CENTRO BACHILLERATO TECNOLÓGICO

DR. CARLOS SOSA MOSS, JUCHITEPEC

TECNICO LABORATORISTA QUIMICO

MODULO III: EJECUTA METODOS DE ANALISIS

QUIMICOS, CUANTITATIVOS Y MICROBIOLOGICOS
SUBMODULO III: EMPLEA TECNICAS DE
CUANTIFICACION DE MICROORGANISMOS

MAESTRA: LISSI YOLANNY AREVALO REYES

NOMBRE DE Los Alumnos:

Leilani Yamilet García Villalba
JONATHAN JOSUE GUZMAN RODRIGUEZ
Valeria Peñaloza Bustamante
Martin Alejandro Pérez Aguilar
Dulce maría Pichardo calvo
CUARTO SEMESTRE
2.5
Metabolismo microbiano
La vida en la Tierra es posible gracias a la gran diversidad microbiana (Capello,
2000). Esta diversidad microbiana se puede traducir en diversidad metabólica. Los
microorganismos procariontes y eucariontes realizan el mismo metabolismo
básico, sin embargo, la diversidad recae en las formas de generar energía y en los
metabolitos secundarios que estos secretan (Kenneth,2008).

Cuando hablamos de metabolismo nos referimos a la suma de reacciones

bioquímicas necesarias para generar energía y al uso de esa energía para
sintetizar el material celular a partir de pequeñas moléculas en el ambiente. El
metabolismo contiene un componente generador de energía llamado catabolismo
y un componente biosintético consumidor de energía llamado anabolismo. Las
vías o reacciones catabólicas producen energía como ATP la cual es utilizada en
las reacciones catabólicas para la síntesis de material celular a partir de nutrientes
en el ambiente (Kenneth,2008).

El conocimiento de esta diversidad microbiana y sus metabolitos derivan en

aplicaciones biotecnológicas. Los microorganismos como herramientas
biotecnológicas tienen una gama infinita de posibilidades industriales, agrícolas,
alimentarias, ambientales y para la salud, ya sea que utilicemos la entidad celular
completa o los metabolitos producidos por estas.

En los probióticos podemos ver el uso de los organismos completos, y en el caso

de los metabolitos tenemos la producción de aminoácidos aditivos alimentarios. La
producción de nuevos antibióticos, vacunas, interferones y otros agentes
terapéuticos, son producto de la tecnología aplicada de estos microorganismos.
En el caso de la agricultura también vemos el impacto en el desarrollo de
bioinsecticidas, biofungicidas, para control biológico. La biorremediación del suelo
o el tratamiento de aguas residuales por consorcios microbianos son un claro
ejemplo de aplicaciones ambientales. La proyección de las biotecnologías en
todas las facetas de la vida humana, dependerá del ingenio de cada biotecnólogo,
no teniendo limite en cuanto a posibilidades, por lo que el comprender el
metabolismo microbiano es fundamental para la aplicación de nuevas alternativas
tecnológicas

Metabolismo energético en microorganismos de interés

industrial.
Las bacterias son los organismos más pequeños que tienen la maquinaria
requerida para el crecimiento y la replicación. Están compuestas, como las células
eucariotas, por proteínas, polisacáridos, lípidos, ácidos nucleicos, entre otros.
Estas macro-moléculas pueden formar parte de estructuras celulares más
complejas, como la pared celular y la membrana plasmática. El crecimiento
bacteriano se define como el aumento ordenado de todos los constituyentes
químicos de la célula. Es un proceso complejo que supone la replicación de todas
las estructuras y componentes celulares a partir de nutrientes exógenos. El
conocimiento de la fisiología y del metabolismo bacteriano tiene algunas
aplicaciones prácticas. En principio permite conocer el modo de vida y el hábitat
de diferentes especies bacterianas. El ser humano actuando como huésped,
ofrece una variedad de nichos ecológicos que se diferencian entre sí por aspectos
físicos y químicos (temperatura, concentración de oxígeno, pH, presión osmótica,
etc.), en los cuales pueden crecer y multiplicarse distintas especies bacterianas
según sus requerimientos nutricionales, ambientales y atmosféricos. Además,
permite formular medios de cultivo para el aislamiento e identificación de los
patógenos participantes. Desde un enfoque terapéutico, nos permite conocer y
entender el modo de acción de algunos antibióticos que bloquean una vía
metabólica o la síntesis de alguna macromolécula esencial para la bacteria. El
término metabolismo se refiere al conjunto de reacciones químicas que se
producen en la célula y tiene tres funciones específicas. La primera es obtener
energía química del entorno y almacenarla, para luego usarla en diferentes
funciones celulares. La segunda es convertir los nutrientes exógenos en unidades
precursoras de los componentes macromoleculares de la célula bacteriana. Y la
tercer función es formar y degradar moléculas necesarias para cumplir funciones
celulares específicas, por ejemplo: movilidad y captación de nutrientes. El
metabolismo se produce por secuencias de reacciones catalizadas
enzimáticamente y se divide en anabolismo y catabolismo. El proceso por el cual
la célula bacteriana sintetiza sus propios componentes se conoce como
anabolismo y resulta en la producción de nuevo material celular; también se
denomina biosíntesis. La biosíntesis es un proceso que requiere energía, por lo
tanto las bacterias deben ser capaces de obtenerla de su entorno para crecer y,
eventualmente, multiplicarse. El conjunto de reacciones degradativas de los
nutrientes para obtener energía o para convertirlos en unidades precursoras de la
biosíntesis, se conoce como catabolismo. Así, hemos visto dos tipos de
transformaciones químicas que ocurren simultáneamente en la bacteria, por lo
tanto el metabolismo es el resultado colectivo de ambas reacciones.
Metabolismo productor de energía
En los seres vivos, la utilización de la energía potencial contenida en los nutrientes
se produce por reacciones de oxidación reducción. Químicamente la oxidación
esta definida por la pérdida de electrones y, la reducción por la ganancia de los
mismos. En bioquímica, estas reacciones frecuentemente incluyen también la
transferencia de átomos enteros de hidrógeno, por lo tanto se conocen con el
nombre de reacciones de deshidrogenación. En las reacciones de este tipo hay
sustancias que ceden electrones (dadoras) y otras que los aceptan (aceptoras).
En las bacterias de interés médico los sistemas de oxidación reducción
transforman la energía química de los nutrientes en una forma biológicamente útil;
dichos procesos incluyen la fermentación y la respiración. En la primera, tanto la
molécula dadora como la aceptora de electrones, son compuestos orgánicos. En
cambio, en la respiración hay un aceptor final exógeno, que cuando es el oxígeno
se denomina respiración aerobia y cuando es un compuesto inorgánico,
respiración anaerobia. FERMENTACIÓN En ésta los electrones pasan del dador,
un intermediario formado durante la degradación del substrato, hacia un aceptor
constituido por algún otro intermediario orgánico también generado durante el
catabolismo del substrato inicial. Por lo tanto, este proceso de oxidación reducción
no requiere el aporte exógeno de un aceptor final de electrones. Aunque hay
distintos tipos de fermentaciones, todas llevan a una oxidación parcial de los
átomos de carbono del substrato inicial y liberan, por lo tanto una pequeña parte
de la energía potencial contenida (Ver figura 1). El rendimiento energético de este
proceso es menor que el de la respiración. En las bacterias se encuentran las tres
vías centrales del metabolismo intermediario de los hidratos de carbono: la
glucolítica o de Embden Meyerhof Parnas, la de pentosa fosfato o shunt de las
pentosas y la de Entner-Doudoroff. La vía glucolítica que degrada la glucosa se
divide en tres etapas principales. La primera es preparativa, con reacciones que
no son de oxidación reducción, sin liberación de energía y con formación de dos
intermediarios de tres átomos de carbono cada uno. En la segunda etapa, sí
ocurren reacciones de oxidación reducción con liberación de energía, formación
de ATP por fosforilación a nivel del substrato (el ATP se genera en un paso
enzimático específico) y producción de dos moléculas de piruvato. En la tercer
etapa, nuevamente ocurren reacciones de oxidación reducción y se generan los
productos finales de la fermentación, que varían según la bacteria en cuestión.
Solo una pequeña parte de la energía libre que potencialmente puede derivar de la
degradación de una molécula de glucosa queda disponible por esta vía, dado que
los productos finales son compuestos en los que el carbono se encuentra todavía
en estado reducido.
Por cada molécula de glucosa que entra a esta vía, se forman cuatro moléculas de
ATP y como se consumen dos en la primer etapa, el balance neto es de dos
moléculas de ATP por cada molécula de glucosa fermentada. El destino final del
metabolito clave, el piruvato, depende de los procesos empleados para la
regeneración del dinucleótido de nicotinamida adenina (NAD) a partir del
dinucleótido de nicotinamida adenina reducido (NADH) y así mantener el equilibrio
de oxidación reducción. Aunque la vía glucolítica es la más importante en las
células eucariotas y procariotas, no es la única. La vía de las pentosas es una ruta
multifuncional para la degradación de hexosas, pentosas y otros hidratos de
carbono. Para los fermentadores heterolácticos es la principal fuente productora
de energía, aunque la mayoría de las bacterias usan esta vía como fuente de
dinucleótido de nicotinamida adenina fosfato reducido (NADPH) y de pentosas
para la síntesis de nucleótidos. La vía de Entner-Doudoroff es la ruta principal para
la degradación de la glucosa en las bacterias aerobias estrictas como Neisseria y
Pseudomonas. Como sucede en la vía de las pentosas, aquí solo se produce una
molécula de ATP por molécula de glucosa degradada. El ácido pirúvico derivado
de la glucosa, es un compuesto clave en el metabolismo fermentador de los
hidratos de carbono. En su formación, el NAD es reducido a NADH y éste debe
oxidarse nuevamente a NAD para alcanzar el equilibrio final de oxidación
reducción. Las bacterias se diferencian de las células eucariotas por la forma en
que eliminan el piruvato; en las bacterias la oxidación incompleta es la regla y se
acumula gran cantidad de metabolitos finales de la fermentación. El estudio y el
conocimiento de las fermentaciones bacterianas tiene importancia práctica, porque
proporciona productos industriales que son útiles en el laboratorio para identificar
las diferentes especies. Entonces, según los productos finales, tenemos diferentes
tipos de fermentación: alcohólica, homoláctica, heteroláctica, del ácido propiónico,
ácido mixta, de butanodiol y del ácido butírico.
 Fermentación alcohólica
Es el tipo de fermentación más antigua que se conoce. Produce etanol a
partir de glucosa. Aunque ciertas bacterias producen alcohol, éste es
elaborado por otras vías.
 Fermentación homoláctica
Todos los miembros del género Streptococcus, Pediococcus y muchas
especies de Lactobacillus fermentan la glucosa fundamentalmente a ácido
láctico con poca acumulación de otros productos finales. En esta reacción
el piruvato se reduce a ácido láctico por acción del enzima láctico
deshidrogenasa, actuando el NADH como dador de electrones. Esto ocurre
en la tercera etapa de la vía glucolítica.
 Fermentación heteroláctica
En este tipo de fermentación solo la mitad de la glucosa se convierte en
ácido láctico, el resto se transforma en una mezcla de anhídrido carbónico
(CO2), ácido fórmico, ácido acético, etc. En esta fermentación se emplea
 fundamentalmente la vía de las pentosas y se produce en las bacterias del
género Leuconostoc y Lactobacillus.
 Fermentación del ácido propiónico
Es característica de algunas bacterias anaerobias como el
Propionibacterium (bacilo grampositivo, no esporulado). Este tipo de
fermentación tiene la ventaja de que genera una molécula más de ATP.
 Fermentación ácido mixta
Es característica de la mayoría de las enterobacterias. Bacterias como
Shigella, Salmonella y E. coli fermentan las hexosas a través del piruvato a
ácido láctico, ácido acético, ácido succínico y ácido fórmico.
 Fermentación de butanodiol
Varias bacterias como Enterobacter, Serratia y Bacillus producen 2,3-
butanodiol durante la fermentación de la glucosa. Esta deriva de la
condensación de dos moléculas de piruvato en una molécula neutra de
acetoína que luego es reducida a 2,3-butanodiol.
 Fermentación del ácido butírico
Se ve en bacterias del género Clostridium (bacilo grampositivo, anaerobio y
esporulado). Si bien hasta ahora nos hemos referido solo a la fermentación
de hidratos de carbono como procedimiento para obtener energía, debemos
destacar que otros compuestos orgánicos pueden ser fermentados, por
ejemplo: aminoácidos (alanina, glicina). En Clostridium proteolíticos, la
fermentación de aminoácidos más característica es la reacción de
Stickland.
Anteriormente hemos discutido el metabolismo de los hidratos de carbono en
ausencia de un aceptor externo de electrones y hemos visto que solo una
pequeña parte de la energía potencial contenida en el substrato es liberada. Esto
se debe a que la diferencia entre los potenciales de oxidación reducción entre la
molécula dadora inicial y la aceptora final es muy pequeña. Otras bacterias tienen
la capacidad de oxidar completamente el substrato inicial a CO2 por el proceso
conocido como respiración. RESPIRACIÓN Es el proceso por el cual un substrato
es oxidado completamente a CO2 y agua, con participación de una cadena de
electrones ubicada en la membrana plasmática, en la cual el aceptor final es el
oxígeno molecular u otro compuesto inorgánico (nitratos, sulfatos, anhidrido
carbónico, etc.)–anaerobia–. Los primeros pasos en la respiración de la glucosa
son idénticos a los de la glucólisis, pero mientras en esta última el piruvato es
convertido en productos finales de la fermentación (ácido láctico, ácido propiónico,
etc.), en la respiración es oxidado completamente a CO2 mediante el ciclo de
Krebs (ver figura 2). Por cada molécula de piruvato oxidada en este ciclo, se
generan tres moléculas de CO2 . Al igual que en la fermentación, los electrones
generados en el ciclo de Krebs, pasan a coenzimas que tienen NAD. Sin embargo,
en la respiración aerobia, los electrones del NADH son transferidos al oxígeno
para regenerar NAD a través de un sistema transportador, en lugar de cederlos al
piruvato. SISTEMAS TRANSPORTADORES DE ELECTRONES Y GENERACIÓN
DE TRIFOSFATO DE ADENOSINA Estos sistemas están compuestos por
transportadores (carriers) de electrones, asociados a la membrana plasmática y
tienen dos funciones básicas: aceptar electrones de un donador y cederlos a un
aceptor y conservar energía liberada durante ese transporte en forma de ATP por
fosforilación oxidativa. Existen varios tipos de enzimas de oxidación reducción y
proteínas transportadoras de electrones, entre los que se destacan las NAD-
deshidrogenasas, las flavoproteínas y los citocromos. Las flavoproteínas contienen
un derivado de la riboflavina como grupo prostético que se reduce y se oxida
alternativamente. La riboflavina, conocida como vitamina B2, es necesaria como
factor de crecimiento por algunas bacterias. Los citocromos son proteínas que
tienen anillos porfirínicos con hierro y también se oxidan y se reducen
alternativamente. Hay diferentes tipos de citocromos que se distinguen por sus
potenciales de reducción. Se los designa con letras a, b, c, etc. También están las
quinonas, sustancias liposolubles relacionadas con la vitamina K, que participan
en el transporte de electrones. Para entender como se genera el ATP durante el
transporte de electrones, debemos recodar su orientación con respecto a la
membrana plasmática de la célula bacteriana. La cadena está ubicada como ya
dijimos en la membrana plasmática, de tal modo que durante el proceso de
transporte hay una separación física entre protones y electrones. Los protones
quedan fuera de la célula, mientras que los electrones quedan dentro de ésta; en
consecuencia se genera un gradiente de pH y un potencial eléctrico a través de la
membrana plasmática, estando el lado externo ácido y cargado positivamente y el
interno alcalino y cargado negativamente. A pesar de su tamaño pequeño, ni los
hidrogeniones, ni los hidróxidos atraviesan libremente la membrana; por lo tanto,
el equilibrio no puede establecerse espontáneamente. Dicho estado energético de
la membrana plasmática, similar a una batería, puede ser usado por la célula para
realizar un trabajo útil, por ejemplo, movilidad o síntesis de ATP. Para la síntesis
de ATP un componente fundamental del proceso es una ATPasa de membrana;
enzima que cataliza la reacción reversible entre difosfato de adenosina (ADP) y
ATP. Operando en una dirección y usando el gradiente de protones generado
durante el transporte, dicha enzima cataliza la formación de ATP a partir de ADP y
fosfato inorgánico. Existe una variedad de agentes químicos llamados
desacopladores que inhiben la síntesis de ATP durante el transporte de electrones
sin alterar el propio proceso de transporte. Ejemplos de estos agentes son el
dicumarol y el dinitrofenol. Son sustancias liposolubles que impiden la formación
del gradiente de pH y el eléctrico, favoreciendo el pasaje de protones a través de
la membrana; de este modo inhiben la síntesis de ATP. La polimixina B (un
antibiótico) se adhiere específicamente a la superficie externa de la membrana,
alterando su estructura y propiedades osmóticas. Se produce entonces la pérdida
de metabolitos y la inhibición de algunos procesos bioquímicos que tienen lugar a
ese nivel, como el transporte de electrones y la síntesis de ATP, entre otros. Otras
sustancias, por ejemplo: cianuro o azida de sodio, bloquean el propio sistema de
transporte y se denominan inhibidores. Tanto los desacopladores como los
inhibidores son venenos celulares que actúan en células eucariotas y procariotas

 Ciclo de Krebs
BALANCE ENERGÉTICO DE LA RESPIRACIÓN
El resultado neto de las reacciones del ciclo de Krebs es la oxidación completa del
piruvato a CO2 con formación de cuatro moléculas de NADH y una de dinucleótido
de flavinadenina (FADH). El NADH y el FADH pueden ser oxidados nuevamente
por el sistema transportador de electrones. Un total de 15 moléculas de ATP son
sintetizadas en cada vuelta del ciclo, por lo tanto, dado que cada molécula de
glucosa rinde dos de piruvato, 30 moléculas de ATP son sintetizadas por cada
molécula de glucosa que entra al ciclo de Krebs (ver figura 3). Esto, sumado a las
seis moléculas de la reoxidación del NADH y las dos del vía glucolítica, da un total
de 38 moléculas de ATP por molécula de glucosa respirada. Además de sus
funciones como mecanismo generador de energía, el ciclo de Krebs sirve como
productor de metabolitos claves para la biosíntesis. La reducción del oxígeno
forma radicales libres que son muy tóxicos para la bacteria. Entre los más
importantes se encuentra el superóxido. Éste es eliminado por las bacterias
aerobias y tolerantes del oxígeno, por la enzima superoxidodismutasa que cataliza
la formación de peróxido de hidrógeno, también tóxico. El peróxido de hidrogeno
es degradado por enzimas como catalasa y la peroxidasa, a oxígeno

 Glucólisis
molecular y agua. Estas enzimas están ausentes en las bacterias anaerobias
estrictas, explicando en parte la susceptibilidad que tienen al oxígeno. En las
bacterias aerobias obligadas, el oxígeno es el aceptor final de electrones. Sin
embargo, las bacterias anaerobias facultativas pueden usar, en ausencia de
oxígeno, otros compuestos inorgánicos como aceptores finales de electrones, por
ejemplo: nitrato, fumarato, sulfato, etc.
REGULACIÓN DEL METABOLISMO
Cada reacción metabólica está regulada no solo con respecto a otras reacciones,
sino también con respecto a la concentración de nutrientes en el medio. La
regulación se realiza a diferentes niveles: en la actividad enzimática y en la
síntesis de las enzimas. En la primera, regulación de la actividad enzimática, se
produce: activación de enzimas alostéricas, inhibición por retroalimentación,
activación alostérica y cooperatividad. La inducción enzimática y la represión por
productos finales, son mecanismos de regulación de la síntesis de enzimas. En las
bacterias anaerobias facultativas la fermentación (como única vía de producción
de energía) es bloqueada en presencia de oxígeno, asegurando que el suministro
de energía se produzca por respiración, que consume menos glucosa y acumula
menos lactato. En este fenómeno denominado efecto Pasteur, la enzima
fosfofructoquinasa es activada o inhibida según la relación entre el ATP y el ADP,
regulando así el consumo de glucosa. Este es un ejemplo de regulación de la
actividad enzimática por una enzima alostérica. El ejemplo clásico de regulación
de la síntesis de enzimas lo constituye el operón lactosa. Hay tres enzimas que
participan en la utilización de la lactosa (ß-galactosidasa, galactósido permeasa y
galactósido transacetilasa), las cuales tienen un promotor único. En ausencia de
lactosa, la transcripción para estas enzimas está bloqueada por un represor que
se une al promotor inhibiendo la acción de la ARNpolimerasa. Cuando se agrega
lactosa al medio, ésta se une al represor, bloqueando de este modo su unión al
promotor y permitiendo la acción de la ARNpolimerasa y la síntesis de las tres
enzimas anteriormente mencionadas.
Crecimiento bacteriano
Puede ser definido como el aumento ordenado de todos los constituyentes
químicos de la célula. Las condiciones físicas y químicas del medio donde el
microorganismo se encuentra afectan marcadamente sus actividades. La
comprensión de como influye el ambiente sobre el crecimiento nos ayuda a
explicar la distribución de los microorganismos en la naturaleza y hace posible
diseñar estrategias que favorezcan el crecimiento o que nos permita controlarlo.
Las bacterias como grupo, son extremadamente versátiles y tienen gran
capacidad para utilizar una amplia gama de nutrientes que van desde compuestos
inorgánicos simples, a compuestos orgánicos más complejos. Los nutrientes se
pueden dividir en dos clases: esenciales, sin los cuales la célula no puede crecer y
no esenciales, se usan cuando están presentes pero no son indispensables.
Algunos nutrientes son usados solo como precursores de macromoléculas
celulares, otros solo como fuente de energía sin ser incorporados directamente al
material celular y otros cumplen las dos funciones al mismo tiempo. También se
pueden clasificar como macro y micronutrientes según la cantidad requerida.

MACRONUTRIENTES
 El carbono es el mayor constituyente de la célula bacteriana, por lo tanto no llama
la atención que requiera más carbono que cualquier otro nutriente. Según la forma
en que lo usa, existen fundamentalmente dos tipos de bacterias: autótrofas y
heterótrofas. Las primeras son capaces de sintetizar todos sus componentes
orgánicos a partir de compuestos inorgánicos como el CO2 . Como ejemplo de
este grupo citamos las bacterias del suelo, que carecen de interés médico. En
cambio, las heterótrofas usan sustancias orgánicas como fuente de carbono. En
este grupo se encuentran todas las bacterias de interés médico. La glucosa, por
ejemplo, es usada como fuente de carbono y de energía. También existen
bacterias que pueden usar otras sustancias orgánicas como fuente parcial o
exclusiva de carbono. Entre las bacterias más versátiles se encuentran las del
género Pseudomonas, muchas de las cuales pueden usar más de cien
compuestos orgánicos. Después del carbono, el elemento más abundante en la
célula es el nitrógeno que representa entre el 12 y el 15% del peso seco. Es el
constituyente principal de las proteínas y los ácidos nucleicos. La mayoría de las
bacterias son capaces de usar el amonio como fuente de nitrógeno, mientras que
otras pueden usar los nitratos. La reducción de nitratos, se puede lograr por dos
mecanismos diferentes: reducción asimiladora, en la cual se reduce por la vía del
nitrito y reducción desasimiladora, donde el nitrato sirve como aceptor final de
electrones. La primera está bastante extendida entre las bacterias, mientras que la
segunda solo es común en bacterias anaerobias y anaerobias facultativas. El
fósforo es usado para la síntesis de ácidos nucleicos y de fosfolípidos. La mayoría
de las bacterias lo usan en forma inorgánica como fosfato (PO4=). Los fosfatos
orgánicos si bien están distribuidos ampliamente en la naturaleza, para ser usados
deben ser atacados primero por fosfatasas, enzimas que clivan estos compuestos
liberando el fósforo inorgánico.
MICRONUTRIENTES
Aunque requeridos en cantidades muy pequeñas, los micronutrientes son
importantes para la nutrición de la bacteria. Entre estos destacamos el cobalto, el
cobre y el manganeso.
FACTORES DE CRECIMIENTO
Son sustancias que deben ser aportadas preformadas, porque la bacteria que los
requieren no pueden sintetizarlos a partir de los nutrientes ya sea por falla o
ausencia de una vía metabólica determinada. Estas sustancias incluyen vitaminas
del complejo B, aminoácidos, purinas y pirimidinas. Las bacterias que no necesitan
factores de crecimiento, se denominan prototróficas y, las que sí los requieren,
auxotróficas para ese factor.
REQUERIMIENTOS ATMOSFÉRICOS Y AMBIENTALES Oxígeno
Las exigencias de oxígeno de una bacteria en particular, reflejan el tipo de
metabolismo pro ductor de energía. Según su relación con el oxígeno, existen
bacterias: anaerobias obligadas, anaerobias facultativas, aerobias obligadas y
microaerófilas. De las primeras (anaerobias obligadas), existen las estrictas y las
aerotolerantes. Las bacterias anaerobias obligadas estrictas, crecen en ausencia
de oxígeno, el cual es muy tóxico e incluso letal cuando la exposición es breve.
Las segundas (aerotolerantes) también crecen solo en ausencia de oxígeno, pero
toleran su presencia un poco más que las anteriores; por ejemplo: Clostridium sp.
Las bacterias anaerobias facultativas, son capaces de crecer en presencia o en
ausencia de oxígeno. Ejemplo de éstas son las bacterias de la familia
Enterobacteriaceae. Las aerobias obligadas, requieren oxígeno para su desarrollo.
Dentro de este grupo se encuentran la Pseudomonas. Por último, las
microaerófilas crecen mejor con presiones de oxígeno bajas (3 a 5%); las
concentraciones altas (21%) inhiben su crecimiento. En las bacterias aerobias,
anaerobias facultativas y anaerobias aerotolerantes, la enzima
superoxidodismutasa impide la acumulación del radical superóxido; esta enzima
está ausente en los anaerobios estrictos. El peróxido de hidrógeno formado por la
acción de la superoxidodismutasa es destruido con rapidez por la enzima catalasa
o peroxidasa, como ya se mencionó. En el laboratorio de microbiología los
requerimientos atmosféricos de oxígeno, pueden determinarse cultivando la cepa
en caldo tioglicolato. Este medio contiene muchos nutrientes, siendo un caldo de
enriquecimiento apropiado para casi todas las bacterias de interés médico. El
ácido tioglicólico actúa como agente reductor que disminuye el potencial redox del
medio, generando un gradiente de concentración de oxígeno a lo largo del tubo.
En la superficie del medio, la concentración es similar a la atmosférica y va
disminuyendo gradualmente hasta que en el fondo del tubo no existe oxígeno
disuelto. Las bacterias aerobias estrictas podrán crecer en la superficie del caldo,
las microaerófilas crecerán en la franja inmediata que está debajo de la superficie.
Las anaerobias facultativas crecerán en todo el tubo, mientras que las anaerobias
lo harán en el fondo del mismo.
Anhídrido carbónico
Algunas bacterias como Neisseria y la Brucella, tienen muchas enzimas con baja
afinidad por el CO2 y requieren una concentración más elevada (10%) de la que
habitualmente está presente en la atmósfera (0.03%). Estos requerimientos
atmosféricos mencionados deben ser tenidos en cuenta cuando se realiza el
cultivo de estas bacterias.
Potencial de oxidación reducción
Es un requerimiento físico del medio de cultivo. Éste es un factor crítico para
determinar si se desarrollará o no el inoculo sembrado en dicho medio. Para la
mayoría de los medios de cultivo en contacto con el aire, el potencial de oxidación
reducción es de +0,2 a +0,4V, a pH 7. Las bacterias anaerobias obligadas son
incapaces de crecer a menos que el potencial sea tan bajo como -0,2V. Para
establecer dichas condiciones en un medio de cultivo se puede eliminar el
oxígeno, recurriendo a sistemas de cultivo anaerobio o agregando al propio medio
compuestos que contengan sulfidrilo, por ejemplo, el tioglicolato de sodio.
Temperatura
Es uno de los factores ambientales más importantes que influyen en la
proliferación y mantenimiento de la vitalidad de los microorganismos. Cada
bacteria tiene su propia temperatura mínima por debajo de la cual no puede
proliferar, temperatura óptima en la cual el crecimiento es mas rápido y
temperatura máxima por encima de la cual no puede multiplicarse. Así, es posible
distinguir tres grupos de microorganismos según el rango de temperatura en el
que es posible su multiplicación: psicrófilas, crecen entre -5 y 30ºC, temperatura
óptimo de 15ºC; mesófilas, crece entre 10 y 45ºC, con el óptimo a los 30ºC y
termófilas, que crecen entre 25 y 80ºC, con el óptimo en 55ºC. En el laboratorio se
puede determinar la temperatura óptima de crecimiento, sembrando el
microorganismo en estudio en un medio de cultivo adecuado e incubándolo a
diferentes temperaturas, para después evaluar los rendimientos obtenidos en las
distintas condiciones. Si bien la mayoría de los microorganismos de interés medico
son mesófilos, pueden existir diferencias entre las temperaturas de crecimiento
óptimas de los mismos, siendo para la mayoría de 35 a 37ºC.
Concentraciones de hidrógeno
Cada microorganismo tiene un rango de pH en cual puede crecer y un pH óptimo
bien definido. Según en el pH que se obtenga mayor rendimiento, encontramos
microorganismos acidófilos, neutrófilos (la mayoría de interés médico) y alcalófilos,
que crecen bien en pH ácidos, neutros y alcalinos respectivamente. Para la
mayoría de las bacterias de interés médico, el pH óptimo es de 7,2 a 7,6. Sin
embargo, hay microorganismos humanos como M. tuberculosis que resisten
valores muy bajos de pH. Como los microorganismos al multiplicarse y realizar sus
funciones metabólicas, suelen modificar el pH del medio, éste puede prepararse
con amortiguadores de pH (buffer), los cuales mantiene el pH relativamente
constante.
Condiciones osmóticas y disponibilidad de agua
El agua es un requerimiento esencial para todo ser vivo y la disponibilidad de ésta
es un factor importante que afecta el crecimiento de los microorganismos en sus
ambientes naturales. Esta disponibilidad no depende solamente del contenido de
agua que haya en el ambiente, porque algunas sustancias y superficies pueden
absorber moléculas de agua y por consiguiente reducir la disponibilidad en el
ambiente. Las sales y los azúcares disueltos en agua, condicionan la
disponibilidad de la misma porque las moléculas de agua se asocian y no quedan
disponibles para ser usadas por los microorganismos. La disponibilidad de agua
se expresa generalmente como actividad acuosa o potencial de agua.
Generalmente los microorganismos se encuentran en ambientes con menor
cantidad de solutos que en el interior celular, por lo tanto el agua tiende a entrar a
la célula por osmosis. Por el contrario, si se encuentran en medios de baja
actividad acuosa, el agua tenderá a salir de la célula, por lo tanto perderá agua.
Así, encontramos microorganismos que pueden crecer en altas concentraciones
salinas (halófilos) como las que están en el agua de mar, en altas concentraciones
de azúcar (osmófilos) como las que hay en una jalea o en ambientes muy secos
(xerófilos). Estos generalmente captan agua de dichos ambientes, gracias a las
altas concentraciones de solutos en su interior. La concentración de solutos con
actividad osmótica dentro de la célula bacteriana es superior a la concentración
del exterior celular. Con excepción de las bacterias del género Mycoplasma y de
las formas lister (L) que no tienen pared celular, la mayoría de las bacterias tienen
tolerancia osmótica que les permite soportar grandes cambios de osmolaridad.
Captación de nutrientes
La concentración de solutos en el interior de una célula bacteriana es mayor que
en el medio extracelular. Esto es aplicable tanto al medio natural como a la
mayoría de los medios de cultivo usados en el laboratorio. La principal barrera
para el paso de solutos entre la célula y el medio externo es la membrana celular.
Las bacterias están rodeadas de membranas semipermeables, compuestas por
una mezcla compleja de proteínas, lípidos y glucoproteínas, que restringen el
ingreso de la mayoría de los solutos. Sin embargo, tienen sistemas que permiten
el transporte de sustancias pequeñas a través de dichas membranas. Las
moléculas de mayor tamaño primero deben ser degradadas a moléculas más
pequeñas por enzimas (exoenzimas) producidas por la propia bacteria y
secretadas al exterior celular. En las bacterias gramnegativas estas exoenzimas
se encuentran fundamentalmente en el espacio periplásmico (espacio virtual
ubicado entre la membrana externa y la membrana plasmática), mientras que en
las bacterias grampositivas están ancladas en la membrana plasmática. Dichas
enzimas son activas sobre: proteínas, polisacáridos, lípidos y ácidos nucleicos,
entre otros. Bacterias como S. aureus, S. pyogenes, y C. perfringens, elaboran
algunas de estas enzimas que contribuyen a la virulencia, destruyendo los
componentes vitales de los tejidos del huésped infectado. Pueden ser constitutivas
(se sintetizan siempre) o inducibles (se sintetizan solo cuando está presente su
substrato). Con excepción del agua y el amonio que ingresan a la célula por
difusión pasiva en respuesta a un gradiente de concentración a ambos lados de la
membrana, el resto de los metabolitos lo hacen por sistemas de transporte más
específicos. Tanto las porinas, como los canales de maltosa, no requieren
consumo de energía. Los primeros son sistemas inespecíficos que permiten el
ingreso de moléculas pequeñas (peso molecular menor o igual a seis mil dalton).
Las porinas son proteínas ubicadas en la membrana externa de las bacterias
gramnegativas, que forman canales o poros permitiendo el pasaje de las
moléculas pequeñas e hidrofílicas. En la difusión facilitada, una proteína asociada
a la membrana celular facilita el equilibrio a ambos lados de la misma, actuando
en conjunto con una quinasa citoplasmática dependiente de ATP. Estas proteínas
de membrana se denominan permeasas y muchas son inducidas por el substrato
a ser transportado. Cuando la sustancia es fosforilada por la quinasa
citoplasmática, queda atrapada dentro de la célula. La difusión facilitada se parece
a la difusión simple, porque el substrato se mueve por un gradiente de
concentración (de mayor a menor), por lo tanto el propio proceso de transporte no
requiere energía. La diferencia que tiene con la difusión pasiva, es que está
mediada por una proteína transportadora, es más rápida y tiene mayor
especificidad de substrato. El transporte activo permite que los solutos ingresen a
la célula en contra de un gradiente de concentración, consumiendo energía
metabólica. Como ejemplo citaremos al sistema de la ß-galactósido permeasa,
mediante el cual la lactosa (disacárido) es concentrado dentro de una bacteria
como E. coli. El transporte de la lactosa se produce por una permeasa específica
(proteína M); dicha reacción implica gasto de energía. La energía se usa para
disminuir la afinidad de la permeasa por la lactosa en la parte interna de la
membrana celular, favoreciendo su rápida liberación dentro del citoplasma. Si la
generación de energía es bloqueada por el agregado de azida de sodio al sistema,
la permeasa cataliza la difusión facilitada de la lactosa, cesando el transporte
cuando la concentración del disacárido sea la misma a ambos lados de la
membrana. En medios aerobios y a pH neutro, la baja concentración de hierro no
permite alcanzar un desarrollo óptimo. Las bacterias han desarrollado varios
sistemas para obtener cantidades adecuadas de dicho elemento. Los sideróforos
son ligandos de bajo peso molecular cuya función es suministrar hierro a la célula.
Aunque existe una variación importante en la estructura de los distintos tipos de
sideróforos conocidos, la mayoría son de dos tipos: catecoles: la enterobactina es
la más estudiada; e hidroximatos: producidos por algunos hongos. La
enterobactina es un poderoso quelante que E. coli produce rápidamente cuando
existe déficit de hierro y la secreta al medio externo.
Crecimiento de las poblaciones bacterianas
El paso esencial para iniciar el estudio de una cepa bacteriana, es el cultivo. Este
paso es importante para proveer de una población de bacterias que puedan ser
analizadas mediante pruebas bioquímicas, serológicas, genéticas y de
susceptibilidad a los antibióticos. El cultivo es el proceso de propagación de los
microorganismos en el laboratorio, que se obtiene aportando las condiciones
ambientales adecuadas y los nutrientes necesarios para el crecimiento bacteriano.
Debemos recordar que algunas de las bacterias que causan infecciones en seres
humanos no son capaces de crecer en medios artificiales inertes. Es necesario
conocer cuales son los requisitos básicos de la bacteria en cuestión para su cultivo
en el laboratorio (nutrientes, requerimientos atmosféricos y ambientales), así como
los requisitos del o de los tipos bacterianos que se necesite recuperar. La siembra
de un material que contiene bacterias en un medio sólido adecuado con la técnica
de aislamiento permite, luego de un período adecuado de incubación, la
recuperación de millones de bacterias agrupadas en colonias aisladas. Éstas
pueden ser aisladas nuevamente en un nuevo medio para obtener un cultivo puro.
El crecimiento se define como el aumento del número de bacterias en una
población determinada (ver figura 4). Es importante diferenciar entre el crecimiento
de una célula individual y el de una población. Dicho crecimiento celular es el
resultado del aumento del tamaño de la célula, seguido de su división. El
crecimiento de una población, en cambio, es el resultado del aumento del número
total de células, que puede ser cuantificado directamente (contando el número de
células) o indirectamente (por ejemplo, midiendo la masa celular). El recuento de
células totales puede determinarse por recuento microscópico en una cámara con
áreas de volumen conocido, contando las células por unidades. Este recuento,
considera la totalidad de las células presentes en la muestra (viables y no viables).
Para realizar un recuento de las células viables, es necesario hacer un cultivo en
medio sólido para contar el número de unidades formadoras de colonias (UFC)
presentes en un volumen conocido de la

 Curva de crecimiento bacteriano

muestra. Dicha técnica puede realizarse por siembra en la superficie de un medio
apropiado o por siembra incorporada en agar. El crecimiento de las poblaciones
bacterianas en un sistema de cultivo cerrado (sin entrada ni salida de los
componentes del sistema), está limitado por el agotamiento de los nutrientes o
bien por la acumulación de productos tóxicos del metabolismo. Cuando las
bacterias se siembran en el laboratorio en un medio líquido (por ejemplo en un
tubo de ensayo), se trata de un sistema cerrado de cultivo. Si se toman muestras a
intervalos regulares en diferentes tiempos de incubación y se realiza un recuento
del número de células viables por mililitro de cultivo, la representación gráfica de
los datos (conteo de células viables en función del tiempo) dará la curva de
crecimiento característica que consta de cuatro fases: latencia, exponencial,
estacionaria y muerte.
FASE DE LATENCIA
Las bacterias transferidas de un cultivo en fase estacionaria a un medio fresco,
sufren un cambio en su composición química antes de ser capaces de iniciar la
multiplicación. Hay aumento de los componentes macromoleculares y de la
actividad metabólica, casi sin división celular, asociado a un incremento de la
susceptibilidad a los agentes físicos y químicos. Por lo tanto, la mal llamada fase
de latencia implica intensa actividad metabólica.
FASE EXPONENCIAL
Las células se dividen a velocidad constante, determinada por la naturaleza
intrínseca de la bacteria y por las condiciones del medio. Existe gran aumento del
número total de células viables, que puede ser expresado en forma exponencial.
Próximo al final de esta fase, se produce la liberación de exotoxinas por las
bacterias que las producen.
FASE ESTACIONARIA
Eventualmente el agotamiento de los nutrientes o la acumulación de productos
tóxicos determina el cese del crecimiento. Hay pérdida de células por muerte, la
cual es balanceada por la formación de nuevas células. Cuando esto ocurre, el
conteo total de células aumenta levemente aunque el de las bacterias viables
permanece constante. Hacia el final de esta etapa, puede ocurrir la esporulación
en aquellas bacterias que poseen este mecanismo de resistencia.
FASE DE MUERTE
Luego de la fase estacionaria, la tasa de muerte se incrementa, el número de
bacterias viables disminuye rápidamente y, por lo tanto la curva de crecimiento
declina. Las características de la curva de crecimiento pueden variar, dependiendo
de las características propias del microorganismo, del estado metabólico del
inoculo, del medio de cultivo y de las condiciones de incubación. Las condiciones
físicas y químicas del medio donde el microorganismo crece afectan las
actividades de éstos. La comprensión de cómo influye el ambiente en el
crecimiento, nos ayuda a explicar la distribución de los microorganismos en la
naturaleza y hace posible diseñar métodos que permitan estudiar y controlar el
crecimiento bacteriano. Además, existen sistemas de cultivo abiertos que son
poco usados en el laboratorio de microbiología clínica. El cultivo continuo (con
aporte y salida de nutrientes y requerimientos a una tasa constante), permite
mantener a las bacterias en una misma fase de crecimiento durante un largo
período de tiempo (por ejemplo, en la fase estacionaria o en la exponencial). Dicha
técnica es interesante por ejemplo para los procesos productivos.
Medios de cultivo
 Son una mezcla equilibrada de nutrientes requeridos a concentraciones que
permiten el crecimiento de los microorganismos. Deben contener todos los
nutrientes necesarios en cantidades apropiadas a los requerimientos de los
microorganismos y en condiciones de pH, presión osmótica, oxígeno disuelto, etc.,
adecuados para el crecimiento. Aunque los diferentes microorganismos tienen
distintas propiedades fisiológicas y requerimientos nutricionales, la composición
química de las células es constante en todo el mundo vivo. Los medios más
simples están compuestos por una base mineral se puede suplementar con una
fuente de carbono, de energía, de nitrógeno y con algún factor de crecimiento
requerido. Los medios deben esterilizarse antes de ser usados. Esta esterilización
generalmente se realiza con calor húmedo, pero algunos medios con
componentes sensibles al calor pueden filtrarse. Existen muchos medios con
diferentes utilidades que pueden ser clasificados de la siguiente manera. Según su
consistencia en: líquidos, semisólidos y sólidos. Los medios sólidos son usados
para el aislamiento bacteriano, mientras que los líquidos son útiles para el
enriquecimiento de una población bacteriana de interés. Según su composición:
definidos (de composición química conocida, medios simples) y complejos (con
agregados de sustancias no definidas, por ejemplo extracto de levadura). Según la
cantidad de nutrientes: pobres (por ejemplo el agar simple) y ricos (por ejemplo el
agar sangre). También pueden clasificarse en medios: diferenciales, que permiten
diferenciar algunas propiedades distintivas del grupo bacteriano (por ejemplo el
uso de lactosa en agar CLED); y selectivos, que permiten el desarrollo de algunos
microorganismos pero no de otros (por ejemplo el Mac Conckey para la selección
de bacterias gramnegativas). También existen los medios especiales para el
transporte de muestras o cepas, o aquellos específicos para identificar alguna vía
metabólica determinada. (G. Varela & G. Grotiuz, 2007)