Propiedades Fisicoquimicas Del DNA

DNA
DNA ESTRUCTURA
LA
ESTRUCTURA
DEL ADN ESTA
DEFINIDA POR
LA SECUENCIA
DE LAS BASES
NITROGENADA
S EN LA
CADENA DE
NUCLEOTIDOS
ESTRUCTURA DE BASES NITROGENADAS

DEL DNA Y RNA
Composicin en bases del DNA en algunas especies

A
Hombre, H.sapiens
0.29
0.18
0.18
0.31
Bovino, Bos taurus
0.26
0.24
0.23
0.27
Levadura, S.cerevisiae
0.30
0.18
0.15
0.29
Mycobacterium sp.
0.12
0.28
0.26
0.11
Reglas de Chargaff
1. La relacin purinas/pirimidinas es igual a 1

Es decir, A+G = C+T
2. En todos los DNA estudiados, la proporcin molar
de A es igual a la de T, y la de G igual a la de C.
Es decir, A = T y G = C
Modelo de Watson - Crick, A
3.4 nm
1. El DNA es una doble hlice

plectonmica y dextrgira,
con un paso de rosca de 3.4 nm
Modelo de Watson-Crick, B
2. Cada una de las dos hlices es un polinucletido entrelazado con

el otro de manera que su polaridad es opuesta (es decir, corren en
sentido antiparalelo)
3. El eje ribosa-fosfato se sita

hacia el exterior de la doble hlice,
en contacto con el solvente
Modelo de Watson-Crick, C
4. Mientras que las bases nitrogenadas

(anillos planares) se sitan, apiladas,
hacia el interior de la estructura, en un
entorno hidrofbico
Modelo de Watson-Crick, D
0.34 nm
5. Las bases estn situadas en planos aproximadamente

perpendiculares al eje mayor de la doble hlice. La distancia
entre planos es de 0.34 nm
Modelo de Watson-Crick, E
6. Cada base interacciona

con su opuesta a travs de
enlaces de hidrgeno, y de
manera que:
CH3
H
A
N
N
H
N
O
H
T
N
N
O
(a) Adenina (A) slo puede

interaccionar con timina (T)
(y viceversa), a travs de dos
puentes de hidrgeno, y
H
G
N
N
H
N
(b) Guanina (G) slo

puede interaccionar con
citosina (C) (y viceversa),
a travs de tres puentes
de hidrgeno
N
H
N
H
N
H
N
O
Modelo de Watson-Crick, F
8. La desoxirribosa
en forma furansica
7. La base est situada

en posicin anti-
1
4
3
9. El anillo furansico est

en conformacin endo-2
Surco
estrecho
Surco
ancho
10. El eje de la doble hlice

no pasa por el centro geomtrico
del par de bases. Esto determina
que la hlice presente un surco
ancho y un surco estrecho
Modelo de Watson-Crick, G
Geometra de la doble hlice (DNA-B)
3.4
0.34
2.4
Paso de rosca
3.4 nm
Distancia entre
planos de bases
0.34 nm
Pares de bases/vuelta
10
Anchura
2.4 nm
Interacciones dbiles que mantienen la estructura del DNA

1. Enlaces de hidrgeno entre
bases complementarias
2. Interacciones hidrofbicas
entre planos de bases contiguos
(int. de apilamiento, stacking)
3. Interacciones inicas del fosfato
con molculas electropositivas
(histonas, poliaminas, etc.)
Pruebas experimentales de la estructura del DNA

1. Compatible con los datos cristalogrficos
2. El modelo predice una determinada densidad lineal que se
cumple para todos los DNAs conocidos
3. El DNA rico en GC debe ser ms difcil de desnaturalizar que
el rico en AT. Esta prediccin se cumple perfectamente.
4. El estudio de frecuencias de vecino ms prximo (A.Kornberg)
slo es compatible con un modelo complementario y antiparalelo
p.e.: el par AG tiene la misma frecuencia que el par CT; AT tiene
la misma frecuencia que TA, y as sucesivamente.
Distintas formas del DNA
Grosor
Giro
Bases/vuelta
P.de rosca
Inclinacin
plano bases
2.6
Dextro
11
2.5
19
2.4
Dextro
10.4
3.4
1
1.8
Levo
12
4.5
9
DNA-A
1.Doble hlice plectonmica y dextrgira

2. Planos de bases oblicuos respecto
al eje de la doble hlica
3. Propio de RNAs en doble hlice, o
de hbridos DNA-RNA
4. Ms ancha y corta que DNA-B
DNA-Z
1. Doble hlice plectonmica y levgira
2. Zonas de secuencia alternante -GCGC3. Conformacin de G es syn- en lugar de
anti4. Ms estrecha y larga que DNA-B
Desnaturalizacin del DNA

% Incremento
Absorbancia a
260 nm
La desnaturalizacin
trmica del DNA sigue
una curva sigmoide. El
punto medio, Tm, est
relacionado con el contenido en G+C. As, la muestra
B tiene un mayor contenido
en G+C que A.
T, C
La temperatura de fusin (Tm) necesaria para

desnaturalizar la mitad del ADN de una mezcla (punto
medio de la reaccin ADN doble hlice ADN hlice
sencilla) esta directamente relacionada con el contenido en
G+C, a mayor contenido en G+C mayor temperatura de
fusin (Tm).
Efecto Hipo crmico del DNA

El estado fsico de los cidos nucleicos est relacionado
con su capacidad de absorcin de la luz ultravioleta
(UV) a 2.600 . El menor grado de absorcin se
produce en estado de doble hlice, la absorcin
aumenta cuando se produce la desnaturalizacin
pasando a estado de hlice sencilla (efecto
hipercrmico, aumento de la absorbancia) y, por ltimo,
si degradamos este ADN de hlice sencilla a nivel de
nucletidos libres, de nuevo aumenta la absorbancia.
EFECTO HIPOCROMICO
Para qu purificar DNA?

Aplicaciones
Aplicaciones
Forense
Dx enfermedades infecciosas
Dx enfermedades congnitas
Clonacin de Genes
Genmica
Control de calidad microbiolgico
Biodiversidad
Identificacin de especies
Cmo purificar DNA?
Los 3 pasos bsicos para purificar DNA
1. Lisis celular
2. Fraccionamiento de los cidos nucleicos
3. Concentracin de los cidos nucleicos
1. Lisis celular
Lisis enzimtica de tejidos animales
Tampn de lisis con detergente. Algunos protocolos
Con proteinasa K.
Lisis de bacterias o levaduras.
Lisozima (Bacterias Gram-positivas)
liticasa (levaduras).
Detergente y pH alcalino para plsmidos.
Homogenizadores mecnicos
Agitador mecnico, a la muestra se adicionan esferas.
Congelacin descongelacin
Se usa nitrgeno liquido.
2. Fraccionamiento de los cidos nucleicos
Preparacin de lisados crudos

No se purifica
Salting-out methods
Se precipitan las proteinas y
contaminantes con sales de acetato de
amonio o potasio
Fraccionamiento con solventes
orgnicos
Fenol/cloroformo/alcohol isoamlico
3. Concentracin de cidos nucleicos
Precipitacin con:
Etanol
Isopropanol
En presencia de sales
2. SEPARACION DE FRAGMENTOS DE DNA
Electroforesis
Cmo hacer una electroforesis de

DNA?
Electroforesis de DNA
Cmo se ve una electroforesis de DNA en geles de Agarosa?
5
4
Propiedades estructurales del DNA

3
5p
OH
3OH
p5
Las hebras de una molecula de DNA son

Antiparalelas y complementarias
Complementaridad del DNA
5p
OH
C
Puentes
Hidrgeno
T
3
OH
G
p 5
Desnaturalizacin/reasociacin del DNA
A T G T T C A G C
A T G T T C A G C
T A C A A G T C G
T A C A A G T C G
95C
Reasociacin solo con cadenas complementarias
A T G T T C A G C
G T G T C C A A A
Hibridacin
Es la unin de dos cadenas de cidos nucleicos

complementarias para formar un duplex o
molcula de cadena doble.
Posibles hbridaciones
DNA-DNA
DNA-RNA
Reasociacin
Renaturalizacin
Desnaturalizacin
dsDNA
ssDNA
apaream
iento
inicial
dsDNA
Molcula de DNAcs o
RNA homloga a una
secuencia de DNAcs o
RNA con la que se
hibrida
de
forma
estable y especfica por
asociacin
de
bases
complementarias.
Sondas
Una sonda es un fragmento de DNA que:

Se puede marcar para ser identificado y medido
Se hibrida a un DNA gracias a su complementaridad
Tipo de marcajes
Radioactivo (32P, 35S, 14C, 3H)
Fluorescente
Biotinilacin (avidina-streptavidina)
Southern Blot
Hibridacin de DNA
inmobilizado en soportes de
hibridacion:
Nitrocelulosa
Membranas de nylon
Nucleasas
5 Exonucleasa
Endonucleasa
3 Exonucleasa
Southern Blot
Enzimas de retriccin
DNA de varios
tamaos
Electroforesis en gel de agarosa
gel
Denaturacin y transferencia a NC
blot
Hibridacin de la sonda
Visualizacin
Southern (and Northern) blot:

1. electrophoresis

2. transfer to a filter/membrane

3. hybridization to a labeled unique probe
transferencia
vo
neg
ati
Gel de agarosa
Tes
tigo
Denaturalizacin del ADN
mue
stra
Clulas,
microorganismos
Tes
tigo
Ectraccin y
pos
itivo
MUESTRA
Filtro de
nitrocelulosa
Separacin de
filamentos
de ADN
ELECTROFORESIS
sondas
hibridacn
lavado
autoradiografa
Southern Blot
COLONIAS
FILTRO DE
NITROCELULOSA
- Rplica en placa con filtro

COLONIAS REPLICA EN
PLACA CON FILTRO
FILTRO CON COLONIAS
- Lisis
- Secado
ADN DE LAS COLONIAS
EN EL FILTRO
- Hibridacin con sonda radioactiva

AUTORADIOGRAFA
COLONIA
Hibridacion in situ por fluorescencia
Hibridacion in situ por fluorescencia

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ESTRUCTURA DE BASES NITROGENADAS

Composicin en bases del DNA en algunas especies

Bovino, Bos taurus

1. La relacin purinas/pirimidinas es igual a 1

Modelo de Watson - Crick, A

1. El DNA es una doble hlice

2. Cada una de las dos hlices es un polinucletido entrelazado con

3. El eje ribosa-fosfato se sita

4. Mientras que las bases nitrogenadas

5. Las bases estn situadas en planos aproximadamente

6. Cada base interacciona

(a) Adenina (A) slo puede

(b) Guanina (G) slo

7. La base est situada

9. El anillo furansico est

10. El eje de la doble hlice

Geometra de la doble hlice (DNA-B)

Interacciones dbiles que mantienen la estructura del DNA

Pruebas experimentales de la estructura del DNA

Distintas formas del DNA

1.Doble hlice plectonmica y dextrgira

Desnaturalizacin del DNA

La temperatura de fusin (Tm) necesaria para

Efecto Hipo crmico del DNA

Para qu purificar DNA?

Cmo purificar DNA?

Los 3 pasos bsicos para purificar DNA

2. Fraccionamiento de los cidos nucleicos

Preparacin de lisados crudos

3. Concentracin de cidos nucleicos

2. SEPARACION DE FRAGMENTOS DE DNA

Cmo hacer una electroforesis de

Cmo se ve una electroforesis de DNA en geles de Agarosa?

Propiedades estructurales del DNA

Las hebras de una molecula de DNA son

Complementaridad del DNA

Desnaturalizacin/reasociacin del DNA

Reasociacin solo con cadenas complementarias

Es la unin de dos cadenas de cidos nucleicos

Una sonda es un fragmento de DNA que:

Southern (and Northern) blot:

Southern (and Northern) blot:

Southern (and Northern) blot:

Denaturalizacin del ADN

- Rplica en placa con filtro

FILTRO CON COLONIAS

- Hibridacin con sonda radioactiva

Hibridacion in situ por fluorescencia

Hibridacion in situ por fluorescencia

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