Une-En Iso 22718 2010

norma UNE-EN
N ISO 22718
españolla
Enero 2010
TÍTULO Cosm
méticos
Microobiología
Detección de Staphylococcus aureus
(ISO 22718:2006)
2
Cosmeticss. Microbiology. Detection of Staphylococcus aureus (ISO 22718:2006).
Cosmétiquues. Microbiologie. Détection de Staphylococcus aureus (ISO 22718:22006).
CORRESPONDENCIA Esta norrma es la versión oficial, en español, de la Norma Europpea EN ISO 22718:2009,
que a suu vez adopta la Norma Internacional ISO 22718:2006.
OBSERVACIONES
ANTECEDENTES Esta norrma ha sido elaborada por el comité técnico AEN/CTN

N 84 Aceites esenciales y
producttos cosméticos cuya Secretaría desempeña STANPA.
Editada e impresa por AENOR LAS OBSE

ERVACIONES A ESTE DOCUMENTO HAN DE DIRIGIRSE A:
Depósito legal: M 2355:2010
21 Páginas
© AENOR 2010 Génova, 6 info@aenor.es Tel.: 902 102 201 Grupo 15

Reproducción prohibida 28004 MADRID-Españña www.aenor.es Fax: 913 104 032
AENOR AUTORIZA EL USO DE ESTE DOCUMENTO A LABORATORIOS GOMEZ BESER

S

NORMA EUROPEA
EUROPEAN STANDARD EN ISO 22718
NORME EUROPÉENNE
EUROPÄISCHE NORM Junio 2009
ICS 07.100.99; 71.100.70
Versión en español
Cosméticos
Microbiología
Detección de Staphylococcus aureus
(ISO 22718:2006)
Cosmetics. Microbiology. Detection of Cosmétiques. Microbiologie. Détection de Kosmetik. Mikrobiologie. Nachweis

Staphylococcus aureus. (ISO 22718:2006) Staphylococcus aureus. (ISO 22718:2006) von Staphylococcus.
(ISO 22718:2006)
Esta norma europea ha sido aprobada por CEN el 2009-05-30.
Los miembros de CEN están sometidos al Reglamento Interior de CEN/CENELEC que define las condiciones dentro de
las cuales debe adoptarse, sin modificación, la norma europea como norma nacional. Las correspondientes listas
actualizadas y las referencias bibliográficas relativas a estas normas nacionales pueden obtenerse en el Centro de
Gestión de CEN, o a través de sus miembros.
Esta norma europea existe en tres versiones oficiales (alemán, francés e inglés). Una versión en otra lengua realizada
bajo la responsabilidad de un miembro de CEN en su idioma nacional, y notificada al Centro de Gestión, tiene el mismo
rango que aquéllas.
Los miembros de CEN son los organismos nacionales de normalización de los países siguientes: Alemania, Austria,
Bélgica, Bulgaria, Chipre, Dinamarca, Eslovaquia, Eslovenia, España, Estonia, Finlandia, Francia, Grecia, Hungría,
Irlanda, Islandia, Italia, Letonia, Lituania, Luxemburgo, Malta, Noruega, Países Bajos, Polonia, Portugal, Reino Unido,
República Checa, Rumanía, Suecia y Suiza.
CEN
COMITÉ EUROPEO DE NORMALIZACIÓN
European Committee for Standardization
Comité Européen de Normalisation
Europäisches Komitee für Normung
CENTRO DE GESTIÓN: Avenue Marnix, 17-1000 Bruxelles
© 2009 CEN. Derechos de reproducción reservados a los Miembros de CEN.

EN ISO 22718:2009 -4-
PRÓLOGO
El texto de la Norma ISO 22718:2006 del Comité Técnico ISO/TC 217 Cosméticos, de la Organización
Internacional de Normalización (ISO), ha sido adoptado como Norma EN ISO 22718:2009.
Esta norma europea debe recibir el rango de norma nacional mediante la publicación de un texto idéntico
a ella o mediante ratificación antes de finales de diciembre de 2009, y todas las normas nacionales
técnicamente divergentes deben anularse antes de finales de diciembre de 2009.
Se llama la atención sobre la posibilidad de que algunos de los elementos de este documento estén sujetos a
derechos de patente. CEN y/o CENELEC no es(son) responsable(s) de la identificación de dichos derechos
de patente.
De acuerdo con el Reglamento Interior de CEN/CENELEC, están obligados a adoptar esta norma europea
los organismos de normalización de los siguientes países: Alemania, Austria, Bélgica, Bulgaria, Chipre,
Dinamarca, Eslovaquia, Eslovenia, España, Estonia, Finlandia, Francia, Grecia, Hungría, Irlanda, Islandia,
Italia, Letonia, Lituania, Luxemburgo, Malta, Noruega, Países Bajos, Polonia, Portugal, Reino Unido,
República Checa, Rumanía, Suecia y Suiza.
DECLARACIÓN
El texto de la Norma ISO 22718:2006 ha sido aprobado por CEN como Norma EN ISO 22718:2009 sin
ninguna modificación.

-5- ISO 22718:2006
ÍNDICE
Página
PROLOGO .............................................................................................................................................. 6
INTRODUCCIÓN ................................................................................................................................... 7
1 OBJETO Y CAMPO DE APLICACIÓN .................................................................................. 7
2 NORMAS PARA CONSULTA ................................................................................................... 7
3 TÉRMINOS Y DEFINICIONES ................................................................................................ 8
4 PRINCIPIO .................................................................................................................................. 8
5 DILUYENTES Y MEDIOS DE CULTIVO............................................................................... 8

5.1 Generalidades ............................................................................................................................... 8
5.2 Diluyente para la suspensión bacteriana (solución de triptona y cloruro sódico) .................. 9
5.3 Medios de cultivo.......................................................................................................................... 9
6 APARATOS Y MATERIAL DE VIDRIO............................................................................... 12
7 CEPAS DE MICROORGANISMOS ....................................................................................... 12
8 MANIPULACIÓN DE LOS PRODUCTOS COSMÉTICOS Y LAS MUESTRAS

DE LABORATORIO ................................................................................................................. 12
9 PROCEDIMIENTO .................................................................................................................. 13
9.1 Recomendaciones generales ...................................................................................................... 13
9.2 Preparación de la suspensión inicial en el caldo de enriquecimiento .................................... 13
9.3 Incubación de la suspensión inicial en el caldo de enriquecimiento ..................................... 13
9.4 Detección e identificación de Staphylococcus aureus ............................................................... 14
10 EXPRESIÓN DE LOS RESULTADOS (DETECCIÓN DE

STAPHYLOCOCCUS AUREUS) ............................................................................................... 14
11 Neutralización de las propiedades antimicrobianas del producto ......................................... 15
11.1 Generalidades ............................................................................................................................. 15
11.2 Preparación del inóculo ............................................................................................................. 15
11.3 Validación del método de detección.......................................................................................... 15
12 INFORME DE ENSAYO .......................................................................................................... 16
ANEXO A (Informativo) OTROS MEDIOS .................................................................................. 17
ANEXO B (Informativo) NEUTRALIZANTES DE LA ACTIVIDAD

ANTIMICROBIANA DE LOS CONSERVANTES
Y LIQUIDOS DE LAVADO ................................................................ 20
BIBLIOGRAFÍA ................................................................................................................................... 21

ISO 22718:2006 -6-
PRÓLOGO
ISO (Organización Internacional de Normalización) es una federación mundial de organismos nacionales

de normalización (organismos miembros de ISO). El trabajo de preparación de las normas internacionales
normalmente se realiza a través de los comités técnicos de ISO. Cada organismo miembro interesado en
una materia para la cual se haya establecido un comité técnico, tiene el derecho de estar representado en
dicho comité. Las organizaciones internacionales, públicas y privadas, en coordinación con ISO, también
participan en el trabajo. ISO colabora estrechamente con la Comisión Electrotécnica Internacional (IEC)
en todas las materias de normalización electrotécnica.
Las normas internacionales se redactan de acuerdo con las reglas establecidas en la Parte 2 de las Directivas
ISO/IEC.
La tarea principal de los comités técnicos es preparar normas internacionales. Los proyectos de normas
internacionales adoptados por los comités técnicos se envían a los organismos miembros para votación.
La publicación como norma internacional requiere la aprobación por al menos el 75% de los organismos
miembros que emiten voto.
Se llama la atención sobre la posibilidad de que algunos de los elementos de este documento puedan estar
sujetos a derechos de patente. ISO no asume la responsabilidad por la identificación de cualquiera o todos
los derechos de patente.
La Norma ISO 22718 fue preparada por el Comité Técnico ISO/TC 217, Cosméticos.

-7- ISO 22718:2006
INTRODUCCIÓN
Los exámenes microbiológicos de los productos cosméticos se deben realizar conforme a un análisis adecuado de los
riesgos microbiológicos, para asegurar su calidad y la seguridad de los consumidores.
El análisis de riesgos microbiológicos depende de varios parámetros, como:
− alteración potencial de los productos cosméticos;
− la patogenicidad de los microorganismos;
− el lugar de aplicación del producto cosmético (pelo, piel, ojos, membranas mucosas, etc.);
− el tipo de usuario (adulto, niños menores de tres años).
Para los cosméticos, y otros productos tópicos, la detección de patógenos de la piel como Staphylococcus aureus, Pseudo-
monas aeruginosa y Candida albicans puede ser relevante. La detección de otro tipo de microorganismos (incluyendo
indicadores de contaminación fecal, por ejemplo Escherichia coli) podría ser de interés dado que estos microorganis-
mos indican falta de higiene durante el proceso de fabricación.
1 OBJETO Y CAMPO DE APLICACIÓN

Esta norma internacional proporciona unas directrices generales para la detección e identificación del microorganismo
específico Staphylococcus aureus en los productos cosméticos. Los microorganismos considerados como específicos en
esta norma internacional podrían variar de país a país, de acuerdo con las prácticas o reglamentos nacionales.
Para asegurar la calidad del producto y la seguridad de los consumidores, se recomienda realizar un análisis de riesgos
microbiológicos adecuado para determinar los tipos de productos cosméticos para los que es aplicable esta norma
internacional. Los productos que se considera que presentan un bajo riesgo microbiológico incluyen los que presentan
una baja actividad de agua, los productos hidroalcohólicos, los que tienen valores extremos de pH, etc.
El método descrito en esta norma internacional se basa en la detección de Staphylococcus aureus en un medio líquido no
selectivo (caldo de enriquecimiento), seguido de un aislamiento en un medio selectivo de agar. Otros métodos pueden ser
apropiados en función del nivel de detección requerido.
NOTA Para la detección de Staphylococcus aureus, se pueden realizar subcultivos en medios de cultivo no selectivos, seguidos de las etapas de identifica-
ción adecuadas (por ejemplo, usando kits de identificación).
Debido a la gran variedad de productos cosméticos dentro de este campo de aplicación, este método puede no ser apropiado,
en algunos aspectos, para todos los productos (por ejemplo, ciertos productos inmiscibles en agua). Otras normas
internacionales pueden ser apropiadas (ISO 18415[10]). Otros métodos (por ejemplo, los automatizados) pueden sustituir a los
ensayos que se describen en esta norma, siempre que se haya demostrado su equivalencia o que el método se haya validado
de otra manera.
2 NORMAS PARA CONSULTA

Las normas que a continuación se indican son indispensables para la aplicación de esta norma. Para las referencias con
fecha, sólo se aplica la edición citada. Para las referencias sin fecha se aplica la última edición de la norma (incluyendo
cualquier modificación de ésta).
ISO 21148:2005 Cosméticos. Microbiología. Instrucciones generales para el examen microbiológico.
EN 12353 Antisépticos y desinfectantes químicos. Conservación de los organismos de ensayo utilizados para la deter-
minación de la actividad bactericida, esporicida y fungicida.

ISO 22718:2006 -8-
3 TÉRMINOS Y DEFINICIONES
Para los fines de este documento, se aplican los términos y definiciones siguientes:
3.1 producto:
Porción de un producto cosmético identificado, recibido en el laboratorio para su ensayo.
3.2 muestra:
Porción del producto (de al menos 1 g o 1 ml) que se emplea en el ensayo para preparar la suspensión inicial.
3.3 suspensión inicial:

Suspensión (o disolución) de una muestra en un volumen definido del caldo de enriquecimiento apropiado.
3.4 muestra(s) diluida(s):

Disolución(es) de la suspensión inicial.
3.5 microorganismo específico:

Bacteria aerobia mesófila o levadura que no es deseable en un producto cosmético y que se ha identificado como una
especie patógena para la piel que puede ser perjudicial para la salud humana o indicativa de falta de higiene en el proceso
de fabricación.
3.6 Staphylococcus aureus:

Coco Gram positivo, principalmente agrupado en acúmulos con forma de racimo de uva, originando colonias lisas gene-
ralmente pigmentadas en amarillo.
NOTA 1 Las principales características para la identificación son: crecimiento en un medio selectivo específico, catalasa positiva y coagulasa positiva.
NOTA 2 Staphylococcus aureus es una bacteria patógena oportunista para los humanos que se puede encontrar además en la piel de personas sanas sin
causarles ningún perjuicio. No es deseable en los productos cosméticos debido a su potencial patogenicidad.
3.7 caldo de enriquecimiento:

Medio líquido no selectivo que contiene los neutralizantes y/o agentes dispersantes adecuados y que se ha validado para
el producto sometido a ensayo.
4 PRINCIPIO
El primer paso del procedimiento es realizar un enriquecimiento mediante un caldo de cultivo no selectivo para incre-
mentar el número de microorganismos sin riesgo de inhibición por los ingredientes selectivos que se encuentran presentes
en los medios de cultivo selectivos/diferenciales.
El segundo paso del ensayo (aislamiento) se realiza en un medio selectivo, y a continuación se llevan a cabo los ensayos
de identificación.
Se debe neutralizar la posible inhibición del crecimiento microbiano en la muestra, para permitir la detección de los
microorganismos viables [1]. En todos los casos, y sin importar la metodología, se debe comprobar y validar la neutra-
lización de las propiedades antimicrobianas del producto [2], [3], [4].
5 DILUYENTES Y MEDIOS DE CULTIVO
5.1 Generalidades
En la Norma ISO 21148 se proporcionan las instrucciones generales. Cuando en este documento se menciona el agua,
se refiere a agua destilada o agua purificada conforme a la Norma ISO 21148.

-9- ISO 22718:2006
El caldo de enriquecimiento se usa para dispersar la muestra y para incrementar la población microbiana inicial. Puede
contener neutralizantes si la muestra a ensayar tiene propiedades antimicrobianas. Se debe demostrar la eficacia de la
neutralización (véase el capítulo 11). El anexo B proporciona información relativa a los neutralizantes adecuados.
El siguiente caldo de enriquecimiento es adecuado para comprobar la presencia de Staphylococcus aureus conforme a
esta norma internacional a condición de que se valide conforme al capítulo 11.
Pueden emplearse otros diluyentes y medios de cultivo, si se puede demostrar que son adecuados para este uso.
5.2 Diluyente para la suspensión bacteriana (solución de triptona y cloruro sódico)
5.2.1 Generalidades
El diluyente se emplea para la preparación de la suspensión bacteriana utilizada en el procedimiento de validación
(véase el capítulo 11).
5.2.2 Composición
− triptona, digerido pancreático de caseína 1,0 g
− cloruro sódico 8,5 g
− agua 1 000 ml
5.2.3 Preparación
Se disuelven los componentes en el agua, mezclándolos mientras se calientan. Se dispensa en recipientes adecuados. Se
esteriliza en autoclave a 121 ºC durante 15 min.
Después de la esterilización y enfriamiento, el pH debe ser equivalente a 7,0 ± 0,2 cuando se mide a temperatura ambiente.
5.3 Medios de cultivo
5.3.1 Generalidades
Los medios de cultivo se pueden preparar siguiendo las indicaciones que se proporcionan a continuación, o a partir de
un medio de cultivo deshidratado, conforme a las instrucciones del fabricante. Se recomienda seguir las instrucciones
proporcionadas por el proveedor de los medios.
NOTA Los medios preparados (listos para su uso) se pueden utilizar cuando su composición y/o su rendimiento en crecimiento sean comparables a los
de las fórmulas que se indican en esta norma.
5.3.2 Medio de agar para la validación (véase el capítulo 11) [agar de caseína y soja digeridas (SCDA) o agar de
triptona y soja (TSA)]
5.3.2.1 Composición
− digerido pancreático de caseína 15,0 g
− digerido papaínico de soja 5,0 g
− agar 15,0 g
− agua 1 000 ml

ISO 22718:2006 - 10 -
5.3.2.2 Preparación
Se disuelven los componentes o el medio deshidratado completo en agua, mezclándolos mientras se calientan. Se dispensa
el medio en recipientes adecuados. Se esteriliza en autoclave a 121 ºC durante 15 min.
5.3.3 Caldo de enriquecimiento
5.3.3.1 Caldo Eugon LT 100
5.3.3.1.1 Generalidades
Este medio contiene ingredientes que neutralizan las sustancias inhibidoras presentes en la muestra: lecitina y polisorbato 80,
y un agente dispersante: octoxynol 9.
5.3.3.1.2 Composición
− L-cistina 0,7 g
− sulfito sódico 0,2 g
− glucosa 5,5 g
− lecitina de huevo 1,0 g
− polisorbato 80 5,0 g
− octoxynol 9 1,0 g
− agua 1 000 ml
5.3.3.1.3 Preparación
Se disuelven los componentes -polisorbato 80, octoxynol 9 y lecitina de huevo- uno tras otro, en agua hirviendo, hasta
su completa disolución. Se disuelve el resto de componentes mezclándolo todo mientras se calienta. Se dispensa el medio
en recipientes adecuados. Se esteriliza en autoclave a 121 ºC durante 15 min.
5.3.3.2 Otros caldos de enriquecimiento

Se pueden emplear, si son apropiados, otros caldos de enriquecimiento (véase el anexo A).

- 11 - ISO 22718:2006
5.3.4 Medio selectivo de agar para el aislamiento de Staphylococcus aureus
5.3.4.1 Medio de agar Baird Parker
5.3.4.1.1 Medio base
5.3.4.1.1.1 Composición
− extracto de levadura 1,0 g
− extracto de carne 5,0 g
− piruvato sódico 10,0 g
− L-glicina 12,0 g
− cloruro de litio 5,0 g
− agar de 12 g a 22 g1)
− agua hasta un volumen final de 950 ml
5.3.4.1.1.2 Preparación
Se disuelven los componentes o la base completa deshidratada, en agua mediante ebullición. Se transfiere el medio en
cantidades de 100 ml a recipientes o botellas de capacidad adecuada. Se esteriliza el medio en autoclave a 121 ºC
durante 15 min.
5.3.4.1.2 Solución de telurito potásico
− Telurito potásico (K2TeO3) 1,0 g
− Agua 100 ml
El telurito potásico se disuelve por completo en agua, mediante un calentamiento mínimo.
Se esteriliza por filtración empleando membranas de tamaño de poro de 0,22 μm. La solución se puede almacenar como
máximo un mes a 3 ºC ± 2 ºC. La solución se descarta si se forma unprecipitado blanco.
El sólido debería solubilizarse rápidamente. Si se forma un material blanco insoluble en el agua, se debería descartar el
polvo.
5.3.4.1.3 Emulsión de yema de huevo (concentración aproximada del 20%, o conforme a las instrucciones del
fabricante)
Si no se dispone de un preparado comercial, se prepara el medio como sigue:
1) En función de la fuerza del gel de agar.

ISO 22718:2006 - 12 -
Se usan huevos frescos de gallina, con la cáscara intacta. Se limpian los huevos con un cepillo usando detergente líquido.
Se enjuagan con agua corriente y a continuación se desinfectan las cáscaras, bien sumergiéndolas en etanol al 70%
(fracción volumétrica) durante 30 s y dejándolos secar al aire, o bien pulverizándolas con alcohol seguido de una este-
rilización por llama. Procediendo en condiciones asépticas, se rompe cada huevo y se separa la yema de la clara, trans-
firiendo repetidas veces la yema de una mitad de la cáscara a la otra mitad. Se colocan las yemas en un recipiente estéril y
se añade cuatro veces su volumen de agua estéril. Se mezcla minuciosamente. Se calienta la mezcla a 47 ºC durante 2 h y
se deja durante 18 h a 24 h a 3 ºC ± 2 ºC, para que se forme un precipitado. Asépticamente se recoge el líquido sobre-
nadante, en un recipiente estéril nuevo, para su uso.
Se puede almacenar la emulsión a 3 ºC ± 2 ºC durante un máximo de 72 h.
5.3.4.1.4 Medio completo
− medio base (5.3.4.1.1) 100 ml
− solución de telurito potásico (5.3.4.1.2) 1,0 ml
− emulsión de yema de huevo (5.3.4.1.3) 5,0 ml
Se funde el medio base, (5.3.4.1.1) y se enfría hasta aproximadamente 47 ºC. Se añaden, en condiciones asépticas, las
otras dos soluciones (5.3.4.1.2 y 5.3.4.1.3) previamente calentadas a 47 ºC y se mezcla bien después de cada adición.
5.3.4.2 Otros medios selectivos de agar

Se pueden usar otros medios selectivos de agar (véase el anexo A).
6 APARATOS Y MATERIAL DE VIDRIO

Se debe emplear equipo de laboratorio, aparatos y material de vidrio conforme a lo descrito en la Norma ISO 21148.
7 CEPAS DE MICROORGANISMOS
Se usa la siguiente cepa representativa para la validación de las condiciones de ensayo:
Staphylococcus aureus ATCC2) 6538 (cepa equivalente: CIP3) 4.83 o NCIMB4) 9518).
El cultivo se debería reconstituir conforme a los procedimientos proporcionados por el suministrador de la cepa de
referencia.
La cepa se puede almacenar en el laboratorio conforme a la Norma EN 12353.
8 MANIPULACIÓN DE LOS PRODUCTOS COSMÉTICOS Y LAS MUESTRAS DE LABORATORIO

Si es necesario, los productos se almacenan a temperatura ambiente.
Los productos (3.1) y muestras (3.2) no se deben incubar, refrigerar o congelar antes o después de los análisis.
2) American Type Culture Collection.

3) Institut Pasteur Collection.
4) National Collection of Industrial and Marine Bacteria.

- 13 - ISO 22718:2006
El muestreo de los productos cosméticos a analizar se debería llevar a cabo conforme a lo descrito en la Norma ISO 21148.
Las muestras se analizan según se describe en la Norma ISO 21148, y conforme al siguiente procedimiento.
9 PROCEDIMIENTO
9.1 Recomendaciones generales

Para preparar la muestra, la suspensión inicial y las diluciones, se usa material y equipo estéril y técnicas asépticas. En el
caso de preparar la suspensión inicial en un agente solubilizante apropiado, el tiempo que pasa entre el final de la prepara-
ción y el momento en el que la alícuota entra en contacto con el caldo de enriquecimiento no debe exceder de 45 min, a no
ser que se mencione específicamente en los protocolos o documentación establecida.
9.2 Preparación de la suspensión inicial en el caldo de enriquecimiento
9.2.1 Generalidades
El enriquecimiento se prepara a partir de una muestra (3.2) de al menos 1 g o 1 ml, del producto a ensayar, bien homoge-
neizado, que se dispersa en, al menos, 9 ml de caldo de enriquecimiento.
Se anota como S el peso o volumen exacto de la muestra.
Se debe comprobar el método para asegurar que la composición (incluyendo los posibles neutralizantes añadidos) y el
volumen del caldo son adecuados para realizar el ensayo satisfactoriamente (véase 11.3).
NOTA En algunos casos, y cuando sea posible, la filtración del producto cosmético a través de una membrana que después se sumerge en el caldo de
enriquecimiento favorece la neutralización de las propiedades antimicrobianas del producto (véase 11.3).
9.2.2 Productos miscibles en agua

Se transfiere la muestra, S, del producto a un recipiente que contenga un volumen adecuado de caldo.
9.2.3 Productos no miscibles en agua

Se transfiere la muestra, S, del producto a un recipiente apropiado que contenga una cantidad adecuada de agente
solubilizante (por ejemplo, polisorbato 80).
Se dispersa la muestra en el agente solubilizante y se añade un volumen adecuado de caldo.
9.2.4 Productos filtrables

Se usa un filtro de membrana que tenga un tamaño de poro nominal no superior a 0,45 μm.
Se transfiere la muestra S sobre la membrana en un aparato de filtración (véase la Norma ISO 21148). Se filtra inmedia-
tamente y se lava la membrana con volúmenes definidos de agua y/o diluyente.
Se transfiere y se sumerge la membrana en un tubo o un recipiente del tamaño adecuado que contenga un volumen
apropiado de caldo.
9.3 Incubación de la suspensión inicial en el caldo de enriquecimiento

Se incuba la suspensión inicial preparada en el caldo (véase 9.2) a 32,5 ºC ± 2,5 ºC durante al menos 20 h (con un
máximo de 72 h).

ISO 22718:2006 - 14 -
9.4 Detección e identificación de Staphylococcus aureus
9.4.1 Aislamiento
Con un asa estéril, se toma una alícuota del caldo de enriquecimiento incubado y se pasa por la superficie del medio de
agar de Baird Parker para obtener colonias aisladas.
Se invierte la placa Petri y se incuba a 32,5 ºC ± 2,5 ºC durante al menos 24 h (con un máximo de 48 h).
Se comprueba las características de las colonias (véase la tabla 1).
Tabla 1 – Características morfológicas de Staphylococcus aureus en un medio selectivo
Medio selectivo Aspecto de las colonias de Staphylococcus aureus

Agar Baird Parker Colonias negras brillantes, rodeadas de zonas claras (de 2 mm a 5 mm)
9.4.2 Identificación de Staphylococcus aureus
9.4.2.1 Generalidades
Se procede con los siguientes ensayos en las colonias sospechosas, aisladas en el medio de agar Baird Parker. La presencia
de Staphylococcus aureus se puede confirmar con otros ensayos en medios de cultivo o bioquímicos adecuados.
9.4.2.2 Tinción de Gram

El ensayo se describe en la Norma ISO 21148.
Se comprueba la presencia de cocos Gram positivos agrupados en racimos.
9.4.2.3 Prueba de la catalasa

El ensayo se describe en la Norma ISO 21148.
Se comprueba el resultado positivo de catalasa en el ensayo.
9.4.2.4 Prueba de la coagulasa

Con un asa estéril, se transfieren colonias sospechosas representativas bien aisladas de la superficie del agar Baird-
Parker a tubos estériles individuales, en cada uno de los cuales hay 0,5 ml de plasma de mamífero, preferiblemente de
conejo o caballo, con o sin aditivos adecuados.
Se incuba a 37 ºC ± 2 ºC y se examinan los tubos a las 3 h, 4 h, 6 h, y si no hay coagulación durante las 6 h, se llega
hasta las 24 h, a no ser que el fabricante especifique lo contrario. Una coagulación positiva que aparezca a las 24 h, debe
ser confirmada.
Se ensayan los controles simultáneamente con las colonias sospechosas conforme a las recomendaciones del fabricante.
Se comprueba el resultado positivo de coagulasa en el ensayo.
10 EXPRESIÓN DE LOS RESULTADOS (DETECCIÓN DE STAPHYLOCOCCUS AUREUS)

Si la identificación de las colonias confirma la presencia de esta especie, se expresa el resultado como:
Presencia de Staphylococcus aureus en la muestra S.

- 15 - ISO 22718:2006
Si no se ha producido crecimiento después del enriquecimiento y/o si la identificación de las colonias no confirma la
presencia de esta especie, se expresa el resultado como:
Ausencia de Staphylococcus aureus en la muestra S.
11 NEUTRALIZACIÓN DE LAS PROPIEDADES ANTIMICROBIANAS DEL PRODUCTO
11.1 Generalidades
Los diferentes ensayos que se describen a continuación demuestran que el microorganismo puede crecer en las condiciones
del análisis.
11.2 Preparación del inóculo

Antes del ensayo, se inocula la superficie de agar de caseína y soja digerida (SCDA), o de otro medio adecuado (no
selectivo y no neutralizante) con Staphylococcus aureus (véase el capítulo 7). Se incuba la placa a 32,5 ºC ± 2,5 ºC de
18 h a 24 h.
Se recoge el cultivo con un asa estéril, pasándola por la superficie del cultivo y se vuelve a suspender en el diluyente para
obtener una suspensión estandarizada de aproximadamente 1 × 108 UFC por ml (por ejemplo, mediante un espectro-
fotómetro), véase la Norma ISO 21148:2005 (anexo C).
Esta suspensión estandarizada y sus diluciones se usan dentro de las siguientes 2 h.
11.3 Validación del método de detección
11.3.1 Procedimiento
11.3.1.1 Se prepara una dilución de la suspensión estandarizada en tubos con 9 ml de diluyente para obtener un recuento
final de entre 100 UFC por ml y 500 UFC por ml. Para el recuento de la concentración final de microorganismos viables en
la suspensión estandarizada diluida, se transfiere 1 ml de la suspensión a una placa Petri y se vierten de 15 ml a 20 ml del
medio de agar fundido mantenido en un baño de agua a no más de 48º C. Se deja solidificar y se incuba a 32,5 ºC ± 2,5 ºC
de 20 h a 24 h.
11.3.1.2 Se prepara por duplicado la suspensión inicial en las condiciones seleccionadas para el ensayo (al menos 1 g o
1 ml del producto a ensayar, volumen definido de caldo de enriquecimiento) en un tubo o recipiente. Cuando se emplee
el método de filtración a través de membrana se filtra, por duplicado, al menos 1 ml del producto a ensayar y se transfiere
cada membrana a un tubo o recipiente que contenga el caldo de enriquecimiento en las condiciones seleccionadas para
el ensayo.
11.3.1.3 Se introduce, asépticamente, 0,1 ml de la suspensión estandarizada diluida (11.3.1.1) de los microorganismos
en un tubo o recipiente (ensayo de validación). Se mezcla e incuban ambos tubos o recipientes (ensayo de validación y
control sin inocular) a 32,5 ºC ± 2,5 ºC de 20 h a 24 h.
11.3.1.4 Se realiza un aislamiento de cada tubo o recipiente (ensayo de validación y control sin inocular). Con un asa
estéril se pasa una alícuota (en las mismas condiciones que en el ensayo) de la mezcla incubada por la superficie de una
placa Petri (con un diámetro comprendido entre 85 mm y 100 mm) que contenga aproximadamente entre 15 ml y 20 ml
del medio de agar Baird Parker. Se incuban las placas a 32,5 ºC ± 2,5 ºC de 24 h a 48 h.
11.3.2 Interpretación de los resultados de la validación

Se comprueba que la suspensión de bacterias estandarizada diluida (11.3.1.1) contenga entre 100 UFC por ml y
500 UFC por ml.
La neutralización y el método de detección quedan validados si se produce una característica de crecimiento de

Staphylococcus aureus en la placa de validación y no hay ningún crecimiento en la placa de control.

ISO 22718:2006 - 16 -
Cuando se detecta el crecimiento en la placa de control (productos contaminados), la neutralización y el método de

detección quedan validados si se recupera Staphylococcus aureus de la placa de validación.
La falta de crecimiento en la placa de validación indica que todavía existe actividad antimicrobiana y es necesario
modificar las condiciones del método mediante un incremento en el volumen del caldo de enriquecimiento, manteniendo la
misma cantidad de producto, o con la incorporación de una cantidad suficiente de agente neutralizante en el caldo de
enriquecimiento, o mediante una combinación de estas modificaciones que permita el crecimiento de Staphylococcus
aureus.
Si a pesar de la incorporación de una cantidad adecuada de agente neutralizante y el incremento sustancial en el volumen
del caldo todavía no es posible recuperar un cultivo viable como se ha definido anteriormente, indica que no es probable
que el producto se contamine con Staphylococcus aureus.
12 INFORME DE ENSAYO
El informe de ensayo debe contener la siguiente información:
a) toda la información necesaria para una completa identificación del producto;
b) el método empleado;
c) los resultados obtenidos;
d) todos los detalles operativos para la preparación de la suspensión inicial;
e) la descripción del método con los neutralizantes y los medios empleados;
f) la validación del método, incluso si el ensayo se ha realizado por separado;
g) cualquier punto no especificado en este documento, o considerado como opcional, junto con los detalles de cualquier
incidencia que pudiera haber influido en los resultados.

- 17 - ISO 22718:2006
ANEXO A (Informativo)
OTROS MEDIOS
A.1 Otros caldos de enriquecimiento
A.1.1 Medio líquido de caseína y soja digeridas
A.1.1.1 Composición
− agua 1 000 ml
A.1.1.2 Preparación
Se disuelven los componentes o el medio completo deshidratado en agua, calentando si es necesario. Se esteriliza en
autoclave a 121 ºC durante 15 min.
El medio se dispensa en los recipientes adecuados.
A.1.2 Medio neutralizante D/E (Caldo neutralizante Dey/Engley) [7]
− glucosa 10,0 g
− lecitina de soja 7,0 g
− tiosulfato sódico pentahidratado 6,0 g
− bisulfito sódico 2,5 g
− tioglicolato sódico 1,0 g
− púrpura de bromocresol 0,02 g
− agua 1 000 ml

ISO 22718:2006 - 18 -
Se disuelven todos los componentes o el medio completo deshidratado, uno tras otro, en agua hirviendo hasta su disolución
completa. Se dispensa el medio en los recipientes adecuados. Se esteriliza en autoclave a 121 ºC durante 15 min.
A.1.3 Caldo Letheen modificado
− digerido péptico de carne 20,0 g
− lecitina 0,7 g
− bisulfito sódico 0,1 g
− agua 1 000 ml
En agua hirviendo se disuelven sucesivamente, el polisorbato 80 y la lecitina hasta su completa disolución. Se disuelve
el resto de componentes mezclando bien mientras se calienta. Se agita suavemente para evitar la formación de espuma.
Se dispensa el medio en los recipientes adecuados. Se esteriliza en autoclave a 121 ºC durante 15 min.
A.2 Otros medios selectivos de agar
A.2.1 Medio de agar de manitol y sal (Agar Chapman)
− digerido pancreático de carne 5,0 g
− D-manitol 10,0 g
− agar 15,0 g
− rojo fenol 0,025 g
− agua 1 000 ml

- 19 - ISO 22718:2006
Se mezcla y después se calienta con agitación frecuente, y se lleva a ebullición durante 1 min para que se produzca la
disolución. Se dispensa como se desee, y se esteriliza.
A.2.2 Medio de agar Vogel-Johnson
− manitol 10,0 g
− fosfato potásico dibásico 5,0 g
− cloruro de litio 5,0 g
− glicina 10,0 g
− agar 16,0 g
− rojo fenol 0,025 g
− agua 1 000 ml
Se lleva a ebullición la solución de sólidos durante 1 min. Se esteriliza, se enfría entre 45 ºC y 50 ºC, y se añaden 20 ml
de solución estéril de telurito potásico.

ISO 22718:2006 - 20 -
ANEXO B (Informativo)
NEUTRALIZANTES DE LA ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA

DE LOS CONSERVANTES Y LÍQUIDOS DE LAVADO
Compuesto químico capaz de Ejemplos de neutralizantes y líquidos

Conservante neutralizar la actividad de lavado adecuados (para los métodos de
antimicrobiana del conservante filtración a través de membrana)
Compuestos fenólicos: parabenos, Lecitina, polisorbato 80, óxido de Polisorbato 80, 30 g/l + lecitina, 3 g/l.
fenoxietanol, feniletanol, etc. etileno condensado en alcohol graso, Óxido de etileno condensado en alcohol graso,
Anilidas tensoactivos no iónicos 7 g/l + lecitina, 20 g/l + polisorbato 80, 4 g/l.
Caldo neutralizante D/E a
Líquido de lavado: agua destilada; triptona, 1 g/l +
NaCl, 9 g/l; polisorbato 80, 5 g/l.
Compuestos de amonio Lecitina, saponina, polisorbato 80, Polisorbato 80, 30 g/l + dodecil sulfato sódico,
cuaternario, tensoactivos dodecil sulfato sódico, óxido de 4 g/l + lecitina, 3 g/l.
catiónicos etileno condensado en alcohol graso Polisorbato 80, 30 g/l + saponina, 30 g/l + lecitina,
3 g/l.
Líquido de lavado: agua destilada; triptona, 1 g/l
+ NaCl, 9 g/l; polisorbato 80, 5 g/l.
Aldehídos, agentes liberadores de Glicina, histidina Lecitina, 3 g/l + polisorbato 80, 30 g/l + L-histidina,
formaldehído 1 g/l.
Polisorbato 80, 30 g/l + saponina, 30 g/l + L-histidina,
1 g/l + L-cisteína, 1 g/l.
Líquido de lavado: Polisorbato 80, 3 g/l+ L-histidina,
0,5 g/l.
Compuestos oxidantes Tiosulfato sódico Tiosulfato sódico, 5 g/l.
Líquido de lavado: Tiosulfato sódico, 3 g/l.
Isotiazolinonas Lecitina, saponina, aminas, sulfatos, Polisorbato 80, 30 g/l + saponina, 30 g/l + lecitina,
Imidazoles mercaptanos, bisulfito sódico, 3 g/l.
tioglicolato sódico. Líquido de lavado: triptona, 1 g/l + NaCl, 9 g/l;
polisorbato 80, 5 g/l.
Biguanidas Lecitina, saponina, polisorbato 80 Polisorbato 80, 30 g/l + saponina, 30 g/l + lecitina,
3 g/l.
Líquido de lavado: triptona, 1 g/l + NaCl, 9 g/l;
polisorbato 80, 5 g/l.
Sales metálicas (Cu, Zn, Hg), Bisulfato de sodio, Tioglicolato sódico, 0,5 g/l o 5 g/l.
compuestos órgano- mercuriales L-cisteína, compuestos sulfhidrilos, L-cisteína, 0,8 g/l o 1,5 g/l.
ácido tioglicólico. Caldo neutralizante D/E a
Líquido de lavado: tioglicolato sódico, 0,5 g/l.
NOTA Véanse las referencias [8] y [11] de la Bibliografía.
a
Caldo neutralizante D/E (Caldo neutralizante de Dey/Engley), véase el anexo A.

- 21 - ISO 22718:2006
BIBLIOGRAFÍA
[1] COLIPA, Guidelines on Microbial Quality Management, published by the European Cosmetic, Toiletry and
Perfumery Association, 1997.
[2] CTFA, Microbiology Guidelines, published by the Cosmetic, Toiletry and Fragrance Association
ISBN 1-882621-32-8, 2001.
[3] E P, Microbiological Examination of non-sterile products, 4th edition, published by the European
Pharmacopoeia, 2002.
[4] FDA, Bacteriological Analytical Manual, 8th edition, published by the U.S. Food and Drug Administration,
1995, http://www.cfsan.fda.gov/~ebam/bam-23.html.
[5] JP 14, General Tests. Microbial Limit test, published by the Japanese Pharmacopoeia, 2001.
[6] USP 28, Microbial Limit test 61, published by the U.S. Pharmacopoeia, 2005.
[7] ATLAS, R.M. Handbook of Microbiological Media, CRC Press, ISBN 0-8493-2944-2, 1993.
[8] SINGER, S. The Use of Preservative Neutralizers in Diluents and Plating Media, Cosmetics and Toiletries, 102,
55, December 1987.
[9] ISO 21149, Cosmetics. Microbiology. Enumeration and Detection of aerobic mesophilic bacteria.
[10] ISO 18415, Cosmetics. Microbiology. Detection of specified microorganisms (Staphylococcus aureus,
Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Candida albicans) and non specified microorganisms.
[11] EN 1040, Chemical disinfectants and antiseptics. Basic bactericidal activity. Test method and requirements
(phase 1).

Génova, 6 info@aenor.es Tel.: 902 102 201
28004 MADRID-España www.aenor.es Fax: 913 104 032

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Detección de Staphylococcus aureus

Cosmeticss. Microbiology. Detection of Staphylococcus aureus (ISO 22718:2006).

Cosmétiquues. Microbiologie. Détection de Staphylococcus aureus (ISO 22718:22006).

ANTECEDENTES Esta norrma ha sido elaborada por el comité técnico AEN/CTN

Editada e impresa por AENOR LAS OBSE

© AENOR 2010 Génova, 6 info@aenor.es Tel.: 902 102 201 Grupo 15

AENOR AUTORIZA EL USO DE ESTE DOCUMENTO A LABORATORIOS GOMEZ BESER

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Cosmetics. Microbiology. Detection of Cosmétiques. Microbiologie. Détection de Kosmetik. Mikrobiologie. Nachweis

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1 OBJETO Y CAMPO DE APLICACIÓN .................................................................................. 7

2 NORMAS PARA CONSULTA ................................................................................................... 7

3 TÉRMINOS Y DEFINICIONES ................................................................................................ 8

5 DILUYENTES Y MEDIOS DE CULTIVO............................................................................... 8

6 APARATOS Y MATERIAL DE VIDRIO............................................................................... 12

7 CEPAS DE MICROORGANISMOS ....................................................................................... 12

8 MANIPULACIÓN DE LOS PRODUCTOS COSMÉTICOS Y LAS MUESTRAS

10 EXPRESIÓN DE LOS RESULTADOS (DETECCIÓN DE

12 INFORME DE ENSAYO .......................................................................................................... 16

ANEXO A (Informativo) OTROS MEDIOS .................................................................................. 17

ANEXO B (Informativo) NEUTRALIZANTES DE LA ACTIVIDAD

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ISO (Organización Internacional de Normalización) es una federación mundial de organismos nacionales

AENOR AUTORIZA EL USO DE ESTE DOCUMENTO A LABORATORIOS GOMEZ BESER

El análisis de riesgos microbiológicos depende de varios parámetros, como:

− alteración potencial de los productos cosméticos;

− la patogenicidad de los microorganismos;

− el tipo de usuario (adulto, niños menores de tres años).

1 OBJETO Y CAMPO DE APLICACIÓN

2 NORMAS PARA CONSULTA

ISO 21148:2005 Cosméticos. Microbiología. Instrucciones generales para el examen microbiológico.

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3.3 suspensión inicial:

3.4 muestra(s) diluida(s):

3.5 microorganismo específico:

3.6 Staphylococcus aureus:

3.7 caldo de enriquecimiento:

5 DILUYENTES Y MEDIOS DE CULTIVO

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5.2 Diluyente para la suspensión bacteriana (solución de triptona y cloruro sódico)

− triptona, digerido pancreático de caseína 1,0 g

− cloruro sódico 8,5 g

5.3 Medios de cultivo

− digerido pancreático de caseína 15,0 g

− digerido papaínico de soja 5,0 g

− cloruro sódico 5,0 g

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5.3.3 Caldo de enriquecimiento

5.3.3.1 Caldo Eugon LT 100

− digerido pancreático de caseína 15,0 g

− digerido papaínico de soja 5,0 g

− cloruro sódico 4,0 g

− sulfito sódico 0,2 g