PROTOCOLOS DE PRÁCTICAS DE LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA EXPERIMENTAL FACULTAD DE QUÍMICA

UNIDAD VII. TÉCNICAS PARA LA ENUMERACIÓN DE

MICROORGANISMOS.

ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO DEL AGUA Y OTRAS MUESTRAS.

Objetivos

Al finalizar este ejercicio el alumno será capaz de:

 Explicar el fundamento de la técnicas más utilizadas en el recuento microbiano: microscópico,
turbidimétrico, filtración y siembra en placa, reducción de indicadores óxido-reducción.
 Establecer la cantidad de microorganismos en una muestra mediante la aplicación de las
técnicas más adecuadas.
 Relacionar los resultados obtenidos y explicar las causas que determinan la variación de
éstos.

Introducción

El crecimiento de los microorganismos presentes en sustratos que se encuentren en condiciones que

lo propicien, se traducirá primero en el aumento de los componentes celulares, y en seguida por el
aumento del tamaño y el incremento del número de células. Los estudios relacionados con el análisis
de muestras como agua, alimentos, leche y aire requieren de una enumeración cuantitativa de los
microorganismos presentes en estos compuestos, ya que la calidad microbiológica de estos
productos está en relación directa con la calidad sanitaria y la seguridad para el consumo de ellos.

Por lo heterogéneo de los microorganismos y de las muestras, existen muchos métodos para tales
fines que incluyen métodos microscópicos o directos, el uso de contadores electrónicos de células
como el contador Coulter, métodos químicos que permiten estimar la masa celular o constituyentes
celulares, lecturas turbidimétricas que se pueden relacionar con el aumento de la masa celular y el
método de cuenta en placa de unidades formadoras de colonias.

Las sesiones están diseñadas para realizar:

a) La determinación cuantitativa de bacterias en agua utilizando tres métodos que forman
parte del método oficial para determinar la calidad bacteriológica del agua: coliformes
totales por el método del Número Más Probable (NMP) y el método de filtración para
determinar coliformes fecales. La cuantificación de bacterias mediante los métodos:
Cuenta directa al microscopio (Método de Breed) y el Redox, ambos aplicados en el
análisis de leche.
b) El método turbidimétrico para la construcción de una curva que relaciona la densidad
óptica y el log de UFC obtenido en cada muestra. El método turbidimétrico es aplicado
para ajustar inóculos a una determinada concentración o en el caso de vacunas.

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PRÁCTICA 7.1 Método del Número Más Probable (NMP).

Cuantificación de coliformes totales y fecales
PRÁCTICA 7.2 Método de Filtración y Siembra en Placa.
Cuantificación de Coliformes Fecales (1ª Sesión)

Materiales

Material por equipo:

Pinzas de pato
Manguera para vacío
Membrana Millipore estéril de 5 cm de diámetro y 0.45 µm de poro
1 Placa Petri de ENDO
Vaso de precipitado de 250 mL
Pinzas Millipore
Manguera para vacío
5 Tubos de 22 x 175 con 10 mL de Caldo lauril sulfato (triple concentración) con campana de Durham

Material que deben tener los alumnos:

200mL de muestra de agua presumiblemente potable (cisterna, pileta, garrafón, etc.)
Equipo Millipore para filtración (matraz, filtro, embudo) estéril
Mecheros
Gradillas
Asas
Etanol (96°) para flamear pinzas
Pinzas de punta roma
Pipetas serológicas de 1.0 mL estériles

Metodología

7.1 Técnica del Número Más Probable (NMP).

(PRUEBA PRESUNTIVA del análisis microbiológico del agua).
1. Colocar en la gradilla los 5 tubos con caldo lactosado doble concentración y rotularlos.
2. Agitar la muestra para homogeneizarla.
3. En condiciones asépticas colocar a cada tubo 10 mL del agua a analizar. Agitar los tubos
para homogeneizar la muestra.
4. Incubar los tubos a 35 ± 0,5°C. Examinar los tubos a las 24 h., observar si hay formación de
gas (desplazamiento del medio en la campana de Durham); si no se observa producción de
gas, incubar 24 h. más.

7.2 Técnica de filtración:

1. Montar el equipo Millipore en condiciones de asepsia, y conectarlo al sistema de vacío (figura 1).
2. Colocar la membrana Millipore estéril (cuadriculado hacia arriba) en el soporte, con la ayuda de
una pinza (de punta roma) previamente flameada con alcohol y enfriada.
3. Montar nuevamente el equipo y fijarlo con la pinza adaptadora (pinza de pato).
4. Agitar vigorosamente el frasco que contiene la muestra de agua y verter 100 mL en el embudo del
equipo Millipore y filtrar al vacío; cuando haya pasado toda la muestra, con el filtro aún en su
lugar, enjuague el embudo mediante la filtración de 100 mL de solución buffer de fosfatos
(procurar que el líquido recorra las paredes del embudo). Cerrar el vacío antes de retirar la
membrana.
5. Retirar la membrana tomándola con la pinza estéril y depositarla asépticamente sobre la placa de
agar ENDO, asegurando el contacto de la membrana con el medio.
6. Incubar a 37° C durante 24-48 h.

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Precauciones generales

 Procura emplear propipetas en buen estado. Es importante que las cantidades (volúmenes o
masa) empleadas en esta práctica sean exactas.
 El rotulado de tubos y cajas es básico en esta práctica, pues una equivocación conduce a la
obtención de resultados erróneos.
 Si la muestra de agua, que se usará para la cuantificación de bacterias coliformes mediante la
técnica de filtración, está turbia (presencia de sólidos), será necesario diluirla o cambiar de
muestra.
 Ten mucho cuidado al tomar la membrana. Si ésta se rompe no servirá para el análisis.

Disposición de desechos
1. Las pipetas se depositan en el pipetero (recipiente largo) con desinfectante inmediatamente
después de su uso. Dejar actuar por 10 minutos, sacar las pipetas, envolverlas en papel
kraftin para su esterilización y finalmente lavarlas con agua y jabón.

PRÁCTICA 7.1 Método del Número Más Probable (NMP).

PRÁCTICA 7.2 Método de Filtración.
Cuantificación de Coliformes Fecales (EXTRACLASE)

Por equipo
 5 tubos de 16 x 150 mm con 10.0 mL de caldo bilis verde brillante con campana de Durham.
 5 de 16 x 150 mm con 10.0 mL de caldo EC y campana de Durham

Material que deben tener los alumnos:

 1 gradilla
 Mechero
 Asa bacteriológica.

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7.1 Técnica del Número Más Probable (NMP).

1. Observar y registrar el número de tubos que muestren turbidez, acidificación del medio y
presencia de gas resultante del crecimiento microbiano.
2. Con los resultados obtenidos calcular el NMP de microorganismos utilizando la tabla
correspondiente.
3. Reportar el NMP/ 100mL de muestra.

i. Prueba confirmativa de microorganismos coliformes totales.

 Transferir de 2 a 3 asadas de cada tubo positivo obtenido durante la prueba presuntiva, a

tubos que contienen caldo de bilis verde brillante (brila) con campana Durham.
 Agitar suavemente los tubos par su homogeneización
 Incubas a 35±2°C durante 24 a 48h.
 Registrar como positivos aquellos tubos en donde se observe turbidez (crecimiento) y
producción de gas después de un período de incubación de 24 a 48h
 Consultar la tabla 1 de NMP para conocer el número más probable de organismos coliformes
totales/100mL.

ii. Prueba confirmativa de microorganismos coliformes fecales.

 Transferir de 2 a 3 asadas de cada tubo positivo obtenido durante la prueba presuntiva, a

tubos con caldo EC
 Agitar suavemente los tubos para su homogeneización
 Incubar a 44.5± 0.1°C en incubadora o un baño de agua con circulación durante 24 a 48h
 Registrar como positivos aquellos tubos en donde se observe crecimiento y producción de gas
después de un período de incubación de 24 a 48
 Consultar la tabla 1 de NMP para conocer el número más probable de organismos coliformes
fecales/100mL.

Control de calidad para coliformes fecales:

 Inocular en tubos de caldo EC una cepa de E. coli como control positivo y una de Enterobacter
aerogenes como control negativo e incubar junto con las muestras.

7.2 Técnica de filtración.

1Revisar las membranas sobre las placas y ubicar la presencia de colonias típicas:
i. De coliformes. Color rojo obscuro con brillo metálico. El área brillante puede variar de
tamaño desde que solo brille la parte superior de la colonia hasta que abarque la
superficie total de la colonia, las colonias atípicas de coliformes pueden ser rojo oscuro
o nucleadas sin brillo.
ii. No coliformes. Colonias sin brillo, que pueden ser rosas, rojas, blancas o incoloras.
2. Utilizar un cuentacolonias para contar las colonias con las características antes descritas
cuyo número oscile entre 20 y 80 con un límite máximo de 200.
3. Reportar el número de UFC /100 mL de muestra.

EXTRACLASE

Por equipo
 2 cajas Petri con agar Eosina azul de metileno

Material que deben tener los alumnos:

 1 gradilla

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 Mechero
 Asa bacteriológica.

iii. Prueba confirmativa de Escherichia coli.

 Tomar una asada de cada uno de los tubos positivos de caldo EC y sembrar por estría en
cuadrante radial en agar eosina azul de metileno (EMB) para su aislamiento.
 Incubar las placas invertidas a 35°C por 18-24h.

7.2 Técnica de filtración.

1. Revisar las membranas sobre las placas y ubicar la presencia de colonias características de
enterobacterias fermentadoras de lactosa (rojas de 1 a 2 mm de diámetro con halo de
precipitación rojizo).
2. Utilizar un cuentacolonias para contar las colonias con las características antes descritas y
calcular el número de UFC /100 mL de muestra.
3. Consultar la Norma Oficial Mexicana NOM-127-SSA1-1994, que señala los límites permitidos
de bacterias coliformes fecales y confirmar si el agua analizada reúne y cumple con lo
establecido.

Disposición de desechos

1. Esterilizar los tubos en los que preparó las suspensiones bacterianas y posteriormente lavarlos.
2. Después de realizar las lecturas correspondientes, sellar las caja de Petri de plástico con la
membrana Millipore y colocarlas en el contenedor rojo ubicado en el laboratorio 1A.

SESIÓN

Materiales

Por equipo
 2 cajas Petri con agar cuenta estándar

Material que deben tener los alumnos:

 1 gradilla

Material por mesa:

 1 Cuentacolonias

Método
iv. Prueba confirmativa de Escherichia coli.

 Seleccionar dos colonias de cada placa de EMB con la siguiente morfología colonial: colonias
con centro negro, planas con o sin brillo metálico. Si no hay colonias con morfología típica,
probar una o más colonias lo más parecido a E. coli de cada placa.
 Realizar tinción de Gram.
 Sembrar la colonia seleccionada (bacilo corto gram negativo) en agar cuenta estándar.
 Incubar las placas a 35°C por 18-24h.

Disposición de desechos

1. Esterilizar los tubos en los que preparó las suspensiones bacterianas y posteriormente lavarlos.

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2. Después de realizar las lecturas correspondientes, sellar las caja de Petri de plástico con la
membrana Millipore y colocarlas en el contenedor rojo ubicado en el laboratorio 1A.

Discusión de resultados

1. ¿Cuáles son los puntos críticos para realizar las técnicas del NMP y Filtración? ¿cuál para la
de dilución y vertido en placa?
2. ¿Cuáles fueron las dificultades a las que te enfrentaste al realizar la lectura de éstas técnicas?
3. ¿Qué similitudes y diferencias existen entre las técnicas de estudio? ¿cuál crees que
proporcione resultados más certeros?
4. Discute sobre la información que te proporciona cada una de las técnicas.

EXTRACLASE

Por equipo:

4 Tubos de 13 x 100
1 con caldo triptona
2 con caldo RM-VP
1 con caldo triptona o citrato de Simmons

Material que deben tener los alumnos:

 1 gradilla
 Asa bacteriológica
 Mechero

Metodología.

7.1 Método del NMP.

v. Identificación bioquímica de Escherichia coli mediante pruebas IMViC

 Seleccionar una colonia desarrollada en agar cuenta estándar, resuspenderla en 2mL de

solución salina isotónica para realizar las siguientes pruebas bioquímicas:
a) Producción de indol(I)
 Tomar una asada de la suspensión bacteriana e inocular un tubo con caldo
triptona.
 Incubar a 35°C por 24 ± 2h.
b) Producción de ácidos mixtos (o prueba de rojo de metilo, RM)
 Tomar una asada de la suspensión bacteriana e inocular un tubo que contenga
caldo RM-VP
 Incubar a 35°C por 24 ± 2h.
c) Producción de metabolitos neutros (Voges-Proskauer VP)
 Tomar una asada de la suspensión bacteriana e inocular un tubo que contenga
caldo RM-VP
 Incubar a 35°C por 24 ± 2h.
d) Utilización del citrato como única fuente de carbono (C)
 Tomar una asada de la suspensión bacteriana e inocular un tubo que contenga
agar citrato de Simmons.
 Incubar a 35°C por 96h.
NOTAS.
- Para determinar la producción de indol, en lugar de caldo triptona puede utilizarse el medio SIM. Este
medio se inocula por picadura con el asa bacteriológica de forma recta. Se incuba a 35°C por 24 ± 2h.

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- Para evitar resultados falsos positivos, en el agar citrato de Simmons e inóculo no debe ser muy
abundante. Además de ser este el primer medio en sembrar.

Sesión

Lectura e interpretación de resultados de pruebas IMViC

Materiales
Por equipo
 Frascos gotero con reactivo de Ehrlich o Kovac
 Frascos gotero con indicador rojo de metilo
 Frascos gotero con reactivo alfa naftol (VP1)
 Frascos gotero con solución de hidróxido de potasio al 40 % (VP2)

Metodología

a. Producción de indol (I)

 Finalizada la incubación, adicionar entre 0.2 y 0.3 mL de reactivo de Kovacs o Ehrlich.
 La presencia de una coloración roja en la superficie del tubo se considera como
prueba positiva para la presencia de indol.

b. Producción de ácidos mixtos (o prueba de rojo de metilo, RM)

 Finalizada la incubación, adicionar 5 gotas de solución de rojo de metilo.
 Se considera una prueba positiva cuando se desarrolla un color rojo. Un color
amarillo es una prueba negativa.

c. Producción de metabolitos neutros (Voges-Proskauer VP)
 Finalizada la incubación, adicionar 0.6 mL de solución KOH 40% (VP1), agitar y 0.2 mL
de solución alfa- naftol (VP2) y agitar.
 Dejar reposar el tubo destapado durante 10 minutos; se considera una prueba positiva
cuando se desarrolla un color rosa en la superficie.

d. Utilización del citrato (C)

 Finalizada la incubación, observar el desarrollo del cultivo con el vire del indicador de
verde a azul turquesa, mismo que se considera una prueba positiva.

Disposición de desechos

1. Esterilizar los tubos en los que realizaron las pruebas IMViC y posteriormente lavarlos. Desechar
el agar al colocarlo en bolsas de plástico y colocarlos en los contenedores del laboratorio 1A.

Precauciones generales

Para obtener resultados confiables:

 Respeta los tiempos de incubación establecidos
 Agrega los reactivos en el orden indicado

Discusión de resultados

5. ¿Cuáles son los puntos críticos para realizar las técnicas del NMP y Filtración?

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6. ¿Cuáles fueron las dificultades a las que te enfrentaste al realizar la lectura de ambas
técnicas?
7. Discute sobre la información que te proporciona cada una de las técnicas.

Literatura de consulta

 CCAYAC-M-004 (2006) “Estimación de la densidad microbiana por la técnica del número más
probable, detección de coliformes totales, coliformes fecales y Escherichia coli por el número
más probable”.
 Collins C.H. y Lyne Patricia M. 1989. Métodos Microbiológicos. ACRIBIA. 524 pp
 Farmacopea de los Estados Unidos Mexicanos. 8th ed.
 Food and Drug Administration (2003) “Bacteriological Analytical Manual” 9 th ed. Arlington,
VA:AOAC.
 Norma Ofical Mexicana NOM-041-SSA1-1993. Bienes y servicios. Agua purificada
envasada.Especificaciones sanitarias.
 Madigan, M. T., J. M. Martinko y J. Parker. 2003. Brock. Biología de los microorganismos. 10ª
Ed. Prentice Hall Iberia. España.
 Norma Oficial Mexicana NOM-127-SSA1-1994. Salud ambiental, agua para uso y consumo
humano. Límites permisibles de calidad y tratamientos a que debe someterse el agua para su
potabilización.
 Ramírez-Gama, R. M., B. Luna Millán, O. Velásquez Madrazo, L. Vierna García, A. Mejía
Chávez, G. Tsuzuki Reyes, L. Hernández Gómez, I. Müggenburg, A. Camacho Cruz y M del
C. Urzúa Hernández. 2006. Manual de Prácticas de Microbiología General. 5ª edición.
Facultad de Química, UNAM. México.
 Standard Methods for the examination of water and wastewater. 1998. American Public Health
Assiciation. 20th ed. Washington.
 Tortora Gerard J., Fonke Beidell R. y Case Christine L. 1995. Microbiology an Introduction . 5a.
ed. The Benjamin/Cummings Publishing Company, Inc. 801 pp
 Vullo, D., M. Wachsman, L. Alche. 2000. Microbiología en Práctica. Manual de laboratorio
para la enseñanza de Microbiología básica y aplicada. 1ª edición. Atlante S. R. L. Argentina

PRÁCTICA 7.3 Técnica de Cuenta Directa:

Método de Breed y Método Redox.

Materiales

Muestras
Leche pasteurizada
Leche no pasteurizada
Leche cruda o bronca (de establo)
Vino

Material por mesa

Solución de tiocianato de azul de metileno
Frasco gotero con azul de metileno

Material por equipo:

Microscopio
Objetivo micrométrico

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Material que deben tener los alumnos:

Mecheros
Gradillas
Portaobjetos
Tubos de ensayo de 16x150 con tapón de rosca estériles
Pipetas de 10 mL estériles
Pipetas de 1.0 mL estériles
Pipetas de 0.1 mL estériles
Pipetero

Metodología

7.3.1 Cuenta directa (método de Breed).

Cálculo del factor microscópico (FM):

1. Medir el diámetro del campo microscópico por medio del micrómetro objetivo, en mm.
2. Determinar el área del campo: elevar el radio al cuadrado y multiplicar por 3.1416. Dividir este
resultado entre 100 para obtener el área del campo en centímetros cuadrados.
3. Determinar el número de dichos campos en 1 cm 2, dividiendo 1 cm2 entre el área del campo
obtenido antes.
4. Como se coloca 0.01 mL de leche en un área de 1 cm 2, multiplicar el número de campos por
100 para conocer el número de campos microscópicos por mL de leche.

Preparación de la muestra:
1. En un portaobjetos desengrasado marcar un área de 1 cm2.
2. Agitar la muestra de vino.
3. Con una pipeta estéril tomar 0.01 mL del vino y transferirlo al portaobjetos previamente
marcado, extendiendo la muestra en el área marcada con el asa.
4. Dejar secar al aire.
5. Teñirlo con solución de azul de metileno durante 2 minutos. Lavar con agua. Dejar secar a
temperatura ambiente.
6. Observar en el microscopio con objetivo de inmersión y contar el número de microorganismos
por campo, obteniendo el promedio de 5 campos.
7. Calcular el FM.
8. Calcular el número de bacterias por mL de vino.

7.3.2 Método Redox (reducción del azul de metileno).

Reducción del azul de metileno:

1. Agitar la muestra de leche pasteurizada y transferir 10 mL a un tubo de ensayo.
2. Agitar la muestra de leche cruda y transferir 10 mL a otro tubo de ensayo.
3. Agregar a cada tubo 1 mL de la solución de colorante, mezclar bien y colocarlos en un baño
de agua a 37°C (o en la incubadora).
4. Después de 10 minutos, asegurar los tapones e invertir lentamente los tubos tres veces para
distribuir la capa de crema.
5. Observar cada 30 minutos y continuar la incubación hasta que registre decoloración del
colorante.
6. Anotar los resultados obtenidos prácticamente, de acuerdo con la clasificación indicada en el
cuadro 19.

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Cuadro 19. Clasificación de la calidad de leche y número de microorganismos, mediante la técnica de

reducción del azul de metileno.
Calidad Tiempo (°C) de incubación en el que se Número de microorganismos /
presenta la decoloración mL
Excelente No se decolora en 5.5 h < de 500 000
Buena Se decolora entre las 2 y 5.5 h 500,000 a 4 000 000
Mala Se decolora entre los 20 minutos y 2 h 4 a 20 millones
Muy mala Se decolora en 20 minutos > de 20 millones

Precauciones generales

 Registra los tiempos adecuadamente para observar el cambio de color en las muestras de
leche empleadas para cuantificar microorganismos mediante la técnica de Redox.

Disposición de desechos

1. Después de efectuar las observaciones, los portaobjetos se sumergen durante 10 minutos en

una solución sanitizante de hipoclorito de sodio al 10% a partir de una solución comercial,
después se lavan con detergente líquido, se enjuagan y se sumergen en alcohol al 95%
durante 24 horas.
2. En caso de que las preparaciones se rompan, envolverlas en papel, esterilizar en autoclave y
desecharlas en el contenedor exclusivo para material roto de vidrio.
3. Las muestras de leche con colorantes se colocan en los contenedores dispuestos para este fin
en cada laboratorio.

Discusión de resultados

1. ¿Cuál fue la problemática a la que te enfrentaste para llevar a cabo los métodos de Breed y
Redox?

Literatura de consulta

 Atlas, R. M. Y R. Bartha. 2000. Microbial Ecology. Fundamentals and Applications. 4a edición.

Benjamin/Cummings Science Publishing
 Collins C.H. y Lyne Patricia M. 1989. Métodos Microbiológicos. ACRIBIA. 524 pp
 Ramírez-Gama, R. M., B. Luna Millán, O. Velásquez Madrazo, L. Vierna García, A. Mejía
Chávez, G. Tsuzuki Reyes, L. Hernández Gómez, I. Müggenburg, A. Camacho Cruz y M del
C. Urzúa Hernández. 2006. Manual de Prácticas de Microbiología General. 5ª edición.
Facultad de Química, UNAM. México.
 Standard Methods for the examination of water and wastewater. 1998. American Public Health
Assiciation. 20th ed. Washington.
 Tortora Gerard J., Fonke Beidell R. y Case Christine L. 1995. Microbiology an Introduction . 5a.
ed. The Benjamin/Cummings Publishing Company, Inc. 801 pp
 Vullo, D., M. Wachsman, L. Alche. 2000. Microbiología en Práctica. Manual de laboratorio
para la enseñanza de Microbiología básica y aplicada. 1ª edición. Atlante S. R. L. Argentina

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PRÁCTICA 7.4 Método Turbidimétrico

Materiales
Material por equipo
Matraz nefelométrico conteniendo un cultivo de Escherichia coli de 24 horas.
Celdas para espectrofotómetro
Tubo de ensayo de 22x175 con 20 mL de caldo nutritivo estéril.

Material que deben tener los alumnos:

Cajas de Petri estériles de plástico
Pipetas graduadas de 1.0 mL estériles
Pipetas graduadas de 10 mL estériles
Pipetas graduadas de 5 mL estériles
Tubos de ensayo de 16x150 vacíos con tapón de rosca estériles

Metodología

1. Agregar 1 gota de formaldehído a los tubos con muestra.

2. Vaciar el contenido de cada uno de ellos a 5 celdas espectrofotométricas y proceder a tomar
la lectura del % de transmitancia.
3. Agitar suavemente el matraz que contiene el cultivo de Escherichia coli, insertar el tubo lateral
en el espectrofotómetro y tomar la lectura del % de transmitancia.
4. Construir una gráfica (y=No. Microorganismos, x=% transmitancia) con la Curva de
McFarland.
5. Obtener la ecuación de la recta a partir de la curva e interpolar los datos obtenidos para los
tubos muestra en la curva de McFarland.

Precauciones generales

 Procura homogenizar perfectamente tus cultivos al realizar cada dilución, y antes de leer el %
transmitancia.

Disposición de desechos

1. Esterilizar los tubos en los que preparó las suspensiones bacterianas y posteriormente lavarlos.

Discusión de resultados

1. ¿Qué precauciones propondrías para mejorar el método turbidimétrico?

Literatura de consulta

 Atlas, R. M. Y R. Bartha. 2000. Microbial Ecology. Fundamentals and Applications. 4a edición.

Benjamin/Cummings Science Publishing
 Collins C.H. y Lyne Patricia M. 1989. Métodos Microbiológicos. ACRIBIA. 524 pp
 Madigan, M. T., J.M. Martinko y J. Parker. 2003. Brock. Biología de los microorganismos.
10ª Edición en español. Prentice may Iberia, España.
 Standard Methods for the examination of water and wastewater. 1998. American Public Health
Association. 20th edition. Washington.
 Norma Oficial Mexicana NOM-127-SSA1-1994.
 Tortora Gerard J., Fonke Beidell R. y Case Christine L. 1995. Microbiology an Introduction. 5a.
ed. The Benjamin/Cumings Publishing Company, Inc. 801 pp.

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