CALIBRACIÓN

Calibración. Definición
conjunto de operaciones que, bajo condiciones específicas,
establecen la relación entre los valores indicados por una
medida instrumental y los correspondientes valores conocidos
de la sustancia medida.
chequear la respuesta del instrumento
Calibración Instrumental con un material de propiedades
conocidas, y aplicar, en caso
necesario, un factor de corrección.

Calibración Metodológica Analítica Conjunto de operaciones que

establece, bajo condiciones
específicas, la relación entre las
señales producidas por un
instrumento analítico y los
correspondientes valores de
concentración o masa del juego de
patrones de calibrado.
 Ejemplo

Calibración instrumental:
verificación
•λ
•transmitancia

Espectrofotómetro UV-vis
Vidrio de Holmio
El filtro de óxido de Holmio proporciona bandas de absorción discretas y exactas
que son útiles para revisar la precisión de los espectrofotómetros.
 Calibración con K2Cr2O7
⚫ Solución Madre: K2Cr2O7 al 0.02% en H2SO4 0.005N
⚫ Soluciones a preparar:0.002, 0.006 y 0.01%

⚫Procedimiento: medir las absorbancias de

cada una de las diferentes concentraciones a
las siguientes longitudes de onda: 235, 257,
313 y 350nm. Grafique los datos obtenidos y
calcule el A1% 1cm para determinar si coincide
con los valores teóricos. Calcule también la
Absortividad
CALIBRACIÓN ANALÍTICA
⚫ Técnica empleada para medir una propiedad de un analito de forma indirecta
mediante la medida o determinación de otra propiedad distinta de ésta, pero
que esta correlacionada con la propiedad que me interesa determinar.

Mediante la construcción de un modelo

¿Como se matemático, normalmente de línea recta,
lleva a cabo? cuyo producto RECTA DE REGRESIÓN O
DE CALIBRADO
Regresión lineal
concentración señal

La concentración del analito no se mide directamente, sino que se determina de forma indirecta midiendo
una magnitud física, Respuesta, relacionada con ella.

La condición básica es la existencia de una relación causa-efecto entre la concentración de una especie, C,
y la Respuesta medida R. La relación se estudia mediante un Análisis de regresión: consiste en una función
matemática que puede ser utilizada para predecir una variable a partir de las otras.

El modelo de línea recta es el más utilizado en calibración analítica:

- simplicidad
- soporte teórico en algunas aplicaciones analíticas: ley de Lambert-Beer
Regresión lineal
Etapas

1. SELECCIÓN DEL PATRÓN ADECUADO

2. SELECCIÓN DEL MÉTODO DE CALIBRACIÓN
3. DEFINICIÓN MATEMÁTICA DE LA RELACIÓN SEÑAL-CONCENTRACIÓN
• Estimación de los parámetros
• Validación del modelo
• Determinación de los intervalos de confianza
• Características analíticas: Sensibilidad
Límite detección
Rango dinámico

4. DETERMINACIÓN DE ANALITO EN LA MUESTRA

• Errores implicados en la determinación
SELECCIÓN DEL PATRÓN ADECUADO

⚫ Materiales patrón certificados: NBS, BCR

⚫ Homogeneidad
⚫ Estabilidad
⚫ Máxima exactitud en la certificación
⚫ Patrones con matriz sintética: componentes mayoritarios
⚫ Patrón modelo: índice de polifenoles (mg ácido gálico/L)
⚫ Analito puro

Instituto Nacional de Normas y Tecnología

SELECCIÓN DEL MÉTODO DE CALIBRACIÓN

PATRONES
⚫ CALIBRACIÓN EXTERNA
CONCENTRACIÓN
DE ANALITO (C)
0 1 2 3 4 5
Unidades arbitrarias.
MEDICIÓN SEÑAL
ANALÍTICA

SEÑAL (X) Señal x1 x2 x3 x4 x5

Unidades blanco
arbitrarias.

⚫ CALIBRACIÓN INTERNA
⚫ PATRÓN INTERNO
⚫ ADICIÓN ESTÁNDAR
 Características generales del calibrado
⚫ Los estándares de calibración deben de cubrir todos los rangos de concentración
requeridos en los análisis posteriores. Las concentraciones se miden por
interpolación, y no por extrapolación.

⚫ La calibración debe incluir un blanco el cuál es frecuente que no de una señal igual
a cero.
El blanco está sujeto a errores, como otros puntos de la recta de calibrado, por lo que no
es muy aconsejable, en principio, sustraer el valor del blanco de otros valores estándar
antes de efectuar la representación.

⚫ Los cálculos de regresión se llevarán a cabo considerando que los errores siempre
afectan a la señal (eje de las y), mientras que las concentraciones estándar (valores
de x) están libres de errores.
Además se considerará que el error que afecta a las y es independiente de la
concentración del analito.

11
 Consideraciones generales del calibrado

Patrones de calibración
Concentración conocida
Cubrir el rango de concentración de las muestras a analizar en los
ensayos
Mismos disolventes y reactivos que en el ensayo
Matriz lo más parecida posible que la muestra real
Incluir el blanco en la curva (no restar)

Gráfica de calibración
Señal instrumental en ordenada
Concentración, cantidad en abcisa
Habitualmente lineal y = a + bx (no siempre)

Errores
Coeficiente variación de señal instrumental 2-3%
Preparación del patrón < 0,1% (despreciable)
Si se realiza varias medidas punto calibración : Distribución gaussiana
normal
 Calibración
Se establecen pares (xi, yi)

El problema de la calibración analítica se reducirá a

encontrar las estimaciones de los coeficientes de la
recta de calibrado (ordenada en el origen y pendiente),
y a asegurar que la recta encontrada se ajusta
correctamente a los puntos experimentales (es decir,
asegurar que no hay falta de ajuste).

El método universalmente más empleado para

encontrar los coeficientes de la recta de calibrado es el
método de ajuste de los mínimos cuadrados

Se incluye el blanco (0, y0)

• la incertidumbre asociada a la respuesta instrumental de cada punto experimental ha de ser mucho

mayor que la incertidumbre asociada al correspondiente valor de concentración. Esta condición se
suele cumplir en la mayoría de los casos.

• la incertidumbre asociada a la respuesta instrumental (estimable por ejemplo mediante repeticiones)

debe tener un valor constante a lo largo de todo el intervalo de linealidad (homocedasticidad).

• los errores aleatorios asociados a la respuesta instrumental deben ser mutuamente independientes.
En la práctica esto implica que las soluciones patrón utilizadas para construir la recta de calibrado
deben prepararse de forma independiente, a partir de una o varias soluciones madre.
DEFINICIÓN MATEMÁTICA DE LA RELACIÓN
SEÑAL-CONCENTRACIÓN

⚫ REGRESIÓN POR MÍNIMOS CUADRADOS

mínimo

Parámetros de la regresión

Pendiente, coeficiente de
regresión o sensibilidad

Ordenada en el origen o valor

del blanco
 DEFINICIÓN MATEMÁTICA DE LA RELACIÓN
SEÑAL-CONCENTRACIÓN
Número mínimo de puntos experimentales:
•Para rectas de calibrado de rutina, correspondientes a métodos
perfectamente establecidos que proporcionan unos resultados muy
controlados, probablemente una recta de calibrado con pocos puntos sea
suficiente.

•recta de calibrado para efectuar predicciones de muestras futuras,

obteniéndose también sus intervalos de confianza asociados,
probablemente será necesario aumentar el número de puntos hasta un
mínimo de 5 ó 6. De lo contrario, la seguridad en las predicciones y sus
intervalos de confianza asociados puede disminuir considerablemente.

•establecer el intervalo de linealidad de un método: mínimo de 6 niveles de

concentración más un blanco.

métodos analíticos que no requieren de dicha medida (p.e.

métodos potenciométricos); en esos casos la recta de calibrado se
construye con las restantes soluciones estándar

medida de la señal del blanco Otros métodos sí requieren de dicha medida (métodos
(disolución estándar con espectroscópicos):
concentración cero del analito) 1) registrar directamente la señal del blanco → (0,y0)
2) corregir la señal del resto de soluciones estándar por la señal del
blanco → (0,0).
Cuestiones a tener en cuenta

Este procedimiento de calibrado plantea varias cuestiones estadísticas importantes:

(1) ¿Es lineal la gráfica de calibrado?. Si es una curva. ¿Cuál es la forma de la curva?

(2) Si cada punto de la gráfica de calibrado está sujeta a errores, ¿cuál es la mejor línea recta (o
curva) que pasa por los puntos?

(3) Suponiendo que la curva de calibrado es lineal, cuales son los errores estimados y los límites
de confianza para la pendiente y la ordenada en el origen.

(4) Cuando la calibración se usa para el análisis de una muestra, ¿cuales son los errores y los
límites de confianza para la concentración determinada?

⚫ VALIDACIÓN DEL MODELO

⚫ INCERTIDUMBRE E INTERVALOS DE CONFIANZA

16
VALIDACIÓN DEL MODELO
Ámbito lineal del calibrado
⚫ Una parte importante de la tarea de calibración es
determinar el intervalo de concentraciones para el cuál
el modelo lineal es válido.
⚫ cálculo del coeficiente de correlación (r):

⚫ investigación del gráfico de residuos en función de la

concentración.
Los residuos deben ser todos de la misma magnitud y deben estar distribuidos
aleatoriamente en su signo (en una secuencia del tipo +-+-+- etc.). Si esto no fuese
así, debe sospecharse una relación no lineal entre x e y por lo que debe disminuirse
el rango de trabajo, o bien aplicar otro modelo, si la teoría así lo permite.

⚫ Análisis de la varianza
 Coeficiente de correlación
Tradicionalmente, la validación del modelo de línea recta se
suele llevar a cabo mediante la comprobación del
coeficiente de determinación (r2).

La calibración es realmente lineal?

coeficiente de correlación (r).

Rango de valores -1 r +1

+1 Correlación positiva perfecta. Ajuste perfecto
-1 Correlación negativa perfecta. Ajuste perfecto
0 No existe correlación
 Coeficiente de correlación
Que valores de r indican una buena calibración?

Se puede realizar un contraste estadístico en función del número de puntos de

calibración
H0 r es pobre, x e y no guardan relación
H1 r es significativo, buena correlación

t calc

Para t crítica = t n-2, 0.05 (tabla dos colas)

Si t calc < t crit aceptamos H0

Generalmente para alrededor de 5 puntos de calibración

r2 > 0,995 Es aceptable

Asegura una relación lineal? No

 Coeficiente de correlación
Malinterpretaciones de r

Estupendo r2 > 0,995 = Relación lineal

2
Falso

La relación entre x e y es una función

polinómica de segundo grado
y = cx2+bx+a
 Coeficiente de correlación
Malinterpretaciones de r

r =0 No existe relación entre x e y

Falso

Si hay relación entre x e y

pero no es lineal sino parabólica
 Análisis de residuos
Residuos = yi − yˆ i = ei

Su examen precisa experiencia previa, pero

hay varios comportamientos típicos:
- el número de residuales positivos es aproximadamente
igual al número de residuales negativos,
- los residuales están distribuidos aleatoriamente,
- los residuales tienen todos aproximadamente el mismo
valor absoluto,
- los residuales no muestran tendencias.

Correlación lineal
Distribución de residuos gaussiana y de media 0
(simétricas)

Correlaciones no lineales
Distribución de residuos no gaussiana normal
 Análisis de residuos
Homocedasticidad de residuos
Homocedasticidad
La dispersión (desv.std) de la población
independiente de x (concentración)

Todos los puntos en calibración igual peso

Calibración no ponderada

Heterocedasticidad
La dispersión (desv.std) de la población
depende de x (concentración)

Calibración ponderada Los puntos en calibración no deben de tener igual

peso al realizar la regresión
Calibración ponderada

Factor de peso
 Test F de Linealidad
⚫ Este Test se basa en descomponer la varianza existente entre las señales
experimentales y los valores predichos en dos aportes.
⚫ Variación total de los datos SST

⚫ Que puede dividirse en partes:

Media de las desviaciones experimentales correspondientes a cada valor de x

Valor predicho por el modelo para ese valor de x

⚫ Si elevamos al cuadrado y se hace un sumatorio sobre i y j los términos cruzados se
anulan:
 Test F de Linealidad

Variación residual, no Variación explicada por

explicada por la regresión la línea de regresión

Mide la variación Mide la variación

debida al puro error debida a la falta de
experimental ajuste
p-1 P=nº de
Grados de libertad: parámetros
del modelo
(p=2)
 Test F de Linealidad
⚫ Varianzas o cuadrados medios:
⚫el error experimental: debemos medir “i” replicados de cada patrón, por lo
que para cada punto x habrá varios valores de señal (yi).

n es el número total de mediciones,

k es el número total de patrones,
i son las repeticiones de cada patrón
yij son las señales de todos los experimentos.

⚫el error debido a la falta de ajuste:

 Test F de Linealidad

⚫ Si el modelo lineal es correcto, las varianzas MSLOF y MSPE serán comparables.

⚫ Si MSLOF es mayor que MSPE el ajuste no es correcto y hay que utilizar otro
modelo o reducir el ámbito de concentraciones en el cuál se hace el calibrado.
⚫ Para comparar MSLOF y MSPE hacemos un test F de varianzas calculando:

se acepta que existe buen ajuste al modelo lineal

 Test F de Linealidad
⚫ ejemplo
 Test F de Linealidad
⚫ SSREG/SST : Coeficiente de determinación múltiple, R2
⚫ Proporción de varianza total explicada por el modelo
⚫ Varía entre cero (x no tiene efecto sobre y) y uno (x explica
perfectamente y)
⚫ R: coeficiente de correlación múltiple
⚫ Si el modelo es una recta (p=2), R2 se convierte en r2 :
coeficiente de determinación
⚫ Su raíz cuadrada corregida por el signo de la pendiente es el
coeficiente de correlación (r)
Incertidumbre e intervalos de
confianza
La calidad de la calibración se evalúa prediciendo el valor de la señal, yˆ , para los
distintos patrones a través del modelo utilizado. Las diferencias entre la señales
observadas y las predichas se denominan residuos.

Varianza residual, se2, representa la varianza que no puede ser explicada por la línea
de regresión

ERROR ESTÁNDAR O
PURO ERROR
EXPERIMENTAL, sx/y

Para controlar la calidad de la

Y = mx + b información obtenida se puede
establecer el intervalo de
confianza del modelo.
 Incertidumbre e intervalos de
confianza de m y b
DESVIACIÓN ESTÁNDAR DE LA PENDIENTE

DESVIACIÓN ESTÁNDAR DE LA ORDENADA

Intervalos de confianza para m y b

m ± t (α/2, N-2) sm
t N-2 grados de libertad y el nivel de significación deseado y
b ± t (α/2, N-2) sb se busca en una tabla de dos colas
Incertidumbre e intervalos de
confianza de la línea de regresión
p
0,10 0,050 0,025 0,010 0,005 0,0025 0,0010 Una cola
g.d.l. 0,20 0,100 0,050 0,020 0,010 0,0050 0,0020 Dos colas
1 3,078 6,314 12,706 31,821 63,657 127,321 318,309
2 1,886 2,920 4,303 6,965 9,925 14,089 22,327
3 1,638 2,353 3,182 4,541 5,841 7,453 10,215
4 1,533 2,132 2,776 3,747 4,604 5,598 7,173
5 1,476 2,015 2,571 3,365 4,032 4,773 5,893
6 1,440 1,943 2,447 3,143 3,707 4,317 5,208
7 1,415 1,895 2,365 2,998 3,499 4,029 4,785
8 1,397 1,860 2,306 2,896 3,355 3,833 4,501
9 1,383 1,833 2,262 2,821 3,250 3,690 4,297

10 1,372 1,812 2,228 2,764 3,169 3,581 4,144

11
12
1,363
1,356
1,796
1,782
2,201
2,179
2,718
2,681
3,106
3,055
3,497
3,428
4,025
3,930
Los valores de m y b son únicamente estimaciones
13
14
1,350
1,345
1,771
1,761
2,160
2,145
2,650
2,624
3,012
2,977
3,372
3,326
3,852
3,787 de los verdaderos valores de los parámetros del
15 1,341 1,753 2,131 2,602 2,947 3,286 3,733
16
17
1,337
1,333
1,746
1,740
2,120
2,110
2,583
2,567
2,921
2,898
3,252
3,222
3,686
3,646
modelo. Por ello, la línea de regresión no es única
18
19
1,330
1,328
1,734
1,729
2,101
2,093
2,552
2,539
2,878
2,861
3,197
3,174
3,610
3,579 sino que existe una banda de regresión dentro de la
20
21
1,325
1,323
1,725
1,721
2,086
2,080
2,528
2,518
2,845
2,831
3,153
3,135
3,552
3,527
que está la verdadera línea.
22 1,321 1,717 2,074 2,508 2,819 3,119 3,505
23 1,319 1,714 2,069 2,500 2,807 3,104 3,485
24 1,318 1,711 2,064 2,492 2,797 3,091 3,467
25 1,316 1,708 2,060 2,485 2,787 3,078 3,450
26 1,315 1,706 2,056 2,479 2,779 3,067 3,435
27 1,314 1,703 2,052 2,473 2,771 3,057 3,421
28 1,313 1,701 2,048 2,467 2,763 3,047 3,408
29 1,311 1,699 2,045 2,462 2,756 3,038 3,396

30 1,310 1,697 2,042 2,457 2,750 3,030 3,385

40 1,303 1,684 2,021 2,423 2,704 2,971 3,307
60 1,296 1,671 2,000 2,390 2,660 2,915 3,232
120 1,289 1,658 1,980 2,358 2,617 2,860 3,160
####### 1,282 1,645 1,960 2,326 2,576 2,807 3,090

región conjunta de confianza que tenga en

cuenta la correlación existente entre las
estimaciones b0 y b1.
La incertidumbre de las predicciones
Tenemos la relación lineal entre concentraciones y señal del instrumento

Analicemos una muestra de concentración desconocida

http://t1.gstatic.com/images?q=tbn:ii_p5lcTMp4HRM:http://3.bp.blogspot.com/_IVijlECpkAk/SK4J_hSQFqI/AAAAAAAAASE/GHKyD3SqWYg/s320/matraz1.JPG

http://t3.gstatic.com/images?q=tbn:DZ7nNptXT8Y_OM:http://www.wcaslab.com/gif/ICP-OES_torch.jpg

¿ Cual será el error de la medida de concentración interpolada?

Depende de la precisión de la señal instrumental (recuerda que era apreciable)

Depende de la incertidumbre/error de la calibración efectuada (sb y sa)
Expresión del error global muy compleja !!!
 La incertidumbre de las predicciones
Se utiliza una expresión aproximada
Siendo
y0 valor de la señal experimental de la muestra
n Nº de patrones utilizados en calibración
xi Concentraciones de patrones de calibración
b pendiente

Que se puede transformar en

Siendo
m Repeticiones de la medida de la muestra

Si realizamos más de una medida de la muestra

Intervalo de confianza de la concentración interpolada (x0)

x0 ± t(n-2) sx0

Para n-2 grados de libertad y la confianza/probabilidad deseada

(preferiblemente al 95%)
La incertidumbre de las predicciones
Tiende a 0 cuando la señal se
encuentra en la zona central de
la calibración

Se minimiza sx
0

Se minimiza los errores y la incertidumbre

x0 ± t(n-2) sx0
menores errores en el centro de la calibración
 La incertidumbre de las predicciones

Interesa seleccionar bien cual es el rango de

concentración que queremos cubrir antes de calibrar

Zona central calibración = Rango de concentración

esperado de las muestras

x0 ± t(n-2) sx0 máximo Medida con alto error asociado

x0 ± t(n-2) sx0 mínimo Medida con bajo error asociado

Desde un punto de vista práctico, un experimento de calibración proporcionará valores más

precisos cuando las medidas se realizan en una zona de concentración próxima al punto
centroide que en los extremos de la misma
Características analíticas
Rango dinámico
Se considera que va desde la menor concentración
detectable (el LOD) hasta la pérdida de relación entre rango de aplicabilidad
respuesta y concentración. de la técnica.

En la zona de pérdida de la
linealidad, podría aplicarse, en
principio, un método de
regresión polinómica para la
calibración (o algún otro de
naturaleza no lineal), de modo
que nada impide que dicha zona
sea utilizada con propósitos
predictivos.
Características analíticas
intervalo óptimo de medida,
“intervalo útil”: corresponde al
rango lineal o intervalo de
concentraciones en el que la
curva presenta una relación
lineal entre señal y
concentración (LOL).

Sensibilidad: m

Límite de detección
• LOD= SB + 3 sB
• LOD = a + 3sy/x
• CLOD = (LOD-a)/b
Límite de cuantificación
• LOQ= SB + 10 sB
• LOQ = a + 10 sy/x
• CLQ = (LOQ-a)/b
 Límites de detección (LOD)
http://t2.gstatic.com/images?q=tbn:cRp-bL-QiUA4pM:http://geologia.cicese.mx/labs/images/t_geoquimica3.gif

http://t2.gstatic.com/images?q=tbn:8r5iZztPuncQ4M:http://www.agilent.fr/about/newsroom/lsca/imagelibrary/images/lsca_127_ICP-MS.jpg

http://t3.gstatic.com/images?q=tbn:SjG38lyEW7L79M:http://img.directindustry.es/images_di/photo-g/sistema-combinado-de-cromatografia-liquida-y-espectrometria-de-masas-lc-ms-330301.jpg

¿Como se calculan?
 Límites de detección (LOD)
Definición

“Aquella concentración de analito que proporciona una señal en el instrumento

significativamente diferente de la señal de ruido de fondo o señal de un blanco”

Definición abierta a interpretación

¿Donde situar la frontera entre ruido y señal de analito?

Situémoslo en Lc para α (p.e. 0,05) distribución normal de la señal de ruido o blanco (yb)
Imaginemos que son 2 ppb

Cualquier señal que de una

concentración > 2 ppb se debe al
analito y no a ruido

Podemos cometer error !!!

Hay ocasiones (α) en las que damos
por señal de analito lo que es ruido
 Límites de detección (LOD)
Estamos diciendo que nuestro técnica ve
a partir de 2 ppb pero…

¿Qué pasa con los valores de señal y concentración < 2 ppb que se deben a analito?

Erróneamente decimos que es ruido cuando es señal de analito

No podemos definir LOD de esta forma, demasiado error

 Límites de detección (LOD)
Debemos aumentar el límite de detección para tener
menos errores α y β

σ0 = σD Recuerda !!! que s es

igual en todo el rango de
concentración calibrado
HOMOCEDASTICIDAD

Si distancia LD – YB = 3 Sblanco Se demuestra que los errores α y β < 7%

Error razonable que es asumible
 Límites de detección (LOD) y de
Cuantificación (LOQ)
Hemos definido LOD
YLOD = YB + 3 SBlanco

Interpolar en recta El criterio de utilización es puramente

calibrado para averiguar arbitrario, pero hay que indicar el
concentraciones método utilizado
LOD o LOQ

También se utiliza LOQ

YLOQ = YB + 10 SBlanco
Límites de detección (LOD). Valores
YB y SBlanco
Obtención del valor de YBlanco
❖ Podemos tomar el valor a (ordenada en el origen) de la calibración

❖ Podemos medir 10 veces un disolución blanco y realizar promedio de señal

Obtención del valor de SBlanco

Recuerda!!! HOMOCEDASTICIDAD de residuos

S es igual en todo el rango de concentración

calibrado

❖ Podemos tomar S Blanco = S y/x de los puntos de calibración

❖ Podemos calcular la S de las 10 medidas de señal de blanco

Límites de detección (LOD). Valores
YB y SBlanco

Interpolar en recta
calibrado para
averiguar
concentraciones
LOD o LOQ
 Método de adición estándar
La adición de patrón es apropiada cuando la composición de la
muestra es desconocida o compleja y afecta a la señal analítica
http://t2.gstatic.com/images?q=tbn:8r5iZztPuncQ4M:http://www.agilent.fr/about/newsroom/lsca/imagelibrary/images/lsca_127_ICP-MS.jpg

ICP

No siempre podemos aislar el analito de

interés del resto de componentes que lo
acompañan en la muestra

¿Influirán en la señal del analito?

Método de adiciones estándar
¿Influirán en la señal del analito?
La respuesta es posiblemente sí

En función de
❖Técnica analítica empleada
❖Naturaleza de componentes que acompañan
❖Concentración de estos componentes

pueden influir en la señal del analito:

Inhibiendo/activando el proceso fisico-

químico que produce la señal

Interfiriendo directamente la señal de analito

Método de adiciones estándar
Queremos analizar Zn en agua de mar
Alrededor de 11000 ppm Na+

Si realizamos calibración con disoluciones puras de Zn (II) en agua destilada

estaríamos cometiendo un error ya que la relación Señal/concentración Zn(II) nada
tiene que ver el de las muestras reales (interferidas por Na+)

Solución
Reproduzcamos lo mejor posible condiciones
de salinidad de muestras añadiendo 11000
ppm de Na+ a cada patrón
Método de adiciones estándar
Ahora queremos analizar Zn en agua de ría
¿ppm Na+?

En función de las mareas y entrada de agua de mar a la ría

Rango desde unos pocos ppm hasta 11000 ppm

No podemos realizar unas condiciones de calibración que reproduzca

el número infinito de posibilidades de concentración en Na+ en
muestras a distinta salinidad

Solución
Método de adición de patrón
Método de adiciones estándar
¿En que consiste?

Adición de cantidades conocidas (excepto a una)

de concentración de analito de interés a
volúmenes iguales de la muestra a analizar

¿Concentración en
Zn de la muestra
analizada?
Extrapolar
Incertidumbre de concentración por
adición de patrón Extrapolación
SxE algo diferente a la expresión para una
calibración normal por interpolación

Intervalo de confianza de la concentración extrapolada (xE)

xE ± t(n-2) sxE
¿Cómo mejorar la precisión?

❖Aumentando en número de adiciones n (al menos n=6)

❖Maximizando (xi- )2, Deben cubrir un intervalo suficientemente grande

Si No
 Adición de patrón
Desventajas de adición de patrón

❖Cantidad de muestra disponible grande

❖Cada muestra requiere su propia gráfica de calibración

❖La extrapolación es menos precisa que interpolación

¿Cómo comprobar si existe efecto matriz y si debemos realizar adición patrón?

Se representa calibración normal

(disoluciones de analito puro) y adición
de patrón sobre una muestra
No hay efecto matriz
Pendientes iguales (líneas paralelas)
Hay efecto matriz
Pendientes desiguales
Método de patrón interno

❖ Si antes de la determinación se le agrega a la muestra una cantidad fija

de una sustancia con características químicas similares a las de la especie
a determinar, esta sustancia es llamada patrón interno y el método se
denomina método del patrón interno.

❖ La señal del analito se compara con las del patrón interno, y de ese modo
se determina el analito presente en el problema.

❖ En la adición estándar, el patrón es la misma sustancia que el analito. En

la calibración con patrón interno este es una sustancia distinta al analito.
Método de patrón interno

❖ Los patrones internos son especialmente útiles cuando la cantidad de

muestra analizada o la respuesta del instrumento varían algo de
experiencia a experiencia, por razones que son difíciles de controlar:
⚫ Por ejemplo, una variación de los caudales de gas o de líquido en una
experiencia cromatográfica, puede variar la respuesta del detector.

❖ Reduce errores por variación de condiciones experimentales: mayor

precisión de la recta de calibrado

❖ Una curva de calibrado solo es valida si se mantiene el conjunto de

condiciones como se obtuvo.

❖ Sin embargo, la respuesta relativa del detector para el analito y el patrón

es normalmente constante en un amplio intervalo de condiciones.
Método de patrón interno

❖ Características
❖ No ser un componente original de la muestra.
❖ Naturaleza similar al resto de los solutos.
❖ Debe añadirse en concentraciones similares a la de los otros componentes
de la muestra.
❖ Eluirse en el centro de los solutos a cuantificar.
❖ Separarse bien del resto de los solutos.

cromatografía
 Método de patrón interno
⚫ En la preparación de los patrones como en la del analito, se añade una
cantidad idéntica de una sustancia que actúa de "patrón interno".
⚫ La recta de calibrado se obtiene representando
⚫ en ordenadas el cociente
Area patrón/Area patrón interno
⚫ frente a concentraciones de los patrones en abscisas.

⚫ Si el detector responde de igual manera al estándar que al

analito, F = 1. Si el detector con intensidad doble al analito
que al estándar, F = 2. Si el detector responde con una
intensidad mitad al analito que al estándar, F = 0,5.

Área de la señal del analito  Área de la señal del patrón 

Factor de respuesta : = F 
Concentración de analito  Concentrac ión de patrón 

AX  AS 
= F  
X   S  
Otras aplicaciones de interés analítico

Validación de métodos

1. Ensayos de recuperación
2. Comparación de métodos
3. Efectos matriz
Ensayos de recuperación

⚫ Sirven para validar un procedimiento analítico

⚫ Se analizan blancos dopados o fortalecidos
(spiked) con concentraciones diferentes de
analito exactamente conocidas.
⚫ Se representa la concentración encontrada
frente a la añadida
Ensayos de recuperación

⚫ Al hacer la regresión, se debería

obtener una línea recta de ordenada
en el origen cero y pendiente uno, o
bien los intervalos de confianza de b
y m deben incluir a cero y a uno,
respectivamente.

⚫ Si la ordenada en el origen es mayor

de cero existe un error sistemático
(bias) constante (o una corrección
incorrecta del blanco)

⚫ Si la pendiente difiere de uno, existe

un error sistemático (bias)
proporcional que suele ser debido a
la matriz.
Comparación de métodos mediante
análisis de regresión
⚫ Supóngase que se ha desarrollado un método nuevo para determinar un
analito en una matriz dada. Para validar la incertidumbre y la exactitud del
método este se aplica a un material de referencia certificado.

⚫ Sin embargo, el proceso de validación cambia cuando se quiere validar un

método a varios niveles de concentración, y no a uno solo. Para ello, será
necesario utilizar varios materiales de referencia, conteniendo distintos
niveles de concentración de analito, o también, aplicar el método a un
conjunto de muestras ya estudiadas por otro procedimiento estándar o de
prestigio.

⚫ Cuando se comparan dos métodos a diferentes concentraciones de

analito se puede utilizar el análisis de regresión: Uno de los ejes de la
gráfica de regresión se utiliza para los resultados obtenidos con el nuevo
método( eje Y), y el otro para los que se obtienen aplicando el de
comparación o referencia a las mismas muestras (eje X). Así cada punto
de la gráfica representa una única muestra analizada por dos métodos
separados
Comparación de métodos
mediante análisis de regresión
Caso a
m = 1, b=0 y r=1 no hay evidencia de error
sistemático

m =1 y b ≠ 0 uno de los métodos

sufre una interferencia,
o lo que es igual, la
señal de fondo de uno
de los métodos no está
bien medida (uno de los
blancos o los dos no
esta bien construido)

m≠1 existe error sistemático

Ejemplo

muestra AAS PSA

1 35 35 400

2 75 70 300
3 75 80
200
4 80 80
100
5 125 120
6 205 200 0
7 205 220 0 100 200 300 400
8 215 200
9 240 250
10 350 330
a = 3,87; b = 0,968; r = 0,9945
Sy/x = 10,56; sa = 6,64; sb = 0,0357
t (8, 95%) = 2,31

a = 3,87 ± 15,34 No hay evidencia de diferencias

sistemáticas entre los dos conjuntos
b = 0,963 ± 0,083 de resultados
Detección de efectos de matriz
⚫ Los efectos de matriz se buscan comparando las
pendientes de una línea de calibrado hecha con
patrones puros, y la de un M.A.P. realizado sobre una
muestra real

⚫ Las concentraciones de analito en ambos casos deben

ser comparables.

⚫ Si las pendientes son idénticas, o sus intervalos se

solapan, o la prueba t dice que son comparables: no hay
efecto de matriz: Las determinaciones pueden hacerse
por calibrado lineal.

⚫ Si las pendientes son diferentes, hay efecto de matriz:

Es necesario utilizar el M.A.P.
Detección de efectos de matriz

Comparación de las pendientes de dos líneas de

regresión
⚫ Dadas las pendientes de dos líneas de regresión
b11 y b12, se las puede comparar mediante una
prueba de significación (test t):

donde el t crítico se busca con

n1+n2-4 g.d.l. y el nivel de
significación deseado
Detección de efectos de matriz

⚫ Si las varianzas residuales de ambas líneas no son

comparables, el t crítico se calcula previamente como:

⚫ La prueba puede hacerse de forma rápida: si los

intervalos de confianza de b11 y b12 no se solapan las
pendientes difieren significativamente, y viceversa.
Métodos de regresión

⚫ Regresión lineal simple: ajuste lineal de una

respuesta a una sola variable independiente
⚫ Heterocedasticidad: mínimos cuadrados ponderados
⚫ Ambas variables están sujetas a error (comparación de
métodos): regresión de la distancia ortogonal
⚫ Regresión lineal múltiple: varias variables
independientes
⚫ Notación matricial η = β0 + β1x1 + β2x2 + ... + βmxm

⚫ Regresión no lineal
Mínimos cuadrados con pesos
(ponderados)
Factor de peso
 Regresión lineal ortogonal
ambas variables están sujetas a error

minimizar di2 : la suma de los cuadrados de las

distancias perpendiculares de los puntos
experimentales a la línea de regresión
 Regresión lineal múltiple

Las estimaciones b0...bm de los p (p = m+1) coeficientes de regresión

desconocidos β0...βm, se obtienen minimizando la suma de los cuadrados de
los residuales.

Σεi2 →mínimo
Tε ε →mínimo

La varianza global del ajuste, que es una

estimación del error experimental σ2 si el
modelo es correcto
 Regresión no lineal
⚫ En ocasiones el modelo en el que se basa el sistema que se está
estudiando no es lineal en los parámetros. A veces, mediante la
adecuada transformación, se puede linearizar el problema y resolverlo
mediante Regresión lineal por Mínimos Cuadrados.
⚫ Cuando el modelo no se puede transformar en un modelo lineal no queda
más remedio que aplicar Métodos de Ajuste No Lineal.
⚫ El más importante es el basado en la minimización de la suma de
cuadrados de los residuales, que origina el Método de Mínimos
Cuadrados No Lineales cuya modalidad más extendida es el Método de
Gauss-Newton.
⚫ el proceso no origina la solución exacta en una sola operación, y al contrario
que en el caso lineal, debe llevarse a cabo un proceso iterativo