a 70 °C, que se evapora fácilmente y es
inflamable, benceno, que disuelve también ceras y pigmentos, y alcohol, que es
soluble en agua. Se emplea cuando hay componentes de peso molecular elevado
que no son lo suficientemente volátiles.1
e) Extracción con gases en condiciones supercríticas: Se emplean gases,
principalmente CO2, a presión y temperatura superiores a su punto crítico. En esas
condiciones se obtienen buenos rendimientos y se evitan alteraciones de los
componentes de la esencia. La infraestructura necesaria es cara, pero tiene
susventajas, como la fácil y rápida eliminación del gas extractor por
descompresión, la ausencia de residuos de disolventes y que los gases no resultan
caros.1

2.1.10. Método de Destilación de Aceites Esenciales

La obtención de los aceites esenciales es realizada comúnmente por la tecnología

llamada de destilación por arrastre de vapor, en sus diferentes modalidades. La
pureza y el rendimiento del aceite esencial dependerán de la técnica que se utilice
para su aislamiento.

17
a) Destilación por Arrastre de Vapor
Es llamada también destilación por arrastre de vapor, extracción por arrastre,
hidrodifusión, hidroextracción o HIDRODESTILACIÓN. Sin embargo, no existe
un nombre claro y conciso para definirla, debido a que se desconoce que pasa
exactamente en el interior del equipo principal y porque se usan diferentes
condiciones del valor de agua para la obtención.10
Es así que cuando se usa vapor saturado o sobrecalentado, fuera del equipo principal,
es llamado “DESTILACIÓN POR ARRASTRE DE VAPOR”. 10
Cuando se usa vapor saturado, pero la materia prima está en contacto íntimo con el
agua que genera el vapor se le llama “HIDRODESTILACIÓN” .10
b) Hidrodestilación

El material está en contacto íntimo con el agua generadora del vapor. En este caso
se ponen en el mismo recipiente el agua y el material a extraer, se calientan a
ebullición y el aceite extraído es arrastrado junto con el vapor de agua hacia un
condensador, que enfría la mezcla, la cual es separada posteriormente para obtener
el producto deseado. 11

c) Hidrodestilación Clevenger:

El Equipo Clevenger es usado en muchos laboratorios y considerado en varios

estándares internacionales, como el más adecuado para obtención de aceite esencial
de una planta aromática.10, 12

Está compuesto de un balón donde se deposita la materia prima molida y una

cantidad conocida de agua pura. Se le calienta constantemente, el aceite esencial
con el agua presente se evaporan continuamente. Un condensador va acoplado al
balón y una conexión en forma de D, permite acumular y separar el aceite esencial
de la mezcla condensada. El agua floral condesada regresa al balón por el rebose de
la conexión.10, 12,13

18
 Figg.2.3: Equip
po Clevengeer

Cuanndo destilam
mos plantass aromáticaas con la finalidad dde obtener aceites eseenciales
mos tener enn cuenta lass siguientes consideraciiones:
debem

aa. Tratamieento del Maaterial de laa Planta: T

Tener en cuenta los sigguientes facctores:

‐ R
Reducción d nta: Los aceeites esenciiales se encuuentran
del tamaño de la plan
coontenidos dentro
d de gglándulas grasas,
g venas, sacos dde aceite o pelos
gllandulares een las planttas aromáticcas. Si el m
material de la
l planta see dejara
inntacto, los aaceites seriaan removidoos (evaporaddos) por el vapor soloddespués
quue ellos hayyan pasado a través de llos tejidos dde la planta y se exponggan a la
Para evitar esto, el maaterial debee ser trituraado, desintegrado,
suuperficie. P
coortado, mollido, etc. anntes de su destilación,, de tal maanera que ahora
a el
acceite volátiil estará exxpuesto seerá llevadoo con el ppaso del vaapor.La
deestilación de la planta después del triturado ddebe ser inm
mediatamennte para
evvitar que se evapore parrcialmente.110
‐ A
Almacenamiiento del M de la Plantta: El almaacenamientoo de la
Material d
pllanta antes de
d su trozaddo debe ser en condicioones óptimaas como atm
mósfera

19
 seca, baja temperatura y un ambiente libre de circulación de aire para evitar
la oxidación y rezonificación de los aceites esenciales.10
‐ Pérdida de Aceite Esencial en el Material de la Planta antes de la
Destilación: El aceite volátil contenido en el tejido de la planta es de algún
modo, afectado por el secado de la planta después de su cosecha. La pérdida
del aceite durante el periodo de marchitez y secado de la planta es mucho
mayor a la perdida ocurrida durante el almacenamiento del material de la
planta después de esta ha sido secada. Esto puede ser explicado por el hecho
de que durante estas primeras etapas la planta retiene una gran cantidad de
humedad en las células, la cual lleva por difusión el aceite a la superficie y
ayuda a su evaporación. Una vez que la humedad ha desaparecido y la planta
se ha secado, la hidrodifusión ya no puede ocurrir.10
‐ Cambio de la Propiedades Físico-Químicas de los Aceites Esenciales
durante el Secado de la Planta: Aceites esenciales destilado de partes
frescas o secas de la planta, muestran una amplia variación en sus
propiedades físico-químicas y su composición química. Esto es
especialmente cierto en flores, hojas, hierbas y raíces, las cuales en su estado
fresco contienen mucho mas humedad.10

b. Factores que acompañan una Destilación

‐ Difusión de Aceites Esenciales y Agua caliente a través de la Membrana
de las Plantas: Después que el material de la planta ha sidotrozado, solo
una parte del aceite esencial está presente en las superficies e
inmediatamente disponible para su evaporación. El resto del aceite llega ala
superficie solo después de difundir a través de una pared (diafragma), se
aplica el término “libre difusión”, si la difusión se realiza a través de una
membrana permeable, se llama osmosis.10

La destilación de material de la planta está relacionada a procesos de

difusión y principalmente de ósmosis. La destilación ofrece buenas
condiciones para la ósmosis del aceite, porque la alta temperatura y el
movimiento del agua, causado por las fluctuaciones de presión y temperatura

20
 dentro del destilador, aceleran las fuerzas de difusión hasta un punto tal que
todo el aceite volátil contenido dentro del tejido de la planta puede ser
colectado. A la temperatura de ebullición del agua, una pared del aceite
volátil se disuelve en el agua resiente dentro de las glándulas de la planta.
Esta solución de aceite en agua fluye por ósmosis, a través de las membranas
hinchadas y finalmente llega a la superficie, donde el aceite es evaporado por
el paso del vapor. La velocidad de la evaporación del aceite en la destilación
de la planta, está influenciada no tanto por la volatilidad de los componentes
del aceite, si no por su grado de solubilidad en agua. Todos los aceites
esenciales son solubles en agua caliente, aunque sea en un grado ligero.10

‐ Efecto de la Hidrólisis en la Destilación de la Planta: En presencia de

agua y particularmente a elevada temperatura, los ésteres tiene a reaccionar
con el agua para formar los ácidos y los alcoholes originales.
Consecuentemente, si la cantidad de agua es grande, y existen las
condiciones ácidas, se obtendrán cantidades significativas de alcohol y
ácido. La hidrólisis tomará así, una gran extensión.10
‐ Efectos del Calor de Destilación de Plantas: Prácticamente todos los
constituyentes de los aceites esenciales son de algún modo inestables a
temperaturas altas. Con el fin de obtener la mejor calidad el aceite, es
necesario asegurarse que durante la destilación, los aceites esenciales (oel
material de la planta) sean mantenidos a bajas temperaturas o en todo caso
que sean mantenidos a altas temperaturas por el menor tiempo posible.10

2.1.11.Rectificación de Aceites Esenciales

Es el proceso más común, consiste en fraccionar en una columna de rectificación

obteniéndose porciones que son analizadas individualmente. Aquellas que tengan una
misma calidad se juntan. Generalmente un AE. se fracciona en tres partes. 7
a) Cabeza o fracción liviana
b) Corazón o parte media
c) Fracciones pesadas

21
2.1.12.Fraccionamiento
Es la separación dela aceite volátil en varias fracciones según sus puntos de ebullición. En
la mayoría de los casos se obtiene pordestilación al vacío. 9

a) Destilación al Vacío: Como su nombre lo insinúa la destilación al vacío (simple o

fraccionada), crea un vacío parcial dentro del sistema con la finalidad de destilar
sustancias por debajo de su punto de ebullición normal. Por lo tanto sirve para
destilar sustancias con un alto punto de ebullición, y también nos permiten
purificarlas.9

2.1.13. Desterpenado de Aceites Esenciales.

Se basa en el refinamiento del aceite esencial que consiste en redestilar el producto al vacío.
Este proceso a su vez concentra el contenido de componentes importantes de los productos.
Los terpenos y sesquiterpenos no solo son de poco valor para la fuerza y el carácter de los
aceites, sino que también se oxidan y polimerizan rápidamente en reposo para formar
compuestos de un sabor fuerte y semejante a la trementina.7

2.2. Mentha piperita L.

22
 Fiig.2.4: Plan
ntas de Men
ntha piperita
ta L.

2.2.1.Taxonomíía14
REIN
NO : VE
EGETAL
DIVIISIÓN : FA
ANEROGAM
MAS
CLASE : DIC
COTILEDO
ONEAS
ORD
DEN : SUP
PEROVAR
RICAS
FAM
MILIA : (Laabiada)
GÉN
NERO : LA
AMIACEAE
E
ESPE
ECIE : Meentha piperiita L.

2.2.2. Nombres Vulgares 144

Casteellano : Menta piccante
Italiaano : Menta pipperita

2.2.3. Etimologíía5

23
El nombre genérico Mentha deriva de la ninfa griega Mintha, enamorada de Zeus, a quien
la diosa Persefone, celosa, transformo en planta. El nombre especifico deriva de la palabra
latina piper, pimienta, por el sabor picante de su esencia.

2.2.4. Origen14
Centro de origen: Europa y África del Norte, con amplia presencia en Asia y América.

2.2.5. Descripción Botánica

La menta piperita es un híbrido de la menta acuática a sándalo de agua (M. aquatica L.) y
de la menta romana, menta de espiga o hierbabuena (M. viridis L. = M. spicata L.); como
esta última es, a su vez, probablemente, un híbrido de dos mastranzos, el común (M.
rotundifolia L.) y el nevado (M. longifolia.L = M. sylvestris L., resulta que la M. piperita es
el resultado de una triple hibridación natural.5
Es una planta herbácea, vivaz, de tallos erectos cuadrangulares, muy ramificados que puede
alcanzar los 80 cm de altura. Las hojas opuestas, pecioladas, con bordes aserrados, de color
verde oscuro en la cara superior y más claro en la cara inferior. Los estolones, de sección
cuadrangular, crecen bajos y sobre la superficie de suelo en todas las direcciones.
Existen más de 25 especies de menta, tanto silvestres como domésticas. La mayoría de las
especies son perennes. Las mentas son ricas en aceites volátiles de composición variada.5

2.2.6.Composición Química
Las hojas contienen de 10 a 12 % de elementos minerales, flavonoides, ácidos fenólicos,
taninos.14
Contiene de 0.5% a 1% de aceite esencial 14,15

2.2.7. Aceite Esencial de Mentha piperita L.

a) El aceite esencial de Mentha piperita L. es obtenido de todas las partes de la planta,
pero en mayor concentración de las hojas.5, 15

b) Presenta un color amarillo pálido o amarrillo verdoso pálido.5, 15

24
 c) El olor es característico con sensación de frescura.5, 15
d) Es obtenido generalmente por destilación y rectificado por fraccionamiento para sus
diferentes usos.5
e) El AE. de Mentha piperita L. es muy usado en comidas, en industria farmacéutica,
medicina, cosmética, perfumería, etc. y es uno de los aceites esenciales más
producidos por su importancia económica en el mercado internacional.5, 15

2.2.8.Propiedades Funcionales del AE. DE Mentha piperita L.

Es usado:
En síndrome de intestino irritado, como antimicrobiano, para las náuseas, como repelente
de mosquitos, tratamiento de desórdenes nerviosos y fatiga mental, indigestión, antitusivo,
descongestionante nasal, desordenes biliares, aromaterapia con fines de relajación.16, 17

2.2.9. Genotoxicidad y Precauciones

El AE. de Mentha piperita L. en humanos induce aberraciones de los cromosomas solo
cuando la inhibición de la actividad mitótica es mayor a 70%.
El AE. de Mentha piperita L. no es tóxico ni irritante en diluciones bajas, pero la
sensibilidad pude ser un problema debido al contenido de mentol. Puede causar irritación
de la piel y mucosas, debe ser alejado de los ojos.16

2.2.10. Constitución Química del AE. de Mentha piperita L.

El aceite esencial de Mentha piperita L. contiene varios constituyentes: limoneno, cineol,
mentona, mentofurano, isomentona, acetato de mentilo, isopulegol, mentol, pulegona y
carvona, etc. 16

Estructuras químicas que se presentan en la figura 2.5

25
Fig.2.5: Principales Constituyentes Químicos del AE. de Mentha piperita L.

Limoneno Acetato de mentilo Mentol

Mentona Pulegona Carvona

26
 Mentofurano

Los compuestos químicos mayoritarios del AE. de Mentha piperita L. son el mentol,
mentona y acetato de mentilo, pero su concentración en la planta depende de factores
endógenos de la planta (biosíntesis) y de factores externos (clima, abono, edad,
temperatura, etc.).
a) Mentol: Es un alcohol secundario que se obtiene del AE. De Mentha piperita L. o
de otras mentas, o preparado sintéticamente a partir de la hidrogenación del timol.
Es un sólido cristalino de densidad 0.89 g/cm3, punto de fusión 41-43 °C, punto de
ebullición 212 °C, poder rotatorio de -50° y un Índice de refracción de 1.458y peso
Molecular 156.3 g/mol 18,19
b) Mentona: Es una cetona que se obtiene del AE. de Mentha piperita L. o de otras
mentas, o preparado sintéticamente a partir del mentol.
Es un líquido de densidad 0.895 g/cm3, punto de fusión -6 °C, punto de ebullición 207
°C, poder rotatorio de -24.8 °y un índice de refracción 1.450y Peso Molecular
154.3g/mol 18, 19
c) Acetato de Mentilo: Es un éster que se obtiene del AE. de Mentha piperita L. ó de
otras mentas, o preparado sintéticamente a partir del mentol.
Es un líquido de densidad 0.9 g/cm3, punto de ebullición 227 °C, poder rotatorio -
79.42° y un índice de refracción 1.446 y Peso Molecular 198.3g/mol 18,19

2.3. ANÁLISIS Y CONTROL DE CALIDAD DE LOS ACEITES ESENCIALES

Para la utilización de los aceites esenciales es necesario conocer su composición detallada y

sus características fisicoquímicas y organolépticas, como parámetros imprescindibles para a
establecer las normas que determinen sus requisitos mínimos de calidad.20

A estas determinaciones habrá que agregarles los ensayos que aseguren su eficacia y la
inocuidad de su uso.

27
Se debe controlar también la calidad de la materia prima de la obtención de los aceites
esenciales: las plantas aromáticas. Bien se comercializan para su consumo en forma directa,
ya sea con finalidad medicinal, alimentación, cosmética, etc.20

Las exigencia de control de calidad, difieren según el uso final que se le dará a la planta o
al aceite esencial que de ella se obtenga, por lo que no es posible indicar un único control
de calidad analítico.20

2.3.1. Drogas Vegetales Aromáticas como Materia Prima20

a) Las drogas vegetales aromáticas pueden hallarse en el mercado entero o bien

troceado con diferentes tipos de corte.
b) Se pueden transportan en diferentes recipientes (ejemplo: yute, papel)
c) Cuando se las recepcionan, tras controlar el peso e inspeccionar que su contenido
corresponda a lo indicado en los envases contenedores y notas de entrega, así como
la ausencia de posibles daños ocasionados durante el transporte (por ejemplo,
infestación por insectos, hongos, contaminación cruzada por olores, envases
mojados , etc.), deben someterse a un periodo de cuarentena, hasta evaluará su
calidad.
d) De cada lote se efectúa una toma de muestras siguiendo un esquema
predeterminado, descrito en algunas farmacopeas o normas específicas, siendo este
el más representativo del lote posible.

2.3.2. Objetivos del Control de Calidad de las Drogas Vegetales Aromáticas20

a) Asegurar la identidad del material, es decir confirmar que corresponda a la parte de

la planta y la especie vegetal correspondiente.
b) Asegurar que se encuentran en las condiciones adecuadas de comercialización por
lo que se refieren a su estado de conservación y pureza, es decir, que no a sufrido
alteraciones, adulteraciones ni excede los límites de materias extrañas u otros
contaminantes.
c) Asegurar que contiene la cantidad adecuada de aceite esencial, y que su
composición es correcta. (En este caso de un uso específico, como medicinal,

28
 cosmético o alimenticio, puede ser conveniente el análisis de otros grupos de
principios activos también).

2.3.3. Normas de Calidad para Aceites Esenciales20

a) Para Fragancias
‐ La calidad está determinada principalmente por las características olfativas.
‐ La industria de las fragancias suele utilizar patrones propios de referencia,
típicos para cada empresa, y a veces para cada producto terminado donde va ser
usado.
‐ Debe destacarse en este ámbito el rol que juegan las normas IFRA (International
Fragrance Associaton), como determinantes de aquellos productos aromáticos
que tienen restricciones o prohibición de uso.

b) Para Sabores o Alimentación20

‐ La calidad depende de su sabor y olor.
‐ Las normas correspondientes están inscritas en los códigos alimentarios y
legislaciones nacionales sobre los alimentos.
‐ También en este caso debe recalcarse las normas IOFI (International
Organization of the Flavour Industry), que al igual con las normas IFRA para
la industria de fragancias, tratan de regular o restringir el uso de determinadas
materias primas, tanto naturales como sintéticas.

c) Para la Industria Farmacéutica y Cosmética20

‐ La calidad está supeditada a la presencia de constituyentes activos definidos,
los que deben ser cuantificados, o a su actividad farmacológica, aunque no se
conozca con certeza cual o cuáles son sus principios activos.
‐ En estos casos solamente se podrá hacer una evaluación a través de su perfil
cromatográfico, contra patrón. Las normas están dadas por las Farmacopeas
oficiales, tanto nacionales o internacionales (Farmacopea Europea) o herbarias

29
 (como la Farmacopea Ufficiale Italiana (1992) o la British Herbal
Pharmacopoeia (1996).
‐ Cuando el uso es cosmético, las normas mas empleadas son las publicadas por
FMA (Fragrance Material Association), IFRA (International Fragrance
Association) y las AFNOR (Francia), ISO (Internacionales), o las normas
nacionales existentes en muchos otros países.
d) Para uso Industria20
‐ Se busca disolvente, agente de flotación de minerales, etc.
‐ Aquí pueden ser parámetros trascendentales la densidad relativa, tipo de
destilación, el color, constante dieléctrica, su poder disolvente, sin importar
tanto el olor, el sabor o la constitución específica de cada esencia.

2.3.4. Análisis de la Composición de los Aceites Esenciales20

Son mezclas que pueden llegar a ser muy complejas, por lo que la identificación de sus
componentes no es una tarea simple.

‐ Antiguamente esta identificación se convertía en una larga y tediosa operación,

que consumía muchísimo tiempo, ya que requería el aislamiento y purificación
de cada componente por técnicas combinadas de destilación fraccionada, CCF,
cristalización, etc.
‐ Por ello se usaba comúnmente para el control, la determinación de sus
constantes físicas (principalmente solubilidad, densidad, poder rotatorio e
índice de refracción) o algunos índices químicos (acidez, de acetilo, fenoles,
etc.)
‐ En las últimas décadas, el desarrollo de técnicas instrumentales de análisis y su
acoplamiento a sistemas informáticos y base de datos, ha cambiado
sustancialmente el panorama, agilizando de manera notable la identificación de
los componentes de las esencias.

Han contribuido especialmente a este cambio el desarrollo de:

‐ Técnicas cromatográficas de alta resolución, principalmente la cromatografía
de gases con columnas capilares.

30
 ‐ Técnicas espectroscópicas, particularmente la espectrometría de masas (EM), la
espectroscopia infrarroja (IR) y la espectroscopia de resonancia magnética
nuclear (RMN).

‐ Sistemas cromatográficos acoplados a técnicas espectroscópicas, especialmente

la cromatografía de gases acoplada a la espectroscopia de masas (CG-MS) y la
cromatografía de gases acoplada a la espectroscopia infrarroja (CG-IR).

2.3.5. Evaluación de la Concentración de los Aceites Esenciales20

‐ Para el cumplimiento de las normas de calidad

‐ La detección de adulteraciones, por ejemplo el agregado de diluyentes, u otros
casos el agregado de mentol a esencias naturales de mentas, o el de terpenos
cítricos a la esencia de limón.
‐ Discriminación de calidades: como puede ser diferenciar una esencia de
Geranio Europeo de otro de origen Africano.
‐ Normalización de calidades: como la estandarización de una esencia de menta
por mezclado de distintas partidas con diferentes calidades.
‐ Determinación de que el producto es realmente natural.
‐ Como base de datos
‐ Como aporte científico.

2.3.6. Análisis Realizados para el Control de Calidad de Aceites Esenciales

Dentro de todos los niveles de la cadena productiva de aceites esenciales, el primer control
que se realiza, es el de los parámetros organolépticos. Esta prueba se realiza para saber si el
AE. presenta adulteración, aunque en otros casos, el comprador puede exigir un análisis
químico con el fin de saber la proporción en la cual se encuentran los componentes
principales o en el peor de los casos, exigirle a la empresa certificaciones BPM, ISO, etc.7,20

La tabla 2.3 muestra los principales análisis de control de calidad que se le debe realizar a
los aceites esenciales.

31
Tabla 2.3: Análisis que más se utilizan para el Control de Calidad de los AE.s:

Características Determinaciones Índices Cromatografía Características

Organolépticas Físicas Químicos Cuali- Espectroscópica
Cuantitativa

Perfil
Densidad
Olor Índice de Acidez Cromatográfico UV
Poder Rotatorio
Sabor por GC IR
Índice de
Color CCF
Refracción

2.4. TÉCNICAS CROMATOGRÁFICAS

La cromatografía se define como la separación de una mezcla de dos o más compuestos por
distribución entre dos fases, una de las cuales es estacionaria y la otra una fase móvil.
Varios tipos de cromatografía son posibles, dependiendo de la naturaleza de las dos fases
involucradas: sólido-liquido (capa fina, papel o columna), liquido-líquido y gases-liquido
(fase vapor).21

Todas las técnicas cromatográficas dependen de la distribución de los componentes de la

mezcla entre dos fases inmiscibles: una fase móvil, llamada también activa, que transporta
las sustancias que se separan y que progresa en relación con la otra, denominada fase
estacionaria. La fase móvil puede ser un líquido o un gas y la estacionaria puede ser un
sólido o un líquido.21

Todos los sólidos finamente pulverizados tienen el poder de adsorber en mayor o menor
grado otras sustancias sobre su superficie; y, similarmente, todas las sustancias pueden ser

32
adsorbidas, unas con más facilidad que otras. Este fenómeno de adsorción selectiva es el
principio fundamental de la cromatografía.21

2.4.1. Cromatografía De Capa Fina (CCF).

‐ En este caso se utiliza una placa recubierta con fase estacionaria manteniendo un
pequeño espesor constante a lo largo de la placa. El eluyente ascenderá, por
capilaridad, por la placa y arrastrará los componentes a lo largo de ésta produciendo
“manchas” de los componentes.22,23,24

‐ Se usan láminas de: vidrio como soporte del adsorbente, plástico (ej.: acetato) ó
metálicos (ej.: aluminio). Los tamaños de la placa para CCF. convencional son: 20 x
20; 10 x 20 y 5 x 2.1823

‐ Hay placas que contienen un indicador de fluorescencia, para facilitar la

identificación de las muestras. Si no se usa indicador y los componentes no son
coloridos se requerirán técnicas de revelado.23

a) Eluyentes más comunes para cromatografía en capa fina.23

‐ éter de petróleo
‐ tolueno
‐ dietil-éter, t-butil-éter
‐ diclorometano
‐ acetato de etilo
‐ n-pentano, n-hexano
‐ ciclohexano
‐ tetracloruro de carbono
‐ éter dietílico
‐ cloroformo
‐ acetona
‐ iso-propanol

33
 ‐ etanol
‐ metanol
‐ ácido acético

b) Reveladores más comunes para Cromatografía en Capa Fina

Las manchas de color son, por supuesto, inmediatamente visibles; las incoloras
puedenrevelarse mediante:
‐ Luz UV: si la sustancia absorbe luz ultravioleta, se puede usar una
fase estacionaria impregnada con un indicador fluorescente (F254 ó
F366).23
‐ La introducción de la placa en vapores de yodo.18
‐ El rocío con una solución de agua/H2SO4 (dentro de un
compartimiento especialmente protegido y bajo una campana de
extracción de gases).23
c) Adsorbentes más comunes para Cromatografía en Capa Fina.23
‐ Sílica gel (se utiliza en el 80% de las separaciones)
‐ Óxido de Alumínio ó Alúmina (ácida, neutra ó básica)
‐ Celulosa (Nativa o micro-cristalina)
‐ Poliamidas

d) Concepto de R.F.23
‐ Rf es el registro y se define como:
‐ Rf = distancia que recorre la muestra desde el punto de aplicación /
distancia que recorre eldisolvente hasta el frente del eluyente
‐ El valor de Rf depende de las condiciones en las cuales se corre la
muestra (tipo de adsorbente, eluyente, así como las condiciones de la
placa, temperatura, vapor de saturación, etc.). Tiene una
reproducibilidad de ± 20%, por lo que es mejor correr duplicados de
la misma placa.

2.4.2. Cromatografía de Gases

34
A
A. Antecedeentes ⁄ Historia
L
La cromatoggrafía es un método físsico de sepaaración en el
e cual los componente
c es a ser
separados son distrribuidos enntre dos fasses, una dee las cualees es estacionaria
mientras que la otra
o se m
mueve en dirección ddefinida. Los
L compoonentes
sonseparaados por suus diferentees tazas de migración. La cromattografía pueede ser
clasificadda por su uttilidad y enn base al maaterial que sse utilice coomo eluyentte para
separar llos solutos. De acuerddo a su utiilidad la crromatografíaa se clasifiica en:
micos preseentes en unaa mezcla y en que
analítica,, utilizada ppara determiinar los quím
concentraación, y ppreparativa, utilizada para purifi
ficar grandees cantidaddes de
químicoss.21

‐ La primera técnica crom

L matográfica fue ideada por un botáánico ruso M
Mikhail
Tswett en 11906, quien utilizó alúm
T mina para seepar los pigmentos colooreados
dee las hojas de las planttas, Tswett en su experrimento origginal, metióó dentro
mna de viddrio un finno polvo (ssacarosa) para producir una
dee una colum
coolumna de altura deseeada. Posteeriormente extrajo
e los pigmentos de las
hoojas y las ccolocó en unn solvente ((éter de petrróleo) y agrregó un pocco de la
soolución denntro de la ccolumna. C
Cuando todaa la solucióón había paasado a
trravés de la columna, loos pigmentoos se iban separando inndividualmeente. La
cllave del éxxito de la ccolumna de Tswett, fuue la aplicacción de la mezcla
deentro de la columna enn una zona inicial estreecha y la posterior apllicación
deel solvente ffresco.21

Fig. 2.6: Columna Cromatográfica de T

Tsweet

35
 ‐ En 1931, fue redescubierta por Richard Kuhn al utilizarla para el análisis de
polienos.21

‐ Los primeros en utilizar un gas como fase móvil fueron A.T. James y A.J.
Martin en 1952, para separar ácidos grasos cortos.21
‐ Posteriormente Daabrio en 1971, la utilizo para separar metilaminas, aminas
alifáticas y homólogos de la piridina.21
B. Fundamentos Teóricos
Se han propuesto muchas teorías con complejos modelos matemáticos para explicar
el comportamiento de los solutos en las columnas cromatográficas. Las más estudiadas
son:

i. Teoría de las Placas Teóricas (theoretical plates theory)

Es la principal, la cual plantea que una columna cromatográfica está constituida
por una serie de placas contenidas en la fase estacionaria. Supone como
constante el volumen de la fase estacionaria en cada placa; que el volumen
de fase móvil entre placas es constante; que las dos fases están en equilibrio
en cada placa, y que el valor de coeficiente de distribución es constante e
independiente de la concentración del soluto. Desventaja: además de que se
basa en muchas suposiciones, la principal desventaja es la falta de
conexión entre la eficiencia de la columna y las propiedades
fisicoquímicas de la partícula.21

La ecuación de esta teoría

N=16(tr/w)2

N= número de placas teóricas, adimensional

tr= tiempo de retención de un compuesto, minutos

w= ancho del pico a media altura, minutos

36
ii. Teoría Cinética21
Considera el comportamiento en un proceso cromatográfico en función de los
factores cinéticos que intervienen:

‐ Variaciones en las velocidades de flujo, debido a las diferentes rutas que

puede tomar el analíto durante su migración a través del empaque.
‐ Difusión axial o longitudinal del soluto en la fase móvil.
‐ Resistencia a la transferencia de masas entre la fase móvil y la fase
estacionaria.
‐ La ecuación de Van Deemter:

HETP o H=A+B/u+Cu

HETP o h= altura equivalente a una placa teórica, milímetros.

u= L/ tr aire promedio de la velocidad lineal, cm/seg

A= 2λdp difusión aparente

B= 2γDm coeficiente del término debido a la difusión molecular

C= (8/π)(k’/[1+ k’]2)(df/Ds) coeficiente del término debido a la

resistencia a la transferencia de masas.

iii. Teoría para las Columnas Capilares

Se considera que la difusión aparente no contribuye de manera apreciable al
ensanchamiento de los picos en este tipo de columnas.El coeficiente
relacionado con la difusión molecular tiene un valor de uno debido a que la
distancia que recorre la partícula es igual a la longitud de la
columna. El término relacionado con la transferencia de masas viene
dado en función del diámetro de la columna, pues en este tipo de
columna es más importante que el tamaño de partícula de relleno.
La ecuación de esta teoría es un caso particular de la ecuación de la teoría
cinética, en este caso se omite el término A pues su valor es despreciable; se
relacionan las magnitudes que caracterizan la geometría del soporte y el

37
 término C se presenta de manera distinta pues en este tipo de columna es
más importante la fase móvil que el tamaño de partícula.21

Circulación del gas portador

La ley de Darcy correlaciona la velocidad lineal de un gas que circula por

una columna con el gradiente de presión.

u= - (k/η) (dP/ dz)

u= velocidad lineal en un punto de la columna

z=distancia a la entrada de la columna

η= viscosidad del gas

dP= gradiente de presión de un elemento

dz= longitud de columna

k=constante de permeabilidad.

C. Terminología

Coeficiente de reparto (K)

Propiedad termodinámica del sistema soluto-fase estacionaria-fase móvil

independiente del proceso cromatográfico. Concentración de soluto en la fase
estacionaria frente a concentración de soluto en fase móvil a temperatura
constante.25,26

Factor de capacidad (k’)

Depende de las propiedades termodinámicas del sistema (K) y además es función de

las características de la columna en particular. Probabilidad de encontrar una
molécula determinada de soluto en la fase estacionaria o en la fase móvil.25,26

Relación frontal (Rf)

38
 La relación frontal y el factor de capacidad son dos maneras de medir el mismo
fenómeno.

Representa la relación entre las velocidades medias del soluto y la fase móvil
en su recorrido por la columna.25,26

Tiempo muerto (tm)

Es el tiempo de retención de una sustancia insoluble en la fase estacionaria (K=0).

Resolución Rs

Cada sustancia se desplaza a una velocidad característica dada por el valor de su

relación frontal en dichas condiciones. Altura equivalente a una placa teórica. Por
tratarse de un método donde se separa por elución es mejor referirse a tiempo de
elución más que a distancias recorridas.25,26

Eficacia

Una columna será más eficaz mientras mayor sea el número de placas teóricas que
tenga. Para poder hacer comparaciones entre columnas es necesario establecer
condiciones similares de trabajo.25,26

D. Funcionamiento de un Cromatógrafo de Gases

En resumen, un cromatógrafo de gases funciona de la siguiente forma: un gas inerte
fluye en forma continua desde un cilindro de gas a través del inyector, la columna y
el detector. La velocidad de flujo del gas carrier se controla para asegurar tiempos
de retención reproductibles y minimizar las variaciones y ruidos en el detector. La
muestra se inyecta (normalmente con una micro jeringa) en el inyector que se
encuentra a alta temperatura donde se vaporiza y es transportada a la columna, en
general de 15 a 30 m de largo, cubierta en la parte interior por un film de un líquido
de alto punto de ebullición (la fase estacionaria). La muestra se reparte entre la fase
móvil y la estacionaria de modo de que los componentes individuales se separen en
base a su solubilidad relativa en la fase líquida y sus presiones de vapor relativas.27

39
 Luego dee la columnna, el gas ccarrier y la muestra paasan a través de un detector,
donde se mide la canntidad de caada componnente y se ggenera una sseñal eléctriica.Esta
señal se transmite a un sisteema de reggistro e integración, el
e cual gennera un
cromatoggrama que rrepresenta un registro del análisiis. En la m
mayor parte de los
casos, el sistema inteegra automááticamente eel área de caada pico, reaaliza los cállculos e
imprime un reporte ccon los resuultados cuanntitativos y loos tiempos de retenciónn. 27

Fig. 2.7: R
Representación esquem
mática de un
n sistema de
d cromatog
grafía gaseo
osa

E den ser Anaalizadas por GC.26

E. Caracterrísticas de llas Muestraas que pued
‐ G
Gases líquidoos o sólidos
‐ Compuestos orgánicos e inorgánicos
‐ Laa muestra ddebe ser voláátil o debe ppoder ser traansformada en volátil.
E
Estas características deeterminaran las ventajjas y limitaaciones de la cromatoografía
ggaseosa, lo qque se expliica a continuuación en laa tabla 2.4.

40
Tabla 2.4: Ventajas y limitaciones de la cromatografía gaseosa

VENTAJAS LIMITACIONES
Eficiente, permite alta resolución La muestra debe ser volátil.
Requiere muestras pequeñas (µl) No aplica a muestras termolábiles
Alta sensibilidad detecta ppm y ppb Muestras sucias requieren un “clean up”
Se debe utilizar otro sistema de detección (ej.:
Cuantitativa
para confirmar la identificación
Alta velocidad de análisis Es necesario algo de entrenamiento y experien
Buena exactitud
Fácil de usar, bien conocida

F. Componentes de un Cromatógrafo de Gases

1. Gas carrier
La función principal del gas carrier es transportar la muestra a través de la columna.
Es la fase móvil, debe ser inerte en las condiciones usadas y no debe interaccionar
químicamente con la muestra. Una segunda función es actuar como una matriz
conveniente en el detector para la medida de los componentes en la mezcla.26-29
La selección del gas carrier (portador) y su selección dependerán fundamentalmente
del tipo de detector utilizado. Los gases mas utilizados son N2, H2, He o Ar. El H2
tiene la menor viscosidad de todos, lo que significa que su uso es ventajoso en
columnas capilares largas en las cuales se requiere flujos relativamente altos. La
curva de Van Deemter, que relaciona la altura de plato teórico de la columna con la
velocidad de flujo linear de la fase móvil, a partir de la cual la eficiencia de la
columna puede ser optimizada, es muy diferente para el H2 y N2. Como se ve en la

41
Figura haay un mínim
mo más achatado para eel H2, lo quue determinaa una eficieencia de
mayor a veloocidades de flujo altas.226-31
la columnna consideraablemente m

Fig. 2.8:: Curva de Van Deemter

a) Control de flujoo y su medid

da
medida y conntrol del fluujo del gas ccarrier es esencial paraa lograr unaa buena
La m
eficieencia de sepparación dee la columnna y para el análisis cualitativo de las
mezclas. La eficiiencia de unna columna depende dee la velocidaad lineal dell gas, al
cual se puede determinar
d fácilmente cambiandoo la velociddad de flujoo hasta
ejor resoluciión) 31, 32
lograrr el máximoo número dee platos (mej

Para el análisis cualitativo

c d mezclas es esenciall tener una velocidad dde flujo
de
consttante y reprooductible de forma que los tiemppos de retennción tambiéén sean
reproductibles. L
La comparaación de loss tiempos de retención es la técniica mas
rápidaa y sencilla para la idenntificación dde componeentes. Se deebe tener enn cuenta
de quue 2 o más compuestoos pueden presentar
p el mismo tiem
mpo de rettención,
mponente puude presentaar 2 tiemposs de retencióón diferentes en las
pero nningún com
mism
mas condicioones instrum
mentales. Poor lo tanto, el tiempo dde retenciónn es una
característica de cada solutto, pero no único. Obvviamente unn buen conntrol de
método de ideentificaciónn.31
flujo es esencial para este m

42
 b) Sistemasde Control de Flujo

El primer sistema de control de flujo está representado por los reguladores de

dos etapas conectados a los cilindros de gas carrier, necesarios parareducir la
presión del cilindro desde aprox. 2500 psi a un nivel de 20-60 psi.31, 32

Para cromatografía gaseosa isoterma (temperatura del horno constante durante

toda la corrida), la presión de entrada constante es suficiente para tener una
velocidad de flujo constante, asumiendo que la columna produce una caída de
presión constante.

Para cromatografía gaseosa en la que se utilizan programas de temperatura, aun

cuando la presión de entrada de la fase móvil es constante, la velocidad de flujo
disminuirá a medida de que la temperatura de la columna aumenta. Esta
disminución de la velocidad de flujo es debida al aumento de la viscosidad del
gas carrier a temperaturas elevadas. En todos los cromatógrafos de temperatura
programada, se debe utilizar un controlador diferencial de flujo que asegure una
velocidad de flujo constante.31, 32

c) Medidores de flujo

El sistema más común utilizado en la medida de flujo de la fase móvil, está

representado por un flujímetro que utiliza burbujas de jabón líquido. Se trata de
un tubo calibrado a través del que se permite fluir el gas carrier. Se forman
burbujas en el jabón con una pera de goma en la parte inferior del tubo y al
pasar el gas desde el cromatógrafo arrastra estas burbujas que recorren una
distancia (volumen) en un determinado tiempo indicando una determinada
velocidad de flujo (ml/min).31, 32,

2. Sistemas de Inyección27-32
La muestra a ser analizada por cromatografía gaseosa puede ser de diferente
naturaleza: gases, líquidos y sólidos. En consecuencia, el sistema de inyección debe
contemplar estas características y permitir que la muestra sea introducida al
cromatógrafo en forma rápida y cuantitativa. Para cada caso, se requiere de

43
diferentes tipos y tamaños de columnas y por lo tanto se dispone de diferentes
sistemas de inyección. Para los fines de esta discusión, se considerarán sólo
columnas capilares y el sistema de inyección más frecuente, que involucra
laaplicación de un divisor (sistema split) de flujo, o la eliminación del mismo
(sistema splitless).

Mientras que la inyección de la muestra en columnas empacadas normalmente no

presenta problemas, una forma de introducir cantidad una pequeña y definida de
muestra en una columna capilar, consiste en utilizar el sistema “split”, es decir que
sólo una cierta cantidad de la muestra inyectada llega a la columna. Esta cantidad se
determina por la relación de split, la cual normalmente se encuentra en el rango
1:20-1:200. Dado que el sistema de “split-injection” puede provocar discriminación
de los componentes de mayor punto de ebullición, no siempre puede ser utilizado
con fines cuantitativos.

En todos los casos se debe considerar previamente el uso de jeringas apropiadas. El

material de la aguja es acero inoxidable, al igual que el émbolo, mientras que el
cuerpo de la jeringa es de vidrio borosilicatado. Un criterio útil en al selección de
jeringas, consiste en utilizar jeringas cuyo volumen total sea al menos dos veces
mayor que el volumen a ser inyectado. En todos los casos y aplicaciones, la jeringa
y sus partes deben ser cuidadosamente limpiadas y enjuagadas con solventes
apropiados entre inyecciones.

44
 Fig. 2.9:: Puerto de inyección

a) Moddalidad splitt

Caraacterísticas

‐ La muestra se vaporriza en un innyector a altta temperatuura

‐ La muesstra vaporizzada se divvide (split)) por lo quue sólo unaa parte
conocidaa de la muesstra entra a la
l columna de separacióón
‐ La relaciión normal de
d split utiliizada está enntre 10:1 a 200:1
2
‐ El operador regula ffácilmente laa relación de
d split abrieendo o cerraando
una válvvula y controolando los vvalores de fluujo.

45
 Fig. 22.10: Inyecttor Split

bb) Modalidaad splitless

Caracteríísticas y passos a seguir:

‐ Se insertta en el inyeector la jerinnga y se aguuarda alrededdor de 5 seggundos

‐ Se cierraa la válvula dde split (reqquiere purgaa de septa)
‐ Se inyecttan entre 1 a 3 ml en laa columna frría
‐ Se abre lla válvula ddel split lueggo de 45 seggundos paraa purgar el innyector
(flujo 300-50 mL/minn)

‐ Iniciar prrograma de temperaturaa de la colum

mna (hornoo)

46
 Fig. 2.111: Inyectorr splitless

3. Columnaa
La decisiión más im
mportante enn la fijaciónn de los parrámetros paara un análiisis por
cromatoggrafía gaseoosa, es la selección de la
l mejor coolumna o fasse estacionaaria. La
otra decisión importtante es la selección de
d la temperratura de laa columna, ppero se
trata de una deciisión menoos crítica debido a la amplia posibiliddad de
programaaciones que se pueden sseleccionar y ensayar.277

En la sellección de una
u fase esstacionaria sse pueden sseguir algunnos o todoss de los
siguientes criterios:

‐ mación previa acerca de la separración requuerida - Lass referenciaas en la

Inform
literattura y las notas de apliicación son fuente de eeste tipo de informaciónn. Si se
encueentran otras columnas disponibles en el laborratorio, evaaluar los ressultados
al utillizarlas.27
‐ Selectividad – Determinar
D eel tipo de innteracción potencial
p enttre el compuesto y
la faase estacionaria (disppersión, dippolar, enlaaces de hiidrógeno). Si los

47
 compuestos tienen diferentes dipolos o pueden formar puentes de hidrógeno,
considerar una fase estacionaria selectiva con esas características.2
‐ Polaridad – Utilizar la fase estacionaria más no-polar que provea las
separaciones requeridas.27
‐ Límites de temperatura – Compuestos con altos punto de ebullición o pesos
moleculares elevados requieren altas temperaturas de columna para evitar
tiempos de retención extremadamente largos. Los límites de temperatura
menores para las fases estacionarias polares, restringen su uso a compuestos con
bajo o medio punto de ebullición (como aproximación a su volatilidad).27
‐
Actividad de cada compuesto – Las columnas con fases estacionarias no polares
generalmente son las más inertes. Con fases polares se pueden experimentar
“tailings” importantes en los picos o adsorción.27
‐ Tiempo de análisis – Algunas fases estacionarias dan separaciones satisfactorias
en menos tiempo de corrida.27
‐ Capacidad – Las fases estacionarias similares en polaridad a los compuestos a
separar, tienen mayor capacidad para esos compuestos.27
‐ Sangrado – En general, las fases estacionarias no polares tienen menos
sangrado. Compuestos con elevados PE ó PM eluyen en zonas de alta
temperatura donde el sangrado de la columna es más severo. Fases estacionarias
no polares no sólo tienen menos sangrado, sino que además el máximo de
sangrado ocurre a mayores temperaturas.27
‐ Detectores selectivos – Se deben evitar las fases estacionarias que contengan
especies o grupos funcionales que generen una fuerte respuesta a un detector
selectivo (ej. cianopropil). En este caso usualmente ocurren derivas extremas de
la línea de base y elevado ruido.27
‐ Versatilidad – Para análisis múltiples, se pueden requerir diferentes fases
estacionarias para obtener una óptima separación. En algunos casos, diferentes
análisis pueden ser realizados con una sola fase estacionaria sacrificando calidad
en la respuesta y obteniendo resultados aceptables. Esta práctica reduce el
número de columnas necesarias, lo que reduce la complejidad de su manejo y el
costo.27

48
 no de la collumna
a) Horn
En ell interior se sitúa la columna, dondde se debe tener una buuena regulacción de
la tem Dentro del hhorno la collumna se connecta en un extremo al puerto
mperatura. D
de innyección, y en otro ell detector. L
La columnaa debe estarr en el cenntro del
hornno sin tener ccontacto conn las paredees.27

Fig. 2.12: Horno del cromatógrafo de gasees

b) Fasee estacionarria
La faase estacionaaria es la enncargada dee separar loss componenntes de la m
muestra.
Esta puede ser un sólido o un líquidoo, dispuestoos sobre unn sólido quee actúa
comoo soporte (columna). El sólido de la fasee estacionarria puede ser de
minio, sílica gel, carbónn o tierra de diatomeas,ccuando la faase estacionnaria es
alum
un sóólido, la intteracción quue puede tenner con la fase
f móvil sse puede claasificar
25
en: A
Adsorción, iintercambio iónico y dee filtración sobre
s geles porosos.
p
Las ffases se pueeden clasificcar en:
‐ No polares: paraa separar suustancias poocas o nadaa polares. L
Las más
utilizaadas son laas gomas dee silicona O
OV-1, OV-1101 o SE-330, para
trabajjar hasta 3300°C dondde se conssiguen eficaacias de coolumna
extraoordinarias.266

49
 ‐ Con carácter ligeramente polar: utilización general, buena
selectividad para mezclas mixtas. Sebecato de dietil (2etil hexilo),
aceite de silicona, gomas de silicona.26
‐ De polaridad media o alta: no aptos para hidrocarburos no
aromáticos. Aceite de Ucon LB_550X, polifenil éter, Carbowax
1540.25
c) Tipos de columnas
La elección de las columnas es lo más crítico, existen dos diferencias
fundamentales que deben ser consideradas para la elección de las columnas: La
cantidad de muestras que admiten (capacidad de carga). Valores de los flujos
del gas portador.
La capacidad de carga se define como la cantidad de muestra que se puede
inyectar sin pérdida apreciable de eficacia y está relacionado con la cantidad de
fase estacionaria por unidad de longitud de la columna.26, 27, 28

 Columnas clásicas de relleno27,28

Constituidas por un tubo de metal o vidrio con relleno de soporte granular con
la superficie recubierta por una película de fase estacionaria.
Longitud 1-10 m
Diámetro interno 2-4 mm hasta 5cm en escala preparativa
Tamaño de la partícula de relleno diez veces menor que le diámetro del tubo
Capacidad de carga grande
Relación de fases pequeñas
Permeabilidad baja

 Columnas capilares rellenas27,28

Se distinguen de las columnas clásicas de relleno por el diámetro interno mide
tubo, no excede un milímetro. Además, la relación entre los diámetros del tubo
y de la partícula de relleno es del orden de tres a cinco veces. Esto hace que sea
un relleno irregular y una permeabilidad del orden de diez veces superior.

50
 Longitud de 10-50 cm
Diámetro interno de 1mm
Tamaño de partícula de relleno de 3 a 5 veces
Capacidad de carga pequeña
Relación de faces grande
Permeabilidad mayor que las clásicas
 Columnas capilares de capa porosa27, 28
En este caso el soporte es depositado en le interior del tubo, después es
recubierto por la fase estacionaria y la parte central del capilar permanece vacía
Longitud de 25-200 m
Diámetro interno de 0.1-0.5 mm
Tamaño de la partícula de relleno varía entre el de un soporte clásico y las partículas de
carbono producidas por la pirólisis de una sustancia orgánica.
Permeabilidad valores máximos (al igual que las capilares abiertas)

 Columnas capilares abiertas27,28

También conocidas como columnas Golay, quien fue el primero en utilizarla
(Golay,1958).
La fase estacionaria va depositada en la pared interior del tubo que actúa como soporte.
Longitud hasta 200 m, los más utilizados varían entre 50-100 m
Diámetro interno 0.1-0.5 mm
Capacidad de carga muy pequeña
Relación de fases es la más alta
Se debe considerar la solubilidad, cambios en la volatilidad y estabilidad de los
solutos, cambios en el flujo y estabilidad de la fase estacionaria. La
temperatura debe estar dentro de la Tmi ⁄Tmax de la columna.
Determinar la temperatura inicial y el tiempo basado en la mejor separación
posible de los primeros picos. Repetir uno para los últimos picos para encontrar
la mejor temperatura y tiempo. Experimentar con varias rampas para el resto de
los componentes.

51
d) Factoores que dissminuyen laa eficacia dee una colum
mna

‐ Longgitud de la columna. L
Limita en cuuanto a lass velocidadees lineales del gas
portaador, originnando tiem
mpos de annálisis muyy largos y sin mejoorar la
resollución.21, 28,229
‐ Diám
metro de la columna.
c M
Mas importannte en colum
mnas capilaares abiertass, por la
resistencia que oopone la fasse móvil a laa transferenccias de masaas.21, 28, 29
‐ Tamaño de la paartícula de rrelleno21
‐ Natuuraleza de laas fases. Fasse estacionaaria no afectta, Gas porttador: viscoosidad y
valorres de coeficciente de difusión en laa fase móvil.21
‐ Canttidad de fasee estacionarria. A menorr cantidad mayor
m eficaccia.21
‐ Tempperatura de la columnaa. Al aumenntar esta dissminuye la eficacia
e al aafectara
direcctamente el coeficientee de reparto.21
ma.21
‐ Veloocidad del gaas portador.. Una velociidad elevadaa es la óptim
‐ Canttidad de mueestra inyectada.21

A B

Fig. 2.13: Column

na A)empaquetada B)
B capilar

52
4. Programación de temperatura
La columna se encuentra termostatizada de modo de obtener una buena separación
en un tiempo razonable. Por lo tanto se hace necesario mantener la columna en un
amplio rango de temperaturas diferentes, desde temperatura ambiente hasta 360 ºC.
El control de la temperatura de la columna es una de las formas más sencillas y más
efectivas de influenciar la separación de los componentes. La columna se fija entre
un inyector mantenido a una temperatura de inyección, y un detector mantenido a
una temperatura también predeterminada. Por lo tanto, se debe definir la
temperatura a la que cada uno de los componentes opera.27

a) Temperatura del inyector

La temperatura del inyector debe ser suficientemente alta como para vaporizar
la muestra en forma rápida, pero lo suficientemente baja como evitar su
descomposición térmica o arreglos químicos.32

La determinación de los valores óptimos se logra mediante práctica y

experiencia.

b) Temperatura de la columna
La temperatura de la columna debe ser lo suficientemente alta como para
asegurar que los componentes de la muestra atraviesen la columna a una
velocidad razonable. Sin embargo, no puede ser mayor que el punto de
ebullición de la muestra; de hecho es preferible que la temperatura de la
columna se encuentre por debajo del punto de ebullición. Se debe tener en
cuenta de que la temperatura de la columna debe operar a una temperatura a la
que la muestra está en estado vapor, pero no debe estar en estado de gas. ES
decir que en cromatografía gaseosa, la temperatura debe ser mantenida por
encima del “punto de rocío” de la muestra, pero no por encima de su punto de
ebullición.32

53
 Las técnicas utilizadas implican el uso de sistemas isotermos (donde la
temperatura de la columna se mantiene constante) o de temperatura programada
(PTGC), donde la columna s somete a un incremento lineal de la temperatura
con el tiempo.

c) Temperatura del detector

La temperatura del detector depende fundamentalmente del tipo de detector
empleado. Sin embargo, como regla general la temperatura del detector y la de
su conexión a la salida de la columna, deben ser suficientemente altas como
para evitar la condensación de la muestra. Si la temperatura es muy baja y
ocurre condensación, se producirá ensanchamiento de los picos o la ausencia
total de los mismos.30, 31

En el caso del detector de ionización de llama, una temperatura mínima

razonable es de 250 ºC.

5. DETECTORES25-31
Los detectores son dispositivos que indican y miden los solutos en la corriente del gas
acarreador, convirtiendo una señal no medible en una señal elaborable de una propiedad física.
Esta señal es elaborada por una comparación entre el gas acarreador puro (blanco) y el mismo
gas llevado cada uno de los componentes previamente separados en la columna esto es
traducido en una señal eléctrica que es amplificada y registrada al momento de salir de la
columna.
Un buen detector es altamente sensible (sensibilidad) tiene una respuesta lineal (lineabilidad)
sobre un amplio rango de concentración y es relativamente insensible a variaciones de flujo y
temperatura (rango dinámico lineal).
Pueden ser clasificados por:
‐ Grado de selectividad: universales que responden a la mayoría de solutos,
específicos-selectivos con respuesta a un grupo particular de sustancias.
‐ Recuperación de la muestra: dependientes del flujo de la masa (cantidad de
soluto independientemente de la cantidad del gas portador), dependientes de la
concentración (cantidad de soluto por unidad de volumen de gas portador)
‐ Proceso de detección: ionización, óptico-espectroscópico, electroquímico.

54
a) Detector de Conductividad Térmica (TCD termal conductivity detector)
Consiste de dos celdas metálicas idénticas, cada una conteniendo un filamento de
alambre de tungsteno o de tungsteno con lámina de oro. El efluente fluye a través
de una celda y el gas portador (He o H2) fluye a través de la otra. En un lado de la
muestra el gas fluye por el filamento mientras que en el lado de referencia el gas
puede pasar sobre el alambre del filamento y difundir a través de él. Los filamentos
son calentados por una corriente eléctrica. La temperatura del elemento censor
depende de la conductividad térmica del gas que fluye alrededor. Cambios en
conductividad térmica, como cuando las moléculas orgánicas desplazan un poco al
gas portador, provocan un incremento en la temperatura del elemento el cual está
siendo monitoreado como un cambio en la resistencia.
Dos pares del TCD son utilizados en cromatógrafos de gases, un par localizado en
la salida de la columna para detectar los componentes separados mientras van
saliendo, el otro par localizados antes del inyector o en una columna de referencia
separando las resistencias de los dos pares y están acomodados en un circuito de
puente.
Para un máximo de sensibilidad, la temperatura del filamento es incrementada, la
temperatura y la velocidad del flujo son disminuidas y se escoge un gas con mayor
conductividad térmica (la mayoría de los gases orgánicos tienen calores de
conductividad bajos).
Este es un método no destructivo dependiente de concentración, con selectividad
universal, con un límite de detección de ~400 pg/ml de gas portador. Su modo de
detección es debido al cambio de resistencia del cable basado en la
termoconductividad del gas cuando fluye a través de la columna.

b) Detector de Ionización de Flama (FID flame ionization detector)

El FID consiste de una flama hidrogeno –aire y una placa colectora. Las muestras
que salen de la columna pasa a través de la flama, la cual rompe las moléculas
orgánicas y produce iones. Los iones son colectados en unelectrodo parcial y

55
 produce una señal eléctrica. Es extremaadamente sensible
s a un amplio rango
dinámicoo. La única ddesventaja ees que destruuye la muesstra.
La muesttra debe serr un combuustible, esta entra en la base del detector, se m
mezcla
con el hidrogeno y eentra en la flama. Hay compuestoos con poca o sin respuuesta la
FID, com
mpuesto coomo el NH
H3, CO, CO
O2, O2, H2O,
H N2, etc.
e La resspuesta
estábasadda en el núm
mero de carbbonos y otroos elementoos tales com
mo los halóggenos y
el oxígenno presentes que reduceen la combustión.
Este es uun método ddestructivo ddependientee del flujo dde masa, conn selectividaad para
compuesttos orgánicoos. Su modoo de detecciión es debiddo a al produucción de ioones en
una flamaa resultandoo en una corrriente que ppuede ser m
medida.

Fig. 2.14: Detector

D FIID

c)) Detector F
Fotométricco de Flamaa (FPD flam
me photomeetric detector)

Es uno dde los más uusados en loos métodos selectivos dde cromatoggrafía de gaases. El
FPD connsiste en unna flama reductora quee produce especies
e quuimioluminicentes.
Estas esppecies emiteen una luz característiica que es óptimamentte filtrada por la
longitud de onda deeseada, la cuual determinna que com
mponentes soon los detecctados.
La luz filltrada es meedida por unn fotomultipplicador (PM
MT) y transdducida a unaa señal.
Se puedee agregar unsegundo
u fotomultipllicador, el cual permiite una dettección
simultáneea de una seegunda señaal.
Los filtroos para FPD
D pueden seer seleccionnados para ddiferentes ccomponentes, pero
los más comunes son para la detección de sulfuraddos y fosfoorados en mezclas
m

56
 complejaas. La selecttividad de FPD clásicoss (como unaa porción poor peo de caarbono)
es 105 paara sulfuradoos y 106 paraa fosforadoss

Fig.2.15: Detector FPD

d
d) Detectorr de Capturra de Electrrones (ECD
D electrón ccapture deteector)
Es altam
mente sensible a com
mpuestos halógenos y por lo tantto muy útill en la
deteccióón de pestiicidas. Da un poco dde respuestaa a hidrocaarburos y a otros
carbonilos conjugaados. Para eeste tipo de cromatograafía la muesstra debe coontener
una fasee gaseosa ellectrófora. E
Este es un siistema dondde se detectaan partículas β por
absorcióón de especcies que conntienen halógenos, nitrilos, nitratoss, organomeetales y
d 63Ni,
dobles eenlaces connjugados. Laas partículas β son emiitidas por uuna fuente de
los elecctróforos laa absorben reduciendo la corrientte, siendo eesta la basee de la
respuestta.

57
 Fig. 2.16: Detecttor ECD

nización (PIID photoionizacion G

a) Detectorr de Fotoion GC detector))
Este tipoo de detecttor es muy selectivo para
p los coompuestos ccon hidrocaarburos
aromátiicos o con heteroátom
mos, los cuuales tienenn potenciales de ionizzación.
Utiliza luz ultraviooleta para ionizar un analíto,
a la loongitud de onda oscilaa entre
106-1500 nm. Los iones prodducidos sonn colectadoos por electrodos siendo la
corrientte generada una médicaa de la conceentración deel analíto.
Este es uun método no destructtivo dependdiente de concentraciónn, con selecttividad
para coompuestos alifáticos, aromáticoos, heterocííclicos, oraagnosulfuraados y
algunoss organomeetalicos, cettonas, esterres, aldehíddos y aminnas. Su moodo de
deteccióón es debidoo a los potennciales de ioonización dee los compuuestos analizzados.

Fig. 22.17: Detecttor PID

58
a) ESPECT
TROMETR
RO DE MA
ASAS
El especctrómetro de masas ess el detectoor más podderoso utiliizado tanto en la
cromatoggrafía de gaases como en la crom
matografía llíquida paraa llevar acaabo un
análisis tanto cualitaativo como ccuantitativoo de los analítos. En la espectromeetría de
masas, laas moléculass gaseosas sson ionizadaas, son acelleradas en uun campo elléctrico
y por ultiimo son separadas en fuunción de laa masa.21
El proceso natural tiene suficiiente energíía como paara romper las molécuulas en
varios troozos y al ggrafico que representa la abundanccia isotópicca relativa dde cada
trozo se lle denominaa espectro dee masas.21
En el ejee X de este eespectro de masas se rrepresenta laa relación m⁄z
m donde m es la
masa de uun ion (en unidades
u mica-uma-) y z es la carrga del ion. Como
dee masa atóm
en muchoos casos la ccarga del ion equivale a la unidad la relación m⁄z se reduuce a la
masa dell ion. Al trrozo de iguual masa a la de la m
molécula orriginal (M†) se le
denominaa ion molecular.21
El especctrómetro dee masas see puede sepparar en 4 partes: intterface, fueente de
ionizacióón, zona de sseparación y detector.

Figg. 2.18: Inteerior de un

n MS

La interface une laa columna capilar

c y la fuente de ionización. Por una paarte, la
mna es muy alta y en laa fuente de iionización llo que es altto es el
presión de la colum

59
vacío. En esas condiciones las funciones de la interface son lassiguientes: quitar
las moléculas de gas transportador e introducir las moléculas de analíto en el
espectrómetro de masas.
Las moléculas de analíto que llegan a la fuente de ionización son moléculas
bombardeadas con electrones de alta energía que provienen del filamento
(ionización por medio del choque de electrones). Normalmente una energía
controlada de los electrones de 70 eV suele ser suficiente para provocar la
ionización (M + e−, M+ + 2 e−) y garantizar la rotura de la molécula iónica.
Las partes obtenidas son llevadas al espectrómetro de masas para medir su
espectro.21

Tipos de ionización:32

‐ Impacto electrónico (EI) 32

Es la ionización más utilizada en GC/MS donde se da una
fragmentación extensiva “huella digital” de la molécula, con el
propósito de identificación.
El valor m/z del ion M+ ofrece información sobre el peso molecular del
compuesto para ser identificado. Normalmente los iones positivos son
analizados.26
‐ Ionización Química (CI) 32
Se da por reacción de ion molecular, es una ionización más baja, por lo
tanto es un proceso más suave.
Nos da una información estructural limitada.
‐ Ionización Química Negativa (CNI) 32
Se da por interacción electrón-molécula (e- de baja energía) para formar
iones negativos (proceso captura de e-).
Tiene una sensibilidad alta para este tipo de compuestos. Es una
fragmentación no tan alta y nos da una limitada información estructural.

60
Monitoreo de loos Iones en MS33

Existen ddos modos S

SCAN Y SIM
M
‐ SCAM

Los ionnes molecuulares con rango dee masas sson monitooreados

secuencialmente, esste modo nnos da el esspectro de masas, la cual es
importannte para la iddentificaciónn.34

‐ SIM
Solo unos ppocos ioness molecularres son monitoreados. Este modoo tiene
S
mejor sennsibilidad

6. Cromatoggrafía de Gaases y Espeectrometríaa de Gases ((GC-MS)

Fig. 2.199: GC-MS

Durante los últimoss veinte añoos la MS y GC han ddemostrado repetidamennte, en
gran núm
mero de labboratorios een todo el mundo, suu versatilidaad como métodos
m
analíticoss para la deeterminaciónn estructural y separaciión de comppuestos orgáánicos.
Ambas técnicas
t hann alcanzadoo últimamennte un altoo grado de desarrollo en sus
diversas facetas práccticas, habiéndose convvertido resppectivamentte e indepenndiente
de dos m
método analííticos en loss que se conjuntan unaa gran rapiddez, sensibillidad y
poder ressolutivo.21
Aunque en la práctiica en 19577 la cromatografía de gases y la espectromeetría de
masa avaanzaron porr caminos ddiferentes ppero paralellos en le campo del aanálisis
orgánico,, gracias aal gran pottencial dem
mostrado poor los prim
meros intenntos de

61
combinación y su rápido desarrollo, en la actualidad la combinación directa
cromatografía de gases- espectrometría de masas se reconoce como uno de los
sistemas más eficaces a disposición del químico analista para el estudio e
identificación de mezclas complejas de productos orgánicos.21
Conectando la salida de un cromatógrafo de gases a la cámara de ionización de un
espectrómetro de masas se puede obtener información estructural (espectro de
masa) para cada uno de los componentes de la mezcla original, previamente
inyectada en el cromatógrafo, a medida que estos son eluídos en serie de la
columna cromatográfica. De esta forma las limitaciones inherentes de la
cromatografía de gases quedan considerablemente reducidas en el análisis
cualitativo. Dichas limitaciones surgen del hecho de que mientras la cromatografía
de gases pueda separar los componentes individuales de una mezcla con un alto
grado de poder resolutivo, no puede dar, en sentido riguroso más que información
preliminar sobre su estructura. Hay que señalar como esencial que cualquier
columna cromatográfica no es un instrumento analítico, sino un medio de
separación física.21
Asimismo, desconectando ciertos detectores específicos (por ejemplo captura de
electrones, fósforo, etc.) los detectores cromatográficos solamente responden en
general a la cantidad de la muestra eluída por la columna, por ello la utilización de
los datos basados en el tiempo de retención absoluto o relativo puede resultar un
método adecuado para la identificación tentativa de ciertos compuestos o mezclas
relativamente simples o para las cuales se dispone de los correspondientes patrones.
Sin embargo cunado esta metodología se intenta llevar a extremos, como el análisis
de mezclas de productos naturales de extrema complejidad, los resultados así
obtenidos carecen de la precisión cualitativa, sobre todo en los casos que se
requiere una programación de la temperatura de la cromatografía de gases y se
carece de compuestos patrón. A este respecto, una de las áreas mas activas de la
combinación cromatografía de gases-espectrometría de masas es en conclusión la
identificación de compuestos nuevos o no sospechados previamente.21

62
a) Muestras para GC-MS
Ejemplo:
 Pesticidas en aguas, frutos, vegetales, etc.
 Solventes orgánicos , en materiales de embalaje
 Drogas en orina sangre
 Alcoholes en sangre
 Ácidos grasos
 Aceites esenciales.
b) Sistemas de Muestreo GC-MS
 Inyección líquida: muchas muestras para GC-MS son introducidas
como líquidas, y en este tipo de técnica se usan microgeringas.
La muestra es introducida directamente en la fuente de iones del MS
pasando por el GC.30
 Head Space (HS) “espacio de cabeza”
Supongamos que en un recipiente cerrado hay una muestra (tanto
sólida como líquida) con compuestos volátiles y un lugar entre la
muestra y el recipiente (espacio de cabeza).30
Si se coge a través de una jeringa de gases una cantidad pequeña de
la muestra de ese “espacio de cabeza” y se inyecta de forma directa
en el cromatógrafo de gases se habla de la técnica de espacio de
cabeza.31
Es una técnica rápida, sencilla, automatizable y directa pero solo
viable en compuestos volátiles y semivolátiles conteniendo matrices
sólidas o líquidas.30
Por ejemplo: solventes residuales en empaquetamiento.
 Pirólisis:
Las moléculas muy grandes especialmente los polímeros, no se
pueden analizar por cromatografía de gases porque la volatilidad de
estos compuestos es pequeña. En la pirolisis, estas sustancias que no
son volatilizables son transformadas en sustancias mas pequeñas que
si pueden ser analizadas por cromatografía de gases utilizando para

63
 ello una energía en forma de calor como “ribbon type”, “punto
curie” o “pirolizantes laser”.30
Por ejemplo: polímeros

 Purga y Trampa:
Si se purga una fase gas en equilibrio junto con la muestra (tanto
líquida como sólida), tras introducir continuamente una fase gaseosa
limpia o sin analítos se rompería el equilibrio gas-líquido o gas-
solido.30
Gracias a la ruptura de este equilibrio se conduciría el analito de
modo más cuantitativo que el caso anterior.
 Derivatización de la Muestra:
En el caso de moléculas que no son vaporizables es necesario crear
derivados que si lo sean.
En el proceso de derivatización tiene lugar un cambio químico en los
grupos funcionales de la molécula y como consecuencia de ello se
mejoran tanto las características de detención como de separación de
las moléculas.30
Modifica los componentes para dar más volatilidad, aumentar
estabilidad térmica, etc.

c) Cuantificación GC-MS
Determinación de las concentraciones individuales de los compuestos que
son separados.
En GC el objetivo es alcanzar la separación completa de los compuestos,
para que aisa cada compuesto detectado sea puro, y su concentración pueda
ser determinada exactamente.30
Métodos principales para cuantificación:

64
 Método de Normalización (porcentaje de área)30
Determina la composición relativa de una muestra
Contenido del compuesto en la muestra (C):

Ci = Ai/AT x 100%
Ai = Área del pico del compuesto en el cromatograma
AT = Área total de los picos en el cromatograma
Precaución:
Respuesta del detector es asumido a ser el mismo para compuestos
diferentes.
Compuestos de la muestra inyectada son asumidos de ser todos
detectados y producir picos.
 Método de Normalización Área Corregida:30
Determina la composición relativa de la muestra
Ayuste (corrección) es hecha para considerar la diferencia de la
respuesta del detector para compuestos diferentes
Muestras contiendo compuestos con concentraciones conocidas son
analizados primero.
 Método de Curva de Calibración Absoluta (patrón externo)31
Determina las concentraciones absolutas de los compuestos de la
muestra
Incluye:
‐ Medición de mixtura de padrón con concentración conocida.
‐ Generación de curva de calibración de padrón externo (que
exhibe relación entre concentración absoluta/cantidad del
compuesto y su alta/área del pico).
‐ Medición de la muestra con concentraciones desconocidas de
sus compuestos.
‐ Cálculo de las concentraciones de los compuestos a partir de
sus alturas/áreas del pico.

65
 Método Patrón Interno30
Compuesto padrón adicional es añadida al padrón y muestra (The Internal
Standard, IS)
Determina concentraciones de los compuestos de la muestra usando la
concentración del IS y su respuesta relativa al compuesto de interés.

66
 CAPÍTULO III

MATERIALES Y MÉTODOS

3.1. CAMPO DE INVESTIGACIÓN

3.1.1. Unidades de Estudio

El trabajo de investigación se llevó a cabo con 3 muestras (A, B y C) desecadas de la

planta Mentha piperita L., adquiridas de Puquio-Ayacucho-Perú.

3.1.2. Ámbito Geográfico y Tiempo

Este trabajo de investigación se llevó a cabo en el Laboratorio de Química Orgánica

(pabellón F-303) y Laboratorio de Control de Calidad (pabellón H-204), de la
Universidad Católica de Santa María de la ciudad de Arequipa-Perú, durante los meses
de abril a diciembre del año 2012.

3.2. MATERIALES

A. Materiales de Laboratorio
- Pipetas graduadas de 0.5, 1 ml.
- Pipetas volumétricas de 2, 5 y 10 ml.
- Micropipetas automáticas de 10-50-200-1000 ul.
- Bureta graduada de 10, 100 ml.
- Fiolas de 10, 25 ml.
- Vasos de precipitado de 200 y 250 ml.
- Pera de decantación de 125 y 250 ml.
-Erlenmeyer de 100 y 250 ml.
- Embudo de vidrio.
- Probeta graduada de 100 ml.
- Balón de 100, 500 ml y 1 L.
- Trampa Clevenger.
- Refrigerante.
- Adaptadores esmerilados de vidrio.
- Cuba para Baño María.

65
- Agitador magnético.
- Papel filtro.
- Pipetas Pasteur.
- Frascos de vidrio ámbar con tapa rosca.
- Cuba para CCF.
- Placas de sílica gel.
- Capilares.
- Viales para GC-MS de 1.5 ml.

B. Reactivo
- Etanol 96% (Diproquim)
- Agua destilada.
- Diclorometano 100 % p.a. (Diproquim)
- Diclorometano grado GC (Merck)
- Sulfato de sodio Anhidro p.a. (Merck)
- Dicromato de potasio p.a. (Merck)
- Ácido sulfúrico p.a. (Merck)
- Hidróxido de Sodio p.a. (Diproquim)
- Anhídrido Acético p.a. (Merck)
- Acetato de sodio p.a. (Merck)
- Carbonato de sodio p.a. (Merck)
- Hielo seco (Praxair).
- Hidróxido de potasio p.a. (Merck)
- Tolueno p.a. (Merck)
- Cloroformo p.a. (Merck)
- Anisaldehido p.a. (Merck)
- Ácido acético glacial p.a. (Merck)
- 2,4 Dinitrofenilhidrazina p.a. (Merck)

C. Estándares
- l-Mentol (Merck)
- l-Mentona (síntesis y purificación propia)
- l-Acetato de mentilo (síntesis y purificación propia)

66
 D. EQUIPOS
- Equipo de Destilación con Trampa Clevenger.
- Rota vapor (Buchi), modelo R-114.
- Bomba de vacío Cenco megavac
- Stirrer Hot Plate VELP, modelo ARE
- Refractómetro Digital Abbe (Optic Ivymen System), modelo WYA-S
- Polarímetro automático, modelo Polax-2L.
- Balanza Analítica (Ohaus), modelo Pioneer.
- Vortex homogenizador Barnstead, modelo M37610-33.
- Cromatógrafo de Gases con Detector de Masas GC/MS-QP 2010 Ultra
Shimadzu, con el siguiente equipamiento:
Auto injector Shimadzu AOC-201
Columna RTX-5MS, Thickness 0.25 um, Length 30m, diameter 0.25 mm.

3.3. MÉTODOS

3.3.1. Obtención del Aceite Esencial de Mentha piperita L.

a. Método: Hidrodestilaciòn Clevenger.

b. Procedimiento:
‐ El material vegetal (Mentha piperita L.), previamente desecada, se debe
trozar momentos antes de la hidrosdestilaciòn.
‐ Se coloca una cantidad adecuada de Mentha piperita L. (aprox. 100 g), en el
balón de 1L de capacidad, del equipo de Hidrodestilaciòn Clevenger.
‐ Se añade una cantidad adecuada de agua destilada (aprox. 400 a 500 ml),
pero sin sobrepasar el cuello del balón para evitar proyecciones al momento
de la hidrosdestilaciòn.
‐ Se arma el equipo de Hidrodestilaciòn Clevenger, se coloca en una cuba de
Baño María de aceite, se forra con papel aluminio todas las partes del equipo
a excepción del refrigerante, a fin de dar calor al sistema.
‐ Se debe controlar la temperatura del sistema que no debe sobrepasar los 120
°C, para evitar evaporación del aceite esencial y olores empireumáticos.
‐ El proceso deber durar entre 2 a 3 horas.
‐ En este proceso la Trampa Clevenger desempeña un rol importante, ya que
en esta se ira juntando el aceite esencial, que por densidad en el caso de la

67
 a L., se situuará en la parte
Menttha piperita p superiior, y la paarte acuosa en la
inferrior.
‐ Lueggo se abre la
l llave de la trampa, antes que se llene enn su totalidaad de
aceitte esencial y agua.
‐ El aggua del sisttema caerá nuevamente en el baalón, mientrras que el aceite
a
queddara colectad
do en la tram
mpa.
‐ Trannscurrido ell tiempo deel proceso, se retira la trampa Clevenger que
contiiene el aceite con un ppoco de agu
ua, se deja en
e reposo ap
aproximadam
mente
24 hooras.
‐ Se lleva a perra de separración, lueg
go se añad metano, se agita
de diclorom
cuidaadosamentee de 2 a 3 veeces y se dej
eja en reposo
o.
‐ Se reecupera la fase
f orgánicca en vaso de precipitado, luego se añade su
ulfato
de soodio anhidro
o, dejando rreposar de 10
1 a 15 minu
utos.
‐ Se fiiltra con pap
pel filtro poor gravedad
d, se lleva a rota vapor,, hasta comp
pletar
evapporación del dicloromettano.
‐ El acceite esencial obteniddo, se debe guardar en
n un frascoo ámbar ceerrado
herm
méticamentee y bajo refr
frigeración a 4°C.

Fiig.3.1: Hidrrodestilaciò
òn Cleveng
ger

68
 IMPOR
RTANTE:

‐ El reeposo del aceite

a esenccial en la trrampa cleveenger debe ser de 24 horas
para facilitar la separación completa de la parte accuosa, lo quue se ve refllejado
posittivamente en
n el rendim
miento final del
d aceite essencial obteenido.
‐ El éxxito de la eliminación del dicloro
ometano deel aceite eseencial, en el
e rota
vapoor, consta dee ayudar al sistema con
n un Baño María
M a 40 °°C para evaaporar
el dicclorometano
o, así comoo que por el refrigerantee del rota vaapor circulee agua
heladda para mejjorar la conndensación y recuperación del solvvente.

Fig. 3.2: A
AE. de Men
ntha piperita
a L. en repposo

cc. Expresióón de Resu

ultados:
L
La cantidad de aceite esencial obteenido se expresa como
o porcentajee de rendim
miento
((%R), de accuerdo a la siguiente
s eccuación:

% (Ecu
uación 3.1)

69
3.3.2. Determinación de las Características Organolépticas del Aceite Esencial de
Mentha piperita L.

Dentro de todos los niveles de la cadena productiva de un aceite esencial, el primer

control que se realiza es el de las características organolépticas. Esta prueba se realiza
para saber si el AE. presenta adulteración.

Dentro de estas características las más resaltantes son olor, sabor y color.5

3.3.3 Determinación de las Características Fisicoquímicas del Aceite Esencial de

Mentha piperita L.

A. Determinación del Poder Rotatorio

 Método: Polarimètrico (polarimetría)

 Fundamento: Se basa en la medición de la rotación del plano de polarización
de la luz, cuando esta atraviesa cierto espesor de aceite esencial en condiciones
determinadas.34
 Procedimiento:
‐ Se pesa aproximadamente 0.02 g/ml en un matraz y se disuelve con
etanol de 96%.
‐ Se coloca en tubo de 100mm. La solución y se coloca en el polarímetro,
en el espacio correspondiente entre el polarizador y el analizador.
‐ Se debe evitar burbujas dentro del tubo, que pueda interferir con el
análisis.
‐ Se ajusta el analizador, hasta que ambas mitades en el campo de visión
tengan igual intensidad de luz.
‐ Leer directamente la desviación óptica reportada en grados, y la
dirección de la desviación (+) dextrógiras y (-) levógiras.
 Expresión de los Resultados:
La desviación polarimètrica a 20 °C se calcula de acuerdo a la siguiente ecuación:

α20°CD (Ecuación 3.2)

70
 Donde:

- A = el valor del ángulo de rotación, expresado en grados.

- L = la longitud del tubo, expresado en decímetros.

- V = volumen de la solución, en mililitros.

- P = peso de la sustancia disuelta, en gramos.

B. Determinación de la Densidad

 Método: Gravimétrico
 Fundamento: Se fundamenta en la relación entre el peso (masa) de un volumen
dado de aceite esencial y su volumen, determinados a 20 °C.34
 Procedimiento:
‐ Una pipeta de 1ml se llenó hasta su línea de enrace con agua destilada a
la que previamente se le midió la temperatura, luego se pesó el agua
contenida en la pipeta por 20 veces con la finalidad de determinar el
verdadero volumen que aloja la pipeta.
‐ Luego con la muestra de aceite esencial, que estaba a la misma
temperatura del agua al momento de la prueba, se realizó el mismo
procedimiento por 3 veces.
 Expresión de Resultados:
Se debe calcular primero el volumen real de la pipeta (VlR) y luego la densidad del
aceite (ρ A.E.), de acuerdo a la siguiente ecuación:

VlR = (Ecuación 3.3)

. .
ρ A.E. (Ecuación 3.4)

Donde:

- H2O = promedio de las pesadas con agua.

- A.E. = promedio de las pesadas con aceite.

- ρ H2O = Densidad del agua a la temperatura del ensayo

71
C. Determinación del Índice de Refracción

 Método: Refractométrico (Refractómetro ABBE)

 Fundamento: Consiste en la medición del ángulo de refracción del aceite
esencial mantenido en condiciones de transparencia e isotropismo siendo la
longitud de onda de 589.3 mm, que corresponde a la línea D del sodio y siendo
la temperatura de 20 °C.34

 Procedimiento:
‐ Previamente se debe calibrar el refractómetro con agua destilada, que
corresponde a un índice de refracción de 1.33 a 20 °C.
‐ Limpiar los prismas del refractómetro con alcohol.
‐ Colocar unas gotas de aceite esencial y cerrar los prismas
adecuadamente.
‐ Se ajustan las perillas de dispersión y el control para alinear la frontera
entre la línea clara y obscura con el centro de la X.
‐ Se toma directamente la lectura el índice de refracción y se tiene en
cuenta la temperatura.

 Expresión de Resultados:
El índice de refracción a 20°C ( ntd ) se calcula según la siguiente ecuación:

ntd = nt´d + a (t´ - 20 °C) (Ecuación 3.5)

Donde:

- nt´d =Índice de refracción a la temperatura del ensayo.

- a = factor de corrección. En general a = 0.0004.

- t´ = temperatura del ensayo.

D. Determinación de Índice de Acidez

 Método: Titulación Volumétrica

 Fundamento: Se basa en la neutralización de los ácidos libres por una solución
alcohólica de hidróxido de potasio.34

72
  Procedimiento:
‐ Se pesa 0.1 g de aceite esencial., dentro de un matraz Erlenmeyer.
‐ Agregar 10 ml de etanol, y 5 gotas de rojo de fenol.
‐ Neutralizar la solución obtenida con hidróxido de potasio 0.1 N hasta la
aparición de una coloración que persista por algunos segundos.

 Expresión de resultados:
El índice de acidez se calcula de acuerdo a la siguiente ecuación:

.
Índice de Acidez (Ecuación 3.6)

Donde:

- V = volumen en mililitros de hidróxido de potasio utilizado.

- N = normalidad verdadera del hidróxido de potasio.

- P = peso en gramos del aceite esencial.

3.3.4. Síntesis y Purificación de Estándares de l-Mentona y l-Acetato de Mentilo

Entendiéndose la síntesis orgánica como la construcción planificada de moléculas

orgánicas mediante reacciones químicas. Y la purificación de sustancias orgánicas como
la depuración de impurezas se procedió:9

- A partir del Estándar de l-Mentol C10 H20 O, M = 156.26 g/mol, Ensayo: ≥ 98%,
Densidad: 0.890, al que se le evaluó su poder rotatorio como característica
fisicoquímica importante para indicar su identidad y pureza.

Se procedió a sintetizar y purificar los estándares l-Mentona y l-Acetato de Mentilo.

A. Síntesis y Purificación de l-Mentona.35

 Reactivos:
‐ Estándar de l-Mentol.
‐ Dicromato de Potasio.
‐ Ácido Sulfúrico cc.

73
 ‐ Agua destilada.
‐ Diclorometano p.a.
‐ Hidróxido de sodio al 5%
‐ Sulfato de Sodio anhidro
 Procedimiento:
 Síntesis:
‐ Se pesa 12.0 g de dicromato de potasio, 10 g de ácido sulfúrico.
‐ Se lleva a un balón de 500 ml, se añadió 60 ml de agua destilada, y se
añadió en 4 porciones el l-mentol previamente pulverizado.
‐ Se forma una masa negra la cual tiene que estar bajo agitación (stirring
con agitador magnético, a temperatura ambiente)
‐ La temperatura se eleva a 55 °C aproximadamente al empezar la
reacción, y cuando esta se haya completada la temperatura desciende.
‐ El aceite se mezcla con igual volumen de diclorometano y es llevado a
pera de separación, se agita suavemente de dos a tres veces y se deja en
reposo alrededor de 15 minutos.
‐ Se desecha la fase acuosa y se recupera la fase orgánica, la que es lavada
con hidróxido de sodio al 5%.
‐ Lavada la fase orgánica, se recupera y se seca con sulfato de sodio
anhidro, se filtra y se lleva a rota vapor hasta eliminar el solvente.
‐ Se debe obtener un líquido oleoso, guardar en frasco de vidrio ámbar
hermético hasta su purificación.

K2Cr2O7

Aq. H2SO4

l-Mentol l-Mentona

Fig.3.3: Síntesis de l-Mentona

74
  Purificación:
‐ Elproceso de purificación se llevó a cabo mediante destilación al vacío,
con una bomba de vacío de 2mmHg de presión, conectada a equipo de
destilación de vacío.
‐ En medio de esta conexión se conectó una trampa de vacío con hielo
seco, a fin de bajar la temperatura y mejorar la condensación.
‐ Se calculó con un nomograma la temperatura aproximada en la que
empezaría la destilación, sabiendo que el punto de ebullición de la l-
Mentona es de 207 °C a 1 atmosfera de presión.
‐ La colección de la l-Mentona se dio en tres porciones (cabeza, cuerpo y
cola), considerando la porción del cuerpo como la más pura.
‐ Se guardó en frasco de vidrio ámbar sellado herméticamente hasta su
análisis en el GC-MS.

B. Síntesis de l-Acetato de Mentilo.35

 Reactivos:
‐ Estándar de Mentol.
‐ Anhídrido acético.
‐ Acetato de sodio anhidro
‐ Agua destilada
‐ Carbonato de sodio al 25%
‐ Diclorometano
‐ Sulfato de Sodio anhidro.
 Procedimiento:
 Síntesis:
‐ Se pesa 15.62 g de l-mentol, 20.42g de anhídrido acético y 2g de acetato
de sodio anhidro.
‐ Se lleva a balón de 100ml, conectado a reflujo, en agitación constante
(hot plate stirring), en Baño María de aceite, controlando que la
temperatura no exceda los 130°C por un periodo de 2 horas.
‐ Se deja enfriar, luego se lleva a pera de separación y se lava con agua
destilada tibia (aproximadamente 25 ml).
‐ Se elimina la fase acuosa.

75
 ‐ S lava nuevamente coon carbonatto de sodio al 25 % (ttener cuidad
Se do de
p
proyeccione
es), luego see le añade diiclorometan
no.
‐ S recuperaa la fase oorgánica, see seca con sulfato dee sodio anh
Se hidro,
p
posteriormen
nte filtrar y llevar a rotta vapor hassta eliminar solvente.
‐ E productto es guaardado en frasco de
El d vidrio ámbar seellado
h
herméticame
ente hasta ssu purificaciión.

H 3C C CH3COONa
O

H3 C C

l-Mentool Annh. Acético

o l-Acetaato de Menttilo

Fig. 3.4: Síntessis de l-Aceetato de Meentil

 Purificación
P n:
- EL
L proceso dee purificacióón se llevó a cabo mediante destiilación al vacío,
v
conn una bomb
ba de vacíoo de 2mmH
Hg de presión, conectaada a equip
po de
desstilación de vacío.
- En medio de esta
e conexióón se conecttó una tram
mpa de vacíoo con hielo seco,
a fin
f de bajar la temperatuura y mejorrar la condensación.
- See calculó co
on un nom
mograma laa temperatu
ura aproxim
mada en laa que
em
mpezaría la destilación,
d sabiendo que
q el punto de ebulliciión del l-Accetato
de Mentilo es 229 °C a 1 atmosfera de
d presión.
- La colección de l-Acetatto de Menttilo se dio en tres porrciones (cab
beza,
cueerpo y cola)), consideraando la porcción del cuerrpo como laa mas pura.
- Se guardó en
n frasco dee vidrio ám
mbar sellado
o herméticaamente hastta su
anáálisis en el GC-MS.

76
IMP
PORTANTE
E:

- En el procesoo de la sínteesis de la ll-Mentona y l-Acetato de Mentiloo, es imporrtante

conntrolar la tem
mperatura, con
c la finaliidad de que las molécu
ulas no sufraan pirólisis.

porciones y tiempos inddicados, a fin

- Es fundamentaal realizar los lavados en las prop f de
minar todo tipo
elim t de impu
urezas.

- El éxito de laa purificació

ón de estas sustancias,, parte desd
de su secado
do con sulfaato de
soddio anhidro, la eliminacción de solvvente en el rota
r vapor (Condicione
( es óptimas: Baño
Maaría, circulacción de agua helada poor el refrigerrante).

- La purificacióón será óptiima con loss cuidados antes menccionados, laa presencia de la
mpa de hieloo seco lo qu
tram ue mejora laa condensacción y la reg
gulación de temperatura.

Fiig.3.5: Puriificación dee l-Mentona

a y l-Acetatto de Menttilo

3.3.55. Determin
nación Cua
alitativa d
de l-Mentoll, l-Menton
na y l-Acettato de Meentilo
preseente en el AE.
A de Men
ntha piperitta L.

 Método: Cromatografía de Cappa Fina (CC

CF.)
 Procedim
miento :
‐ El mentol,
l-m mentona
l-m y o
l-acetato de mentilo, fueeron analizzados
cualitativvamente meediante CCF
F. de la sigu
uiente maneera:
‐

77
a) Preparación de la Fase Móvil22
‐ En cuba de vidrio para CCF., colocar la mezcla de la fase móvil:
Tolueno-Cloroformo (10+10).
‐ Se dispersa la fase móvil de manera uniforme por toda la cuba, se tapo y
dejo saturar por un periodo de tiempo de 25 minutos.

b) Corrida Cromatográfica
‐ Se preparó placas de sílica gel de 7 cm de largo x 5 cm de ancho, a las
cuales se las lavó con etanol previamente, para limpiarlas.
‐ Luego se trazó dos márgenes a 1 cm del borde de las placas, uno en la
parte superior, y otro en la parte inferior.
‐ Se sembró el estándar de l-mentol y l-acetato de mentilo, y las muestras
de aceite esencial, diluidos en diclorometano.
‐ Se introdujo las placas dentro de la cuba que contenía la fase móvil,
esperando que esta empiece ascender hasta el margen superior.
‐ Acabada la corrida se dejó secar las placas a temperatura ambiente.

c) Detección
 l-Mentol y l-Acetato de Mentilo:22
‐ Se preparó el reactivo revelador: Anisaldehido (1ml) y Ácido sulfúrico
concentrado (2ml) en Ácido acético glacial (100ml).
‐ Se sumergió las placas dentro de la solución reveladora alrededor de 3 a
5 segundos, se retiró cuidadosamente y se secó con una corriente de aire
frio (producido por una secadora), hasta que la placa se encuentre seca.
‐ Se llevó luego a una estufa a temperaturas aproximadas de 90-125°C
entre 5 a 10 minutos.
‐ Aparecen manchas de color azul violeta.

 l-Mentona:22
- Se preparó el reactivo revelador: 2,4 dinitrofenilhidrazina (0.4 g), Ácido
sulfúrico concentrado (2ml), 12 ml de etanol 96% (12ml) y agua destilada
(3ml).

78
 - Se sumergió las placas dentro de la solución reveladora alrededor de 3 a 5
segundos, se retiró cuidadosamente y se secó con una corriente de aire frio
(producido por una secadora), hasta que la placa se encuentre seca.
- Se llevó luego a una estufa a temperaturas aproximadas de 90-125°C entre
5 a 10 minutos.
- Aparecen manchas de color amarillo.
 Expresión de Resultados:
El factor de Retención (Rf), se calcula de acuerdo a la siguiente ecuación:

Rf (Ecuacion 3.9)

3.3.6. Cuantificación de l-Mentol, l-Mentona y l-Acetato de Mentilo en el Aceite

Esencial de Mentha piperita L.

A. Método: Cromatografía der Gases acoplada a Detector de Masas (GC-MS)

B. Fundamento: Analizar cuantitativamente muestras en GC-MS, se fundamenta
en separar completamente los compuestos, para que así cada compuesto
detectado sea puro y su concentración pueda ser determinada.
Esto se consigue llegando al equilibrio de los parámetros Cromatográficos, como la
temperatura, presión, flujo, etc., y la elección adecuada de la columna.33
C. Procedimiento: El procedimiento para trabajar con un GC-MS, se divide en
dos partes que comprenden respectivamente en:

 Configuración del equipo:

‐ Elegida la columna, y colocada en el horno del equipo, este se
prende y se empieza a configurar.
‐ Esta configuración consiste en poner a punto el equipo (tuning),
que son parámetros que se logran automáticamente por el equipo
(ejemplo: control del vació, etc.), parámetros que se comprueban
con la línea base. Este proceso se realiza entre 5 a 24 horas
aproximadamente.

79
 ‐ Luego se debe ingresar al software y crear el método de análisis
correspondiente a todos los parámetros que exige el equipo de
acuerdo a la muestra hacer analizada.
‐ Finalmente se realiza el análisis y se adquiere los datos.

 Análisis Cuantitativo de Muestras:

‐ Creado el método, lo primero que se hace es analizar la o las
soluciones estándares.
‐ Luego se cera la tabla de compuestos y parámetros cuantitativos.
‐ Se realiza la curva de calibración.
‐ Se analiza la muestra.
‐ Finalmente se cuantifica.

 Parámetros Cromatográficos para el Análisis Cuantitativo de l-Mentol, l-

Mentona y l-Acetato de Mentilo en el Aceite Esencial de Mentha piperita L.
‐ Equipo: Cromatógrafo de Gases con Detector de Masas (GC-MS) Shimadzu
‐ Auto Inyector AOC Shimadzu
‐ Columna: RTX-5MS (5% fenil/95% dimetilpolisiloxano) de 30 m de longitud,
0.25 um de espesor y 0.25 mm de diámetro.
‐ Gas Carrier: Helio
‐ Sistema: temperatura programada
‐ Solvente: Diclorometano grado GC
‐ Volumen de Inyección : 2ul
‐ Sampler:
 Número de lavadas con solvente antes de la corrida: 3
 Número de lavadas con solvente después de la corrida: 3
 Número de lavadas del sampler: 3

‐ GC (Cromatógrafo de Gases):
 Temperatura del horno: 40°C
 Temperatura de la inyección: 240°C
 Modo de Inyección: Splitles
 Tiempo de muestreo: 2 minutos

80
  Modo de control de flujo: Presión
 Presión: 54.2 KPa
 Flujo total: 30.0 ml/min
 Flujo de la columna: 1.06 ml/min
 Velocidad linear: 37.2 cm/seg
 Flujo de purga: 3.0 ml/min
 Proporción de partida: -1 .0

‐ Temperatura programada del Horno:

Rate Final T° Hold Time

- 40 3
40 110 10
20 200 0
15 240 1

‐ MS (Espectrómetro de Masas):
 Temperatura de la fuente de ión: 200°C
 Temperatura de la interface: 240°C
 Tiempo de corte del solvente: 5 min
 Tabla de Compuestos:

art time nd CQ Modevent an Speed art nd

me me /z /z
an 30 50 0

‐ Tiempo Total de Corrida: 22.92 min

‐ Método de Calculo: Estándar Externo

81
 Fig.
F 3.6: Parrámetros Cromatográ
C áficos

 Preparaación de lass Solucione s Estándarres

i. Solución Estándar de l-M
Mentol:
‐ S pesó 5 mg
Se mentol y se diluyó en fiola 10 ml
m de estánndar de l-m m con
d
diclorometan
no grado GC
C, resultand
do una conccentración dde 500 ppm
‐ A partir de esta soluciión, se prep
pararon 5 soluciones eestándar dee: 2.1,
2 2.9, 3.3 y 3.7 ppm rrespectivam
2.5, mente.
ii. Solución Estándar de l-M
Mentona:
‐ S pesó 0.00
Se 086 g de esttándar de l--mentona y se diluyó een fiola de 25
2 ml
c diclorom
con metano graddo GC, resultando una concentraci
c ión de 344 ppm.
p
‐ L
Luego se peesó 3.9261 g (2.9835 ml)
m de solución madree (344 ppm)) y se
e
enrazó en fio
ola de 10 m
ml con diclo
orometano, resultando
r 1102.63 ppm
m.
‐ A partir de la
l solución 102.63 ppm
m, se prepaararon 5 soluuciones esttándar
d 0.9, 3.0, 5.2, 7.2 y 99.1 ppm resp
de: pectivamentte.
iii. Solución Estándar de l-Accetato de Mentilo:
M
‐ S pesó 0.00
Se 086 g de esttándar l-aceetato de men
ntilo y se ddiluyo en fio
ola de
2 ml con diiclorometanno grado GC
25 C, resultand
do 344 ppm..
‐ L
Luego se peesó 3.9175 g (2.9769 ml)
m de solución madree (344 ppm)) y se
e
enrazó en fio
ola de 10 m
ml con diclorrometano, reesultando 1 02.41 ppm..

82
 ‐ A partir de esta solución 102.41 ppm, se prepararon 5 soluciones
estándar de: 1.0, 3.1, 5.1, 7.2 y 9.1 ppm respectivamente.
 Preparación de las Soluciones de las muestras de AE. de Mentha piperita L.
iv. Preparación de la solución de la muestra de AE.A de Mentha piperita L.
‐ Se preparó una solución madre, pesando 0.0096 g (0.0126 ml) de
muestra de aceite esencial y se diluyó en fiola de 25 ml con
diclorometano grado GC.
‐ Luego se pesó 0.3914 g (0.3376 ml) y 0.6468 g (0.4915 ml),
respectivamente de solución madre y se enrazó en fiola de 10 ml con
diclorometano.
v. Preparación de la solución de la muestra de AE.B de Mentha piperita L.
‐ Se preparó una solución madre, pesando 0.0096g (0.0126 ml) de muestra
de aceite esencial y se diluyó en fiola de 25 ml con diclorometano grado
GC.
‐ Luego se pesó 0.3886 g (0.2953 ml) y 0.6502 g (0.4940 ml),
respectivamente de solución madre y se enrazó en fiola de 10 ml con
diclorometano.
vi. Preparación de la solución de la muestra de AE.C De Mentha piperita L.
‐ Se preparó una solución madre, pesando 0.0117 g (0.0154 ml) de
muestra de aceite esencial y se diluyó en fiola de 25 ml con
diclorometano.
‐ Luego se pesó 0.3962 g (0.3010 ml) y 0.6573 g (0.4994 ml),
respectivamente de solución madre y se enrazó en fiola de 10 ml con
diclorometano.
 Los ajustes de g a ml en la preparación de las soluciones se realizaron teniendo
en cuenta la densidad del diclorometano 1.131593 . Se realizó de esta manera

para obtener mayor precisión y exactitud en los cálculos y considerando que la

concentración se expresa en ppm

 Idoneidad del Sistema

a) Coeficiente de reparto (k)
Es la concentración en fase líquida o gaseosa necesaria para eluir un compuesto
después del volumen inicial contenido en la columna (tm).33

83
Este factor determina la retención del soluto y se calcula según ecuación:

k ( Ecuación 3.10)

Donde:
- tr = tiempo de retención del compuesto
- tm = tiempo en el que el compuesto no retenido pasa por el interior del sistema.

b) Números de Platos Teóricos (N)

Este parámetro muestra la eficiencia de la columna, donde un valor alto significa
mejor eficiencia.33
El cálculo se basa en la relación entre el tiempo de retención y la anchura de pico
cromatográfico, y se calcula según ecuación:

2
N 16 x t|w (Ecuación 3.11)

Donde:
- t = tiempo de retención
- w = anchura del pico en la línea de base determinado por la tangente ajustada a un
porcentaje de altura del pico.

c) Altura Equivalente al Plato Teórico (HETP)

Este parámetro muestra la eficiencia de la columna un valor pequeño significa
mejor eficiencia.33
Este parámetro se calcula según ecuación 3.12:

HETP (Ecuación 3.12)

Donde:
- L = longitud de la columna en cm o mm
- N = número de platos teóricos.

84
 d) Resolución (R)
Es la medida de la separación entre dos picos. Este parámetro resulta muy útil para
controlar el comportamiento de posibles interferencias.33
Este parámetro se calcula según ecuación 3.13:

R 2 (Ecuación 3.13)

Donde:
- V2 y V1 = tiempo de retención
- W1 y W2 = anchura del pico

D. Expresión de Resultados

- Primero se analizó los estándares l-Mentol, l-Mentona y l-Acetato de Mentilo,

obteniendo sus espectros, los que fueron comparados con la bibliografía. Se obtuvo
sus tiempos de retención.

- Luego se elaboraron las curvas de calibración respectivas a cada estándar, obteniendo

las ecuaciones de regresión lineal.

- Se analizaron las muestras de aceite esencial de Mentha piperita L., obteniéndose sus
espectros, tiempos de retención, y áreas bajo la curva, las cuales fueron interpoladas
con sus respectivas ecuaciones de regresión lineal.

- Finalmente se realizan los cálculos tomando en cuenta las diluciones de las muestras
que se hicieron para preparar la solución de análisis, obteniéndose una concentración
final, que se puede expresar en g/ml, tomando en cuenta la densidad de cada muestra
de aceite esencial de Mentha piperita L., obtenido en las características fisicoquímicas.

85
 CAPÍTULO IV

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

4.1. OBTENCIÓN DE AE. DE Mentha piperita L.

Se obtuvo el AE. de Mentha piperita L. siguiendo el procedimiento 3.3.1.

4.1.1. Rendimiento:

El rendimiento de aceite esencial de Mentha piperita L. de las tres muestras de aceite

esencial obtenido, se expresaron en porcentaje de rendimiento, según ecuación 3.1. Lo
que se expresa en las tablas 4.1, 4.2 y 4.3.

Tabla 4.1. Muestra A - Porcentaje de Rendimiento de AE. de Mentha piperita L.

Peso de Menta (g) Peso del A.E. obtenido (g) % Rendimiento

101.83 1.14 1.11
101.76 1.16 1.14
101.79 1.22 1.19
101.91 1.11 1.09
101.87 1.28 1.26
101.89 1.27 1.25
101.86 1.28 1.26
101.88 1.17 1.15
101.84 1.16 1.14
101.86 1.19 1.17
Promedio 1.18

Tabla 4.2. Muestra B - Porcentaje de Rendimiento de AE. deMentha piperita L.

Peso de Menta (g) Peso del A.E. obtenido ( g ) % Rendimiento

101.80 0.66 0.65
101.72 0.63 0.62
101.68 0.60 0.59
101.74 0.64 0.63
101.78 0.60 0.59
101.85 0.61 0.59
101.76 0.64 0.63
101.73 0.61 0.59
101.83 0.55 0.64
101.68 0.66 0.59
Promedio 0.61

86
Tabla 4.3. Muestra C - Porcentaje de rendimiento de AE. deMentha piperita L.

Peso de Menta (g) Peso del A.E. obtenido (g) % Rendimiento

101.52 0.87 0.85
101.61 0.95 0.93
101.74 0.91 0.89
101.61 0.89 0.87
101.67 0.86 0.84
101.61 0.9 0.88
101.61 0.92 0.90
101.69 0.88 0.87
101.60 0.91 0.89
101.66 0.84 0.85
Promedio 0.88

Los porcentajes de rendimiento de aceite esencial de Mentha piperita L. mencionados

en literaturas son: 16, 34,36

 0.5% a 1% 16
 0.1% a 1% 34
 0.2 a 0.5 % (material oreado) y 1 a 2.5% (material seco).36

Estos valores de literatura se aproximan entre si a un porcentaje de rendimiento de

aceite esencial de Mentha piperita L. de 0.5 a 1%.

Como se observa en las tablas 4.1, 4.2 y 4.3, los porcentajes de rendimiento de AE. De
Mentha piperita L. reportados en este trabajo de investigación, se encuentran dentro de
los valores establecidos en las distintas literaturas.

Sin embargo a la hora de evaluar el rendimiento de aceite esencial , tenemos que

considerar que estos pueden variar según el origen de la planta, condiciones climáticas,
secado de la Planta (considerado el secado por muchos autores y trabajos de
investigación como un factor favorable en la mejora de rendimiento por evaporación del
agua) y es a la vez este factor motivo de estudio constante, ya que determinar una
técnica (secado al ambiente o desecadores industriales) y temperatura de secado así
como su almacenamiento después de la cosecha, un factor determinante en la mejora de
rendimiento y calidad en el proceso productivo de los aceites esenciales.

87
4.2. CARACTERÍSTICAS ORGANOLÉPTICAS

Se evidencia en este trabajo de investigación buenas características de olor, color y

sabor en las tres muestras de AE. de Mentha piperita L., sin partículas en suspensión, ni
rastros de agua o solvente.

Estos resultados se expresan en la tabla 4.4:

Tabla 4.4: Características Organolépticas de las tres muestras AE. de Mentha

piperita L. ( Muestra A, Muestra B y Muestra C)

Características Organolépticas Olor Sabor Color

AE.A Característico Picante Verde claro-traslucido
AE.B Característico Picante Verde claro-traslucido
AE.C Característico Picante Verde claro-traslucido

Estas características organolépticas propias de un buen aceite de Mentha piperita L., se

lograron al tener en cuenta los parámetros establecidos en el procedimiento 3.3.1.:

 El baño de aceite, contribuyo a controlar la temperatura del sistema, evitando

sobrepasar los 120°C impidiendo la formación de un olor empireumático
(“quemado”). Por lo tanto el olor de los tres AE.s. de Mentha piperita L. fueron
característicos ( fresco, penetrante )
 La selección del solvente utilizado para la separación de la fase acuosa y
orgánica, es fundamental. Se utilizo diclorometano que posee un punto de
ebullición de 40°C, lo que aseguro la remoción del agua que pudiese contener la
fase orgánica.
 La eliminación del solvente del aceite esencial, se dio en le rota vapor.

Es importante mencionar que después de obtenidas las tres muestras de aceite esencial de
Mentha piperita L., estas fueron almacenadas en frascos ámbar, sellados herméticamente y bajo
refrigeración, hasta su cuantificación. En este tiempo no se evidencio presencia de agua dentro
del frasco, ni partículas extrañas, manteniendo sus características ya mencionadas.

88
Finalmente estos resultados nos indican de manera general que el método de destilación
empleado, y el cumplimiento de los parámetros ya mencionados contribuyeron a
obtener tres muestras de aceite esencial de buena calidad.

4.3. DETERMINACIÓN DE LAS CARACTERÍSTICAS FISICOQUÍMICAS DE

LAS TRES MUESTRAS (A, B y C) DE ACEITE ESENCIAL OBTENIDO DE
Mentha piperita L.

Siguiendo el procedimiento 3.2.2 para la determinación de las principales características

fisicoquímicas, se elaboró la tabla 4.5 donde se muestran los resultados obtenidos:

Tabla 4.5: Características Fisicoquímicas determinadas para las muestras de AE.

de Mentha piperita L. (Muestra A, Muestra B y Muestra C)

Características Resultados
Fisicoquímicas A.E. A A.E. B A.E. C
Poder rotatorio -30° -27.5° -27.5°
Densidad 0.8991g/ml 0.8994 g/ml 0.8987 g/ml
Índice de refracción 1.4643 1.4573 1.4622

Índice de acidez 1.6715 1.6861 1.5759

A. Determinación de Poder Rotatorio:

La determinación del poder rotatorio de las tres muestras de aceite esencial de Mentha piperita
L., se determinó según procedimiento 3.3.3:

- Las lecturas directas del polarímetro para las tres muestras de aceite fueron :
A: -0.60° B: -0.55° C: -0.55°
- La longitud de tubo utilizada fue 100 mm (1dm)

. °
 α20°CD A.E. A (Ecuación 3.2)

α20°CD A.E. A 30°

89
 . °
 α20°CD A.E. B (Ecuación 3.2)

α20°CD A.E. B 27.5°

. °
 α20°CD A.E. C (Ecuación 3.2)

α20°CD A.E. C 27.5°

El poder rotatorio de un aceite esencial es una característica resultante de la suma de las

rotaciones ópticas de sus constituyentes.

Para el aceite esencial de Mentha piperita se indican valores de -10° a -30° (NTP)34
(BP)36, -18° a -32° (USP).19

Los valores obtenidos en las tres muestras de AE. deMentha piperita L. evaluadas, se
encuentran dentro de los valores estipulados por las normas antes mencionadas. Por lo
tanto, estos resultados son criterios importantes de identidad y pureza de las muestras
obtenidas.

B. Determinación de la Densidad:
La densidad de las tres muestras de aceite esencial de Mentha piperita L. se realizaron
según el procedimiento 3.3.3:

.
 VlR 1.0205 (Ecuación 3.3)
.

.
 ρ A. E. A 0.8991 (Ecuación 3.4)
.

.
 . . 0.8994 (Ecuación 3.4)
.

.
 . . 0.8987 (Ecuación 3.4)
.

Para el aceite esencial de Mentha piperita L. se indican valores de 0.9 g⁄ml a 0.916g⁄ml
(NTP)34,(BP)36 y 0.896 a 0.908 (USP).19
Los valores obtenidos en las tres muestras de aceite esencial de Mentha piperita L.
evaluadas se encuentran dentro de los valores estipulados por las normas antes

90
mencionadas. Por lo tanto estos resultados nos sirven como criterio de pureza, ya que
en el control de calidad de aceites esenciales se manejan rangos estrechos de
densidades.

C. Determinación de Índice de Refracción:

La determinación de las tres muestras de aceite esencial de Mentha piperita L. se

determinaron según procedimiento 3.3.3:

- Las lecturas directas del refractómetro de Abbe fueron:

A: 1.4642 B: 1.4574 C: 1.4624

 AE.A n td 1.4642 0.0004 20.3 20° (Ecuación 3.5)

n td 1.4643

 AE.B n td 1.4574 0.0004 19.8 20° (Ecuación 3.5)

n td 1.4573

 AE.C n td 1.4624 0.0004 19.6 20° (Ecuación 3.5)

n td 1.4622

Para el aceite esencial de Mentha piperita L., se indican valores de 1.4600 a 1.4670
(NTP),34 1.457 a 1.467 (BP)36 y 1.459 a 1.465 (USP).19

Los valores obtenidos en las tres muestras de aceite esencial de Mentha piperita L.
evaluadas se encuentran dentro de los valores estipulados en las normas antes
mencionadas.

D. Determinación del Índice de Acidez:

Los índices de acidez de las tres muestras de aceite esencial de Mentha piperita L. se
determinaron según procedimiento 3.3.3:

. . .
 Índice de Acidez A.E. A 1.6715 (Ecuación 3.6)
.

91
 . . .
 Índice de Acidez A.E. B 1.6861 (Ecuación 3.6)
.

. . .
 Índice de Acidez A.E. C 1.5759 (Ecuacion 3.6)
.

Los valores de índice de acidez de un aceite aumenta a medida que envejece. Por lo que
los valores obtenidos en las tres muestras de aceite esencial de Mentha piperita L.
evaluadas se pueden considerar bajos, teniendo en cuenta que fueron almacenados en
frasco ámbar, sellado herméticamente, bajo refrigeración, y además que este y los
demás parámetros fisicoquímicos se evaluaron poco tiempo después de su extracción.

4.4. Síntesis y Purificación de Estándares de l-Mentona y l-Acetato de Mentilo

Para evaluar el contenido de mentol, mentona y acetato de mentilo en las tres muestras
de aceite esencial de Mentha piperita L., mediante cuantificación por método de patrón
externo, en GC-MS, es de vital importancia contar con los estándares respectivos.

A partir del estándar de l-mentol de referencia, es que se sintetizó y purificó los

estándares de mentona y acetato de mentilo, llevando a cabo cuidadosamente cada uno
de los parámetros establecidos en el punto 3.3.4.

a) Poder Rotatorio del Estándar de l-Mentol

. °
 α20°CD A.E. A (Ecuación 3.2)

α20°CD A.E. A 50°

b) Análisis de los Estándares l-Mentol, l-Mentona y l-Acetato de Mentilo por GC-

MS

Evaluado el poder rotatorio del estándar de l-mentol, sintetizado y purificado los

estándares de l-mentona y l-acetato de mentilo, estos tres fueron analizados por GC-MS,
bajo los parámetros establecidos en el punto 3.3.6, obteniendo los Espectros de Masa
correspondientes, verificando los iones de referencia (target ions) con la bibliografía y la
Biblioteca Virtual del Software GC SOLUTION del GC-MS, en el que se realizó el análisis.

92
Los espectros de masa obtenidos se muestran a continuación

Fig.4.1: Espectro de Masa del Estándar l-Mentol

Fig.4.2: Espectro de Masa del Estándar l-Mentona

93
 Fig.4.3: Espectro de Masa del Estándar l-Acetato de Mentilo

Iones de Referencia mencionados en literatura: (SDBS) 37(NIST)38

 Mentol: 71-81-9537, 38
 Mentona: 112-69-4137, 38
 Acetato de Mentilo:95-43-8137,38

Realizando las respectivas comparaciones entre los espectros de masa obtenidos en el

análisis contra los obtenidos de literatura se puede observar que los iones de referencia
son iguales, lo que nos indica claramente que la síntesis y purificación de los estándares
mentona y acetato de mentilo, se llevaron a cabo de manera adecuada, así como
también, seguir de manera ordenada y minuciosa el protocolo 3.34. de síntesis y
purificación, permitió obtener los estándares deseados y solucionar uno de los grandes
problemas en los trabajos e investigación realizados por estudiantes de farmacia , que es
la adquisición de estándares, los cuales tiene un precio muy elevado en el mercado, y
que se convierten muchas veces un factor limitante para trabajos de investigación.

Con este análisis también, se puede resaltar la importancia de la Técnica de

Cromatografía Gaseosa acoplada a un Espectrómetro de Masas, en la obtención de los
perfiles cromatográficos, como medio de separación de compuestos orgánicos,
identificación, cuantificación, evaluación, de muestras complejas como es el caso de
mixturas de estándares, aceites esenciales, etc.

94
DETERMINACIÓN CUALITATIVA DE l-MENTOL, l-MENTONA Yl-
ACETATO DE MENTILO EN LAS TRES MUESTRAS DE ACEITE ESENCIAL
DE Mentha piperita L.

La determinación cualitativa de l-mentol, l-mentona y l-acetato de mentilo en las tres

muestras de aceite esencial de Mentha piperita L. obtenidas así como en los estándares
correspondientes se hizo según procedimiento 3.3.5, lo que se expresa en la tabla 4.6:

Tabla 4.6: Rf para Estándares y Muestras de AE. de Mentha piperita L. (Muestra

A, Muestra B y Muestra C) l-Mentol, l-Mentona y l-Acetato de Mentilo

Fase Móvil: Fase móvil:

Tolueno – Cloroformo Tolueno-Cloroformo
Revelador: Revelador:
Anisaldehido –Ac. Sulfúrico 2,4 dinitrofenilhidrazina
Componentes l-Acetato de
l-Mentol l-Mentona
químicos Mentilo
Rf. Estándar 0.48 0.82 0.64
Rf. A.E. A 0.48 0.82 0.64
Rf. A.E. B 0.48 0.82 0.64
Rf. A.E. C 0.48 0.82 0.64

-Rf para el estándar de l-Mentol

.
 Rf 0.48 (Ecuación 3.9)

- Rf para el estándar l-Acetato de Mentilo

.
 Rf 0.82 (Ecuación 3.9)

- Rf para estándar l-Mentona

.
 Rf 0.64 (Ecuación 3.9)

La fuerza de elución de los solventes que aumenta con la polaridad, es de 0.29 para el
tolueno y 0.40 para el cloroformo, mostrando que estos solventes y las proporciones
utilizadas fueron adecuadas para realizar la cromatografía de capa fina. Ya que

95
lasmanchas y sus respectivas coloraciones correspondes al l-mentol, l-mentona y l-
acetato de mentilo.

Los Rf. obtenidos tanto como las manchas (azul violeta para l-mentol y l-acetato de
mentilo, amarilla para l-mentona)22, para los estándares y las 3 muestras de aceite
esencial de Mentha piperita L. comprueban el proceso de síntesis y purificación de los
estándares, así como la existencia de los componentes químicos l-Mentol, l-Mentona y
l-Acetato de Mentilo en las tres muestras de aceite esencial de Mentha piperita L.

96
4.6. CUANTIFICACIÓN DE l-MENTOL, l-MENTONA Y l-ACETATO DE
MENTILO EN LAS TRES MUESTRAS DE AE. (A, B Y C) DE Mentha piperita L.

La cuantificación de l-Mentol, l-Mentona y l-Acetato de Mentilo en las tres muestras de

aceite esencial de Mentha piperita L. Se realizó según procedimiento 3.3.6, obteniendo
los siguientes resultados:

A) Idoneidad del Sistema

Se evaluaron los parámetros de idoneidad del sistema tanto para los estándares l-mentol,
l-mentona y l-acetato de mentilo, así como para las tres muestras de aceite esencial de
Mentha piperita, lo que se expresa a continuación en las tablas 4.7 y 4.8

Tabla 4.7: Parámetros de Idoneidad de Sistema para los estándares l-mentol,l

mentona y l-acetato de mentilo.

Altura
Coeficiente de Numero de
equivalente al Resolución
Tr Estándar Reparto platos
plato teórico (R)
(K) teóricos (N)
(HETP)
10.479 l-Mentona 0.000 114223 0.000 -
11.123 l-Mentol 0.067 111584 0.000 5.457
l-Acetato de
15.811 0.392 598087 0.000 32.493
mentilo

Tabla 4.8: Parámetros de Idoneidad de Sistema para las tres muestras (A, B y
C)de Aceite Esencial de Mentha piperita L.

97
 Numero Altura
Coeficiente de equivalente
Compuestos Resolución
Muestras tr de Reparto platos al plato
químicos (R)
(K) teóricos teórico
(N) (HETP)
A.E. A 10.479 l-Mentona 0.000 110372 0.000 -
11.123 l-Mentol 0.068 106639 0.000 5.385
l-Acetato de
15.81 0.391 600393 0.000 31.941
mentilo
A.E. B 10.479 l-Mentona 0.000 115597 0.000 -
11.123 l-Mentol 0.068 105311 0.000 5.441
l-Acetato de
15.81 0.392 589824 0.000 31.736
mentilo
A.E. C 10.479 l-Mentona 0.000 112715 0.000 -
11.123 l-Mentol 0.068 107643 0.000 5.422
l-Acetato de
15.81 0.392 585600 0.000 31.976
mentilo

Los parámetros K, N, HETP y R, tanto para los estándares como para las tres muestras
de AE. de Mentha piperita L. coinciden entre si, y son valores obtenidos del software
GC Solution del GC-MS Shimatzu, que nos indican la idoneidad del sistema para llevar
a cabo la cuantificación de l-mentol, l-mentona ya l-acetato de mentilo en las tres
muestras.

B) Concentraciones y Áreas para los Estándares

Se procedió a realizar las lecturas en el GC-MS de las soluciones estándares de

l-mentol, l-mentona y l-acetato de mentilo, hallando sus áreas bajo la curva
correspondientes a cada concentración (ppm) determinadas en el punto 3.3.6, para la
elaboración de sus curvas de calibración y llevar a cabo la cuantificación por método de
patrón externo.

Estas concentraciones y áreas bajo la curva para las soluciones estándares de l-mentol,
l-mentona y l-acetato de mentilo se expresan a continuación en las tablas 4.9, 4.10 y
4.11:

Tabla 4.9: Concentraciones y Áreas para la Curva de Calibración del l-

Mentol
98
 Coeficiente
Concentración Desviación
Área 1 Área 2 Área 3 Promedio de
(ppm) Estándar
Variación
2,1 461745 460438 464392 462191,667 2014,48811 0,43585557
2,5 677178 669865 678542 675195 4666,02604 0,69106348
2,9 826113 829342 828751 828068,667 1719,24237 0,20762075
3,3 1067608 1054314 1036891 1052937,67 15404,6825 1,46301941
3,7 1237613 1195446 1189732 1207597 26151,1499 2,16555274

Tabla 4.10: Concentraciones y Áreas para la Curva de Calibración de la l-

Mentona

Coeficiente
Concentración Desviación
Área 1 Área 2 Área 3 Promedio de
(ppm) Estándar
Variación
0,9 66609 66835 65468 66304 732,762581 1,10515592
3 199936 194873 192547 195785,333 3778,04107 1,92968544
5,2 340221 337985 341528 339911,333 1791,68422 0,52710341
7,2 453481 451687 459871 455013 4301,71268 0,94540435
9,1 563421 563309 560598 562442,667 1598,50941 0,28420842

Tabla 4.11: Concentraciones y Áreas para la Curva de Calibración del l-Acetato de

Mentilo

Coeficiente
Concentración Desviación
Área 1 Área 2 Área 3 Promedio de
(ppm) Estándar
Variación
1 77359 77048 77693 77366,6667 322,568339 0,41693452
3,1 157299 155326 155157 155927,333 1190,8998 0,76375307
5,1 245516 247134 246781 246477 850,760248 0,34516821
7,2 330264 330215 334163 331547,333 2265,36627 0,68327085
9,1 418855 413583 417669 416702,333 2765,74209 0,66372129

C) Curvas de Calibración

99
A partir de los datos obtenidos (Áreas), se construyen las Curvas de Calibración, las que
se muestran a continuación:

1400000
1200000
1000000
800000
Area

600000
400000 y = 467138x ‐ 509503
R² = 0,9965
200000
0
2 2,5 3 3,5 4
Concentracion (ppm)

Fig.4.7: Curva de Calibración del Estándar l-Mentol

600000

500000

400000
Area

300000

200000
y = 60800x + 15028
100000
R² = 0,9992
0
0 2 4 6 8 10
Concentracion (ppm)

Fig.4.8: Curva de Calibración del Estándar l-Mentona

100
 450000
400000
350000
300000
250000
Area
200000
150000
100000
50000 y = 42067x + 31063
R² = 0,9991
0
0 2 4 6 8 10
Concentracion (ppm)

Fig.4.9: Curva de Calibración del Estándar de l-Acetato de Mentilo

D) Tiempos de Retención y Áreas de las tres muestras de AE. de Mentha piperita L.

 Muestra de AE.A
Se preparó una solución madre pesando 0.0096 g (0.0126 ml) de la muestra A.
del AE. de Mentha piperita L. obtenido y se enraso en una fiola de 25 ml con
diclorometano grado GC.
De esta solución madre se pesó una alícuota de 0.3914 g (0.3376ml) y se
realizó la corrida cromatográfica por triplicado en el GC-MS obteniendo el
siguiente resultado expresado en la tabla 4.12:

Tabla 4.12: Tiempos de Retención y Áreas de la muestra a del AE. A deMentha

piperita L.

Tr Compuesto Área 1 Área 2 Área 3 Promedio

10.479 Mentol 225895 227635 223582 225704

11.123 Mentona 402260 400598 403621 4 02159.667
Acetato de
15.811 306618 307241 309586 307815
Mentilo

Como se observa el área promedio del Mentol en la muestra A del AE. De Mentha
piperita L. obtenido no cae dentro de su respectiva curva de calibración (Tabla

101
 4.9), por lo que se preparó una solución más tomando una alícuota de la solución
madre anterior pesando 0.6468 g (0.4915ml) y se realizó una nueva lectura
obteniendo los siguientes resultados expresados en la tabla 4.13:

Tabla 4.13: Tiempos de Retención y Áreas de la muestra del AE.A de Mentha piperita
L.

tr Compuesto Área 1 Área 2 Área 3 Promedio

10.479 Mentol 5305 1523 6146 4324.667
11.123 Mentona 9542 7841 8057 8480
15.811 Acetato de 1869 1093 7885 3615.667
Mentilo

 Muestra de AE.B
Se preparó una solución madre pesando 0.0096 g (0.0126 ml) de la muestra B
del aceite esencial de Mentha piperita L. obtenido y se enrasó en una fiola de 25
ml con diclorometano grado GC.
De esta solución madre se pesó una alícuota de 0.3886g (0.2953ml) y se realizó
la corrida cromatográfica por triplicado en el GC-MS obteniendo los siguientes
resultados expresados en la tabla 4.14:
Tabla 4.14: Tiempos de Retención y Áreas de la muestra del AE.B de Mentha piperita
L.

tr Compuesto Área 1 Área 2 Área 3 Promedio

10.479 Mentona 6711 5863 2548 5040.667
11.123 Mentol 7184 8169 9375 8242.667
15.811 Acetato de 0449 1623 9851 3974.333
Mentilo

Como se observa el área promedio del Mentol en la muestra B del AE. De Mentha
piperita L. obtenido no cae dentro de su respectiva curva de calibración (Tabla
4.9), por lo que se preparó una solución mas tomando una alícuota de la solución

102
 madre anterior pesando 0.6502 g (0.4940ml) y se realizó una nueva lectura
obteniendo los siguientes resultados expresados en la tabla 4.15:

Tabla 4.15: Tiempos de Retención y Áreas de la muestra del AE.B de Mentha

piperita L.

Tr Compuesto Área1 Área 2 Área 3 Promedio

10.479 Mentona 250815 254693 254187 253231.667
11.123 Mentol 553566 556928 550514 553669.33
15.811 Acetato de 630695 637132 639576 635801
Mentilo

 Muestra de AE.C
Se preparó una solución madre pesando 0.0117 g (0.0154 ml) de la muestra C del aceite
esencial de Mentha piperita L. obtenido y se enrasó en una fiola de 25 ml con
diclorometano grado GC.
De esta solución madre se pesó una alícuota de 0.3962g (0.3011ml) y se realizó la
corrida cromatográfica por triplicado en el GC-MS obteniendo los siguientes resultados
expresados en la tabla 4.16:
Tabla 4.16: Tiempos de Retención y Áreas de la muestra del AE.C de Mentha piperita
L.

Tr Compuesto Área 1 Área 2 Área 3 Promedio

10.479 Mentona 127270 129443 128895 128536
11.123 Mentol 281788 285641 284379 283936
15.811 Acetato de 381183 381974 382557 381904.667
mentilo

Como se observa el área promedio del Mentol en la muestra C del AE. De

Mentha piperita l. obtenido no cae dentro de su respectiva curva de calibración,
por lo que se preparó una solución más tomando una alícuota de la solución
madre anterior pesando 0.6573 g (0.4994ml) y se realizó una nueva lectura
obteniendo los siguientes resultados:

103
 Tabla 4.17: Tiempos de Retención y Áreas de la muestra del AE.C De
Mentha piperita L.

Tr Compuesto Área 1 Área 2 Área 3 Promedio

10.479 Mentona 261600 264568 261887 262685
11.123 Mentol 663089 664953 661542 663194.667
15.811 Acetato de 837469 839578 838124 838390.333
mentilo

E) Cuantificación:

Construidas las Curvas de Calibración de mentol, mentona y acetato de mentilo,

obteniendo sus respectivas ecuaciones de regresión lineal (y ), así como el
área promedio de las tres muestras de aceite esencial de Mentha piperita obtenido(A, B
y C), se procede según procedimiento 3.3.6, calculando el contenido de l-mentol, l-
mentona y l-acetato de mentilo expresado en g/ml de aceite esencial, tomando en cuenta
las diluciones realizadas para el análisis y las densidades obtenidas de cada muestra de
aceite esencial de Mentha piperita L.

i. Cuantificación de l-Mentol
 Muestra AE.A de Mentha piperita L.

467138 509503
628480 467138 509503
628480 509503
467138

2.4360

Conociendo la densidad del AE.A que es 1.8991 g/ml, se calcula la cantidad de l-mentol
en % w/w

104
 2.4360 ppm 98341.24562
. .

98341.24562 0.098341245

1ml AE.A.→ 0.8991 → 100%

1ml AE.A. → 0.098341245 →

10.93% de l-Mentol

 Muestra AE.Bde Mentha piperita L.

467138 509503
553669.33 467138 509503
553639.33 509503
467138

2.2759

Conociendo la densidad del AE.B que es 1.8994 g/ml, se calcula la cantidad de l-mentol
en % w/w

2.2759 ppm 91411.22036

. .

1 1
91411.22036 0.091411.22036
1000 1000

1 ml AE.B→ 0.8994 → 100 %

1 ml AE.B → 0.0914112236 →

10.16 % de l-Mentol

105
  Muestra AE.C de Mentha piperita L.
467138 509503
663194.667 467138 509503
663194.667 509503
467138

2.5103

Conociendo la densidad del AE.C que es 1.8987 g/ml, se calcula la cantidad de l-mentol
en % w/w

2.5103 81601.1681 ppm

. .

1 1
81601.1681 0.081601.1681
1000 1000

1 . → 0.8987 → 100 %
1 . → 0.081601168 →

9.07 % de l-Mentol

ii. Quantification de l-Mentona

 Muestra AE.A de Mentha piperita L.

608000 15028
225704 60800 15028
225704 15028
60800

3.4650

Conociendo la densidad del AE.A que es 1.8991 g/ml, se calcula la cantidad de l-

mentona en % w/w

106
 25 10
3.4650 203643.3649
0.0126 0.3376

203643.3649 = 0.2036433649

1 ml AE.A → 0.8991 → 100 %

1 ml AE.A → 0.203643364 →

22.64 % de l-Mentona

 Muestra AE.B de Mentha piperita L.

60800 15028
145040.667 60800 15028
145040.667 15028
60800

2.1383

Conociendo la densidad del AE.B que es 1.8994 g/ml, se calcula la cantidad de l-mentona
en % w/w

25 10
2.1383 143672.832
0.0126 0.2953
1 1
143672.832 0.143672832
1000 1000

1 ml AE. B → 0.8994 → 100 %

1 ml AE. B → 0.143672832 →

15.97 % de l-Mentona

107
  Muestra AE.C de Mentha piperita L.

60800 15028
128536 60800 15028
128536 15028
60800

1.8669

Conociendo la densidad del AE.C que es 1.8987 g/ml, se calcula la cantidad de l-mentona
en % w/w

25 10
1.8669 100653.6638
0.0154 0.3011

1 1
100653.6638 0.1006536638
1000 1000

1 ml AE.C → 0.8987 → 100 %

1ml AE.C → 0.1006536638 →

11.19% de l-Mentona

iii. Cuantificación de l-Acetato de Mentilo

 Muestra AE.A de Mentha piperita L.

42067 31063
307815 42067 31063
307815 31063
42067

6.5788

108
 Conociendo la densidad del AE.A que es 1.8991 g/ml, se calcula la cantidad de l-acetato
de mentilo en % w/w

25 10
6.5788 386646.1672
0.0126 0.3376

1 1
386646.1672 0.3866461672
1000 1000

1 ml AE.A → 0.8991 → 100 %

1 ml AE.A → 0.3866461672 →

43.00 % de l-Acetato de Mentilo

 Muestra AE.Bde Mentha piperita L.

42067 31063
383974.33 42067 31063
383974.33 31063
42067

8.3892

Conociendo la densidad del AE.B que es 1.8994 g/ml, se calcula la cantidad de acetato de
mentilo en % w/w
25 10
8.3892 563672.1333
0.0126 0.2953

1 1
563672.1333 0.563672133
1000 1000

1ml AE.B→ 0.8994 → 100 %

1ml AE.B→ 0.563672133 →

62.67 % de l-Acetato de Mentilo

109
 Muestra AE.C

42067 31063
381904.667 42067 31063
381904.667 31063
42067

8.3400

Conociendo la densidad del AE.C que es 1.8987 g/ml, se calcula la cantidad de l-acetato
de mentilo en % w/w

25 10
8.3400 449649.9847
0.0154 0.3011

1 1
449649.9847 0.4496499847
1000 1000

1ml AE.C → 0.8987 → 100 %

1ml AE.C → 0.4496499847 →

50.03 % de l-Acetato de Mentilo

110
Las tres muestras de AE. De Mentha piperita L. obtenido, correspondientes a: Muestra
A , Muestra B y Muestra C, fueron obtenidas desecadas del mismo distribuidor, del
mismo lugar de origen, pero de distintos lotes, por cuestiones logísticas de tiempo de
siembra, cosecha y terreno de cultivo , que aun tratándose de un mismo fenotipo,
presenta diferencias en su composición (quimiotipo).

Sin embargo las tres muestras tienen la particularidad de contener elevadas

concentraciones de Acetato de Mentilo: Muestra A: 43.00%, Muestra B: 62.67 % y
Muestra C: 50.03 %, seguido de las concentraciones de Mentona: Muestra A: 22.65%,
muestra B: 15.97 % y Muestra C: 11.19 %, y por último las concentraciones de Mentol:
Muestra A: 10.94%, muestra B: 10.16% y Muestra C: 9.07%. Concentraciones muy
bajas de Mentol que no corresponden a los valores exigidos por las normas y
organismos reguladores de la calidad del aceite esencial de Mentha piperita L., como la
Farmacopea Británica (Mentol: 30-55%), Norma Técnica Peruana (mentol: 30-55%),
etc. Considerando al Mentol como primer valor referente de calidad en el AE. de
Mentha piperita L., por su importancia económica ya que se utiliza en productos de
higiene oral, productos farmacéuticos, cosméticos y alimenticios, y también por su alto
potencial farmacológico (anti fúngico, antibacteriano, etc.).

Teniendo en cuenta estos valores obtenidos, se puede referir que el valor agregado en la
cadena productiva de aceites esenciales esta en el refinamiento de los aceites,
concentrando el contenido de un componente en particular del producto, que en este
caso podría ser el Acetato de Mentilo, que si bien no tiene gran importancia económica,
también es requerido por distintas industrias como la perfumería, destacando notas
florales, especialmente de rosas, aguas de tocador, que tiene olor a lavanda,etc. Por lo
que se puede afirmar también que la exigencia de control de calidad, difiere según el
uso final que se le dará a la planta o al aceite esencial que de ella se obtenga.

Sin embargo, los resultados pueden haber sido discrepantes, debido a diferentes factores
y condiciones a las que las plantas fueron sometidas directa o indirectamente, que
interfieren con su composición, como se explicara continuación:

1- Durante la síntesis de aceite esencial de M. piperita L., la recta de isoprenoides

conduce a la formación de geranil pirofosfato, desde el que se origina el
limoneno, junto a la piperitona, que a su vez forma la pulegona que puede
formar mentona y/o mentofurano. La mentona forma el neomentol y el mentol,

111
 que pueden someterse a esterificación y por lo tanto se convierte en acetato de
mentilo. Por lo que se entiende que las condiciones a las que estuvieron
expuestas las plantas favorecieron la producción de acetato de mentilo.39
2- La fertilización con niveles de crecientes de N, P y K en Mentha piperita L.
aumenta el contenido de acetato de mentilo.5,40
3- La composición del AE., depende de las condiciones edafológicas y la etapa
ontogénica de la planta, por lo que determinar con precisión la fecha de cultivo y
cosecha es importante, así como el fotoperiodo. Esta afirmación puede justificar
las variaciones en la composición bajo condiciones de cultivo diferente,
incluyendo niveles altos de acetato de mentilo.5,40,41
4- La floración de las plantas de Mentha piperita L. bajo condiciones de día corto
disminuye el contenido de mentol que es de fotoperiodo largo, incrementando
los niveles de acetato de mentilo por enzima del 10%.5,40,41
5- Plantas maduras, aumenta el porcentaje de ésteres, mientras que el contenido de
mentol está relacionado con el contenido de los ésteres.5,40,41
6- La reducción de mentol y la posterior síntesis y acumulación de acetato de
mentilo parecen ser procesos enzimáticos asociados con la maduración y el
comienzo del crecimiento reproductivo en la menta. Esta relación metabólica
posible está actualmente disponible y casi no se sabe nada acerca de las enzimas
y los mecanismos implicados en la reducción o bien esterificación del mentol,
etc.40

Es así, que hoy en día existe un gran interés y estudios acerca de los efectos de tiempo
de cosecha, medios de cultivo, fertilización, e incluso partes y posiciones de la planta
que contribuyen a la composición y rendimiento del AE. De Mentha piperita L.42, 43

Por lo que se puede concluir que estos factores se pueden modificar, mejorar, etc.,
estratégicamente para las necesidades que el mercado requiera.

112
 CONCLUSIONES

I. Se obtuvo tres muestras de Aceite Esencial de Mentha piperita L. por

método de Hidrodestilaciòn con Trampa Clevenger, obteniendo los
siguientes porcentajes de rendimiento de aceite esencial: Muestra A:
1.18%, Muestra B: 0.61% y Muestra C: 0.88%.

II. Se determinó las principales características fisicoquímicas de las tres

muestras (A, B y C) de Aceite Esencial de Mentha piperitaL.,
obteniendo los siguientes resultados: Características Organolépticas
(olor característico, sabor picante y color verde traslucido), Poder
Rotatorio ( A:-30°, B: -27.5° y C:-27.5°) , Densidad ( A: 0.8991g⁄ml,
B:0.8994g⁄ml y C:0.8987g⁄ml), Índice de Refracción (A: 1.4643, B:
1.4573 y C:1.4622) e Índice de Acidez ( A. 1.6715 mg KOH/g de
aceite, B: 1.6881 mg KOH/g de aceite, y C: 1.5759 mg KOH/g de
aceite, ).

III. Se sintetizó y purificó los estándares l-Mentona y l-Acetato de

mentilo a partir del estándar de l-Mentol

IV. Se evaluó el Contenido de l-Mentol,l-Mentona y l-Acetato de mentilo

de las tres muestras de aceite esencial de Mentha piperita L, de
acuerdo a los resultados obtenidos en la cuantificación por método de
patrón externo mediante GC-MS: Muestra A (Mentol 10.93%,
Mentona 22.64% y Acetato de Mentilo 43.00%), Muestra B (Mentol
10.16%, Mentona 15.97% y Acetato de Mentilo 62.67%) y Muestra
C (Mentol 9.07%, Mentona 11.19% y Acetato de Mentilo 50.03%)

113
 BIBLIOGRAFIA

1. Ortuño M, Manual Practico de Aceites Esenciales, Aromas y Perfumes,

Ediciones Aiyana, 2006.
2. Kuklinski C., Farmacognosia, Ediciones Omega S.A., Barcelona, 2000.
3. Uso Industrial de Plantas Aromáticas y Medicinales
http://ocw.upm.es/ingieneria-agroforestal.
4. Robert H., Chromatographic Measurement of Variations in Essential Oils
withim a Single Plant, Vol. 5, USA, 1997.
5. Muñoz F., Plantas Medicinales y Aromáticas, Estudio Cultivo y Procesado,
Ediciones Mundi, España, 1996.
6. Lock O., Investigación Fitoquimica, Métodos de Estudio de Productos
Naturales, Fondo Editorial PUCP, 1988.
7. Diaz O., Estudio Comparativo de la Composición Química de la Actividad
Antioxidante de Aceite Esencial de Aloysia thriphylla, Colombia, 2007.
8. Keese R., Muller K., métodos de Laboratorio parar Química Orgánica, Editorial
Linusa S.A., México, 1990.
9. Fessenden R., Fessenden J., Technique and Experiments for organic Chemistry,
University of Montana, 1996.
10. Gunther E., The Essential Oils, D. Van Nostrand Company, Tnc, USA, 1948.
11. Cerpa M., Hidrodestilaciòn de Aceites esenciales, Departamento de Ingeniería
Química y Tecnología del Medio Ambiente, Valladolid, 2007.
12. Atofani D., Zamfirache M., Anca A., Improved Techniques for Obtaining
Volatiles Oils Concerning Their Quantitative Analysis from Lamiaceae Taxons,
Romania, 2010.
13. Brithish Herbal Pharmacopoeia, published by the British Herbal Medicine
Association, vol. 1, 1990.
14. Manual para la Producción de Plantas Aromáticas y Medicinales, MINDES,
2007.
15. Delparte C, Productos Naturales, Farmacognosia, universidad de Chile, 2010.
16. Asian journal of Pharmaceutical and Clinical Research, Vol. 2, Issue 2, April-
June, 2009.

114
17. Longwood Herbal Task Force
http://www.mep.edu/herbal.
18. The Merck Index, USA, 2001.
19. USP 35, Farmacopea de los Estados Unidos de América, Mayo, 2012.
20. Control de Calidad de Aceites esenciales.
http://www.slidesbase.mt/profegilde/analisis_y_control_de_aceites_esenciales.
21. Olguin L. rodriguez M., Cromatografía de Gases, Universidad Nacional
Autónoma de México, Instituto de Biotecnología, México, 2004.
22. Jork H., Kunk W., Fischer W., Thyn layer Chromatography Reagents and
Detection Methods, Alemania, 1990.
23. Cromatografía en Capa Fina.
http://es.scribd.com/doc/14172689/5-Cromatografia-en-Capa-Fina
24. Nigan M., essential Oils and their Constituents XXV Thyn Layer
Chromatography Some Chemical and Chemotaxonomic Applications. New
York, 1964.
25. Rubinson K., Rubinson J., Análisis Instrumental, Pearson Educación S.A.,
Madrid, 2001.
26. Harold M., MCnair J., Muller M., Basic Gas Chromatography, Wiley
Publication, Canada, 2009.
27. Neesin W., practice of Gas Chromatography-Mass Spectrometry, USA, 2001.
28. Kitson F., MCEwar Ch., Gas Chromatography and Mass Spectrometry,
Academic Press, USA, 1996.
29. Stuart B., practical Laboratory skills Training Guides Gas Chromatography,
Published for the LGC, UK, 2003.
30. Cromatografía de Gases.
www.mncn.csic.es/../cromatografia/.pdf
31. Seminario sobre Cromatografía
www.4.ujaen.es/mferma/master%200pdf.
32. ELSERVIER Journal of Chromatography, gas Chromatography Technologies
for the analysis of essential Oils, 2001.
33. Magni P., Facchetti R., Cadoppi A., Analysis of Essential Oils by Ultra Fast
GC., Ubiversity of Turin, Italy, 2005.
34. Instituto Nacional de Defensa de la Competencia y de la Protección de la
Propiedad Intelectual (INDECOPI), Norma Técnica Peruana, Perú, 1974.

115
35. Phillips C., Organic Syntheses Coll. Vol. 1, 1941.
36. British Pharmacopoeia, Monograph 0405, Copyright, 2011.
37. SDBS, Spectral Database for Organic compounds, National Institute of
advanced industrial Science and technology (AIST), Japan .
http://sdbs.riodb.aist.go.jp/sdbs/cgi-bin/direct_frame_top.cgi
38. NIST, National Institute of Standards and technology, USA.
http://webbook.nist.gov/chemistry/
39. Murrey M., Genetic Observations on Mentha Oil Biogenesis, USA, 1972.
40. Research Articule, Yield and Composition of essential Oil of Mentha Piperita L.,
Universidad Estadual Paulista, Instituto Biociencias, Brasil, 2005.
41. Journal of Agricultural and food Chemestry, Effect of Harvest Time and Drying
method On Biomass production, essential Oil Yield and Quality of Peppermint
(Mentha piperita L.), 2005.
42. Journal of Agricultural and food Chemistry, Monoterpene composition of
Essential Oil from peppermint (Mentha piperita L.) with Regard to Leaf
Positions, 1999.
43. Aromatic Plants of Morocco, GC/MS Analysis of the Essential oils of Leaves of
Mentha piperita L., American-Eurasian Network for Scientific information
Advances in Environmental Biology, 2010.

116
ANEXOS

117
118
119
120
121
122
123
124
125
126
127
128
129
130
131
132