Marco Teórico

Prueba de la existencia de microorganismos es el crecimiento en sustancias

alimenticias artificiales preparadas en el laboratorio. Este material se denomina
MEDIO DE CULTIVO. Y el crecimiento de los microorganismos CULTIVO.
Para que las bacterias se desarrollen es necesario elegir un medio de cultivo
adecuado.
Las condiciones a tener en un medio de cultivo son varias: temperatura, grado de
humedad, presión de oxígeno, grado de acidez o alcalinidad, nutrientes y factores de
crecimiento. Y debe estar estéril o sea no debe contener ningún tipo de
microorganismo.
Se pueden clasificar por su aspecto en: sólidos, semisólidos y líquidos. Y pueden ser
clasificados por su uso en: básico y especiales y dentro de estos en mejorados,
selectivos, diferenciales y de transporte.
Muchas de las bacterias requieren nutrientes complejos similares en composición a
los líquidos orgánicos del cuerpo humano. Por eso, la base de muchos medios de
cultivo es una infusión de extractos de carne y Peptona a la que se añadirán otros
ingredientes. El Agar es un elemento solidificante muy empleado para la preparación
de medios de cultivo. En los diferentes medios de cultivo se encuentran numerosos
materiales de enriquecimiento como hidratos de carbono, suero, sangre completa,
bilis, etc. Los hidratos de Carbono se adicionan por dos motivos fundamentales: para
incrementar el valor nutritivo del medio y para detectar reacciones de fermentación de
los microorganismos que ayuden a identificarlos. El suero y la sangre completa se
añaden para promover el crecimiento de los microorganismos menos resistentes.

CLASIFICACIÓN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO:

Para el aislamiento, estudio y clasificación de los microorganismos, es necesario

utilizar un medio de cultivo en el que dispongan de las sustancias orgánicas e
inorgánicas necesarias indispensables para el normal desarrollo de su metabolismo.
En estos medios, los microorganismos además de poder multiplicarse, pueden
manifestar características de crecimiento y propiedades bioquímicas; aspectos de gran
importancia para su clasificación. Estos preparados estériles que poseen los
elementos necesarios para el desarrollo de un microorganismo, se denominan medios
de cultivos y pueden dividirse por su:

A) ASPECTO:

Medios líquidos. Se emplean fundamentalmente para:- Cultivar los microorganismos y

obtener grandes cantidades de los mismos o bien la producción de metabolitos
específicos La multiplicación bacteriana en los medios de cultivos líquidos se
manifiesta generalmente por el enturbiamiento de éste. Estimular y promover la
selección de algún o algunos microorganismos e impedir que otros se multipliquen.-
Identificar al microorganismo estudiado mediante pruebas bioquímicas.
Medios semisólidos.- Se utilizan para identificaciones bioquímicas y averiguar si el
germen estudiado es móvil. Los medios semisólidos tienen una consistencia blanda.
Medios sólidos.- Se utilizan para obtener colonias aisladas de microorganismos. Los
medios sólidos constituyen la mayor parte de los medios de cultivo que se emplean en
Microbiología. , En los medios de cultivos sólidos la multiplicación bacteriana se
manifiesta por una formación macroscópica denominada colonia bacteriana, que es el
resultado de la multiplicación de una sola célula bacteriana.

B) USO
I.- Medios de cultivos básicos. Se caracterizan por ser pobres en material nutritivo,
de manera que su uso es muy restringido, constituyen la base para la preparación de
otros medios. Como ejemplo pueden citarse el caldo peptonado y el Agar-Agar
corriente.
II: Medios de cultivos especiales. Entre estos se encuentran:
a) Medios mejorados. En general son los mismos medios básicos a los que se les
agrega una sustancia enriquecedora como sangre, suero, etc. El uso de estos medios
es universal y está orientado especialmente a obtener buen desarrollo de cualquier
tipo de bacteria, se utilizan en primera instancia en el aislamiento bacteriano, ya sea a
partir de otros cultivos o de productos patológicos. Los medios de este tipo de uso más
frecuente son: Agar para recuento total, Agar tripticasa-sangre, caldo tripticasa, Agar
chocolate, medio de Mueller-Hinton.

b) Medios selectivos. Son medios que contienen sustancias que impiden o limitan el
crecimiento de algunas especies microbianas y permiten el desarrollo de otras.
Consiste en aislar un microorganismo de un sustrato que contiene numerosas otras
especies. Se incluyen en este grupo el agar cristal violeta para el aislamiento de
bacterias Gram (-) y el agar telurito de potasio para el aislamiento de bacterias Gram
(+).

c) Medios de cultivos diferenciales. Se emplean para demostrar alguna propiedad

bioquímica de la bacteria como degradación de hidratos de carbono, proteínas,
hidrólisis de la urea, etc., contienen indicadores de ácido base, redox o sustancias que
detectan cambios en el medio o en las características típicas de las colonias el estudio
en estos medios debe realizarse empleando cepas bacterianas puras. Existen
numerosos medios de este tipo, de uso preferencial en la bioidentificación de bacilos
Gram (-) ya que ellos no tienen características muy distintivas en las colonias o
cultivos en general. Entre los de uso más corriente se encuentran: Agar
hierro-triple-azúcar (TSI agar Medio de SIM, Caldo glucosado, fosfatado,
Voges-Proskauer o del rojo de metilo, Medio agar-citrato de sodio (Medio de
Simmons- Medio caldo urea,

d) Medios de transporte. Sirven para transportar los especimenes que contienen a los
microorganismos, del sitio de la toma del producto hasta el laboratorio donde va a
efectuarse el estudio. Estos medios impiden que se altere la proporción original de la
flora microbiana en los especimenes.

La población microbiana

La población microbiana existente en nuestro entorno es grande y compleja. Cientos

de especies microbianas habitan normalmente en distintas partes de nuestro cuerpo,
incluidas la boca, el tracto intestinal y la piel. Al nacer, los microbios inmediatamente
empiezan a colonizar nuestros cuerpos, así como a casi todos los objetos del mundo.
Ellos flotan alrededor hasta que entran en contacto con una superficie que ofrezca
comida y resguardo. Se encuentran más frecuentemente en la oscuridad, en objetos
húmedos que a menudo entran en contacto con la comida, la suciedad o la
vegetación. Las superficies del baño, los cepillos para el cabello, los refrigeradores, los
lavaplatos y las tablas de cocina tienen a menudo muchos microbios. Las manijas y las
paredes tienen menos porque son pobres en nutrientes y secos.
Un estudio adecuado de microorganismos que hay en estos hábitat requiere técnicas
que permitan conocer y ordenar la compleja población mixta o cultivo mixto,
separándole en sus distintas especies como cultivos puros. Un cultivo puro consta de
una población de células derivadas todas ellas de una célula parental. Los
microorganismos se cultivan en el laboratorio sobre materiales nutritivos denominados
medios. Se dispone de una gran cantidad de medios y la clase que se debe de utilizar
depende de muchos factores, uno de los cuales es la clase de microorganismos que
se va a cultivar. El material que se inocula sobre el medio se denomina inóculo
mediante alguna técnica (siembra por estría en placa o siembra en masa en placa).
Durante la incubación a 37:C , las células microbianas individuales se reproducen tan
rápidamente que en un lapso de 18 a 24 horas producen masas visibles de células
denominadas colonias. Una colonia es visible a simple vista. Cada colonia diferente
es presumiblemente un cultivo puro de una sola clase de microorganismo. Si dos
células microbianas procedentes del inóculo original quedan muy cerca una de otra
sobre el medio de Agar, la masa de células observables no será un cultivo puro. La
mayoría de los microbios en nuestro cuerpo y otras superficies son inofensivas, pero
algunos son patógenos o causan enfermedad. Por esta razón, queremos controlar el
número de microbios que nos rodea. La posibilidad de infectarnos aumenta con el
número de microbios en los objetos circundantes.
1 ALCANCE

Preparar un medio de cultivo sólido para efectuar recuento total de bacterias aerobias
mesófilas.

2 REFERENCIAS

IDF (Iternational Dairy Federation)

AOAC (Asssociation of oficial analytical chemists)

Manual de Microbiología de la Universidad Nacional de Luján

ICMSF International Commission on Microbiological Specifications for Foods

3 DEFINICION

Bacteria que forman colonias que pueden contarse en las condiciones especificadas.

4 PRINCIPIO

4.1 Preparar placas utilizando agar para recuento total utilizando una muestra líquida y
una muestra de aire.

4.2 Incubar las placas a 37 ºC durante 48 Hs.

4.3 Calcular la cantidad de microorganismos presentes en la muestras.

5 MEDIO DE CULTIVO

Agar para recuento Total = PCA (Plate Count Agar) =Agar peptona de
caseína-glucosa-extracto de levadura.

Composición:

Peptona de caseína 5.0; extracto de levadura 2.5; D(+) glucosa1.0:; Agar-agar 14.0.
Preparación:

a) Leer las instrucciones del fabricante y pesar la cantidad necesaria según el

volumen de medio de cultivo requerido.
b) Tener en cuenta que el frasco no debe contener mas de un 80 % de su
volumen total en medio de cultivo porque si se excede este volumen el medio
se volcará del recipiente, al esterilizarlo.
c) Hidratar el medio en agua destilada agitando suavemente el recipiente durante
30 segundos. Dejar por espacio de 15 minutos hasta su total hidratación.
d) Colocar el medio de cultivo a baño maría hirviente para lograr su disolución.
e) Esterilizar en autoclave a 121 ºC durante 15 minutos, a menos que se indique
otra cosa.
f) Si ha de utilizarse después de esterilizado mantener en BM a 45ºC hasta el
momento de su utilización.

6 MATERIAL DE VIDRIO, PLASTICO OTROS

6.1. Frasco para medio de cultivo

6.2. Si no se dispone de 1. utilizar erlenmayer con tapón de algodón y gasa.
6.3. Espátula cuchara.
6.4. Recipiente para baño maría hirviente = BM (dónde se colocará el frasco con
medio de cultivo)
6.5. Autoclave u olla a presión.
6.6. Placas de petri. Si son de vidrio deben estar correctamente empaquetadas y
estériles. Sino pueden utilizarse placas de petri estériles descartables.
6.7. Pipetas estériles descartables o de vidrio uso serológico de 1 ml.
6.8. Recipiente con agua lavandina para descartar las pipetas una vez utilizadas
6.9. Algodón.
6.10. Alcohol.

7 MUESTRA

Muestra de agua o bebida y aire ambiente.

8 PROCEDIMIENTO para la muestra líquida.

El siguiente procedimiento debe efectuarse bajo mechero y en forma aséptica

8.1 Tome una placa de petri estéril. Transfiera 1 ml de muestra con pipeta estéril
dentro de la placa.

8.2 Coloque dentro de la placa 10 a 15 ml de medio de cultivo (PCA) dentro de la

placa.

8.3 Cuidadosamente mezcle por rotación el medio de cultivo con el inóculo.

 8.4 Deje la placa en la superficie horizontal hasta que el medio solidifique.

8.5 Invierta la placa y coloque en la incubadora a 37 +/- 1ºC por espacio de 48 Hs.

8.6 Transcurrido el lapso de tiempo cuenta la colonias (sin abrir la placa) e informe

UFC/ml = Unidades formadoras de colonias por ml de muestra.

9 PROCEDIMIENTO para la muestra de aire.

El siguiente procedimiento debe efectuarse en forma aséptica

9.1 Coloque dentro de la placa 10 a 15 ml de medio de cultivo (PCA) dentro de la

placa.

9.2 Deje la placa en la superficie horizontal hasta que el medio solidifique.

9.3 Abra la placa y déjela expuesta al ambiente por espacio de 15 minutos.

Ciérrela.

9.4 Invierta la placa y coloque en la incubadora a 37 +/- 1ºC por espacio de 48 Hs.

9.5 Transcurrido el lapso de tiempo cuenta la colonias (sin abrir la placa) e informe

UFC/15 min. = Unidades formadoras de colonias/15 minutos.

10 EXPRESION DE LOS RESULTADOS

Elabore un protocolo de resultados de análisis conforme al modelo (ver ANEXO 1)

11 CUESTIONARIO

Responda el cuestionario en forma clara y precisa para ser entregado a su Profesor

junto con el protocolo de análisis que efectuó.
Una copia por grupo.

1. ¿Qué es un medio de cultivo?

¿Qué es un cultivo de microorganismo?
2. ¿Qué finalidad tiene utilizar medios de cultivo sólidos?
3. Escribe el nombre de 5 medios de cultivo que pueden ser empleados en el
laboratorio de microbiología.
4. ¿De dónde es obtenido el extracto Agar- Agar para la preparación de medios
de cultivos?
5. ¿Por qué es necesario esterilizar la mesa entes de realizar el vaciado del
medio de cultivo en las cajas de petri?
6. ¿Por qué la base de muchos medios de cultivo es una infusión de extractos de
carne y Peptona?
7. Escribe la composición química para cada medio de cultivo que utilizaste
 8. ¿Qué tipo de nutrientes requieren los microorganismos para poder crecer en un
medio de cultivo?
9. ¿Cómo nos podemos dar cuenta que existió crecimiento de microorganismos
en un medio líquido?
10. ¿Cómo se manifiesta el crecimiento de los microorganismos en un medio de
cultivo sólido?
11. ¿Cuál es el elemento principal del medio de cultivo que favorece su
solidificación?
12. ¿Qué finalidad tiene guardar invertidos los medios de cultivo ya preparados en
las cajas de petri en el refrigerador o en la estufa de incubación?

ANEXO 1

Protocolo Nº Fecha:

Fecha de análisis:

Solicitante:

Muestra:
Marca:

Contenido neto: Estado de conservación:

Fecha:

Muestra extraída por: Cantidad de muestra:

Análisis Microbiológico

Valores
Tipo de análisis Resultados Norma Metodología
permitidos

Recuento total de Bacterias

aerobias totales mesófilas

Observaciones:

Nombre de los integrantes del grupo