Som Maire

FONDATION CONGOLAISE POUR LA RECHERCHE MEDICALE
Rapport de stage
La recherche médicale
Présenté par :
Julphin Ornevalde BATANTOU
30/09/2017
SOMMAIRE :
I. Remerciements ………………………………………………………………………….. 2
II. Introduction…………………………………………………………………………………3
III. Le cadre du stage…………………………………………………………………………4
1. Localisation……………………………………………………………………….4
2. Description……………………………………………………………………….4
3. Organigramme………………………………………………………………….6
IV. Missions effectuées…………………………………………………………………….7
1. Extraction d’ADN du sang humain…………………………………….7
2. PCR (réaction de polymérisation en chaine) classique du
gène CYP2B6 et NCR-3………………………………………………………8
3. Electrophorèse du gène PFMDR-1…………………………………..13
4. Digestion enzymatique du gène NCR-3…………………………….15
5. PCR nichée du gène MSP-1………………………………………………18
6. RT-PCR d’un norovirus……………………………………………………..22
V. Conclusion et perspectives………………………………………………………..24
VI. Annexe..…………………………………………………………………………………….25
VII. Références…………………………………………………………………………………26
Rapport de stage Page 1

I. Remerciements
Avant tout développement sur cette expérience professionnelle, il apparait opportun de

commencer ce rapport de stage par des remerciements, à ceux qui m’ont beaucoup appris
au cours de ce stage, et même à ceux qui ont manifesté la gentillesse de faire de ce stage un
moment très profitable.
Je souhaite tout d’abord remercier le Pr Francine NTOUMI directrice générale de la FCRM

pour avoir accepté de m’accueillir comme stagiaire au sein de l’entreprise.
Aussi, je remercie la responsable de la formation Mme Carine KADES, ainsi que Mr Félix
KOUKOUIKILA KOUSSOUNDA mon maitre de stage de m’avoir accepté dans son équipe.
Je tiens également à remercier toute l’équipe de la FCRM qui m’a suivi et encadré tout au
long de mon stage.
J’aimerais également remercier tout le personnel de la faculté des sciences et technique de

l’université Marien NGOUABI (Doyen, Vice-Doyen, enseignant, personnel administratif,…)
pour m’avoir apporté les connaissances théoriques et pratiques nécessaire au bon
déroulement du stage.

II. Introduction
Du 18 septembre au 30 septembre 2017, j’ai effectué un stage au sein de la Fondation

Congolaise pour la Recherche Médicale (FCRM). Au cours de ce stage au département de
biologie cellulaire et moléculaire, j’ai pu m’intéresser à la recherche en générale mais
particulièrement à la recherche médicale dans le domaine qui est le mien c’est-à-dire la
chimie. Plus largement, ce stage a été l’opportunité pour moi d’appréhender certains aspect
dans la vie au laboratoire, approfondir et appliquer mes connaissances acquises et élevé
mon niveau de compétences et échanger avec des professionnels. Le travail effectué s’est
avéré très enrichissant pour mon expérience professionnelle en vue d’une poursuite de mon
cursus universitaire en chimie médicinale, ce stage m’a permis de mieux m’imprégner sur
quelques techniques utilisées au laboratoire de biologie moléculaire notamment
l’extraction d’ADN du sang humain avec le kit de Qiagen, PCR classique et nichée des gènes
humains, l’électrophorèse avec le gel d’agarose, la RT- PCR d’un norovirus et digestion
enzymatique. Le but de ce rapport n’est pas de faire uniquement une présentation
exhaustive de tous les aspects techniques que j’ai pu apprendre ou approfondir, mais aussi
de manière synthétique et claire de faire un tour d’horizon d’aspects techniques et humains
auxquels j’ai été confronté.

III. Le cadre du stage
1. Localisation
Le laboratoire de biologie moléculaire de la Fondation Congolaise pour la Recherche

Médicale est situé au sein de la Faculté des Sciences de la Santé de l’université Marien
Ngouabi.
2. Description
Le laboratoire de biologie cellulaire et moléculaire de la Fondation Congolaise pour la

Recherche Médicale est constitué de cinq (05) salles
 Salle 1 :
Cette salle est essentiellement une salle de repos avec une connexion internet et une
imprimante
 Salle 2 :
Dans cette salle on fait l’électrophorèse avec le gel d’agarose et la préparation des mix PCR.
On dispose des :
 Appareils
 Une hotte
 Un agitateur
 Une balance
 Une cuve à électrophorèse
 Un congélateur à -20°c
 Un four à micro- ondes
 Une machine à UV relié à l’ordinateur
 Un générateur
 Matériels
 Deux plateaux
 Le niveau
 Portoirs pour tubes
 Micropipettes
 Embouts blancs et jaunes
 Des crayons marqueurs
 Une pissette contenant alcool dilué à 70%
 Les peignes

 Papier parafilm.
 Salle 3 :
Dans cette salle on réalise l’extraction d’ADN du sang humain avec le kit de Qiagen,
une digestion enzymatique et l’addition de l’ADN /ARN au réactif d’amplification. On
retrouve dans cette salle des :
 Appareils :
 Un ordinateur
 Une centrifugeuse
 Un thermomixer
 Une hotte
 Un congélateur à – 4°c
 Deux réfrigérateurs
 Light cycler
 Un vortex
 Un incubateur
 Matériels :
 Micropipettes
 Deux béchers
 Un erlenmeyer
 Embouts blancs et jaunes
 Portoirs pour tubes
 Des crayons marqueur
 Une pissette contenant de l’alcool dilué à 70%
 Salle 4 :
Dans cette salle on réalise l’amplification d’ADN/ ARN et comprend des :
 Appareils :
 Trois thermocycleur
 Un microscope
 Meuble :
Un buffet servant à stocker les réactifs.
 Salle 5 :

Cette salle est composée d’un congélateur à – 80°C permettant de stocker les échantillons à
long terme.
3. Organigramme
Conseil d’Administration
Conseil Scientifique Direction Générale Conseil d’Ethique Institutionnel
(CEI)
Responsable Responsable Chef de Responsable Cabinet de

Administration Opérations Labo Consultation et
et Finances Recherche Laboratoire d’Analyses
Médicales (CCLAM)
Assistant Agents Consultations Laboratoire

Techniciens de Labo
Assistante Contrôle
de de
Assistante CE
Formations
Chercheurs
Etudiants
Qualité
Direction service
Techniciens de Labo
Agents de santé
Infirmières
Médecins
Figure 1:Organigramme de la FCRM

IV. Missions effectuées
1. Extraction d’ADN du sang humain

a. But :
Consiste à réaliser la purification de l’ADN
b. Principe :
Consiste à isoler l’ADN d’une cellule ou d’un tissu.
c. Matériels et produits utilisés :

 Matériels :
 Centrifugeuse
 Vortex
 Thermomixer
 Micropipettes
 Portoirs à tube
 Embouts
 Pissette
 Deux tubes à Eppendorf
 Deux colonnes.
 Produits :
 Kit de Qiagen
 Protéinase K
 Tampon AL, AE, AW1, et AW2
 Alcool (éthanol pure)
 Un échantillon du sang humain.
d. Mode opératoire :
 Nettoyer la paillasse avec la pissette contenant alcool dilué à 70%
 Pipeter 20ul de protéinase K
 Ajouter 200ul de sang humain
 Mettre 200ul de tampon AL (pour garder le PH constant)
 Vortexer les deux tubes pour les mélangés à 15 minutes
 Incuber à 56°C pendant 5 minutes
 Ajouter 200ul d’éthanol puis Vortexer pendant 15 secondes et faire une brève
centrifugation

 Mettre chaque échantillon dans une colonne
 Centrifuger à 8000trs pendant 1 minute
 Séparer les tubes avec la colonne
 Introduire la colonne dans un nouveau tube Eppendorf et ajouter 500ul du tampon
AW1
 Centrifuger à 8000trs pendant 1 minute
 Ajouter 500ul de tampon AW2 et centrifuger à 14000trs pendant 3 minutes
 Introduire la colonne dans un nouveau tube Eppendorf et ajouter 150ul de tampon
AE.
e. Commentaire :
L’ADN (acide désoxyribonucléique) extrait peut ensuite être utilisé pour des recherches de
biologie moléculaire, telles que la PCR ou clonage, la digestion enzymatique et le
séquençage.
2. PCR classique du gène CYP2B6 et NCR-3

a. But :
Quantifier l’expression d’un gène donné ou détecter la présence de ce dernier.
b. Principe :
La réaction de polymérisation en chaine (PCR) consiste à amplifier une séquence spécifique

d’ADN c'est-à-dire obtenir à partir d’une quantité fine plusieurs copies d’une séquence
d’ADN ; elle se déroule en trois étapes à savoir :
 Dénaturation : Rupture des liaisons d’hydrogènes conduisant à la séparation des

brins d’ADN en simple d’ADN Hybridation
 Fixation des couples d’amorces à l’extrémité 3’ de chaque brin d’ADN ;
 Elongation : Taq polymérase permet la synthèse des brins complémentaires d’ADN à
partir de chaque amorce.
c. PCR classique du gène CYP2B6
Le gène CYP2B6 (CY : cytochrome P456, P : famille, B : sous famille et 6 : allèle) est un gène
humain situé sur le chromosome 19. IL intervient dans le métabolisme des médicaments
antipaludique, antirétroviraux et cancéreux. Ce gène est polymorphe de 28 variant
alléliques dont G516T est commun au niveau de l’allèle 6 et 18, ce gène fait intervenir une
mutation G516T au niveau de l’exon 4 au cours de laquelle guanine (G) est substitué par
thymine (T) en position 516 et au niveau de la protéine cette mutation a lieu en position 72
où l’histidine est substitué par la glycine.
 Préparation des amorces de 10pmol (100UL) :

Amorce sens
 Pipeter 10ul d’amorce sens (CYP2D6 4F)
 Ajouter 90ul d’eau stérile et Vortexer.
Amorce anti sens
 Pipeter 10ul d’amorce anti sens (CYP2D6 4R)
d. Matériels et Produits utilisés :
 Matériels :
 Deux hottes
 Micropipettes
 Embouts
 Portoirs pour tube
 Tube à Eppendorf
 Pissette
 Thermocycleur
 Vortex et crayon marqueur
 Tube à PCR
 Produits :
 Taq polymérase
 4 dNTPs (desoxyribonucleotides- tri- phosphates)
 PCR buffer (tampon)
 Deux amorces (sens et anti sens)
 H20 stérile.
e. Mode opératoire:
 Préparation du mélange réactionnel
Produits x 1 x 31
H20 stérile 13,1 406,1
PCR buffer (10x) 2,5 77,5
DNTPs (25x) 0,2 6,2
Amorce sens (CYP2B6 4F) 1 31
Amorce anti sens (CYP2B6 4R) 1 31

Taq polymérase 0,2 6,2
 Vortexer le mélange réactionnel

 Distribuer 18ul du mélange réactionnel dans chaque tubes (31) PCR, ajouter 2ul
d’ADN extrait dans ces tubes (29) , un tube pour un contrôle positif (auquel on
ajoute 2ul d’ADN dont le profil est déjà connu) et un tube pour un contrôle négatif
( on ajoute 2ul d’eau stérile à la place d’ADN)
 Placer les tubes dans le thermocycleur à 30 cycles préalablement programmé et
lancer l’amplification pendant 1h 23 minutes.
f. PCR classique du gène NCR-3
Le gène NCR -3 (récepteur naturel de la cytotoxicité) est un gène humain situé au niveau
des cellules NK (naral killer) intervient dans le mécanisme l’immunité innée, ce gène code
pour une protéine NKP30 (A, B et C) .Les maladies associées à NCR-3 incluent le paludisme,
l’insuffisance vasculaire légère et chronique. Il fait intervenir une mutation au niveau du
chromosome 6 en position 412 au cours de laquelle la cytosine (C) est substitué par la
guanine(G).
 Mode opératoire :
Préparation des amorces de 10pmol (100UL)
Amorce sens :
 Pipeter 50ul d’amorce sens (NCR3F) ;
Amorce anti sens :
 Pipeter 50ul d’amorce anti sens (NCR3R) ;
Matériels et Produits utilisés :
 Matériels :
 Deux hottes ;
 Micropipettes ;
 Embouts ;
 Portoirs pour tube ;
 Tube à Eppendorf ;
 Pissette ;
 Thermocycleur ;
 Vortex et crayon marqueur ;
 Tube à PCR.
 Produits :

 Taq polymérase ;
 4 dNTPs (desoxyribonucleotides- tri- phosphates) ;
 PCR buffer (tampon);
 H20 stérile;
 Deux amorces (sens et anti sens)
 Protocole :
 Préparons le mélange réactionnel pour un volume final de 18ul contenant :
Réactifs x 1 (ul) x 9 (ul)
H20 stérile 13,6 122,4
PCR buffer (10x) 2 18
DNTPs (25x) 0,2 1,8
Amorce sens (CYP2B6 4F) 1 9
Amorce anti sens (CYP2B6 4R) 1 9
 Vortexer le mélange réactionnel ;

 Distribuer 18ul du mélange réactionnel dans chaque tubes(9) PCR, ajouter 2ul
d’ADN extrait dans ces tubes (8) et un tube pour un contrôle négatif ( on
ajoute 2ul d’eau stérile à la place d’ADN) ;
 Placer les tubes dans le thermocycleur à 40 cycles préalablement programmé et
lancer l’amplification pendant 1h 30 minutes.
 préparation de la solution de migration :

Matériels et produits utilisés :
 Matériels :
 Papier à aluminium
 tube à Eppendorf
 Produit :
 H20 stérile ;
 SYBER green ;
 LP.
 Protocole :
 Pipeter 150ul H20 stérile ;
 Ajouter 250ul LP (1x) et 100ul Syber green

 Electrophorèse (amplicons PCR) du gène NCR-3
Matériels et produits utilisés
 Matériels
 Balance ;
 Four à microonde ;
 Becher et papier à aluminium.
 Machine à UV relié à l’ordinateur ;
 Cuve à électrophorèse ayant de fil de branchement (l’anode et la cathode) au
générateur ;
 Générateur ;
 Micropipette (2- 20ul) ;
 Papier parafilm ;
 Peigne et plateau ;
 Portoirs, niveau et cônes
 Produits
 Gel d’agarose ;
 TBE 1x (Tris / Borate / EDTA).
 Solution de migration ;
 Gel d’agarose dissocié
 Amplicons (PCR) ;
 Marqueur poids moléculaire.
 Préparation du gel d’agarose
 Peser 2 g d’agarose ;
 Prélever 100ul de TBE1x à l’aide d’un bêcher ;
 Ajouter 2g d’agarose dans le bêcher ;
 Mettre le dans le four à microonde puis calibrer le four à 3 jusqu'à la
dissolution du gel.
 Dépôt de l’ADN dans les puits

 Couler le gel dissocié sur le plateau préalablement fixé sur un support en
présence des peignes afin de le solidifier et enlevons les peignes ;
 Placer le plateau dans la cuve à électrophorèse contenant du TBE 1X ;
 Mélanger 5ul de la solution de migration avec 5ul du marqueur poids
moléculaire sur du papier parafilm et chargeons 10ul dans le premier puits
du gel ;
 mélanger 5ul de la solution de migration avec 5ul d’amplicons PCR sur du
papier parafilm et charger 10ul dans les puits correspondants ;

 Changer de cône à chaque dépôt ;
moléculaire sur du papier parafilm et chargeons 10ul dans le dernier puits du
gel ;
 Migration
 Fermer le couvercle ;
 Connecter la cuve à l’électrophorèse au générateur. Brancher ce dernier a la
prise du courant, mettre le générateur en marche, calibrer laisser migrer les
amplicons pendant 1 heures
 Coloration
 Retirer délicatement le gel de la cuve et le placer dans un récipient ;
 Rincer le gel à l’eau distillée.
 Observation
 Déposer le gel dans la machine à UV relié à l’ordinateur ;
 Visualiser les bandes
3. Electrophorèse du gène humain PFMDR-1
Le gène PFMR-1 (plasmodium falciparum multi drame resistant-1) est un gène pathogène
qui fait intervenir une mutation au sein du chromosome 5 au cours de laquelle l’asparagine
est substitué par la tyrosine au niveau de la protéine et lui rend résistant aux médicaments
antipaludiques (chloroquine, mefloquine).
a. But :
L’électrophorèse a pour but de séparer les molécules chargées notamment les protéines,
les acides aminés et nucléiques selon leurs poids moléculaires.
b. Principe
Consiste à séparer les différents fragments d’ADN en fonction de leurs tailles en les faisant
migrer à travers un gel d’agarose sous l’effet du courant électrique. L’électrophorèse se
déroule cinq(5) étapes à savoir :
 Préparation du gel d’agarose ;

 Dépôt de l’ADN dans les puits ;

 Migration ;
 Coloration ;
 Observation.

 Matériels
 Balance ;
 Becher et papier à lu.
 Cuve à électrophorèse ayant de fil de branchement au générateur ;
 Générateur ;
 Portoirs, niveau et cônes
 Produits
 Marqueur poids moléculaire ;

dissolution du gel

présence des peignes afin de le solidifier et enlever les peignes ;
moléculaire sur du papier parafilm et charger 10ul dans le premier puits du
gel ;

moléculaire sur du papier parafilm et charger 10ul dans le dernier puits du
gel.
 Migration
 Connecter la cuve à l’électrophorèse au générateur puis le Brancher à la prise
du courant ensuite mettre le générateur en marche, calibrer et laisser migrer
les amplicons pendant 1 heures ;
 Coloration
 Observation
 Déposons le gel dans la machine à UV relié à l’ordinateur ;
 Visualisons les bandes.
4. Digestion enzymatique du gène NCR-3
Le gène NCR -3 (récepteur naturel de la cytotoxicité)) situé au niveau des cellules NK (naral
killer) intervient dans le mécanisme l’immunité innée, ce gène code pour une protéine
NKP30 (A, B et C) .Les maladies associées à NCR-3 incluent le paludisme, l’insuffisance
vasculaire légère et chronique. Il fait intervenir une mutation au niveau du chromosome 6
en position 412 au cours de laquelle la cytosine (C) est substitué par la guanine(G)
.Généralement trois cas sont observés :
CC (sauvage)
CG (muté)
GG (double muté)
a. But :
Couper spécifiquement une molécule d’Adn en utilisant des enzymes de restriction afin de
la manipuler ou de la cloner.
b. Principe :

Ce principe repose sur la capacité de certains enzymes de restriction (enzyme qui coupent
l’ADN au niveau de sites de reconnaissances spécifiques) de digérer ou non l’ADN au niveau
du site de restriction. La digestion enzymatique se déroule en deux étapes notamment :
Hydrolyse de l’ADN par les enzymes de restriction ;

Séparation des fragments de restriction par électrophorèse avec le gel
d’agarose.
 Hydrolyse d’ADN par les enzymes de restriction :
 Matériels
 Incubateur à 37°C ;
 Micropipette ;
 Pissette ;
 Vortex.
 Produits
 PCR buffer tango (10x) ;
 Une enzyme (PF01) ;
 H20 stérile et mix (1x).
 Mode opératoire
 Nettoyons la paillasse avec la pissette ;
 Préparons le mélange réactionnel pour un volume final de 21ul renfermant
produits x 1(ul) x 8(ul)
H20 stérile 18 144
PCR buffer tango 2 16
PF 01 1 8

 Distribuer 21ul du mélange réactionnel dans chaque tube, ajouter 10ul des
amplicons PCR et incuber pendant 16 heures à 37°C.
 Séparation des fragments de restriction par électrophorèse (avec le gel d’agarose)
Matériels et produits utilisés :
 Matériels

 Balance ;
 Portoirs, niveau et cônes.
 Produits
 Marqueur poids moléculaire

dissolution du gel.

gel ;
moléculaire sur du papier parafilm et charger 10ul dans le dernier puits du
gel.

 Migration
 Connecter la cuve à l’électrophorèse au générateur puis le brancher à la prise
du courant, ensuite mettre le générateur en marche, calibrer et laisser
migrer les amplicons pendant 1 heures
 Coloration

 Observation
 Visualiser les bandes.
5. PCR nichée du gène MSP-1
Le gène MSP- 1 (protéine de surface Merozoide - 1) est localisé sur le chromosome 9 du

plasmodium falciparum. Il est composé de 17 blocs, le bloc 2 est le plus variable et est
constitué de trois famille allélique notamment MAD20, K1 et RO 33. Le génome du parasite
est haploïde, l’amplification de ce gène permet de détecter la présence du plasmodium
falciparum.
a. But :
Quantifier ou de détecter la présence des familles alléliques d’un gène spécifiques.
b. Principe :
La PCR nichée consiste à réaliser les PCR successives destinées à amplifier une séquence
spécifique d’ADN. La PCR nichée se déroule en six(6) étapes à savoir :
 Deux dénaturations : Rupture des liaisons d’hydrogènes conduisant à la

séparation des brins d’ADN en simplex d’ADN ;
 Deux hybridations : Fixation des couples d’amorces à l’extrémité 3’ de chaque
brin d’ADN ;
 Deux élongations : Taq polymérase permet la synthèse des brins
complémentaires d’ADN à partir de chaque amorce.

c. Matériels et produits utilisées :
 Matériels
 Deux hottes ;
 Micropipettes ;
 Embouts ;
 Tube à Eppendorf et PCR ;
 Pissette ;
 Thermocycleur;
 Vortex et crayon marqueurs.
 Produits
 Taq polymérase;
 4 dNTPs (desoxyribonucleotides- triphosphates);
 H20 stérile;
 Deux amorces (sens et anti sens);
 Mgcl2.
 PCR classique (premier PCR)
 Protocole
 Préparer le mélange réactionnel pour un volume final de 23ul contenant
Produits x 1(ul) x 6(ul)

H20 stérile 11,85 71,1
PCR buffer (10x) 2,5 15
DNTPs (1 mmol) 2,5 15
Amorce sens (lysat1 5 pmol) 2,5 15
Amorce anti sens (lysat 2 5pmol) 2,5 15
Mgcl2 1 6
 Vortexer le mélange réactionnel;

 Distribuer 23ul du mélange réactionnel dans chaque tubes (6) PCR, ajouter
2ul d’ADN extrait dans ces tubes (4) , un tube pour un contrôle positif (
auquel on ajoute 2ul d’ADN dont le profil est déjà connu) et un tube pour un
contrôle négatif ( on ajoute 2ul d’eau stérile à la place d’ADN) ;
 Placer les tubes dans le thermocycleur à 30 cycles préalablement
programmé et lancer l’amplification pendant 1h 30 minutes.
 PCR nichée (seconde PCR)
 Protocole
 Préparer le mélange réactionnel pour un volume final de 23ul contenant
Produits x 1(ul) x 6(ul)

H20 stérile 11,85 71,1
PCR buffer (10x) 2,5 15
DNTPs (1 mmol) 2,5 15
Amorce sens (MAD 1, RO1 et K1) 2,5 15
Amorce anti sens (MAD2, RO2 et K2) 2,5 15
Mgcl2 1 6

 Distribuer 23ul du mélange réactionnel dans chaque tubes (6) PCR, ajouter
2ul du produit de la PCR classique dans ces tubes (4) , un tube pour un
contrôle positif ( auquel on ajoute 2ul d’ADN dont le profil est déjà connu) et
un tube pour un contrôle négatif ( on ajoute 2ul d’eau stérile à la place
d’ADN) ;
programmé et lancer l’amplification pendant 1h 30 minutes.
 Préparation du TBE 1x
 Matériels :
 Baro-aimanté ;
 Agitateur (à 14000trs) ;
 Erlenmeyer et bêcher.
 Produits :
 TBE 10x ;
 H20 distillé.
 Mode opératoire :
 Prélever 100 ml du TBE 10x et 900 ml d’eau distillé ;
 Mélanger le tout
 Ajouter le Baro- aimanté dans le mélange ;

 Mettre sur un agitateur (1400trs / min).
 Electrophorèse du gène MSP-1
 Matériels :
 Balance ;
 Portoirs, niveau et cônes.
 Produits :
 TBE 1x (Tris / Borate / EDTA) ;
 Gel d’agarose dissocié ;
 Marqueur poids moléculaire ;
 TBE 1X.

 Prélever 100ul de TBE1x ;
 Ajouter 2g d’agarose ;
 Mettre dans le four à microonde puis calibrer le four à 3 jusqu'à la dissolution
du gel.
 Dépôt de l’ADN dans les puits

gel ;

moléculaire sur du papier parafilm et charger 10ul dans le dernier puits du gel
;
 Migration
 Connecter la cuve à l’électrophorèse au générateur puis le brancher à la prise
du courant, ensuite mettre le générateur en marche puis calibrer et laissé
migrer les amplicons pendant 1 heures ;
 Coloration
 Observation
 Visualiser les bandes.
6. RT- PCR d’un norovirus
Ce norovirus est constitué de trois régions ORF1, ORF2 et ORF3 et d’une molécule d’ARN
simple brin positif. La région ORF2 code pour la protéine de la capside majeure, ce virus est
responsable des troubles gastro-entériques chez les enfants.
a. But :
 Quantifier ou détecter la présence des ARNm (acide ribonucléique
messagers) au niveau d’un tissu ou cellule.
b. Principe :
La RT- PCR (reverse transcriptase) consiste à amplifier une séquence d’ARN. La RT-PCR se
déroule en deux étapes à savoir :
 La copie d'ARN messager en ADN complémentaire (ADNc) ;

 La réaction PCR classique sur l’ADNc (ADN complémentaire) synthétisé.
c. Matériels et produits utilisées :

 Matériels
 Deux hottes ;
 Micropipettes ;
 Embouts ;
 Tube à Eppendorf ;
 Pissette ;
 Thermocycleur ;
 Vortex et crayon marqueur ;
 Tube à PCR.
 Produits
 Taq polymérase ;
 4 dNTPs (desoxyribonucleotides- triphosphates) ;
 H20 stérile;
 Deux amorces (sens et anti sens).
 Mode opératoire
 Préparer le mélange réactionnel pour un volume final de 10.5ul contenant :
Réactifs x 1 (ul) x 10 (ul)
H20 stérile 6,18 61,8
RT / PCR buffer (10x) 2,5 25
DNTPs (10mM) 0,5 5
Amorce sens (NV1a+ NV1b 10 Um) 0,31 3,1
Amorce anti sens (NV7a +7b 10 Um) 0,31 3,1
RNase (40 u / ul) 0,2 2
Taq polymérase 0,5 5
 Distribuer 10,5ul du mélange réactionnel dans chaque tubes (10) PCR,
ajouter 2ul d’ARN extrait dans ces tubes (9) , un tube pour un contrôle positif
( auquel on ajoute 2ul d’ARN dont le profil est déjà connu) et un tube pour un
contrôle négatif ( on ajoute 2ul d’eau stérile à la place d’ADN) ;
programmé et lancer l’amplification pendant 1h 30secondes.
d. Commentaires

La RT- PCR (reverse transcriptase) est utilisée dans le diagnostic des maladies génétiques,
dans l’insertion de gènes eucaryotes dans procaryotes et dans l’étude des génomes de virus
dont les génomes sont composés d’ARN notamment les rétrovirus comme le VIH.
V. Conclusion et perspectives
Au regard de ce qui précède, il sied de noter que le stage de fin de cycle licence effectué au
sein de la Fondation Congolaise pour la Recherche Médicale (FCRM) constitue une véritable
expérience acquise dans le domaine de la recherche scientifique. De plus, ce stage m’a
rapporté beaucoup des connaissances concernant le monde du laboratoire de recherche, sa
structure, son fonctionnement et surtout ses activités réalisées.
De même, dans cette perspective il s’avère nécessaire qu’on réalise l’extraction d’ADN du
sang humain avec les méthodes utilisant les solvants organiques notamment le phénol
chloroforme et le chlorure de guanidium. Qu’on effectue d’autres types d’électrophorèse
comme l’électrophorèse bidimensionnelle et capillaire, qu’on réalise d’autres types de PCR
notamment la PCR en temps réel et qu’on envisage des moyens afin de réaliser le
séquençage.
En ce qui concerne le personnel, qu’il y ait un consultant en chimie pour constituer une
équipe pluridisciplinaire de recherche plus efficace.

VI. Annexes
Hotte Agitateur magnétique Machine à UV relié à

l’ordinateur
Four à microonde Balance Thermocycleur
Buffet de stockage des

Hotte
réactifs

VII. Références
 Kiwix
 https://www.futura Science.com
 Wikipédia
 https://www.google.cg/search

Som Maire

Transféré par

Droits d'auteur :

Formats disponibles

Som Maire

Transféré par

Informations du document

Copyright

Formats disponibles

Partager ce document

Partager ou intégrer le document

Options de partage

Avez-vous trouvé ce document utile ?

Ce contenu est-il inapproprié ?

Droits d'auteur :

Formats disponibles

Som Maire

Transféré par

Droits d'auteur :

Formats disponibles

FONDATION CONGOLAISE POUR LA RECHERCHE MEDICALE

Julphin Ornevalde BATANTOU

Rapport de stage Page 1

Avant tout développement sur cette expérience professionnelle, il apparait opportun de

Je souhaite tout d’abord remercier le Pr Francine NTOUMI directrice générale de la FCRM

J’aimerais également remercier tout le personnel de la faculté des sciences et technique de

Rapport de stage Page 2

Du 18 septembre au 30 septembre 2017, j’ai effectué un stage au sein de la Fondation

Rapport de stage Page 3

Le laboratoire de biologie moléculaire de la Fondation Congolaise pour la Recherche

Le laboratoire de biologie cellulaire et moléculaire de la Fondation Congolaise pour la

Rapport de stage Page 4

Dans cette salle on réalise l’amplification d’ADN/ ARN et comprend des :

Un buffet servant à stocker les réactifs.

Rapport de stage Page 5

Conseil Scientifique Direction Générale Conseil d’Ethique Institutionnel

Responsable Responsable Chef de Responsable Cabinet de

Assistant Agents Consultations Laboratoire

Figure 1:Organigramme de la FCRM

Rapport de stage Page 6

1. Extraction d’ADN du sang humain

Consiste à réaliser la purification de l’ADN

Consiste à isoler l’ADN d’une cellule ou d’un tissu.

c. Matériels et produits utilisés :

Rapport de stage Page 7

2. PCR classique du gène CYP2B6 et NCR-3

Quantifier l’expression d’un gène donné ou détecter la présence de ce dernier.

La réaction de polymérisation en chaine (PCR) consiste à amplifier une séquence spécifique

 Dénaturation : Rupture des liaisons d’hydrogènes conduisant à la séparation des

 Préparation des amorces de 10pmol (100UL) :

Rapport de stage Page 8

H20 stérile 13,1 406,1

PCR buffer (10x) 2,5 77,5

DNTPs (25x) 0,2 6,2

Amorce sens (CYP2B6 4F) 1 31

Amorce anti sens (CYP2B6 4R) 1 31

 Vortexer le mélange réactionnel

f. PCR classique du gène NCR-3

Matériels et Produits utilisés :

Rapport de stage Page 10

 Préparons le mélange réactionnel pour un volume final de 18ul contenant :

Réactifs x 1 (ul) x 9 (ul)

H20 stérile 13,6 122,4

PCR buffer (10x) 2 18

DNTPs (25x) 0,2 1,8

Amorce sens (CYP2B6 4F) 1 9

Amorce anti sens (CYP2B6 4R) 1 9

Taq polymérase 0,2 1,8

 Vortexer le mélange réactionnel ;

 préparation de la solution de migration :

Rapport de stage Page 11

 Préparation du gel d’agarose

 Dépôt de l’ADN dans les puits

Rapport de stage Page 12

3. Electrophorèse du gène humain PFMDR-1

 Préparation du gel d’agarose ;

Rapport de stage Page 13

c. Matériels et produits utilisés :

 Préparation du gel d’agarose

 Dépôt de l’ADN dans les puits