..

TEMA 1. CARACTERíSTICAS GENERALES DE LOS VIRUS

-Parásitos intracelulares obligados formados por dos clases de macromoléculas:

• Acido nucleico: DNA o RNA
• Proteína: envuelta o no de una cubierta membranosa
adicional.

-Alterna entre dos fases:

• Extracelular: cápside+Ácido nucleico= virión
• Intracelular: Ácido nucleico en replicación

- Nucleocápside: ácido nucleico + proteína + membrana (sólo en virus animales)

-Ácido nucleico formado normalmente por:

• DNA de cadena doble circular (virus de animales y
bacterias)
• RNA de cadena sencilla y siempre lineal (virus de
plantas)

-Proteína: cápside (protección AN y interacción con célula huesped)

formada por capsómeros:
• Helicoidales
• Poliédricos
• Mixtos

-Reproducción de ~ os virus:
• Infección:
 ..

• virus animales: adsorción membrana

plasmática huésped (o fusión con membrana
del virus).
• virus plantas: entran por vectores (insectos)
ya que no pueden atravesar la pared celular.
• virus bacterias: el ácido nucleico penetra la
pared celular por inyección.
• Síntesis: el ácido nucleico inicia dos procesos:
• Síntesis de proteínas del virus
• Replicación del ácido nucleico viral
• Maduración: formación de las nucleocápsides
• Liberación: salida de los viriones maduros por lisis
(bacterias) o exocitosis (animales).

-Clasificación de los virus según:

• DNA o RNA de ds o ss
• Con o sin envoltura
• Cápside

-Cultivo de virus:
);- Animales
• Monocapa de células de animales + infección + fina
capa de agar
• Cultivo in vitro de células de tejidos infectados
>- Bacteriófagos
• Infección en medio líquido
• Siembra en agar del medio líquido de bacterias
infectadas
>- Vegetales
• Cultivos de tejido
 • Cultivos celulares
• Protoplastos
• Plantas enteras: frotar con abrasivo la hoja

-Purificación de virus:
• Centrifugación diferencial
• Centrifugación en gradiente
• Precipitación por sulfato amónico
• Desnaturalización por disolventes orgánicos
• Digestión enzimática

-Identificación de los virus:

• Morfología: M. E.
• Ácidos nucleicos: PCR o hibridación
• Proteínas: anticuerpos

-Titulación de los virus:

• Método directo: virus totales (M. E. o partículas de
látex)
• Método indirecto: número infecciones
• Hemaglutinación
• Valoración concentración unidades
infecciosas: unidades formadoras de calvas
(PFU) en cultivos celulares, embriones de
pollo y hojas de plantas.
• Diluciones seriadas

BACTERIÓFAGOS

-Acido nucleico:
 • DNA de cadena doble
• RNA de cadena sencilla

-Cápside:
• Poliédrica (la mayoría)
• Poliédrica unida a una cola helicoidal (fagos Tpares)

FAGOS DNA

-Ciclo lítico de infección:

• Adsorción y penetración:
• Elemento de adsorción o cola Tpares
• Inyección del DNA

• Síntesis de proteínas tempranas:

• Transcripción RNAm temprano
• Traducción RNAm ----. enzimas replicación
de DNA del fago
• Replicación: semiconservativa (múltiples copias de
DNA vírico)
• Maduración:
• Transcripción RNAm tardío
• Traducción RNAm ----. proteínas cápside
• Combinación subunidades de la cápside
sobre el DNA condensado ----. viriones
• Liberación:
• Lisozima: ataca pared celular
• Lisis

-Lisogenia:
 • el genoma viral (profago) se reproduce en sincronía
con el de la célula huésped que produce un clon de
células infectadas. El profago produce un represor que
impide la replicación y maduración del fago.
• lisogenia tipo A:
• ds lineal ---+ circular cuando penetra
• entrecruzamiento DNA viral/cromosoma
bacteriano
• acumulación represor
• I,nmunidad: cultivo lisogénico + fago diferente =

células sobreinfectadas ---+ DNA 2° fago reprimido

FAGOS RNAss

-los ribosomas lo reconocen como RNAm y lo traducen a proteínas (como la RNA

sintetasa que replica el RNA del virus)
-Replicación:
• Formación cadera RNA complementaria (-)
• Otra RNA sintetasa usa la cadena - para sintetizar
muchas cadenas +
• Unión cadenas + a los capsómeros

-Cuantificación de fagos : Agar con bacterias sensibles + suspensión de fagos =

halos de lisis

-Purificación de fagos: cultivo líquido de bacterias + fagos ---+ centrifugación

+ ultracentrifugación.

VIRUS ANIMALES

-Clasificación:
 • Virus de DNA (herpes, viruela, fiebre porcina):
• ds o ss
• con o sin envoltura
• Cápside icosaédrica, compleja o cilíndrica
• 22-400 nm
• Ensamblaje de la cápside: núcleo o citoplasma
• Virus de RNA (rubéola, resfriado común, SIDA, gripe):
• dsoss(+o-)
• con o sin envoltura
• Cápside icosaédrica o helicoidal
• 22-300 nm
• Ensamblaje de la cápside sólo en citoptasma

-Ciclo lítico:
• Adsorción: colisión virión/proteína receptora de la MP:
• Inmunoglobulinas (respuesta inmunitaria)
• Receptores de hormonas
• Penetración y descapsidación:
• Penetración directa: virus desnudos, sólo
liberan al citoplasma el AN.
• Fusión: virus con envoltura (glucoproteínas):
descapsidación en el citoplasma.
• Endocitosis: virus con envoltura.
Descapsidación en los lisosomas.
• Transcripción y Replicación:
• Virus de DNA ds o ss:
o Transcripción RNAm temprano
o Replicación (núcleo)
• Virus RNA ss de cadena +:
o Transcripción: = RNAm
o Replicación (citoplasma): RNA ds (+-)
 • Virus RNA ss de cadena -:
o Transcripción: transcriptasa
o Replicación (citoplasma): RNA ds (+-)
• Virus RNA ds:
o Transcripción: transcriptasa cadena ­
o Replicación (citoplasma): 10-13 RNAm-+
asociación -+ copia por una replicasa
viral -+ genoma bicatenario
• Retrovirus: Transcriptasa inversa RNA-DNA,
Ribonucleasa H degrada el RNA Polimerasa
DNA-DNA -+ circular
o Transcripción: una vez integrado se
transcribe a RNAm
o Replicación: copias del RNA +
• Síntesis y ensamblaje de las cápsides:
o Síntesis prat. tardías de la cápside
o Autoensamblaje
• Liberación:
o Lisis: virus desnudos
o Exocitosis: virus con envoltura

-Infecciones citocidas (muerte celular) y daño celular

• Inhibición de la síntesis de DNA, RNA Y proteínas del
huésped
• Degradación l isosomas
• Inserción de proteínas del virus en las MPs
• Efecto tóxIco
• Cuerpos de inclusión
• Alteraciones cromosómicas
• Transformación en célula maligna
 •

VIRUS VEGETALES

-Dificiles de cultivar y purificar. VMT crece en protoplastos

-Clasificación: = virus animales. La mayoría son de RNA ss o ds.

-Multip~icación :

• Utilizan la RNA polimerasa dependi:ente de RNA de las

plantas
• RNA ss de cadena + no sirve de UNAM
• RNA + capsómeros se ensamblan espontáneamente
(VMT tiene el RNA en el conducto central de la espiral
helicoidal)
• Extensión virus por floema o plasmodesmos

-Daño celular
• Inclusiones de agregados de viriones
• Cloroplastos anormales y degeneran

-Transmisión de los virus vegetales

• Viento/ animales ~ entran cuando hay daño mecánico
• Semillas, tubérculos y polen contaminados
• Nemátodos
• Hongos
• Insectos que se alimentan de plantas (la mayoría)
VIROIDES
-Organismos de RNA ss circular de unos 300 nucleótidosque se localizan en el
núcleo.

-1 nterfi,eren con el metabolismo de la planta

-Transmisión: medios mecánicos o insectos

-Transcri pción : no actúa como RNAm y no codifica proteínas

-Replicación: RNA polimerasa del huésped + propiedades enzimáticas de corte

de RNA largo.

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PRIONES

-Partícula proteínica infecciosa (trastornos degenerativos del sistema nervioso)

-Gen del prión presente en muchos vertebrados e invertebrados normales

-Infección: proteína priónica anormal + proteína normal (encéfalo) =

conformación anormal
 TEMA 2. PROCARIOTAS

-Organismos más antiguos de la tierra, unicelulares, adaptados a cualquier

ambiente terrestre o acuático:
• Gran diversidad metabólica
• Rápida tasa de multiplicación

-Clasificación: tres dominios

• Arquea
• Bacteria
• Eucaria
-Según la obtención de energía:
• Quimiótrofos: compuestos orgánicos
• Fotótrofos: luz
-Según la obtención del carbono:
• Heterótrofos: compuestos orgánicos
• Autótrofos: CO 2
-Según dependencia de oxígeno:
• Aerobios
• Anaerobios

-Características:
• Tamaño: 1-301-1
• Metabolismo celular: gran superficie intercambio--+
metabolismo muy activo --+tasa de duplicación elevada cada
20 mino
• Diversidad: mutaciones ----+ +adaptables.
o Fuentes termales/ aguas heladas
o Ambientes ácidos/ alcalinos
o Ambientes desérticos
• Morfología:
o Cocos
 o Bacilos
o Vibriones
o Espirilos

-Estructura: DNA circular sin membrana nuclear

• Cápsula: cubierta mucilaginosa
o Protege desecación
o Protege fagocitosis, y anticuerpos
o Intercambio moléculas
o Fijación sobre substratos
• Pared bacteriana: mureína o peptidoglucano, resiste presión
osmótica
o Gram+: capa gruesa de mureína sin cubierta
o Gram-: capa muy fina de mureína con cubierta o
membrana externa (Lipopolisacárido compuesto de Lípido
A, núcleo polisacarídico y Antígeno O).
• Membrana plasmática: bicapa lipídica que separa y comunica
o Lípidos (glicolípidos, colesterol y fosfolípidos)
o Proteínas: específicas diferenciadores de las membranas
• Mesosomas: invaginaciones de la membrana ---+ t1 superficie
• Flagelos y fimbrias
o Flagelos: filamentos helicoidales con función locomotora.
Unidos por el corpúsculo basal a la membrana plasmática
o Fimbrias o pili: más cortos y numerosos asociados a
adherencia y reproducción sexual.
• Citoplasma: agua, sales, moléculas pequeñas y grandes.
Hipertónico.
o Ribosomas:
o Vacuolas de gas / carboxisomas / clorosomas: membrana
proteica (no lipídicas). Flotación / Enzimas fijación C02 /
pigmentos para la fotosíntesis.
o Inclusiones: de polisacáridos y lípidos.
-Material genético:
• Genóforo: una molécula circular de ADN ds situada en el
nucleoide (zona central del citoplasma)
• Plásmidos: DNA bicatenario y circular mucho más pequeño que el
cromosoma bacteriano

-Reproducción asexual: duplicación genóforo ----+ Z genóforos un jdos a la

membrana ----+ separación genóforos por crecimiento de la membrana
----+ Invaginación membrana plasmática ----+ Escisión.

-Mecanismo de parasexualidad: recombinación de parte del DNA bacteriano.

• Conjugación: paso de un plásmido a otra bacteria a través del
pili. A veces se integra en el genóforo.
• Transducción: DNA bacteriófago se integra en el genóforo.
Cuando se desprende arrastra genes de 'la bacteria.
• Transformación: absorción de DNA del entorno

-Funciones de las bacterias

• Bacterias patógenas
• Bacterias fermentadoras
• Bacterias descomponedoras

-Observación de las bacterias

o Microscopio óptico: azul de metilo/violeta de perciane
(gram+/ -)
 -
TEMA 3. EUCARIIOTAS

-Célula: unidad mínima de un organismo capaz de actuar de manera autónoma

>- Núcleo bien formado
> Orgánulos internos
>- División del trabajo entre estructuras celulares internas
> División asexual = mitosis
.,. Conjugación sexual compleja (intercambio de genes)
>- Mayor diferenciación y especialización

-Membrana plasmática: bicapa lipídica

>- Estructura: 7.5 nm espesor. Dos bandas oscu ras separadas por
una banda clara .
> Composición:
o Lípidos: un extremo polar y uno hidrófobo.
• Glicolípidos
• Colesterol: estabilidad mecánica
• Fosfolípidos: 1 cabeza hidrofílica + 2 colas
hidrofóbicas (banda clara)
o Proteínas: constituyente diferenciador. Periféricas o
integradas. Determinan las funciones específicas
• Intercambio de iones y moléculas
• Producción de energía
• Identificación de moléculas
• Estructura de la membrana
• Receptores de señales químicas
• Enzimas
o Glúcidos: cubierta celular o glicocalix en la cara externa
de la membrana plasmática
> Función:
o Concentraciones intracelulares óptimas
o pH
o volumen celular estable
 •
o Gradación iónica adecuada
Intercambio de moléculas:
o Pequeñas
1. Intercambio pasivo: sin gasto energético
• Difusión simple: moléculas no polares
(Oxigeno, nitrógeno)
• Proteínas canal: intercambio iones
• Difusión facHitada: moléculas polares (aa,
nudeótidos, glucosa)
2. Transporte activo: intercambio en contra de
gradiente consum iendo energía.
o Grandes: vesículas con membrana
1. Endocitosis
• Pinocitosis: gotas de líquido
• Endocitosis específica: unión de molec. a
receptores específicos de la membrana
• Fagocitosis: ingestión partículas grandes
2. Exocitosis: del Golgi se segregan vesículas con
cargo al exterior (residuos, hormonas)

-Citoplasma: los podemos dividir en citosol y orgánulos celulares

-Citosol: Permite movimientos y ocurren muchas reacciones celulares

>- Agua y sales
>- Moléculas pequeñas (monosacáridos, aa y nudeótidos)
>- Proteínas fibrilares (citoesqueleto)
>- Proteínas globulares (enzimas)

-Citoesqueleto: confieren estructura y permiten el movimiento celular.

a) Microfilamentos (7 nm): actina
o Microvellosidades
o Anillos de contracción entre células hijas
o Contracción células musculares
 o Movimientos celulares
b) Filamentos intermedios: función estructural estática
o Filamentos de queratina
o Neurofilamentos
o Gliofilamentos
c) Microtúbulos: polimerización de la tubulina
o Forma de la célula
o Organización citoesqueleto
o Huso mitótico
o Forman lo centriolos, cilios y flagelos.

-Orgánulos citoplasmáticos: rodeados por una membrana lipídica.

> Ribosomas: enlazan aa ----+- proteínas. 405/605 (ARNr +

proteínas ribosomales)
o Cara exterior REr
o Membrana nuclear externa
o Cloroplastos y mitocondrias
o Libres en el citoplasma
> Retículo endoplasmático: membranas interconectadas. 70%prot
en sus membranas.
o Rugoso: presencia de ribosomas; síntesis de proteínas
o Liso: síntesis de fosfolípidos y colesterol de la membrana y
hormonas esteroides.
> Complejo de Golgi: recoge, modifica y envía moléculas dentro y
fuera de la célula.
~ . h ~~k : o Completar la glicosilación de lípidos y proteínas
\ I \ ' I ....~ o Aportar lípidos y proteínas a la membrana celular
- ~(l..J,.;\ c..v.>~
o Modificar y clasificar proteínas para secretarlas
--T~1e ve.s\~
o Producir lisosomas primarios
o Formar vacuolas
>- Lisosomas: enzimas hidrolíticos ácidos para la digestión
o Primarios: vienen del Golgi. + endosoma = secundario
 - - - - -- - - -- - - - - - - -- -- -- -

o Secundarios: digestión celular

• Vacuolas digestivas: primario + fagosoma
• Cuerpos multivesiculares
• Autolisosomas: primario + material celular
>- Peroxisomas: oxidasas que oxidan aa, ácido úrico, ácido láctico,
produciendo H20 2. Las catalasas degradan el H20 2
>- Vacuolas: fina membrana (tonoplasto).
>- Mitocondrias: suministran energía (ATP) . Maquinaria genética
propia.
o Membrana externa: = membranas celulares. Permeable a
electrolitos, moléculas de hasta 100 kDa y impermeable a
iones.
o Membrana interna: replegada (crestas). Altamente
impermeable.
• Proteínas transportadoras específicas
• Proteínas de la cadena respiratoria
• Proteínas del complejo ATP-sintetasa.
Hay dos espacios:
.:. Matriz: espacio central limitado por la membrana interna.
Enzimas rutas metabólicas y de la maquinaria genética,
ADN circular, RNA mitocondrial y ribosomas .
•:. Espacio intermembranoso: = citosol

-Nucleo:
>- Coordina toda la actividad celular
>- Uno solo
>- Forma esférica
>- Zona central de la célula
>- Estructuras:
o Membrana nuclear: membrana externa RER; membrana
interna con proteínas filamentosas. Poros son elementos
complejos de regulación.
o Cromatina: ADN + histonas
 • Heterocromatina: fuertemente empaquetada, no
transcripción.
• Eucromatina: ADN no condensado, si transcripción .
o Nucleolo: corpúsculos esféricos.
• Ribosomas
• Proteínas ribosómicas
• Genes ribosomales
• Enzimas de transcripción
o Nucleoplasma: solución coloidal.
• Proteínas
• Enzimas de la replicación y transcripción
• Proteínas f ibrilares (citoesqueleto del núcleo).

CÉLULAS VEGETALES

-Pared celular: celulosa, hemicelulosa y pectinas.

>- Mantiene la presión osmótica
>- Morfología poligonal
>- Las sustancias entran por los plasmodesmas (no transporte
activo)
Formación pared celular:
>- Lámina media (pectinas)
> Pared primaria: se añaden moléculas de celulosa, hemicelulosa y
pectinas del Golgi
>- Pared secundaria: se deposita más celulosa. En células
especializadas lignina, suberina y cutina.

-Plastidios: capaces de sintetizar y almacenar sustancias. Formados por dos

membranas concéntricas separadas por un espacio intermembranoso.
>- Leucoplastos: sin pigmento. Reserva
>- Cromoplastos: acumulan pigmentos carotenoides
> Cloroplastos: orgánulos fotosintéticos. = mitocondrias. La
membrana externa es permeable pero la interna no.
 -

o Estroma: matriz interior

• Enzimas de la 2a fase de la fotosíntesis (formación
compuestos orgánicos)
• DNA circular
• RNA ribosomal 70S
• Inclusiones de almidón y lípidos
o Tilacoides: a partir de la membrana interna
• Enzimas de la 1a fase de la fotosíntesis (captación y
transformación de la energía lumínica en química)
• Pigmentos de la fotosíntesis
• Cadenas transportadoras de electrones
• Complejos ATP-sintéticos
 TEMA 4. CICLO CELULAR

-Crecimiento celular:
Fusión de 2 células ~ Zigoto ----+ duplicación masa y componentes
----+ divisiones y diferenciaciones celulares

-Ciclo celular: modificaciones de una célula de división a división

> Interfase: crecimiento celular y preparación para la división celular.

Núcleo mecánicamente inactivo pero con actividad sintética
o Fase G1:
• Periodo de crecimiento del citoplasma
• 5-10 horas
• Síntesis de proteínas
• Se puede retardar limitando nutrientes, con inhibidores,
confluencia, parándose el ciclo en G1
• Punto de restricción : final G1, sobrepasado la célula acaba el
ciclo.
• Entrada a la fase GO para células que cesan de dividirse y se
diferenci'an y especializan.
o Fase S
• Duplicación del DNA total (replicación)
• 6-8 horas
• Resultado: cada cromosoma tiene 2 cromátidas
• Síntesis de RNAm
o Fase G2
• Transcripción de los RNA implicados en la mitosis
• 4-5 horas
• Persiste la síntesis de RNAm.

> División celular: condensación cromosomas ----+ desaparece envoltura

nuclear ----+ separ ación cromátidas ----+ 2 nuevas envolturas nucleares
----+ división citoplasma
o Mitosis: división nuclear. Sólo en células somáticas
• Profase:
• Duplicación de los dos centriolos (diplosoma) }
• Material pericentriolar más abundante Comp lejo centri o lar

(centro inductor de polimerización)

• Los vegetales no tienen complejo centriolar, sino
una zona clara desprovista de orgánulos.
• Se forman microtúbulos procedentes del material
pericentriolar a modo de radios alrededor de cada
complejo (ásteres).
• Migración ásteres en direcciones opuestas
• Elongación ásteres = microtúbulos polares
• Condensación de los cromosomas
• Constricción primaria entre las cromátidas, donde
se construyen los esbozos de los cinetocoros
• Prometafase
• Ruptura envoltura nud ear
• Diferenciación cinetocoros-.centros organizadores
• Microtúbulos procedentes de los cinetocoros
• Orientación cromosomas quedando cada cinetocoro
frente a cada polo.
• Elongación microtúbulos cinetocóricos
• Migración cromosomas hacia el plano ecuatorial
• Metafase: reunión cromosomas en el ecuador
• Los cromosomas tienen movilidad mínima en el
plano ecuatorial
• El huso se alarga
• Anafase: separación de los cromosomas en dos lotes idénticos
• Separación cromátidas por la constricción primaria
• Acortamiento microtúbulos cinetocóricos a medida
que los cinetocoros, arrastrando los brazos de los
cromosomas, se acercan a los polos.
• Alargamiento de los m,icrotúbulos polares
 • Cromosomas en los polos: han desaparecido los
microtúbulos cinetocóricos y los semihusos
• Comienzo de la citocinesis
• Telofase:
• Reconstrucción de los dos núcleos hijos
o Unión de vesículas del RE a la superficie de
los cromosomas
o Formación envoltura continua
o Adjunción de nuevas vesículas
o Cromatina con aspecto interfásico
o Recuperación actividades metabólicas
(transcripción y reaparece nucleolo)
• Finalización citocinesis
o Citocinesis: división del citoplasma
• Células animales (estrangulamiento)
• Crece surco de división
• Haz de microfilamentos concéntricos al surco =
anillo contráctil.
• Fusión en un haz úntco de los microtúbulos de la
interzona
• Células vegetales (construcción de un tabique)
• Unión de vesículas del Golgi a los microtúbulos
tetofásicos
• Progresión vesículas centrífugamente hasta bordes
= fragmoplasto
• Las vesículas se fusionan - . futura membrana
plasmática de las células hijas
• Contenido vesículas (entre membranas plasmáticas
de nueva formación) -. esbozo pared

>- Meiosis: dos divisiones celulares formando los gametos. Sólo en células
sexuales.
o interfase muy simHar a la mitótica
 o En ta fase S se duplican los cromosomas
o Meiosis 1: división reduccional
• Profase 1: fase particularmente compleja
• Leptoteno: condensación inicial cromosomas
• Zigoteno: unión cromosomas homólogos por el
complejo sinaptonémico
• Paquiteno: entrecruzamiento entre cromátidas no
hermanas ---+ recombinación génica
• Diploteno: desaparece complejo sinaptonémico +
cromosomas homólogos se repelen (unidos por los
quiasmas)
• Diacinesis: máxima condensación. Se disuelven las
envolturas nucleares y se forma el huso entre los
diplosomas
• Metafase 1: unión centrómeros - huso ---+ placa metafásica
quiasmas en el plano ecuatorial
• Anafase 1: rotura quiasmas ---+ desplazamiento homólogos
a polos opuestos. Los centrómeros no se dividen (si en la
meiosis 11).
• Telofase 1: envoltura nuclear + división en dos células
hijas
o Interfase 11: breve o falta completamente. No hay nueva síntesis de
DNA.
o Meiosis 11: división ecuacional. = mitosis. Cada célula es n
• Profase 11: desaparecen envolturas nucleares + nuevos
husos orientados perpendicularmente al primero.
• Metafase 11: unión cromosomas-huso ---+ placa metaflsica
• Anafase 11: división centrómeros ---+ polos opuestos
• telofase 11: formación envoltura nuclear + citocinesis = 4
células hijas.
-Significado de la meiosis:
y conservación número de cromosomas
y recombinación rasgos hereditarios
I
TEMA 8. ORGANI,ZACIÓN y REPL1CAGÓN DEL MATERIAL
HEREDITARIO. DESDE LOS CROMOSOMAS HASTA LOS GENES

-Estructura: un ácido nucleico está constituido por una cadena de nucleótidos

::: pentosa + residuo fosfato + base nitrogenada
~
Purina s Pirilllidinas
Adenina Citosina
Guanina Timina
Uracilo

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La cadena polinucleotídica ::: enlaces entre 5' -pentosa y la 3' -pentosa a través
die un grupo fosfato:
,... Hélice regular
,... Dos cadenas de polinucleótidos
,... Puentes de hidrógeno entre G y C, y A con T
,... Cadenas antiparalelas (dirección opuesta)
,... Armazon pentosa-fosfato exterior con carga negativa
,... Las bases se sitúan hacia el interior como peldaños
,... Histonas (carga positiva) se unen a la hélice (neutralizan)

-Replicación del ADN: DNA que se replica tiene forma de horquilla

1. Iniciación: primosoma en E. coli
a. Separación cadenas parentales por la helicasa
b. Proteína SSB se une al ADN de cadena sencilla estabilizándola e
impidiendo que vuelva al estado de dúplex
 -
c. ARN polimerasa especial sintetiza tramo corto de ARN (cebador)
que proporciona un extremo libre 3' para poderse elongar por la
polimerasa añadiendo nucleótidos .
2. Elongación: replisoma en E. coli se mueve a lo largo del ADN y las
cadenas parentales se desenrollan y se sintetizan las cadenas hijas.
a. ADN polimerasa 1: reparación ADN dañado
b. ADN polimerasa 11: replicación de ADN dañado
c. ADN polimerasa 111: auténtica replicasa, síntesis nuevas cadenas
de ADN añadiendo nucleótidos uno por uno a un extremo 3' -OH.
Errores 1:10.000; después reparaciones 1 :10 6 •
Las polimerasas poseen actividad exonucleotídica 3' -- 5' con función
reparadora en dirección inversa a la de síntesis.
Síntesis semidiscontinua:
, Cadena conductora: síntesis de ADN continua en la
dirección 5--3' . Sólo necesita un cebador
, Cadena retrasada: en la cadena que crece 3'--5' se
sintetizan de forma discontinua fragmentos (okazaki) en
dirección opuesta 5'--3'(replicación semidiscontinua).
Necesita tantos cebadores como fragmentos de okazaki.
Esto requiere que la polimerasa se transloque y
comience en una nueva localización cerca del punto de
crecimiento de la cadena conductora.

5'

..--
-"
F'. 'I", e"tos de OKI\SAKI .J

~ .
r " h ~ do , de AH N

3. Terminación
a. Separación cadenas duplicadas
b. Eliminar cebador ARN y sustituirlo por un tramo de ADN (ADN
pol imeras 1)
 c. Unión covalente de los fragmentos de okazaki adyacentes por
una ADN ligasa.

-GENOMAS y GENES
r El genoma se mide en miles de pares de bases de nucleótidos
r Los genes están organizados en cromosomas
r Cromosoma = molécula ADN de doble cadena + proteínas
r Los genes representan el 3-4% del genoma total (amplias regiones que
no codifican para proteínas).
r La selección natural mantiene genes que confieren una ventaja
selectiva al organismo.
r Principales regiones de un gen:
o Región promotora: cajas reguladoras de la transcripción (no se
transcribe)
o Región 5' no codificante: se transcribe a mRNA
o Región codificante: da lugar a la proteína
o Región 3' no codificante: secuencias de terminación de la
transcripción. Se transcribe a mRNA.
o Región 3' del gen: no se transcribe a mRNA. Enhancers
Secuencias de ADN que forman parte del gen:
r Exones: secuencias del ARN maduro. Están bajo presión
selectiva por lo que acumulan pocas mutaciones.
r Intrones: secuencias intercaladas que serán eliminadas
cuando se procese el tránscrito primario y se constituya el
ARN maduro (deleción intrones + unión extremos ARN =
procesamiento (splicing) del ARN. Al no codificar
proteínas pueden acumular mas cambios de bases.

-CROMOSOMAS
r Cariotipo: serie de cromosomas como se observan al microscopio óptico
,. Cromosomas eucariotas formando pares = cromosomas homólogos
r Citogenética: citología + genética
o Cultivos celulares de fibroblastos o linfocitos
 o Bloqueo de la división celular con colchicina
o Centrifugación
o Fijación con líquido de Carnoy
o Choque hipotónico
o Tinción cromosomas con azul Unna
, Características de los cromosomas:
o Centrómero: constricción primaria por donde se unen las
cromátidas hermanas en la mitosis
o Constricciones secundarias: asociadas a las regiones NOR (región
organizadora del nucleolo). Genes del ARNr.
o Telómeros: regiones de ADN no codificante, altamente
repetitivas, cuya función principal es la estabilidad estructural
de los cromosomas en las células eucariotas
o Satélites: regiones de ADN repetitivo conectados a ta extremidad
de los brazos por un fino filamento cromático.
, Cromatina: ácidos nucleicos + proteínas básicas, donde sus cargas
positivas son neutralizadas por las cargas negativas de los grupos P. El
empaquetamiento de la cromatina cambia a lo largo del ciclo. Interfase
5-10 veces menos condensada.
o Eucromatina: aspecto relativamente disperso. Transcripción y
replicación.
o Heterocromatina: cromatina densamente empaquetada (similar
a los cromosomas en mitosis) que no se transcribe y se replica de
forma tardía en la fase S. Centrómeros.
Masa cromatina = doble de proteínas (histónicas, polimerasas, factores
de regulación de la transcripc~ón) que de ADN

-REGULACiÓN DE LA EXPRES,IÓN GÉNICA

G E N E S
E s tr uctu rales
R g uiador Promotor Op erador E1 E2 E3 E4

ADN
1 R 1 I p
~-- -
I_LOJ I 1 1 1 , 1 I

-~ EL MODELO DEL OPERÓN

I\HN Hu1nncr d d
 -

En cada operón se diferencian dos clases de genes:

• Los genes estructurales ( El, E2, E3... ), que codifican proteínas

• Un gen regulador (R), que codifica a una proteína represora (PR) que
puede encontrarse en la forma activa o inactiva y es el agente que
controla materialmente la expresión.

Existen además dos regiones que intervienen en la regulación:

• El promotor (P) ,es una zona donde se une la ARN-polimerasa y decide

el inicio de la transcripción.
• El operador (O) , que posee una secuencia reconocida por la QI..oteina
represora activa : cuando se bloquea el operador con la proteína
represora , impide el avance de la ARN-polimerasa y la transcripción se
interrumpe , con lo que se origina el proceso conocido como represión
génica.

Cuando la bacteria necesita sintetizar proteínas debe separar el operador del

represor y utiliza para ello dos tácticas:

1. La inducción enzimática. Como en el caso del operón lactosa , que

regula la síntesis de las enzimas encargadas de metabolizar la lactosa .
Como puede verse en el esquema, cuando aparece la lactosa (molécula
inductora), se une a la proteína represora inactivándo la; entonces el
complejo inductor-represor se separa del operador, permitiendo el
funcionamiento del operón.
Z. La represión enzimática. El ejemplo es el operón histidina , que regula
la síntesis de las enzimas que intervienen en la síntesis de la histidina.
 TEMA 14. CULTIVOS CELULARES ANIMALES

-Cultivo de células:
, Investigación básica (desarrotlo, cáncer)
, Biotecnología (vacunas, anticuerpos)
, Medicina (células madre, transplante)

-Tipos de células:
, Cultivo primario
, Cultivo secundario o subcultivo
, Línea celular contínua
, Células transformadas
, Células diferenciadas
, Célutas embrionarias
, Hibridoma

-Ciclo celular y crecimiento: las células de dividen regularmente si se cambia

frecuentemente el medio de cultivo

-Tipos de cultivo:
, Monocapa
, En suspensión

-Medio de cultivo: mezcla compleja de nutrientes que se suplementa con

suero
, SoluCÍ'ón salina
, Bicarbonato sódico
, Glucosa
, Aa y lípidos
, Vitaminas
, Rojo de fenol
,. Suero: MEM, DME, RPMI necesitan un suplemento de suero
(bovino, equino o humano). Se esteriliza por filtración.
 o Factores hormonales estimuladores del crecimiento
celular
o Factores de adherencia y extensión celular
o Proteínas de transporte para hormonas, minerales y
lípidos

-Equipamiento de un laboratorio:
r Cabina de flujo
, Incubadores
, Microscopio de fases invertido
r Autoclaves
r Tanque de nitrógeno líquido

-Mantenimiento de líneas celulares

r Alimentación periódica
r Subcultivos o pases
r Mantenimiento de stocks
, Controles periódicos
I ...
TEMA 15. CONTROL DE CRECIMIENTO DE PLANTAS. CÁMARAS,
INVERNADEROS, FITOTRONES

-Desarrollo:
>- Crecimiento: cambios cuantitativos
>- Diferenciación: cambios cualitativos

-Factores que influyen en el crecimiento de las plantas:

, Presión de oxígeno
.,. Respiración
>- Agua y nutrientes
, Condiciones ambientales:
o Temperatura
o Luz: más importante. Actua:
• Indirectamente: + fotosíntesis
• Directamente: fotomorfogénesis ~
fotorreceptores:
• Fitocromos (primitivos procariotas)
• Criptocromos
• Fotorreceptores de luz UV
• Fotoclorofilina a: luz roja y azul

-Fotoperiodo: fotorreceptores absorben luz (detectan el largo del día) ~

respuesta fotoperiódica.
);- Plantas de día corto: florecen cuando hay noches largas
>- Plantas de día largo: florecen cuando noches cortas
, Plantas de día neutro: independiente de duración día.

-Tipos de reguladores vegetales:

';- Fitohormonas: sustancias naturales
, Activadores sintéticos del crecimiento
> Retardadores sintéticos del crecimiento
., Herbicidas sintéticos
 -
-Fitohormonas: sustancia orgánica que se sintetiza en una parte de la planta y
se traslada a otra para ejercer su acción a muy bajas concentraciones.
y Efectos pleiotrópicos (numerosos procesos fisiológicos)
y Síntesis en todas las células (no glándula)
,. Equilibrio entre hormonas estimulantes y inhibidoras del
crecimiento:
o Auxinas: IJ. tallo, dominancia apical, < abscisión
o Giberelinas: IJ. tallo, germinación semillas
estimulantes
o Citoquininas: división celular , dominancia lateral
o Etileno: hormona de la maduración de frutos

inhibido"s { o Ácido abcísico: dormancia semillas, senescencia

hojas, antagonista hormonas estimulantes.

-CÁMARA DE CULTIVO O FITOTRONES: receptáculo que permite el control de

algunas variables del ambiente:
);;- Temperatura: sistema refrigeración-calefacción
controlado por un termostato.
o Influyen la T a ambiente y el calor generado por las
fuentes de luz
o Ventilación ~ homogeneidad P
o Estabilidad P ~ programador
y Iluminación: fluorescentes
o Horizontales
o verticales
>- Fotoperiodo: número de horas de luz diarias. Programador
conectado al circuito de iluminación y temperatura.

-INVERNADEROS: lugar cubierto y abrigado artificialmente.

>- Objetivos:
o Producción de cosechas fuera de época
o Aumento de los rendimientos unitarios
 •
o Obtención de productos de mejor calidad
~ Condiciones que debe reunir un invernadero:
o Permeabilidad a la radiación solar
o Estabilidad del medio interno
o Instalación ligera y flexible
o Estanqueidad
o Bajo coste de construcción
o Mínimos gastos de explotación y conservación
>- Partes de un invernadero:
o Armadura: soporta cubierta + sobrecargas
o Cubierta: techumbre y paredes
';- Control climático: regulación de acción rápida. Evitar
sobrecalentamientos y excesivas aireaciones.
o Temperatura:
• 10-20°C
• Calefacción: radiación solar + fluorescentes +
alerones = termostatos
o Humedad relativa
• HR excesiva ~ -transpiración ~
-crecimiento ~ ventilado o ~ P
• HR baja ~ +transpiración ~
deshidratación ............... riegos o HzO pulverizada
o Iluminación:
• Cubiertas con buena transparencia
• Orientación invernadero adecuada
• Suelo con acolchado blanco
• Verano: mallas de sombreo + acolchado
negro en el suelo
o COz:
• 0.1-0.2% + otros factores óptimos =
fotosíntesis máxima
• Por la mañana COz bajo ~ abrir alerones
 •
};- Sistemas de riego: la pérdida de agua en un invernadero es
debida principalmente a la radiación solar.
o A manta
o Infiltración en surcos
o Aspersión
o Goteo
o Fertirrigación: riego con abono
o inundación
);- Suelo
o Rico en elementos nutritivo asimilabtes
o Abono ~ salinidad ~ fatiga del terreno
• De fondo con N, P, K
• A lo targo del cultivo y de forma fraccionada
 •
TEMA 17. CONTROL DE LA NUTRICiÓN DE PLANTAS.
FERTIUZACIÓN y NECESIDADES HíDRICAS. FIJACiÓN DE
NI,TRÓGENO

-Reacciones bioquímicas dependen de: luz, agua y ciertos elementos químicos

);- Fotosíntesis: energía luminosa ---. energía química
(ATP) y compuestos reductores (NADPH). Agua y C02 +
ATP Y NADPH ---. compuestos orgánicos (glucosa)
);- Aas y vitaminas a partir de nutrientes inorgánicos:
• C, H y O provienen del aire yagua
• 13 son absorbidos por las raíces en forma de iones
-Nutrientes inorgánicos:
);- Regulan la ósmosis
);- Afectan la permeabilidad celular
);- Componentes estructurales de las células
);- Activadores o componentes enzimáticos
-El suelo: soporte físico + proporciona nutrientes inorgánicos yagua.
);- Materia sólida:
• Materiales orgánicos (restos en descomposición)
• Materiales inorgánicos (como iones)
);- Espacio poroso: ocupado por agua ---. proporciona O2

-SIMBIOSIS
);- Fijación del nitrógeno: el nitrógeno del suelo proviene de
la atmósfera y no es asimilable por los organismos vivos
~ componentes de proteínas y ácidos nucleicos.
Bacterias que convierten N atmosférico en N asimilable:
Rhizobium: pelos radicales leguminosas
simbióticas { :
Anabaena: con Azolla (helecho flotante)
Acetobacter: alrededor raíces
No simbióticas { :
Clostridium

).- Micorrizas: hongos asociados a sistemas radicales

 • IJ. area de absorción de nutrientes del suelo
• Minerales del suelo y materiales en descomposición------'
formas asimilables
• Extraen P de soluciones diluidas ------. asimilable

Tipos de micorrizas
• Endomicorrizas: las hifas penetran en las células
formando vesículas y arbúsculos
• Ectomicorrizas: las hifas envuelven la raíz. Hacen más
resistentes a los árboles frente frío y sequía
• Asociadas a la familia de los brezos: tela de araña
alrededor de la raíz. Las hifas laterales penetran.
• Asociadas a las orquídeas: hongo interno

-NECESIDADES HíDRICAS
>- Las raíces dirigen su crecimiento hacia las zonas más
húmedas. Entra por ósmosis.
>- 90% agua raíces se evapora por transpiración
>- 2 células estomáticas. Turgentes se abren; perdida de
agua se cierra el poro (por ósmosis).
> ABA: cierra estomas cuando el agua es crítica
>- Germinación:
• la semilla embebe agua para sus actividades
metabólicas
• activación enzimas semilla
• síntesis nuevos enzimas ------. digestión reservas
• Aporte continuo de agua y nutrientes
• Déficit hídrico ------. muerte
>- Transporte de nutrientes: xilema y floema ~ sistema
vascular continuo que penetra por todo.
• Xilema (corriente de transpiración): agua y solutos
inorgánicos. Iones por transporte activo o pasivo
(potencial hídrico)
 -
..
• Floema (corriente de asimilables): azúcares
producidos en la fotosíntesis - - . tubos cribosos -----'
-potencial hídrico en tubos - - . entra agua por
ósmosis - - . azúcares transportados por el agua - - .
salida azúcares del tubo criboso en sumidero -----. +
potencial hídrico --------. salida agua del tubo al
xilema.

-FERTILIZACiÓN: elementos químicos esenciales como el N, P Y K solubles en

agua que se agrega a la tierra para
);> Favorecer el crecimiento vegetal
);> Aumentar la producción
);> Mejorar la calidad de la planta y frutos
~ Resistencia a influencias adversas

• Orgánicos: acción lenta y duración prolongada

~ Estiércol de bovinos, vacunos o caballar
);> Soterramiento de plantas leguminosas
• Inorgánicos: acción inmediata y corta duración
);> Fosfatados: fosfatos naturales o de huesos y superfosfatos
);> Nitrogenados: + partes herbáceas de las plantas
~ Potásicos: cloruro, sulfato, carbonato, nitrato, cenizas
• Fertilización biológica:
);> enriquecimiento rizosfera con microorganismos
);> fijadores simbióticos de nitrógeno
);> hongos de la micorriza
• Fertilización carbónica: en invernaderos. Al mediodía cuando el CO 2
nocturno ha disminuido.
);> Ventilación
);> Recuperación gases de combustión de la calefacción
);> Generadores de CO 2
~ CO 2 almacenado en bombonas
 TEMA 18. EXPERIMENTACiÓN ANIMAL. ANIMALARIOS

-Biomedicina basada en estudios con animales de experimentación (reactivos

biológicos) .
~ Desarrollo de vacunas
~ Estudio de enfermedades
, Desarrollo de nuevos fármacos
" Pruebas de seguridad de fármacos
-Ética:
.,. Sociedad más sensibilizada al sufrimiento animal
'r Respeto a los animales, seres vivos dotados de sensibilidad y capaces
de sufrir. Normas:
o Animales procedentes de criaderos especializados
o Evitar o limitar cualquier sufrimiento físico o psíquico
o Métodos alternativos como modelos matemáticos, estadísticos y
sistemas biológicos in Vitro (bajo coste y plazos de tiempo muy
cortos)
o No usar especies en peligro de extinción
o Científicos cualificados
-índice de severidad: valoración objetiva de los niveles de severidad de la
investigación y balance entre la calidad e importancia de los resultados según
el número de animales utilizados
-Animales de laboratorio:
'r Anfibios : estudios de la piel
>- Reptiles: antídotos de venenos
" Roedores: anticuerpos, comportamiento, estudios de cáncer
, Perros: digestivo, metabolismo y nutrición
,. Gatos: sistema nervioso, comportamiento
),;> Primates: cuando no sirve otra especie. Transplantes, patología
general, último paso test medicamentos ...
>- Cerdo: alcoholismo y diabetes
);- Oveja/cabra: hemodinámica
-Reproducción, cría y herencia del animal de laboratorio
 ..
}- Ciclo estral
,. Manipulación de ta reproducción
)r Cruzamientos: con o sin parentesco
~ Control de la producción
-Alimentación: acto voluntario y consciente mientras que la nutrición
(digestión, absorción y metabolismo) son involuntarios.
~ Buena formulación de la ración para un crecimiento y reproducción
normal
'r Raciones inalteradas durante la duración del experimento
,. Disponibilidad de agua siempre (potable, fresca y sin contaminantes)
'r Almacenamiento de las dietas: en sitios frescos o fríos, humedad
inferior al 15%

-Patología de los animales de laboratorio: diferentes causas de la aparición de

una enfermedad infecciosa
)r Epizootia: enfermedad epidémica donde el agente causal no está
presente en la colonia y afecta a un gran número de animales.
),;- Enzootia: el agente causal está en la colonia y sólo afecta a los
animales del animalario.

-Animalarios: recinto habilitado para experimentar, mantener y criar animales

satisfactoriamente
)r Destinado a:
o Establecimiento de cría
o Establecimiento suministrador
o Establecimiento usuario
y Áreas de un animalario:
o Celdas para animales
o Área de limpieza
o Área de almacenamiento de material limpio
o Área de almacenamiento de pienso, viruta y otros productos
o Vestuarios
o Cuarto de cuarentena
 •.
o Incinerador
o Laboratorio
o Pasillos de separación de las diferentes áreas
~ Disposiciones generales:
o Un horario para experimentos y otro para tareas de
mantenimiento
o Pasillo sucio/ pasillo limpio
o El personal investigador deberá cambiarse de ropa
o Nivel higiénico satisfactorio
}- Instalaciones según el nivel sanitario del animal:
o Gnotobióticos: permanecen siempre en aisladores
• Axénicos: no tienen ningún tipo de gérmen
• Gnotoaxénicos: axénicos con microorganismos
introducidos por el hombre
o Agnotobióticos: tienen flora desconocida
• Heteroxénicos: libres de gérmenes patógenos
• Holoxénicos: mantenidos en condiciones ambientales no
definidas
• Neo-holoxénicos: gnotobióticos o heteroxénicos sacados
de su ambiente y mantenidos en condiciones ambientales
no definidas.
r Barreras para evitar las contaminaciones: mayor status sanitario de los
animales.
o Tipo 1: barrera de máxima seguridad. Para gnotobióticos
o Tipo 11: barrera de seguridad alta para animales libres de
gérmenes (SPF)
o Tipo 111: barrera de seguridad inferior
o Tipo IV: barrera de seguridad mínima. Para animales
convencionales
" Procedimiento normalizado de trabajo (PNT): procedimientos escritos
detalladamente.
>- Marcaje: para diferenciar de forma clara y rápida los animales.
 •
o Marcas: características fenotípicas, tatuajes, colorantes
temporales, hierros, taladros.
o Apliques: grapas, collares, microidentificadores electrónicos
implantables
'; Inoculación de productos:
o Intraperitoneal: subumbilica!
o Subcutánea: pliegue de piel
o Intramuscular: muslo
o Intravenosa: vena marginal de la oreja (conejo), vena caudal de
la cola (ratas y ratones).
o Oral: sonda especial
:r Anestesia: para sujeción y control del animal, exámenes clínicos,
cirugía, eutanasia. Su acción deberá ser rápida y su eliminación
también, no debe deprimir la respiración ni el corazón ni ser irritante
para los tejidos, estable a temperatura ambiente.
o Analgesia: alivia el dolor
o Sedación: grado medio de depresión del sistema nervioso central
o Anestesia local: descenso sensibilidad en un área
o Anestesia basal: base para una anestesia profunda
o Anestesia general: totalmente inconsciente e insensibilidad al
dolor
Preparación del animal: 12 horas antes sin ingerir alimentos
Preanestesia:
o Calma al animal
o Reduce canditad de fármacos a administrar en la anestesia gral
o Reduce la movilidad gástrica
o Previene la parada cardiaca
~ Eutanasia: inducir la muerte sin sufrimiento. Rápido, humanitaria sin
dolor, irreversible, no contaminante para el entorno, seguro para el
manipulador y económico.
o Aturdimiento
o Dislocación cervical
o Guillotina
 o Exanguinación
o Inyección de barbitúricos
o Éter
-Personal del laboratorio
., Personal responsable, motivado y concienciado
>- Un buen servicio se basa en:
o Limpieza
o Desi nfección -esteril ización
o Manejo adecuado de los animales
Un buen equipo humano puede mejorar una instalación por sus buenas
prácticas
" . ..
TEMA 19. CONTROL DE LA NUTRICiÓN Y PRODUCCiÓN
ANIMAL

Nutrición animal:

o Nutrientes: sustancias necesarias para mantener sus estructuras

y realizar sus funciones
o Nutrición: procesos para utilizar los nutrientes
-Procesos de la nutrición animal:
o Ingestión de los alimentos
o Digestión
o Transporte de los alimentos digeridos a las células:
• Aparato circulatorio
• Aparato respiratorio.
o Metabolismo celular: Nutrientes + oxígeno = moléculas complejas
(anabo'lismo) + energía (catabolismo)
o Excreción: COz + sustancias de deshecho del metabolismo
-Composición de los alimentos: los compuestos que contienen C, H, O Y N son
orgánicos y Ca, P, Mg, Na... inorgánicos.
o Nutrientes que contienen N:
• Proteínas: aminoácidos (no) esenciales
• No-proteína: amoníaco, urea
o Nutrientes que contienen energía: C, H y O al metabolizarse
liberan energía
o Vitaminas: buena salud de los animales
o Cromo: favorece la acción de la insulina, desaparición más
rápida de la glucosa
o Zinc: disminuye problemas entéricos

Producción animal

Mejorar la producción como el alimento, abrigo, producción de vacunas y

antibióticos.
 •

-Mecanismos artificiales para aumentar la producción:

o Control de la reproducción: manipulaciones reproductivas para
mejora genética:
• Inseminación artificial: 1 eyacu lación /1400 vacas
• Sincronización del estro: prostaglandina y progesterona
• Transplante de embriones: superovulación con FSH,
fecundación óvulos. 1 vaca/40 crías
• Efecto de la luz sobre la actividad reproductiva: induce
o Alimentación: dieta equilibrada de mínimo coste
o Me jora genética: el hombre ha hecho una selección (alta
productividad, ganancia de peso...) para obtener de generación
en generación un mejoramiento genético. Características a
mejorar independientes o correlacionadas.
• Cruzamientos:
o Endocria
o Exocria
• Clonaje: embriones idénticos a partir de un solo embrión
o Extracción contenido de un óvulo sin fecundar
o División de una mórula
o Una mitad se introduce en el óvulo manipulado
• Determinación del sexo de los gametos: manipular
fecundación
• Mapeo genético: identificar genes de interés
• Corrección de errores: sustitución genes negativos por el
alelo que no causa defecto
o Crecimiento (aumento de masa) y desarrollo (cambios producto
del crecimiento y diferenciación celular:
• Huesos: soporte y protección de órganos
• Músculos: energía en trabajo
• Grasa: relleno de espacios corporales y reserva de energía
Crecimiento compensatorio: tasa de crecimiento mayor después
de un periodo con alimentación restringida
Factores que afectan el crecimiento:
 • Factores genéticos: razas de carne/leche
• Factor sexo: las hembras se engrasan antes
• Factores nutricionales: niveles nutricionales = requerimientos
del animal
o Sanidad: animal sano = estado óptimo de producción
• Prevención de enfermedades:
o Cuarentena de los animales recién adquiridos
o Vacunación
o Nutrición
o Medio ambiente higiénico
o Vigilancia
• Control de enfermedades: control rápido antes de que sea
incontrolable
o Aislamiento de los animales enfermos
o Identificar la enfermedad y tratamiento
o Sacrificio si no tiene control
 TEMA 20. CONSERVACiÓN DE MUESTRAS BIOLÓGICAS.
REFRIGERACiÓN, LIOFILIZACiÓN, CONGELACiÓN Y
DESECACiÓN DE MUESTRAS

-Preservación estructura y composición evitando su degradación por un

periodo prolongado de tiempo.
-Factores que influyen en el deterioro:
,. Tiempo
,. Temperatura
,. Hidratación
,. Acidez (pH)
,. Composición de la atmósfera
-Reacciones de degradación:
,. IReacciones químicas de degradación
,. Reacciones enzimáticas de degradación: enzimas de ruptura
,. Reacciones de Maillard: azúcares y proteínas se transforman en
compuestos intermedios y después polímeros pardos
,. Desnaturalización de proteínas y ácidos nucleicos
r Oxidaciones: de origen enzimático
,. Reacciones biológicas: + microorgan ismos

-REFRIGERACiÓN:
,. -1 a 10°C
,. Disminución reacciones químicas o bioquímicas de degradación
,. Disminución oxidación de lípidos
,. Sigue habiendo migración del agua hacia el ambiente
,. También se presentan pérdidas de vitaminas, proteínas, lípidos y
carbohidratos
,. Disminución de la proliferación de microorganismos, aumenta la
vida útil del material
,. Pero los gérmenes están vivos y empiezan a multiplicarse desde
que se calienta la muestra
,. Se utilizan neveras domésticas o cámaras frías
-LIOFILIZACiÓN: extraer agua de un producto congelado por sublimación
(agua congelada ~ vapor).
r Precongelamiento: T a inferior al punto eutéctico del material (T a
mínima donde coexisten la fase sólida y líquida)
r Secado primario por sublimación: sublimación superficie hielo. A
media que avanza, la velocidad de sublimación es más lenta ya
que el vapor de agua se difunde por las capas secas. Suministro
calor gradiente de presión de vapor de agua ~
extracción del agua por congelación encima condensador a -50°C
r Secado secundario: + T a ~ rotura interacciones físicas o
químicas entre moléculas de agua y material congelado
-Beneficios:
, La sublimación del hielo deja huecos preservando la estructura y
propiedades físicas, químicas y biológicas de sus estados frescos
r -peligro de contaminación microbiana
, No oxidación
r Rápida reconstitución
r Almacenamiento por tiempo ilimitado de materiales biológicos
como cuWvos microbianos, sangre, productos farmacéuticos
r También para preparar muestras titulares para ME
-Desventajas:
, Proceso costoso
, Persona~ cualificado
r Elevado coste de inversión

-CONGELACiÓN:
, Casi total eliminación del agua líquida por transformación en
hielo
, Descenso T a entre -20 Y -80°e. Congelación criogénica -196°C
, Cambia poco las caracteríticas
r Aumenta la vida útil del producto
, Eliminación actividad microbiológica y enzimática
 , Reducción actividad biológica
El agua en 'los tejidos:
, Agua ligada a proteínas, lipoproteínas, etc., que no sufre
cambios durante la congelación
, Agua retenida en las estructuras celulares e intercelulares, que
es la que se transforma en cristales de hielo
Dos procesos de congelación:
, Congelación lenta (-20, -40 o -BO°C): forma cristales grandes.
El agua intercelular tiene menos nutrientes, se congela primero,
+ Inutrientes], sale agua de las células --+ + Isolutoslint --+

deshidratación y desnaturalización de las proteínas + rotura

membrana celular.
, Congelación muy rápida (-196°C): gases criogénicos. Primero se
congela el agua del interior de las células formando cristales
pequeños y luego se forman cristales más grandes extracelulares.
Cambios de textura mucho menores.
Ventajas de la congelación criogénica:
, Calidad bacteriológica: reducción o eliminadón de las
actividades microbianas o enzimáticas.
, Calidad física: cristales más pequeños --+ conservación mucho
mejor de la estructura de la muestra
, Seguirán teniendo lugar las pérdidas de vitaminas, oxidaciones
de lípidos y la degradación por enzimas, aunque de forma lenta.
Factores que influyen en la viabilidad y estabilidad de células congeladas:
1. Edad de las células
2. Velocidad en la congelación y descongelación
3. Temperatura de almacenamiento
4. Agentes crioprotectores

-DESECACiÓN: eliminación del agua hasta que es similar a la del ambiente

-DESHIDRATACiÓN: el agua se extrae casi totalmente
-Transferencia de calor
, Transferencia de calor desde los alrededores a la muestra
 , Conducción calor dentro de la muestra y evaporación en la
superficie
, Transferencia de masa (humedad) desde el interior hacia la
superficie del material + superficie hacia alrededores
, Secadores con T a max entre 425 y 760°C, con estantes perforados
con sistemas de ventilación.
-Características del secado:
1. impide el desarrollo de microbios
2. disminuye la actividad de los enzimas de degradación
3. bajo coste de transporte y almacenamiento por
disminución del volumen y no necesitar frío
4. se desnaturalizan las proteínas y sustancias termolábiles
5. hay degradación química
6. hay oxidación
7. proceso de larga duración
 ..
TEMA 21. SISTEMAS DE CONSERVACiÓN DEL GERMOPLASMA
VEGETAL

RECURSOS FITOGENETICOS
Todo material vegetal, cultivado, silvestre o arvense es considerado como
recurso fitogenético. Son la materia prima para la mejora genética vegetal,
tanto presente como futura. En ellos se encuentran los genes que han sido
seleccionados o bien por el hombre, o bien por la naturaleza por su adaptación,
productividad o resistencia.
En los últimos años, la aparición de nuevas tecnologías, la sustitución de
variedades locales por variedades importadas, la colonización de nuevas tierras,
los cambios en las técnicas de cultivos, etc., están provocando un considerable
deterioro de la variabilidad (erosión genética) que puede llevar a la extinción de
un material de valor incalculable.
Son varias las causas de esta erosión:
1-.Demanda por parte del mercado de uniformidad para los productos agrarios.
2-.Desaparición de las pequeñas unidades de cultivo de variedades autóctonas
para autoconsumo.
3-.Desaparición de muchas especies, debido a la desertización, contaminación,
incendios, sustitución de suelo agrícola para otros usos etc.

La conciencia creada a nivel internacional sobre la necesidad de conservar en lo

posible la mayor parte de los recursos fitogenéticos, puso en marcha mecanismos
adecuados para conseguir dichos objetivos: ayudas económicas para la
recolección, evaluación, conservación, documentación (informatización de los
datos) y intercambio.
Para llevar a cabo estas acciones coordinadas se creo en 1974 un consejo
internacional de Recursos Fitogenéticos (CIRF) conocido también en países de
habla inglesa como (IBPGR) International Board for Plant Genetic Resources.

En los últimos años, los mercados han sido conquistados por un pequeño grupo de
variedades uniformes para cada especie que han estrechado la base genética de
los cultivos más importantes por lo que podemos extraer dos conclusiones:
La conveniencia de ampliar la base genética de los cultivos. Es decir no limitar la
producción de una especie a un reducido número de variedades.
La necesidad de colectar el material heterogeneo primitivo y silvestre (los
recursos fitogenéticos) en sus centros de origen y diversidad antes de que se
pierdan.
1. RECOLECCiÓN
Las acciones coordinadas de búsqueda promovidas por el CIRF (IBPGR) están
enmarcadas por un orden de prioridades con relación a las especies y a las
regiones, teniendo en cuenta el mayor o menor peligro de extinción, utilidad,
recursos humanos disponibles etc. Para la mayor parte de las especies el
material que ha de recogerse son semillas. Los datos de campo son muy
importantes (características climáticas, la información procedente de los
agricultores de la zona ... )
2. CONSERVACiÓN
La conservación es quizás la fase que requiere mayor ayuda ya que precisa de
instalaciones adecuadas (cámaras frías, estancias para la desecación previa del
material, procedimientos de congelación, métodos de propagación del material
etc.). La conservación del germoplasma en condiciones de propagación
indefinida es la actividad central de un banco de germoplasma. Los métodos de
conservación de recursos fitogenéticos pueden clasificarse en dos grandes
categorías:
• Métodos de conservación in situ: consisten en preservar las variedades o
poblaciones vegetales en sus hábitats originales
• Métodos de conservación ex situ: consisten en la conservación en los
llamados bancos de germoplasma.

Bancos de Germoplasma
Son los lugares (cámaras, estancias) e instalaciones anejas donde se conserva el
material vegetal.
Se clasifican en tres tipos, según su dinamismo:
Bancos Base: En ellos el material ha de conservarse a largo plazo (muchos años).
Su finalidad es la conservación y la protección. Las cámaras de conservación han
de estar entre -18 y -20°C Y la HR, inferior al 6%.
 •

Las colecciones de los bancos base, son mantenidas como legados para las
generaciones futuras y no puede extraerse de ellos nada, excepto para la
realización de pruebas de viabilidad y subsiguiente regeneración. El material que
puede ser enviado a mejoradores e investigadores procede de los bancos activos.
Bancos Activos: El materia~ es multiplicado y sometido al menos a una
preevaluación. Su conservación es a medio plazo. Las condiciones de
conservación oscilan entre 5 y 6°( Y la HR del 30 al 40%.
Bancos de mejora: Son los que manejan los mejoradores cotidianamente, y por
tanto precisan entradas y salidas de materiales cotidianamente, se adicionan
generaciones segregantes y nuevos materiales según las necesidades. La
conservación es a corto plazo.

Procedimientos para la conservación del material vegetal.

Dependerá de cual sea la clase de material (semilla, polen, partes vegetativas) y
del tiempo deseado de conservación.

a) La conservación de semWas conlleva el procedimiento más sencillo, siendo

por otra parte el más utilizado.
El fundamento consiste en desecar las semillas, y mantenerlas en bolsas o tarros
cerrados herméticamente dentro de cámaras frigoríficas. Se pueden desecar por
medios físicos (baja HR y temperatura) o añadiendo un desecante (Gel de Sílice,
que cuando absorbe toda la humedad cambia de azul intenso a rosa pálido)
a.1) A corto o medio plazo (p.e. durante 15 años): no es necesario mantenerlas a
temperaturas muy bajas (4°C), siempre y cuando hayan sido correctamente
envasadas y desecadas. Los mejores recipientes para la consevación a corto­
medio plazo son los envases de vidrio con un buen cierre.
a.Z) A largo plazo: Las cámaras de conservación han de estar entre -18 y -ZOO( y
la HR, inferior al 6% y se mantienen en latas metálicas por su resistencia y
hermeticidad.
Temperaturas y humedades altas afectan muy negativamente a su conservación.
Pero no todas las semillas pueden someterse a esas condiciones sin peligro de ser
destruidas.
 •
-Las semillas ortodoxas son aquellas que se pueden conservar en dichas
condiciones.
-Las semillas recalcitrantes (mango, nogal etc.) no toleran el tratamiento
anterior. La reducción de la HR interna provoca procesos químicos irreversibles
con un gran riesgo para su viabilidad posterior.
Las especies recalcitrantes se conservan en campos de multiplicación ("in situ" o
"ex situ") o bien mediante cultivo "in vitro".
-Semillas intermedias: tienen cierta sensibilidad a la desecación hasta un nivel
de HR de 7 -10%. Sin embargo, su longevidad se reduce a temperaturas bajas (por
debajo de 5°C). Por esto, las condiciones ideales para las semillas intermedias es
un 7-10% de contenido de humedad y una temperatura de laboratorio

b) Almacenaje "in vitro" del germoplasma: tiene un gran interés para las especies
de reproducción vegetativa y recalcitrantes. La base de estos métodos consiste
en la introducción de explantes (partes de tejido vegetal),
en medios de cultivo estériles con alto nivel de sacarosa (80 gIL), baja
irradiación y temperatura de 10 oC, manteniéndolos en los mismos el máximo
tiempo posible antes de ser regenerados. Los tejidos cultivados "in vitro" pueden
ser mantenidos en principio, indefinidamente bajo condiciones normales de
crecimiento, sin más que suministrar los nutrientes requeridos. Sin embargo,
esto implica una alta multiplicación celular del tejido, lo cual no es deseable
desde el punto de vista de conservación del germoplasma, ya que la tasa de
mutaciones es entonces alta. Es necesario mantener el tejido en unas
condiciones de crecimiento mínimo, con el fin de reducir la variación somaclonal
(variación originada por el cultivo "in vitro"). La inducción de condiciones de
crecimiento mínimo puede akanzarse del siguiente modo:
- Reducción de la temperatura.
- Omisión o reducción en el medio de algún factor esencial para el crecimiento
- Aplicación de hormonas (por ejemplo ABA) o de inhibidores osmóticos como el
manitol.
- También es aconsejable reducir el nivel de intensidad lumínica, sin embargo, la
oscuridad total nos conduciría a la etiolación de los cultivos.
 •
- iopreservación: la conservación del material vegetal a ultrabajas
:.e~p eraturas ha abierto la posibilidad del almacenaje indefinido de
~er moplasma. Esto se consigue mediante la inmersión del material en nitrógeno

iquido (-196 OC). Es conveniente el uso de crioconservantes para evitar daños en

los tejidos. Si el proceso de congelación es demasiado lento se produce una
deshidratación celular. De lo contrario, si es demasiado rápida se forman
cristales.
Cuando se descongela el germoplasma se aconseja someter a las células frescas a
ciertos cuidados intensivos de protección (lavados repetidos para eliminar el
crioprotector y reemplazarlo por su medio de cultivo habitual).
Se pueden congelar:
-Suspensiones celulares
-Protoplastos
-Callos
-Embriones
-Anteras y polen
-Vástagos apicales

d) Ozonoterapia: se aplica un tratamiento con ozono, no solo para la

conservación de las semillas y granos, sino para la prevención de plagas que se
alimentan de estos cuando se encuentran almacenados.

Tanto para el crecimiento lento como para la crioconservación se recomienda

verificar el éxito en el almacenamiento evaluando su viabilidad.
3. UTILIZACiÓN
Los recursos fitogenéticos son considerados patrimonio de la humanidad, y por
tanto deben estar a disposición de quienes los necesiten. Para que su utilización
pueda ser efectiva es necesario completar las siguientes fases.
Multiplicación, Evaluación, Documentación.
Es necesario disponer de una información descriptiva del material, debidamente
organizada, para conocer qué existe almacenado y sus características. Sin esta
información los mejoradores no podrían hacer uso de este material. Además una
información detallada también permite conocer si los nuevos materiales que van
entrando ya estaban conservados.
Esta información descriptiva se almacena y procesa mediante el empleo de
unidades de información que se denominan Descriptores. Existen diferentes
categorías de descriptores:
-Datos de pasaporte: Consisten en los datos registrados en el momento de
realizar la colecta en el campo, junto con nombres y números de identificación.
(Lugar, altitud, clima etc..)
-Datos de caracterización: Son datos sobre caracteres heredables, fácilmente
apreciables visualmente y que se expresan en cualquier ambiente.
-Datos de evaluación preliminar: Son descripciones de un número determinado
de caracteres adicionales que se consideran de interés para los usuarios de dicho
cultivo. Debe ser posible evaluarlos visualmente pero no es
necesario que se expresen en todos los ambientes (reacción frente a
enfermedades, resistencia a sequía, frio, tolerancia a salinidad etc.)
-Datos de evaluación completa: Se trata de información sobre caracteres
relacionados principalmente con programas de mejora.
 TEMA 21. SISTEMAS DE CONSERVACiÓN DEL GERMOPlASMA
VEGETAL

-Recursos fitogenéticos: todo material vegetal, silvestre o arvense, donde se

encuentran los genes que han sido seleccionados o bien por el hombre, o bien
por la naturaleza por su adaptación, productividad o resistencia.

-Deterioro de la variabilidad (erosión genética):

~ Sustitución variedades locales por importadas
>- Cambios técnicas de cultivos
>- Demanda de uniformidad
>- Desaparición de pequeñas unidades de cultivo
~ Desertización, contaminación, incendios

-Consejo internacional de recursos fitogenéticos (CIRF): recolección,

conservación, evaluación, documentación e intercambio. Objetivos:
:y Ampliar la base genética
>- Colectar material heterogéneo primitivo antes de extinción

-RECOLECCiÓN:
>- Orden de prioridades
>- Datos de campo
-CONSERVACiÓN: métodos de conservación de recursos fitogenéticos:
>- Métodos de conservación in situ: hábitat originales
>- Métodos de conservación ex situ: bancos de germoplasma =
instalaciones anejas donde se conserva el material vegetal:
o Bancos Base: a l argo plazo
• -18 Y -20°C Y HR inferior al 6%
• No puede extraerse nada de ellos
• Legado para generaciones futuras
o Bancos Activos: a medio plazo.
11 S-6°C Y H'R del 30 al 40%
• Puede ser enviado a mejoradores e investigadores
 •

o Bancos de Mejora: a corto plazo

• Los manejan los mejoradores cotidianamente
• Entradas y salidas de materiales frecuentemente

-Procedimientos de conservación del material vegetal:

a) Semillas: desecación y conservación en tarros cerrados
herméticamente dentro de cámaras frigoríficas
a. A corto o medio plazo: bien envasadas y desecadas a 4°(
b. A largo plazo: latas metálicas entre -18 y -20 0 ( Y HR < 6%
Tipos de semillas:
~ Semillas ortodoxas: se pueden conservar en dichas
condiciones
~ Semillas recalcitrantes: no tolera HR baja
~ Semillas intermedias: tolera HR de 7 -10% pero
reduce su longevidad a P < 5°(
b) In Vitro: explantes en medios de cultivo en condiciones de
crecimiento mínimo:
a. Reducción de la temperatura (10°C)
b. Omisión o reducción de algún factor esencial para el
crecimiento
c. Hormonas (ABA) o inhibidores osmóticos
d. Reducir nivel de intensidad lumínica
c) (riopreservación: almacenaje indefinido de germoplasma.
(rioprotector.
a. Suspensiones celulares
b. Protoplastos
c. (allos
d. Embriones
e. Anteras y polen
f. Vástagos apicales
d) Ozonoterapia: prevención de plagas
 -
-UTIUZACIÓN : los recursos fitogenéticos deben estar a disposición de quienes
los necesiten pero antes completar las siguientes fases:

-MULTIPLICACiÓN: regeneración
-EVALUACiÓN: de la viabilidad
-DOCUMENTACiÓN: información descriptiva del material. Descriptores
(unidades de información):
y Datos de pasaporte: nombres, lugar, altitud, clima
y Datos de caracterización: caracteres heredables que se expresan
en cualquier ambiente
y Datos de evaluación preliminar: caracteres adicionales de interés
que no se expresan en todos los ambientes (resistencias ... )
y Datos de evaluación completa: caracteres relacionados con
programas de mejora.
 ...

TEMA 26. EXTRACTOS DE PROTEíNAS

Análisis bioquímico c:=:::> romper células c:=:::> disociación celular c:=:::> separación
diferentes tipos celulares c:=:::> extractos

1. Extracción tejido del animal o planta

2. Aislamiento células del tejido
2.1. Disgregación a 4°C, pH 7 en medio isotónico
2.1.1. Tripsina
2.1.2. EDTA
2.2. Separación diferentes tipos celulares
2.2.1. Centrifugación
2.2.2. Adhesión substrato
2.2.3. Anticuerpos
2.2.4. Citometría de flujo
2.3 . Cultivo celular
2.3.1. Cultivos primarios
2.3.2. Cultivos secundarios
2.3.3. línea celular
2.3.4. línea celular transformada
3. Preparación de homogenados
3.1. Lisis celular suave
3.1.1. lisis osmótica
3.1.2. lisis por congelación y descongelación
3.1 .3. lisis por detergentes
3.1.4. lisis enzimática
3.2. Lisis celular vigorosa
3.2.1. Sonicación
3.2.2. Lisis por presión celular
3.2.3 . Molido
3.2.4. Homogenización
3.2.5 . Homogenización con bolas de cristal
4. Fraccionamiento celular
4.1. Método de centrifugación
4.2. Método de velocidad de sedimentación
4.3 . Método de equilibrio de sedimentación
5. Aislamiento de proteínas
5.1. Precipitación de proteínas
5.1.1. Sulfato amonio
5.1.2. TCA
5.1.3. Acetona
5.1.4. TCA en acetona
5.1.5. Amonio acetato en metanol seguido de extracción con fenol
5.2. Cromatografía
5.2.1. Intercambio iónico
5.2.2. Hidrofobicidad
5.2.3. Filtración por gel
5.2.4. Afinidad
 . ~\ ""'L ,~' •

r
~_,c-c1(

4.
5
 TEMA 29. MICROSCopíA
-
TÉCNICAS DE OBSERVACiÓN MICROSCÓPICA

-Bajo contraste de las células se solucionó utilizando colorantes

-Estudio vital: FRAP, FRET, TL, fotoactivación. Métodos de transfección
-Estudio post vital:
1. Fijación (mamíferos, plantas)
2. Inclusión l(.rl'~
l.J \';,.td., \...~u.o:....
( \c:.sn.J.~~\
3. Corte ¿- Lo , ... -~ ~ r<.J\l
1Uu.u ~ -/
4. Tinción:
a. Histológicas • t.~c: c:. b~o_ \.-t)Li~
b. Citológicas \ '--~\., ¿1~ruQ.I.()~ UJ.~( ~ ~~~,
5. Montage de la preparación

MICROScopíA ÓPTICA (200 nm)

r Microscopía visible: fuente de iluminación, lentes (condensador,
objetivo y ocular)
o Mkroscopía de campo claro
o Microscopía de campo oscuro
() Microscopía de contraste de fases
o Nomarski
r Microscopía ultravioleta: fuente iluminación Hg, filtros
excitación, filtros barrera.
o Microscopía de fluorescencia convencional
o Microscopía confocal

MICROScopíA ELECTRÓNICA (3 Á) ' . ._L- e

~\.I..L ~~........'tQ. '1<..?k.~ lll, .0
,J o P" . ) •. \ I
I \ '- L(? kí
r De transmisión '0 t~\ ~ ~\¡L...., ~ <.l l
I ~-
r Sistema de iluminación: filamento de tungsteno conectado a un
diferencial de potencial = emisión de electrones. Lentes
electromagnéticas.
 •

r Sistema de elaboración de la imagen: lente proyectora que concentra

los electrones formando una imagen
r Sistema de visualización: imagen proyectada en una pantalla, no la
formada por los electrones. + sistema fotográfico

, De barrido: la radiación electrónica recorre la superficie de la muestra

y emite electrones secundarios que formarán la imagen . le s ~ - (~~dJ,
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 •
TEMA 32. TECNICAS RELACIONADAS CON PROTEíNAS

-Genoma: libro de instrucciones generales y quienes realizan el trabajo de

verdad son las proteínas.
-Proteoma: conjunto de proteínas que intervienen en los procesos biológicos
-ADN con solo 4 nucleótidos y se encuentra en el núcleo; las proteínas están
construidas por 20 aa diferentes y pueden encontrarse en ciertos tipos
celulares y sÓ'~o en ciertas fases del desarrollo
-Proteómica: determinar la composición, estructura y funciones de todas las
proteínas.
, Composición: secuenciación directa o espectrometría de masas
, Estructura: cristalografía de rayos X
, Función: comparación con otras proteínas, interacciones con
otras proteínas, generación de mutantes

-Purificación de proteínas: requisito previo para muchos de los avances

biotecnológicos.
, Lisis celular: separación componentes celulares.
o Bajas temperaturas
o Inhib~dores de proteasas
() Desnaturalización
Dos tipos de lisis:
o Lisis suaves: de fácil lisis celular y fraccionamiento celular
• Lisis osmótica
• Lisis por congelación y descongelación
• Lisis por detergentes
• Lisis enzimática
o Lisis vigorosas: tejidos sólidos o células con pared celular
• Sonicación
• Lisis por presión celular
• Molido
• Lisis por homogeneización
• Homogeneización con bolas de cristal
 ..
,.. Precipitación de proteínas: la precipitación está seguida de la
resuspensión de la muestra en una solución.
o TCA (tricloro acético)
() Acetona
,.. Cromatografía: separación de los componentes de una mezcla.
Corumna con resina por la que pasa la muestra y se recoge en
diferentes fracciones.
o Intercambio iónico
o De hidrofobicidad
o Filtración por gel
() De afinidad

-Cuantificación de proteínas: espetrómetro de UV / método Bradford

(reacción colorimétrica que tiñe las proteínas).

-Electroforesis: separación de proteínas en función del peso molecular a

través de un gel de poliacrilamida al aplicar un campo eléctrico.
Posteriormente se tiñen las proteínas con azul de Coomassie o plata
,.. Estudios de fosforilación: 32 p
,.. Estudios de marcaje de proteínas: 35S
,.. Secuenciación por espectrometría de masa. Primero tiene lugar
la proteolisis de la banda del gel
,.. Purificación de la banda para sintetizar anticuerpos
,.. Western-Btot: transferir las proteínas del gel a una membrana de
nitrocelulosa la cual se incuba con el anticuerpo específico

-Electroforesis 20: separación de proteínas según su punto isoeléctrico y su

peso molecular. Se aíslan directamente del gel para anal izarlas por
espectrometría de masas o se transfiere a membrana para inmunodetección.

-Espectrometría de masas: ha simplificado el análisis y caracterización de las

proteínas. Se analizan péptidos obtenidos por digestión enzimática de la
proteína de interés y sus masas moleculares se correlacionan con las
calculadas teóricamente con la misma digestión que se encuentran en las
bases de datos. Se genera una tabla de posibles proteínas candidatas.

Espectrómetro de masas (MS): técnica para formar iones en fase gaseosa de

moléculas , separarlos y determinar su peso molecular. Tres partes esenciales:
1. Fuente de ionización: rompe las moléculas en puntos
determinados relacionados con el tipo de enlace formando iones
a. MALDI-MS: por láser
b. ESI-MS: nebulización
2. Campo eléctrico: separa los iones según sus masa/carga
3. Detector de iones: mide la cantidad de iones y el tiempo de
llegada
a. Analizador de cuadrupolo
b. Analizador de tiempo de vuelo (TOF)

Estrategia:
1. Degradación química o enzimática de la proteína de interés
2. Purificación mediante HPLC
3. Análisis por MS
4. Buscar coinc idencias entre el peso molecular obtenido con los
datos de la base de datos

-Sistema de los dos híbridos: utiliza la levadura y un gen marcador de

localización de la actividad transcripcional para identificar las proteínas
asociadas a la proteína cebo .
1. Fusión del ADN de la proteína cebo al de una proteína de unión a
ADN lexA clonados en un plásmido de expresión. La levadura
huésped tiene dos genes marcadores, leu y lacZ, con sus
correspondientes regiones de activación UAS, que responde a la
transcripción del operador LexA
2. Transformación de la levadura que lleva el cebo con la librería
de cDNA. Librería-act(activador de la transcripción) + cebo -lexA

1
 LexA se une a los promotores UAS

l
Transcripción de Leu y l acZ

3. Aislar los plásmidos de las levaduras que crecen en ausencia de

leucina y son azules, transformarlos en E. colí y caracterizar os
insertos por PCR y mapas de restricción
La levadura es una limitación cuando las modificaciones postranscripcionales
son requeridas para la interacción proteína-proteína.
Esta técnica da muchos fa~sos positivos debido en parte a la autotranscripción
de la proteína cebo.
 'lO

TEMA 32. ANÁLISIS DE PROTEíNAS

1. Aislamiento células del tejido
1.1. Disgregación a 4°C, pH 7 en medio isotónico
1.1.1. Tripsina
1.1.2. EDTA
1.2. Separación diferentes tipos celulares
1.2.1. Centrifugación
1.2.2 . Adhesión substrato
1.2.3. Anticuerpos
1.2.4. Citometria de flujo
1.3. Cultivo celular
1.3.1. Cultivos primarios
1.3.2. Cultivos secundarios
1.3.3. línea celular
1.3.4. línea celular transformada
2. Lisis
2.1. Lisis celular suave
2.2 . Lisis celular vigorosa
3. Purificación de proteínas
3.1. Centrifugación
3.1.1. Método de centrifugación
3.1.2. Método de velocidad de sedimentación
3.1.3. Método de equilibrio de sedimentación
3.2. Cromatografía
3.2 .1. Intercambio iónico
3.2 .2. Hidrofobicidad
3.2.3. Filtración por gel
3.2.4. Afinidad
3.3. Electroforesis
3.3.1. SDS-Page
3.3.2 . 2 dimensiones
4. Cuantificación y detección de proteínas
4.1 . Métodos espectrofotométricos
4.1.1 . Az80
4.1.2. Azo 5
4.1.3 . Fluorescencia
4.2. Métodos colorimétricos
4.2.1. Bradford
4.2.2. Lowry
4.3. Métodos de inmunodetección
4.3.1. EUSA
4.3.2. Westem Blot
4.3 .3. Inmunocitoquímica
5. Análisis de proteínas
5.1. Secuencia
5.1.1 . Edman
5.1.2. Espectrometria de masas
5.2. Estructura
5.2.1. Difracción de rayos X
5.2.2. RMN bidimensional
5.3. Función
5.3.1. Comparación con otras proteínas
5.3.2. Interacción con otras proteínas
5.3.3. Generación de mutantes
I •
ESPECTROMETRÍA DE MASAS

La Espectrometría de Masas ó Espectroscopía de Masas, es una técnica instrumental que permite la

generacion de iones en fase gaseosa además de su separación y detección.

Un espectrómetro de Masas determina el peso molecular de los compuestos químicos mediante la

ionización, separación y medida de los iones moleculares acorde con su relación masa/carga (m/z). Una
vez los iones han sido formados en fase gaseosa pueden ser electrostáticamente dirigidos al analizador,
separados según sus masas y finalmente detectados.

El resultado de la ionización, separación de iones y detección es lo que se conoce como espectro de

masas de cuyo estudio se puede extraer información acerca del peso molecular y acerca de su estructura.
La rotura de la molécula se efectúa en puntos determinados de la misma, relacionados con el tipo de
enlace, por ello se obtiene información sobre la estructura de la molécula. El espectro de masas de cada
sustancia es único, lo cual permite aplicarlo al análisis cualitativo.

Los espectrómetros de masas se han convertido en instrumentos de capital importancia en un amplio

rango de aplicaciones en el análisis de compuestos orgánicos, inorgánicos y bio-orgánicos. Análisis de
isótopos en la determinación de la edad geológica, detección de drogas, monitorización de procesos en la
industria petrolífera, química y farmaceutica, análisis de superficies e identificación estructural de
compuestos desconocidos son ejemplos de uso de forma rutinaria. Los mas recientes avances han
permitido su introducción en el campo de moléculas biológicas como virus, DNA, proteínas y
descubrimiento de nuevas drogas.

Esta técnica acoplada a métodos de separación como HPLC, electroforesis capilar o cromatografía de
gases permite realizar mediante una sola manipulación los espectros de masas de los diferentes
constituyentes de una mezcla.

En el espectro de masas se representa la abundancia del fragmento respecto la relación masa/carga.

Cada uno de estos picos se denomina ABUNDANCIA. El poder de separación de un espectrómetro de
masas se describe por la RESOLUCiÓN que se define como

R= m/~m

Donde m es la masa del ion (de masa menor) y ~m la diferencia de masas entre dos picos resueltos en un
espectro de masas.

Ej. R= 1000 significa que se pueden distinguir (resolver) un ión cuya relación masa/carga sea 100.0 de
otro cuya masa/carga sea 100.1

Tras la secuenciación del genoma humano, la atención científica se ha desplazado hacia el análisis de los
productos de los genes, es decir, las proteínas. La proteinómica estudia las proteínas y sus funciones
tanto en un estado fisiológico normal (sano) como en la enfermedad. La espectrometría de masas tiene
una importancia crucial para identificar y caracterizar las proteínas en los proyectos de proteinómica de
expresión (determinación a gran escal'a de las proteínas formadas en una célu l1a)

COMO OPERA UN ESPECTRÓMETRO DE MASAS

- Crear iones en fase gas

- Separar los iones en espacio o tiempo basándose en su relación masa/carga
- Medir la cantidad de iones de cada relación masa/carga

Las cinco partes básicas de un espectrómetro de masas incluyen: un sistema de vacío, un sistema de
introducción de muestras, una fuente de ionización, un analizador de masas y un detector de iones.

Sistema de Vacío
 -
El sistema de vacío es fundamental en el EM por ser de capital importancia conseguir un medio
donde no tengan lugar colisiones con los iones procedentes del aire. El grado de vacío necesario depende
del analizador, oscilando entre 10-4 a 10-6 torr para cuadrupolo y tiempo de vuelo y 10-7 Y10-9 para sector
magnetico y transformada de Fourier.
Este alto nivel se consigue mediante la utilización de dos tipos básicos de bombas de alto
vacío,(asistidas por bombas de vacio previo o rotatorias), como son las bombas difusoras y las bombas
turbomoleculares.

Creación de iones en fase gas (METODOS DE IONIZACiÓN)

-Impacto electrónico:
La muestra en fase gas se bombardea con un haz de electrones generados por un filamento de
tungsteno. Un electrón del haz arranca un electrón del analito dando lugar a un catión (también pueden
generarse aniones, pero lo hacen del orden de 100 veces menos)
En moléculas poliatómicas tienen lugar reorganizaciones que desembocan en roturas concretas de la
molécula, por lo que se obtienen distintos fragmentos ionizados

- Ionización química:
Se utiliza un ion que reacciona con Ilas moléculas a analizar para formar iones, ya sea por transferencia de
un protón o de un hidruro. Estos iones reactivos se generan sometiendo un exceso de metano a impacto
electrónico, produciéndose CH/ que a su vez reacciona consigo mismo para dar CH s+ y C2Hs+

Mediante esta técnica se consigue conocer el PM del compuesto que, al transferirle un protón aparece a
PM+1.

Existen otras técnicas de ionización aparte de estas dos que serían las clásicas (ver
http://www.chem.vt.edu/chem-ed/ms/ionizatn.html) de las que vamos a mencionar las que se aplican a
macromoléculas:

-Plasma-desorption ionization (PO)

La decaída del isótopo 2s2Cf produce dos fragmentos de fisión que viajan en direcciones opuestas. Uno
impacta contra la muestra produciendo iones y el otro choca contra el detector e inicia la adquisición de
datos

- Oesorción de matrices asistida por laser- Matrix-assisted laser desorption ionization (MALO/)

Basado en ionización por laser. Vaporiza e ioniza moléculas biológicas de gran tamaño, como proteínas
o fragmentos de DNA. Las moléculas biológicas están dispersas en una matriz sólida como ácido
nicotínico o dihidroxibenzóico sensibles a la radiación UV. Por efecto del laser, la matriz junto con alguna
de las moléculas pasa a fase gas en una forma ionizada, de modo que pueden ser introducidas en el
espectrómetro de masas

- Fast-atom bombardment (FAB)

Un haz de alta energía de átomos neutros, Xenon o Argón, impactan sobre una muestra sólida o líquida
de baja presión de vapor, causando la desorción y la Ionización. Se aplica a moléculas biológicas
grandes que tienen dificultades para pasar a fase gas.

La muestra generalmente se dispersa en glicerol. FAB causa poca fragmentación y suele dar un pico
molecular alto, útil para determinar el peso molecular.

- Electrospray ionization (ES/)

Consiste en un aguja muy fina y una serie de skimmers (conos metálicos cuya función es extraer la
muestra hacia el MS en condiciones de vacío creciente).

La muestra en disolución se introduce en forma de spray en la fuente, forzando su paso a través de la

aguja al final de la cual se aplica un potencial. Las pequeñas gotas formadas están cargadas y, a medida
que se evapora el disolvente, aumenta la densidad de carga en su superficie, llegando un momento que
las fuerzas de repulsión superan la tensión superficial y la gota se rompe. Este proceso se repite varias
veces hasta que sólo quedan las moléculas sin disolvente y altamente cargadas. Estas moléculas, ya en
fase gas, son dirigidas al analizador mediante la aplicación de vacío creciente

Esta técnica es muy útil para moléculas biológicas grandes que son difíciles de evaporar o ionizar.

Separar los iones en espacio o tiempo basándose en su relación masa/carga (ANALIZADOR DE

MASAS)

Inmediatamente después del proceso de ionización, los iones en fase gaseosa entran en la región del
analizador, que es la zona del instrumento en donde los iones, dentro del rango de masas seleccionado,
son separados en base a su relacción masa/carga . Esta parte del instrumento juega un importante papel
en cuanto a la precisión y exactitud de las masas a medir.

Los analizadores mas ampliamente utilizados hoy día son los siguientes:

Analizador de Cuadrupolo

El analizador de cuadrupolo consiste en cuatro rodillos paral'elos a los que se aplica una corriente
contínua (OC) sobre la que se superpone un potencial de radiofrecuencia (RF). El campo creado en los
rodillos actúa a modo de filtro y determina que iones alcanzarán el detector. Un espectro de masas se
conseguirá barriendo (scanning ) el campo RF dentro de un rango de frecuencias.
El analizador de cuadrupolo es uno de los mas extendidos hoy día.A su relativa sencillez se une una alta
tolerancia a vacíos relativamente pobres, rango de masas de hasta 3000 Da que le hace muy adecuado
para ser acoplado a interfases de cualquier tipo, incluida la ESI, para el análisis de proteínas y
biomoléculas y lo que es mas importante, su relativo bajo costo. Su principal desventaja es la
imposibilidad de realizar análisis de alta resolución, masas exactas,etc, así como su limitación en cuanto a
rango de masas.

-Trampa lónica (Quadrupole Ion Trap)

Los iones generados en la fuente son "atrapados", durante un cierto tiempo, en un campo de
radiofrecuencia dentro de un anillo toroidal situado entre dos electrodos hiperbólicos.
Mediante la aplicación simultanea de corrientes OC y RF se consigue "atrapar" y mantener dentro del
anillo central los iones procedentes de la fuente de iones. Una vez alH, dichos iones pueden ser extraídos
a voluntad aplicando corrientes de radiofrecuencia variables hasta valores de resonancia y expulsados a
traves del anillo de salida. La posición de los anillos exteriores puede ser modificada para una mayor
eficiencia de transmisión .
Un espectro de masas completo se obtiene mediante el barrido de un rango de radiofrecuencia
determinado.
Las trampas iónicas tienen usos y utilizaciones similares a los cuadrupolos y está muy extendido su uso
como detectores de masas en sistemas CG-EM . Otra aplicación muy extendida es la posibilidad de
n
utilizarlos en la técnica de masas-masas (MS ), puesto que permite la extracción de iones individuales
(Parents lons) que posteriormente pueden ser fragmentados para análisis estructural ( Daughter lons)

- Analizadores de Sector Magnético v Doble enfoque

Los analizadores de sector magnético y doble enfoque se basan en el efecto que sobre una partícula
cargada tienen un campo eléctrico y un campo magnético. El primero, actúa sobre el haz de iones a modo
de filtro energético y es independiente de la masa del ión o de su relacción masa/carga. Mediante este
 •
analizador se consigue colimar los haces iónicos que emergen de la fuente en haces monoenergéticos
uniformes. Una vez conseguido esto, estos haces iónicos son dirigidos a la entrada de un campo
magnético sectorial. El campo magnético sirve para separar los iones en base a su masa/carga y el radio
de curvatura descrito por ellos es una función del campo magnetico (B) aplicado. Este campo magnético
es generado por una corriente de intensidad variable. Solo aquellos iones cuyo radio de curvatura descrito
coincida con el del sector magnetico alcanzarán el detector. Un espectro de masas se consigue variando
la intensidad (1) aplicada al electroimán.
Se consigue asi, mediante la combinación de estos dos sectores, un incremento del poder de resolución
considerable, en contraposición al pobre poder de resolución de sistemas con solo sector magnético.

- Analizador de Transformada de Fourier (FTMSJ

El analizador de Transformada de Fourier esta basado en la acción que un campo magnético ejerce sobre
una partícula cargada (ión) girando en un campo de radiofrecuencia. Mediante el primero, los iones son
dirigidos al interior de una caja donde giran describiendo una orbita de diámetro reducido y mínima
frecuencia. Por aplicación de una señal de radiofrecuencia (RF) los iones son excitados a describir órbitas
espirales de amplitud creciente. Llega un momento en que la orbita descrita es tal que alcanza el diámetro
igual a la distancia de separación de dos electrodos detectores, momento en el cual son detectados
originando una imagen de corriente, que es función directa de su relacción masa/carga. Esta imagen de
corriente es integrada mediante una transformada de Fourier y convertida en una señal proporcional a su
intensidad. El espectro completo se obtiene mediante un barrido del campo de radiofrecuencia aplicado
que varia entre 8 KHz y 100 MHz.
La principal ventaja de este tipo de instrumentos esta en la altísima precisión en la medida de masas (
0.001 % Y superiores) y un poder de resolución casi ilimitado. Por el contrario, el nivel de vacío es un
parámetro crítico y su costo es muy elevado.

-Analizador de Tiempo de Vuelo

El analizador de tiempo de vuelo es, en cuanto a fundamento , uno de los analizadores mas simples de los
que se utilizan hoy en día.
Se basa en la medida del tiempo que tardan los iones generados y acelerados con igual energía en la
fuente de iones,en alcanzar un electrodo colector situado a una distancia prefijada. Como los iones
poseen la misma energía pero diferentes masas alcanzarán el colector a diferentes tiempos, dependiendo
de su masa, carga y energía cinética.
En el pasado, y debido a las limitaciones de tipo electrónico y de software, su uso fue muy limitado
debido a su escaso poder de resolución y rango de masas. No es de extrañar que durante años este
analizador estuviera poco menos que olvidado. Sin embargo, en la última década, y debido precisamente
a los enormes avances en el campo de la microelectrónica y el software ha recibido un increíble
impulso,hasta el punto de que actualmente, junto con los analizadores de cuadrupolo, es el analizador
más ampliamente utilizado

- Analizadores combinados (Tandem Mass SpectrometrvJ

Los analizadores combinados se utilizan de forma generalizada para análisis de estructuras, ya que
mediante ellos y en combinaciones adecuadas se pueden hacer experimentos de fragmentacion ( MS de
grado n=1, 2, 3, etc.)
Así por ejemplo, se puede situar un analizador magnetico (MS\ ya continuación situar un analizador de
trampa iónica para ver los iones hijo que proceden de un ion padre extraido del primero (MS 2) . A
continuación un ión de este segundo experimento puede ser fragmentado de nuevo por colisión
,obteniéndose un nuevo espectro (MS\ etc.
Las combinaciones mas usuales suelen estar formadas por combinaciones de analizadores del tipo:
cuadrupolo - cuadrupolo
sector magnético- cuadrupolo
sector magnético-sector magnético
sector magnético -trampa iónica
cuadrupolo - tiempo de vuelo
ESPECTROMETRIA DE MASAS Y IDENTIFICACiÓN DE PROTEINAS

Mediante la espectrometría de masas es posible mapear una proteína o un péptido. En el proceso la

proteína o el péptido se degradan bajo condiciones controladas empleando reacciones químicas o
enzimas específicos. Oespues de purificarlos mediante HPLC, los fragmentos se analizan por MS,
empleando FAS o MALOI , siendo esta última la más utilizada. Existen muchas bases de datos en Internet
en las que se encuentran las masas de los péptidos proteolíticos que se obtienen de la degradación de
proteínas de secuencia conocida , con lo que buscando coincidencias entre el resultado obtenido en el
análisis con los datos de la base sería pOSible conocer la secuencia de dichos fragmentos, y por tanto de
la proteína.

Historicamente eran necesarios nanomoles para realizar el análisis descrito, pero gracias a la mejora de la
instrumentación y de los métodos, se puede trabajar con cantidades de muestra en e'l rango de los 100
pmoles.

En general, la estragia seguida en la secuenciación de proteínas empleando espectrometria de masas se

puede sumarizar en el siguiente diagrama:

I
La identificación de proteínas requiere la determinación total o parcial de sus secuencias por el método de
la degradación de Edman. En algunos casos particulares, la identificación se puede basar en su
reconocimiento por anticuerpos específicos. La degradación de Edman está limitada a polipéptidos que no
estén bloqueados en su grupo amino terminal, y además es larga y requiere una gran cantidad de
muestra.

Sin duda la MS es el metodo mas eficiente en la identificación de proteinas. La estrategia a seguir se

indica en la figura.
 Unknown protein(s)
.--- -- -- - - --1 Enzymalic digestion

MIxture of proteolytic peptldes

!
Determine mass
o, each peptide by
MALOI or Le/ESI

Determine Intact
masses of prole n(s)
b MALOI or ESI

MSn for addiHonal

Identify and characterize informabon about
proteJn proteln sequence to
design oligonucleotides
for clonlng

Este método se basa en la comparación de los datos obtenidos por MS con otro predecidos para todas
las proteinas contenidas en la base de datos. La eficiencia del método es el resultado del desarrollo de la
MS y la disponibilidad de grandes bases de datos de proteinas. La determinación precisa del PM de la
proteina es util para su identificación y también para conocer su pureza.
 TEMA 37. TECNICAS y PROCEDIMIENTOS RELACIONADOS
CON EXPERIMENTACiÓN ANIMAL EN FISIOLOGíA Y
FARMACOLOGíA

-Biomedicina basada en estudios con animales de experimentación (reactivos

biológicos) .
,. Desarrollo de vacunas
,. Estudio de enfermedades
., Desarrollo de nuevos fármacos
..,. Pruebas de seguridad de fármacos
-Ética:
~ Sociedad más sensibilizada al sufrimiento animal
., Respeto a los animales, seres vivos dotados de sensibilidad y capaces
de sufrir. Normas:
o Animales procedentes de criaderos especializados
o Evitar o limitar cualquier sufrimiento físico o psíquico
o Métodos alternativos como modelos matemáticos, estadísticos y
sistemas biológicos in Vitro (bajo coste y plazos de tiempo muy
cortos)
o No usar especies en peligro de extinción
o Científicos cualificados
-índice de severidad: valoración objetiva de los niveles de severidad de la
investigación y balance entre la calidad e importancia de los resultados según
el número de animales utilizados
-Animales de laboratorio:
,. Anfibios: estudios de la piel
., Reptiles: antídotos de venenos
., Roedores: anticuerpos, comportamiento, estudios de cáncer
,. Perros: di1gestivo, metabolismo y nutrición
~ Gatos: sistema nervioso, comportamiento
);;- Primates: cuando no sirve otra especie. Transplantes, patología
general, último paso test medicamentos ...
, Cerdo: alcoholismo y diabetes
 •
-Alimentación: acto voluntario y consciente mientras que la nutrición
(digestión, absorción y metabolismo) son involuntarios.
).- Buena formulación de la ración para un crecimiento y reproducción
normal
~ Raciones inalteradas durante la duración del experimento
" Disponibilidad de agua siempre

-Animalarios: recinto habilitado para experimentar, mantener y criar animales

satisfactoriamente
,- Procedimiento normalizado de trabajo (PNT): procedimientos escritos
detalladamente.
,. Marcaje: para diferenciar de forma clara y rápida los animales.
o Marcas: características fenotípicas, tatuajes, colorantes
temporales, hierros, taladros.
o Apliques: grapas, collares, microidentificadores electrónicos
implantables
,- Inoculación de productos:
o Intraperitoneal: subumbilical
o Subcutánea: pliegue de piet
o Intramuscular: muslo
o Intravenosa: vena marginal de la oreja (conejo), vena caudal de
la cola (ratas y ratones).
o Oral: sonda especial
,- Anestesia: para sujeción y control del animal, exámenes clínicos,
cirugía, eutanasia. Su acción deberá ser rápida y su eliminación
también, no debe deprimir la respkación ni el corazón ni ser irritante
para los tejidos, estable a temperatura ambiente.
o Analgesia: alivia el dolor
o Sedación: grado medio de depresión del sistema nervioso central
o Anestesia local: descenso sensibilidad en un área
o Anestesia basal: base para una anestesia profunda
o Anestesia general: totalmente inconsciente e insensibilidad al
dolor
 •
Preparación del animal: 12 horas antes sin ingerir alimentos
Preanestesia:
o Calma al animal
o Reduce canditad de fármacos a administrar en la anestesia gral
o Reduce la movilidad gástrica
o Previene la parada cardiaca
);- Eutanasia: inducir la muerte sin sufrimiento. Rápido, humanitaria sin
dolor, irreversible, no contaminante para el entorno, seguro para el
manipulador y económico.
o Aturdimiento
o Dislocación cervical
o Guillotina
o Exanguinación
o 'Inyección de barbitúricos
o Éter
 ..
TEMA 38. TÉCNICAS INMUNOLÓGICAS

Anticuerpo: proteína del suero gamma-globulina producido como respuesta a

sustancias extrañas (antígeno)

Unión antígeno-anticuerpo muy especifica: se ha utilizado para identificar,

cuantificar, localizar y purificar antígenos.

1. Preparación de anticuerpos
a. Anticuerpos poli clona les
» Animal de 2 meses de edad y aclimatado
» Extracción suero preinmune
» 5 inmunizaciones alternadas con 4 extracciones
» El suero se obtiene dejando coagular la sangre y
centrifugando. El sobrenadante se guarda a -80°C
b. Anticuerpos monoclonales
~ Extracción de linfocitos B del bazo de un animal
inmunizado con el antígeno de interés
);- Fusión de los linfocitos B con células de mieloma
inmortales deficientes en enzimas implicados en la
síntesis del nuevo ADN como la TK.

2. Purificación de anticuerpos
a. Inmunoprecipitación I Pull down
b. Cromatografía de afinidad

3. Cuantificación y valoración de anticuerpos

a. Dot Blot
b. ELlSA

4. Inmunodetección de proteínas extraídas

a. Preparación de las muestras
b. Cuantificación de proteínas
 •
c. SDS-PAGE
d. Inmunotransferencia o Western Blot

5. Inmunodetección en células
a. Citometria de flujo
b. Inmunocitoquímica
~ Directa
~ Indirecta
• Enzimática
• Cololidat
• Fluorescencia
6. Aplicaciones
a. Biología experimental
b. Diagnóstico
c. Uso terapéutico
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 •
TEMA 39. MEJORA GENÉTICA ANIMAL Y VEGETAL

-MEJORA GENÉTICA ANIMAL: nuevas técnicas reproductivas y de biología

molecular
, Aumento rendimiento de los animales domésticos:
1. mayor cantidad de los productos
2. mayor calidad de los productos
3. reducción de los costes de producción
~ Inversión dedicada al desarrollo genómico muy reducida
.,. Hasta ahora técnicas de interacción de proteínas (identificación
fetotipos)
., Gran desarrollo de técnicas moleculares gracias a:
1. descubrimiento de los enzimas de restricción
2. secuenciación automática
3. reacción en cadena de la polimerasao POR
4. descubrimiento de los marcadores moleculares:
1. RFLP (polimorfismos de longitud de fragmentos de
restricción
2. RAPD (polimorfismos de ADN amplificados al azar
3. AFLP (polimorfismos de longitud de fragmentos
amplificados)
4. SSRs o microsatélites
5. SNP (polimorfismos de un solo nucleótido)
., Aplicaciones de los marcadores moleculares
1. caracterización de agentes patógenos
2. detección de portadores
3. identificación genética (huella genética)
4. trazabilidad
5. idendificación racial
6. detección de alimentos transgénicos
7. controt de filiación (árbol genealógico)
8. detección de la introgresión genética
 ..
9. selección asistida por marcadores (MAS): marcadores situados en
las QTL (influyen en caracteres de producción). Mejor selección
incluso antes de que el animal haya nacido
10. Velogenética: MAS + técnicas de fertilización in vitro

-Genómica funcional: proyectos genoma -------. genómica funcional =

caracterización del proteoma (conjunto completo de genes que determinan
proteínas en un genoma) + patrones de expresión génica.
).- Chips de ADNc conocido + ADN fabricado a partir del ARNm total
aislado de las células que nos interese = genes que se expresan (ESTs)
>- Chips de ADN con las secuencias codificantes de los patógenos que
afectan a los animales + ADNc = diagnósticos enormemente rápidos
).- Desarrollo de nuevas vacunas gracias a la identificación de dianas

-Germoplasma animal:
);:- Extracción, manipulación y conservación del material seminal
(criopreservación)
)o- Congelación de óvulos y embriones
,. Fertilización in vitro
).- Transferencia de embriones a hembras receptoras

-MEJORA GENÉTICA VEGETAL

>- La mejora es esencialmente una selección
"> Transgénesis: proceso adicional de mejoramiento de los materiales
mejorados por nuestros antepasados. Aumento de la eficiencia de la
agricultura
, El mejorador identificaba los mejores genotipos según las
manifestaciones fenotípicas. Mejor tomar como criterio de selección
un marcador molecular (RFLP)
jo- Introducción de genes en las plantas
• Agrobacterium tumefaciens (método revolucionario)
• Microproyectiles
,. Marcadores genéticos de interés en mejora:
 •
• Marcadores morfológicos
• Marcadores proteicos (isoenzimas)
• Marcadores de ADN:
o Variaciones individuales en la secuencia de ADN
o Evaluación en estadios tempranos
o Evaluación a partir de muestras mínimas sin
destruir al individuo
o No influenciables por el ambiente
o Sin interacciones intergénicas
);- Objetivos de la mejora genética vegetal:
• Aumentar la producción de alimentos
o Mejorando la capacidad fisiológica
o Mejorando el potencial intrínseco
o Protegiendo de los factores adversos
• Mejorar la calidad y valor nutricional de los alimentos
• Cultivos adaptados a los requerimientos de la maquinaria
agrícola
• Recursos fitogenéticos esenciales para mejora del futuro
}- Métodos propios de la mejora vegetal:
• Métodos clásicos: hibridación, recombinación y
segregación en la población
• Métodos citogenéticos: manipulación cromosomas
• Métodos de cultivo in vitro: cultivo de órganos, tejidos,
células, protoplastos
• Métodos de genética molecular:
o Aislar y multiplicar secuencia específica de ADN
o Integracion en genoma del huésped
o Expresión fenotípica
o Eficientes factorías químicas suministradoras de un
amplio repertorio de productos
 TEMA 40. TÉCNICAS DE MANIPULACiÓN IN VITRO DE ÁCIDOS
NUCLÉICOS. TECNICAS DE PCR y SUS DISTINTOS USOS

-ADN recombinante = DNA producido por la unión de segmentos que provienen

de diferentes fuentes biológicas. = técnicas de ingeniería genética:
o Diagnóstico de enfermedades metabólicas e infecciosas
o Obtención de fármacos
o Vacunas recombinantes
o Terapia génica en un futuro
-Obtención DNA recombinante:
1. Romper las membranas celulares con proteasas y detergentes
2. Purificar los ácidos nucléicos (extracción con fenol-cloroformo o resinas
comerciales). Para aislar RNA máxima esterilidad + inhibidores RNAsas
3. Aislamiento del fragmento de DNA deseado cortando el DNA por
secuencias nucleotídicas específicas (enzimas de restricción) o
amplificando el fragmento por PCR o retrotranscribiendo RNAm a cDNA:
a. Nucleasas: degradan ácidos nucleicos. Cortes cohesivos o romos.
i. Exonucleasas: degradan DNA o RNA a partir de extremos
ii. Endonucleasas: rompen en el interior de la cadena
1. DNAsas: cortan aleatoriamente
2. Enzimas de restricción: rompen en una secuencia
específica de nucleótidos.
b. Polimerasas: sintetizan copias de moléculas de ácidos nucleicos
i. DNA polimerasa 1: sintetiza DNA 5'--3' Y tiene actividad
exonucleasa 3'--5' y 5'--3'
ii. RNA polimerasa: cDNA a ARNm
iii. Transcriptasa reversa: RNA dependiente. RNA a DNA
c. Enzimas modificadores: eliminación y adición de grupos fosfato
i. Fosfatasa alcalina: elimina P de 5' del DNA
ii. Polinucleótido quinasa: añade P (marcado) a 5' del DNA
iii. Transferasa terminal: añade nucleótidos a 3' libre del DNA
d. ligasa: unir moléculas de DNA. T4 DNA ligasa
4. Inserción de los fragmentos en vectores: un vector es una molécula de
DNA capaz de transportar y expresar otra molécula de DNA. Requisitos:
a. Origen de replicacion
b. Sitio de policlonaje o polilinker (zona con dianas)
c. Marcador de selección
Vectores procariontes:
).- Plásmidos: ori+, resistencia amp, policlonaje dentro el
gen lacZ, potente promotor (plásmidos de expresión).
Insertos de 5-10 kb .
~ Bacteriófagos: inserción DNA exógeno en su genoma +
infección, ciclo lítico. Insertos de 15 kb.
}.- Cósmidos: vectores híbridos = secuencia cos del fago
tambda + secuencias plasmídicas de genes de resistencia
a antibióticos. Infección bacteria. Insertos hasta 50 kb.
>- BAC: vector derivado del plásmido factor F. Clonaje de
genomas por inserta hasta 400 kb.
Vectores eucariontes: mas complejos
>- Transposon P: genétka de desarrollo en Drosophila. Se
integran en el genoma
~ Plásmido T-DNA: agrobacterium. Genética funcional de
plantas y generación plantas transgénicas. Se integran
.~ Plásmido 2 micras: se utiliza en levaduras
>- YACs: se replican independientemente
).- Virus SV40: se sustituye la región tardía por el gen a
clonar, por eso necesitar un helper. No se integra
.,. Retrovirus: no es infectivo por eso necesitan un helper.
Se integra en el genoma
5. Transferencia DNA recombinante a la célula hospedadora. Se replica de
manera autónoma obteniendo muchos clones. Tipos de células
hospedadoras:
a. Células procariontes: fácil de manejar y propagar
b. Células eucariontes : para el estudio y expresión
Normalmente se usan los dos sistemas: a. para aislar y secuenciar y b
para su expresión.
Incorporación de vectores:
>- Transformación: la célula receptora es una bacteria
(tienen que ser competentes)
>- Infección: el vector utilizado es un bacteriófago que se
integra en el ADN bacteriano. Es más fácil y pueden
contener ADN exógenos más grandes
>- Transfección: transformación que ocurre en células
eucariotas.
o Levaduras: pueden manipularse y crecer de forma
similar a las bacterias. Plásmido 2 micras y YACs
o Células vegetales:
• Biolística
• Agrobacterium tumefaciens (plásmido Ti; T­
DNA se integra en el genoma)
o Células animales: sobre células en cu ttivo o
organismos enteros (embriones).
• Transferencia pasiva: vector plasmídico

• Fosfato cálcico

• DEAE dextrano

• Electroporación

• liposomas

• Biobalística
• Microinyección
• Transfección activa: vector vírico sin lisis
celular

• SV40
• Retrovirus
• Adenovirus
 Métodos de selección para transfecciones
.., Transitorias (DNA introducido en forma de plásmido): el
método para medir la eficacia de la transfección es
estudiar la expresión de los genes marcadores:
• CAT
• Luciferasa
• GFP
• GUS
• lacZ
>- Estables (DNA exógeno se integra en el genoma celular):
• Gen de resistencia a los antibióticos
• PCR

-Bibliotecas de DNA:
)..- De cDNA: la transcriptasa reversa copia el mRNA a cDNA
.,. Genómicas: clonación de fragmentos de DNA genómico
en vectores fágicos

-Técnicas de biología molecular:

,- Hibridación de ácidos nucléicos: desnaturalización +
hibridación con sonda marcada radioactivamente (a
partir de plásmidos o sintéticas)
o Hibridación dotlslot blot: aplicación sobre filtro +
hibridación sonda
o Southern/Northern blot: separación por peso
molecular + fijación filtro + hibridación sonda
o Hibridación in situ: localización ácidos nucleicos en
una sección de tejido. Sonda con fluoresceina,
fosfatasa alcalina o peroxidasa.

-Secuenciación de DNA: secuenciadores automáticos que utilizan dideoxis

(nucleótidos que carecen de grupos OH y paran la elongación) cada uno
marcado con un fluoroforo distinto, juntos en un carril. Un laser excita los
fluoroforos que emiten a diferentes longitudes de onda.
-Reacción en cadena de la polimerasa (PCR): obtención de grandes cantidades
de moléculas de DNA de una secuencia específica. La región que queremos
amplificar la delimitamos con dos oligos sintéticos de hasta 30 nucleótidos
complementarios al principio y hnal de la región deseada . Cada reacción
contiene:
~ ADN a amplificar
~ DNA polimerasa estable a altas temperaturas (Taq)
}- Tampón de reacción
, 4 nucleótidos
~ Oligos

La reacción consta de 3 pasos:

1. Un único ciclo a 94°C durante 1'. Desnaturaliza posibles contaminantes
2. síntesis de las nuevas cadenas de ADN:
a. Desnaturalización de las dos cadenas: 94°C, l'
b. Hibridación de los oligos: 50-60°C, 45"
c. Elongación: síntesis de ADN a 72°C entre 1 y 3 minutos
El conjunto de los tres procesos se denomina ciclo. Normalmente las
reacciones de PCR son de 30 a 40 ciclos.
3. Terminación de la PCR: un único ciclo a 72°C durante 2'. Sirve para
terminar de elongar las nuevas cadenas sintetizadas.

Elección correcta de los oligos:

> Secuencia consevada
~ No complementarios entre si
'r Alta proporción en guaninas y citosinas
 -.
TEMA 41. TÉCNICAS BÁSICAS PARA LA OBTENCiÓN! DE
MICROORGANISMOS, VEGETALES Y ANIMALES
TRANSGÉNICOS

-Transgenia: introducción de genes foráneos en un organismo. Se puede

analizar la expresión de un gen y su influencia en otros tejidos (no en cultivos
in vitro).
-Primeros estudios con mutágenos químicos o radiación --'mutaciones al azar
-Técnicas ADN recombinante producen mutaciones dirigidas

-ANIMALES TRANSGÉNICOS
-Procedimientos para transferir genes:
,. A nivel de células germinales: se expresa en todos los
tejidos y se transmite a la progenie
o Organismos transgénicos
o Quimera transgénica
>- A nivel de células somáticas: terapia génica con células
con construcciones donde se ha insertado el gen viable.
-Modelos animales:
,. Drosophila melanogaster (genética del desarrollo): generación de
mutantes utilizando los elementos P (transposones). P + M =
transposición elementos P (se diluye el represor). Manipulación:
o Sustitución gen transposasa por neo
o Promotor de ta proteína 70 (inducible por temperatura)
o Incorporación gen de interés
Microinyección en la región polar de un embrión de tipo M del
vector junto con un elemento P asistente para que el elemento P
salte del vector utilizando la transposasa del asistente. Se
integra al azar y se localiza por hibridaciones in situ en los
cromosomas politénicos de las larvas o por PCR inversa
" Mus musculus (genética funcional): estudio tumores y ensayo de
nuevas drogas para combatir el cáncer. Todas las técnicas se
basan en el aislamiento de óvulos fertilizados o embriones
tempranos, breve cultivo in Vitro para manipularlo y
reimplantación en madres nodrizas para proseguir su desarrollo.
o Manipulación de los óvulos fecundados
1. Superovulación por acción hormonal
2. Cruce con machos adecuados
3. Aislar huevos fecundados
4. Microinyección gen de interés en el pronúcleo
masculino
5. Reimplantación en madres nodrizas pseudopreñadas
20% producen quimeras transgénicas = integración DNA
más tardía.
6. Confirmación por PCR o Southern (sonda mismo gen
inyectado).
o Manipulación del blastocito: genera quimeras transgénicas
1. Aislar blastocitos del útero después de 4 días desde
la cópula
2. Aislar células madre embrionarias del blastocito y
cultivarlas sobre una capa de células (soporte)
3. Introducción del DNA
4. Reinsertar las células madre en un nuevo blastocito
5. Reimplantar el blastocito en una madre
pseudopreñada por hormonas y apareamiento con
machos vasectomizados.
o Sustitución génica dirigida: permite elegir el gen que se
quiere mutar. Provocar enfermedades humanas en ratones
modelo.
1. Clonar gen y propagarlo en bacterias
2. Mutagénesis dirigida por PCR donde se cambia la
secuencia nucleotídica del gen.
3. Transfección de la construcción en un cultivo de
células madre embrionarias.
4. Secuencias homólogas se alinean e intercambian los
fragmentos
 5. Búsqueda de células con la sustitución deseada por
marcadores que se introducen en el vector:
r
• neo : inserto dentro del gen
• Timidina quinasa: marcador negativo inserto
a un extremo del vector
Si hay recombinación homóloga el gen + neo r
sustituye el gen homólogo del cromosoma pero el
gen tk no se integra . Medio con neomicina
sobreviven células con inserciones aleatorias o
dirigidas y con ganciclovir mueren la que tengan el
gen tk, es decir con inserción aleatoria.
>- Animales de granja (biotecnología y mejora genética)
o La glándula mamaria es capaz de realizar todas las
modificaciones postranscripcionales o a nivel de proteína
1'. Fusión del gen de interés con las secuencias
reguladoras del gen de una de las proteínas de la
leche (caseina)
2. Generar transgénicos
3. Producto deseado se recoge en la leche

-PLANTAS TRANSGÉNICAS
-La mejora genética de las plantas ha tenido lugar a lo largo del tiempo por
selección humana (polinización cruzada) y selección natural (más resistentes a
frío, enfermedades, más productivo)
-Planta transgénica contiene un gen (vegetal, bacteriano, fúngico ... )
introducido de forma artificial y que no lo ha adquirido a través de la
polinización
1. Elección del gen de interés
a. Aislamiento DNA
b. Digestiones con enzimas de restricción
c. Clonaje en un vector :
i. Promotor: controla cuando y donde el gen se expresará en
la planta
 ii. Transgen
iii. Secuencia de terminación
iv. Marcador: identificación y selección de las transformadas
2. Transformación: introducción de DNA
a. Métodos biológicos: Agrobacterium tumefaciens infecta células
dañadas y transfiere su plásmido Ti a las células formando
tumores. Estos tumores sintetizan aa llamados opinas que al
catabolizarlos obtienen energía. 20 kb (T-DNA) se integra al azar
en el DNA nuclear que se está transcribiendo.
Manipulación Plásmido Ti:
>- Cortar la región T con enzimas de restricción
., Inserción T-DNA en un vector usual de E. coli
., Amplificación y purificación
>- Inserción del gen de interés
~ Ligación, transformación y amplificación en E. coli
).;.- Introducción de este plásmido en Agrobacterium
que tenga un Ti completo
>- Recombinación homóloga con el Ti desplazando el
T -DNA normal
>- Infección de plantas con estas bacterias alteradas
b. Métodos FíSico-químicos: PEG, electroporación y microinyección
c. Métodos físicos: biobalística (oro coloidal unido al DNA es
disparado con gases de helio hacia las células diana)
3. Regeneración y evaluación de las plantas obtenidas:
a. Medio selectivo con antibiótico (gen codifica un enzima que
fosforila el anti,biótico inhibiendo su unión al ribosoma por lo
tanto hay síntesis de proteínas) o herbicidas.
i. Kanamicina, gentamicina, tetraciclina o estreptomicina
b. Obtener semillas de las supervivi,entes
-Aplicaciones de las plantas transgénicas:
, In situ: resistencias a herbicidas, insectos, bacterias
~ Ex situ: biorreactores (producción de proteína)