Tema 5 Diagnóstico Microbiológico

DIAGNÓSTICO
MICROBIOLÓGICO
MICROBIOLOGÍA
DIAGNÓSTICO MICROBIOLÓGICO
Los laboratorios de
microbiología colaboran de
cuatro maneras con los servicios
clínicos:
A. Detección e identificación de
microorganismos
B. Medición de la respuesta de
anticuerpo del huésped
C. Como guía de tratamiento
D. Como ayuda para controlar

la infección
MICROBIOLOGÍA
MICROBIOLOGÍA
DIAGNÓSTICO MICROBIOLÓGICO DE LA
INFECCIÓN
 DIRECTO:
Demostrar la presencia del microorganismo responsable
● INDIRECTO:
Demostrar la respuesta inmunitaria del huésped frente al
microorganismo responsable
MICROBIOLOGÍA
DIAGNÓSTICO MICROBIOLÓGICO DIRECTO
 La detección e identificación de los microorganismos

suele exigir cuatro pasos:
1. Obtención, transporte y procesamiento de muestras
2. Visualizar el microorganismo y/o detectar sus productos
3. Cultivo
4. Identificación
MICROBIOLOGÍA
DIAGNÓSTICO MICROBIOLÓGICO DIRECTO:
1. Toma de muestras
 Antes de instaurar el tratamiento antibiótico.

 Evitar la contaminación con flora saprofita.
 Seleccionar el sitio anatómico correcto y utilizar
técnica de asepsia adecuada.
MICROBIOLOGÍA
1. Toma de muestras
 Muestras de secreciones: de ojos, oído, nariz, faríngeas,

heridas, úlceras y genitales. Fáciles de obtener, pero proporcionan
pequeños volúmenes que se secan fácilmente.
 Líquidos: de pus, orina, esputo, bilis, LCR y sangre. Son mejores, ya
que los volúmenes son mayores y los microorganismos sobreviven
mejor.
 Tejido: lo mejor. Los microorganismos suelen estar más
concentrados y ser más viables.
MICROBIOLOGÍA
Transporte y procesamiento de muestras
- A veces son procesados en la cabecera del paciente.

- La mayoría son transportados al laboratorio
Cuando hay dudas sobre la obtención, el transporte o el

procesamiento de especímenes, lo mejor es preguntar al
laboratorio.
MICROBIOLOGÍA
Transporte y procesamiento de muestras
MICROBIOLOGÍA
2. Visualización directa
 Examen microscópico directo: microorganismos de mayor

tamaño.
- Preparación húmeda en solución salina para parásitos
genitales e intestinales.
- KOH para hongos en raspados de piel.
- Preparación con tinta china para resaltar los criptococos.
- Examen microscópico de campo oscuro para visualización de
Treponema.
 Tinciones: para demostrar y diferenciar microorganismos.
- Tinción de Gram (bacterias comunes) y de Ziehl-Neelsen
(para micobacterias, Nocardia y Cryptosporidium)
MICROBIOLOGÍA
TINCIÓN DE
ZIEHL-NEELSEN
TINCIÓN DE GRAM
TINTA CHINA
MICROBIOLOGÍA
2. Detección de productos
2.1. Detección de antígeno:

 Aglutinación: se utiliza anticuerpo acoplado a partículas de látex.
 Coaglutinación
 IFD: anticuerpos marcados con fluoresceína.
 ELISA (enzimoinmunoanálisis)
 Inmunohistoquímica
 Anticuerpos monoclonales
MICROBIOLOGÍA
3. Cultivo bacteriano
3.1. Medios líquidos/sólidos

3.2. Medios usuales/enriquecidos:
 Usuales: contienen las sustancias nutritivas mínimas para el
crecimiento de las bacterias metabólicamente no exigentes.
 Enriquecidos= usuales + sangre o factores esenciales específicos
3.3. Medios de aislamiento/selectivos/selectivo-
diferenciales/para antibiograma:
 Selectivos: Para aislar específicamente un solo tipo de bacteria
(inhibe el crecimiento del resto de bacterias presentes en la muestra)
 Selectivo-diferenciales: Se añade a los medios selectivos sustancias
que confieren un color diferente a las colonias según la distinta
actividad metabólica de las bacterias.
MICROBIOLOGÍA
3. Cultivo bacteriano
MEDIOS CROMOGÉNICOS
MICROBIOLOGÍA
4. Identificación
4.1. Identificación provisional: por la forma, tinción de

Gram, necesidades de desarrollo…
4.2. Identificación definitiva: métodos bioquímicos

 Detección de enzimas (coagulasa, catalasa y oxidasa)
 Utilización de sustrato
 Metabolismo de glúcidos
MICROBIOLOGÍA
INDIRECTO
= Detección de respuesta inmunitaria del huésped.

Se adoptan los mismos métodos que en la detección de antígenos
(aglutinación, precipitación, fijación de complemento,
enzimoinmunoanálisis, pruebas de anticuerpo fluorescente, …)
Inconvenientes:
1. Se debe utilizar un antígeno específico (tiene que haber la
sospecha de una infección específica).
2. Han de pasar 2 a 4 semanas para que los anticuerpos sean
detectables. Si hay IgG previa, hay que demostrar elevación.
MICROBIOLOGÍA
DIAGNÓSTICO
MICROBIOLÓGICO INDIRECTO
Inmunofluorescencia e inmunoanálisis
enzimático para Ag asociados a células
Inmunoanálisis para anticuerpos y

antígenos (Ag) solubles
MICROBIOLOGÍA © Dra. S. Checa Flores 2009
PRUEBAS DE SENSIBILIDAD
 Pruebas de difusión (6 a 18 horas):

 Difusión en disco
 Prueba E
 Pruebas de dilución (4 a 18 horas):
 Dilución en agar
 Dilución en caldo
 Otras pruebas:
 Detección de betalactamasa
 Betalactamasa de espectro extendido (BLEE)
MICROBIOLOGÍA
 DIFUSIÓN EN DISCO:
Se utilizan antibióticos en discos de papel colocados en un “césped” de
microorganismo en agar. El antibiótico difunde, de manera que el
tamaño de la zona de inhibición se relaciona con el grado de
susceptibilidad. Es económica, fácil y exacta si está estandarizada.
MICROBIOLOGÍA
 PRUEBA E:
Utiliza una concentración graduada en una tira, de manera que la CIM
se interpreta donde la unión de crecimiento y no crecimiento intersecta
la tira. Útil para microorganismos atípicos. Relativamente costosa.
MICROBIOLOGÍA
DIAGNÓSTICO MOLECULAR
VENTAJAS:
• Seguridad: Estas técnicas no requieren el aislamiento del agente
infeccioso (se puede trabajar con muestras o extractos fijados
químicamente y por tanto inactivados).
• Sensibilidad: permiten detectar cantidades muy pequeñas de ADN
microbiano en un tejido.
• Especificidad: permite distinguir cepas basándose en las diferencias
de sus genotipos.
MICROBIOLOGÍA
Las técnicas genéticas se utilizan para:

1. Detección de microorganismos directamente en muestras clínicas.
2. Cuantificación del número de virus en sangre o plasma.
3. Identificación de un microorganismo tras su aislamiento.
4. Detección de factores de virulencia.
5. Determinación de resistencia a los antimicrobianos.
6. Estudios de epidemiología molecular que permiten comparar
cepas aisladas.
MICROBIOLOGÍA
La mayoría de las técnicas se pueden adscribir a dos grupos:

 TÉCNICAS DE HIBRIDACIÓN
 TÉCNICAS DE AMPLIFICACIÓN
En ambos casos en primer lugar deben extraerse los

ácidos nucleicos.
MICROBIOLOGÍA
DIAGNÓSTICO MOLECULAR: TÉCNICAS DE HIBRIDACIÓN
 Al calentar el DNA por encima de 90ºC, las dos cadenas se

separan (desnaturalización).
 Se utiliza una secuencia de DNA complementaria a la que
queremos detectar , marcada con una sustancia radiactiva,
con un compuesto fluorescente o lumínico, o con una
enzima.
 Estos pequeños fragmentos de DNA monocatenarios
marcados se denominan sondas.
MICROBIOLOGÍA
DIAGNÓSTICO MOLECULAR: TÉCNICAS DE HIBRIDACIÓN
MICROBIOLOGÍA
DIAGNÓSTICO MOLECULAR: MÉTODOS DE AMPLIFICACIÓN
Fases de la PCR:
1) Desnaturalización: Separación de las dos cadenas de la DNA por el
calor (95ºC).
2) Hibridación: la mezcla se enfría a una temperatura entre 30 y 65ºC ,
temperatura que permite la hibridación. Los cebadores se unirán a sus
secuencias complementarias.
3) Polimerización o extensión: a 72ºC, temperatura óptima para la
actividad de la Taq-polimerasa, se producen las copias de ambas cadenas.
Se repetirán nuevos ciclos hasta conseguir millones de copias, proceso

que tiene lugar en el termociclador.
MICROBIOLOGÍA
MICROBIOLOGÍA
PCR a tiempo real:

Permite la ejecución de la técnica en un tiempo muy reducido (unos
30´) y la cuantificación precisa y continua del DNA que se va formando
( la muestra no se coloca en un tubo convencional sino en uno capilar que
permite cambiar de temperatura en un tiempo muy inferior).
MICROBIOLOGÍA
DIAGNÓSTICO MOLECULAR: MÉTODOS DE
AMPLIFICACIÓN
Las técnicas de amplificación comercializadas se

aplican sobre todo en:
o VIH
o Diagnóstico de hepatitis B y C
o Diagnóstico de infección por CMV
o Diagnóstico de infección por virus de Epstein-
Barr.
o Entre las bacterias:
• Mycobacterium tuberculosis
• Neisseria gonorrhoeae
• Chlamydia trachomatis
MICROBIOLOGÍA
IDEAS CLAVE
• Diagnóstico microbiológico: microscópico, cultivos,

molecular y serológico.
• Estudio microbiológico de las infecciones: demostrar la
presencia del microorganismo responsable (directo) o una
respuesta inmunitaria del huésped frente al microorganismo
responsable (indirecto)
• Diagnóstico bacteriológico directo: Visualizar el
microorganismo, detectar sus productos (antígenos, genoma,
etc.). Aislarlo, identificarlo, estudiar su sensibilidad a los
antimicrobianos.
• Diagnóstico bacteriológico indirecto: Detectar respuesta
inmunitaria específica, dos muestras de suero (seroconversión)
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DIAGNÓSTICO

D. Como ayuda para controlar

 La detección e identificación de los microorganismos

 Antes de instaurar el tratamiento antibiótico.

 Muestras de secreciones: de ojos, oído, nariz, faríngeas,

- A veces son procesados en la cabecera del paciente.

Cuando hay dudas sobre la obtención, el transporte o el

 Examen microscópico directo: microorganismos de mayor

2.1. Detección de antígeno:

3.1. Medios líquidos/sólidos

4.1. Identificación provisional: por la forma, tinción de

4.2. Identificación definitiva: métodos bioquímicos

= Detección de respuesta inmunitaria del huésped.

Inmunoanálisis para anticuerpos y

 Pruebas de difusión (6 a 18 horas):

Las técnicas genéticas se utilizan para:

La mayoría de las técnicas se pueden adscribir a dos grupos:

En ambos casos en primer lugar deben extraerse los

 Al calentar el DNA por encima de 90ºC, las dos cadenas se

Se repetirán nuevos ciclos hasta conseguir millones de copias, proceso

PCR a tiempo real:

Las técnicas de amplificación comercializadas se

• Diagnóstico microbiológico: microscópico, cultivos,

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