Département

Sciences et Techniques

Master spécialisé Procédés d’Analyse et

Contrôle Qualité : Module M9 :
Traitement des eaux et des effluents

Travaux Pratiques
1. Analyses physicochimiques d’une eau minérale
et contrôle de la qualité
2. Analyses microbiologiques de l’eau potable

Réalisé par : Pr. Hind Mouhanni

Année : 2020-2021

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OBJECTIF
Une Chimie et une microbiologie analytiques performantes de l’eau sont bien évidemment
nécessaires pour relever ces défis, en s’appuyant sur des méthodes de dosages fiables, précises,
sensibles. En effet, ces méthodes sont incontournables pour diagnostiquer et prédire l’évolution
de la qualité des eaux naturelles souterraines, superficielles douces ou marines, et aussi pour
contrôler les eaux distribuées à la consommation humaine.
Ce travail pratique concerne le contrôle de la qualité d’un échantillon d’eau de consommation
humaine. D’abord, Pour les analyses physico chimiques nous choisissons un échantillon d’eau
minérale ou eau de table pour déterminer les paramètres dont la conductivité électrique, le pH et
la minéralisation. Ensuite, pour les analyses microbiologiques, nous utilisons un échantillon d’eau
de robinet pour rechercher et dénombrer les germes totaux, les entérocoques intestinaux les
bactéries coliformes et les coliformes thermo tolérants (spécialement l’Escherichia coli) qui sont
de la famille des Enterobacteriaceae et parmi les indicateurs de la pollution fécale dans les eaux..

TP1 : ANALYSES PHYSICO CHIMIQUES D’UNE EAU MINERALE

I. MESURE DE LA CONDUCTIVITE ELECTRIQUE
I.1 DEFINITION ET PRINCIPE
La conductivité électrique d’eau (ɣ) est la conductance d’une colonne d’eau comprise entre deux
électrodes métalliuqes de 1 cm2 de surface et séparées l’une de l’autre de 1 cm. Elle est l’inverse
de la résistivité électrique (ρ).
ɣ = 1/ ρ = (1/R).(L/S)
ɣ : conductivité (en Ω-1.m-1 ou S. m-1)
ρ : résistivité (en Ω.m)
R : résistance (en Ω)
L : distance entre les deux électrodes (en m)
S : surface de cahque électrode ( en m2)
I.2 MODE OPERATOIRE
Prélever l’eau dans un flacon en polyéthylène bien rempli et bien bouché. Effectuer la mesure la
plus vite possible.
D’une façon générale, opérer avec de la verrerie rigoureusement propre et rincée, avant usage,
avec de l’eau permutée.

➢ Mesure directe
A l’aide d’un conductimètre, rincer plusieurs fois la cellule à conductivité, d’abord avec de l’eau
permutée puis en la plongeant dans un récipient contenant de l’eau à examiner ;
Faire l mesure dans un deuxième récipient en prenant soin que les électrodes de platine soient
complètement immergées ;

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Agiter le liquide (barreau magnétique) afin que la concentration ionique entre les électrodes soit
identique à celle du liquide ambiant. Cette agitation permet aussi d’éliminer les bulles d’air sur les
électrodes.
Opérer de référence à la température de référence de 20°C, la température ne devra en aucun cas
varier pendant la mesure.

II. MINERALISATION TOTALE

Il existe une relation entre la teneur en sels dissous d’une eau et sa conductivité. Toutefois, la
minéralisation déterminée par pesée de l’extrait sec n’est pas rigoureusement identique à celle
calculée à partir de la conductivité, étant donné les erreurs inhérentes à la détermination de
chacune de ces deux mesures.
En effet, l’évaporation peut entrainer des transformations de la structure de certains sels :
Hydrogénocarbonates dissociés et donnant des carbonates, cristallisations des sulfates avec un
certain nombre de molécules d’eau, si bien que le poids de l’extrait sec ne représente pas avec
exactitude celui des sels dissous. D’autre part la mesure de la conductivité électrique est
influencée par le pH de la solution, la valence des ions et le degré d’ionisation.

II.1 CALCUL DE LA MINERALISATION

La minéralisation globale d’une eau peut être calculée rapidement par l’une des formules par l’une
des formules suivantes :
Minéralisation (mg/l) : 688 000 x conductivité à 20°C (S/cm)
Somme des anions ou des cations (mEq/l) : 10 x conductivité à 20°C (S/cm)
La minéralisation globale déterminée au moyen de ces formules est inférieure à celle obtenue par
pesée de l’extrait sec. Elle ne s’en rapproche que pour les eaux de minéralisation moyenne, aynt
une conductivité comprise entre 333 et 833 µS/cm.
Le tableau suivant précédent permet d’améliorer la concordance des résultats, en utilisant des
formules qui tiennent compte de l’importance de la minéralisation.

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II.2 EXPRESSION DES RESULTATS
Les mesures de l’EC sont exprimées en unités S/cm , à la température de 20°C.

III. MESURE DU POTENTIEL HYDROGENE

III.1 Définition et principe
La différence de potentiel existant entre une électrode de verre et une électrode de référence,
plongeant dans une même solution, est fonction linéaire du pH de celle -ci. Selon l’expression de
NERST, le potentiel de l’électrode est lié à l’activité des ions H+ présents par la relation.
E = E0 +2,3 RT/nF log10 aH
E : Potentiel mesuré (en volt)
E0 : Potentiel standard dépendant du choix de l’électride de référence (en Volt)
R : Constante des gz (J.mol-1.K-1)
n : Nombre d’électrons mis en jeu dans l’équilibre ox/red
F : Constante de Fraday (96 500 °C°)
aH : Activité de l’ion H+ dans l’échantillon
le pH est relié à l’activité en protons par :
pH = - log10 aH
aH : activité en ions H+ à l’équilibre
Les valeurs du pH peuvent être calculées dans des cas simples. Si on confond activité et
concentration, la valeur approchée du pH d’une solution d’acide fort ou de base forte (dits
« totalement dissociés » est directement relié à la concentration de l’acide ou de la base :
pH = -log10 [acide fort] ou pH = 14 + log10[base forte]

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Pour un monoacide faible, dont l’équilibre acide/base, défini par une constante d’équilibre ou
constante d’acidité HB B + H+ avec : Ka = aH.aB/aHB, l’expression du pH est :
pH = pKa + log aB/aHB
en confondant activité et concentration et avec quelques approximations, la valeur du pH dans
ce cas peut être reliée à la concentration en acide faible :
pH = ½ pKa – ½ log10 [acide faible]
Pour une base faible, la même approche conduit à :
pH= 7 + 1/2pKa + log aB/aHB
En confondant activité et concentration et avec quelques approximations, la valeur du pH dans
ce cas peut être reliée à la concentartion en acide faible :
pH = ½ pKa – ½ log10 [acide faible]
pour une base faible, la même approche conduit à :
pH = 7 + ½ pKa + 1/2log10 [base faible]

III.2 MATERIEL
• Electrode en verre
• Electrode de référence au calomel – chlorure de potassium saturé
• Dispositif potentiométrique ampllificateur spécialement construit pour la mesure du pH
(pH-mètre)

III.3 MODE OPERATOIRE

La mesure du pH par la méthode potentiométrique avec électrode en verre est une méthode très
précise. L’eau à analyser se met en agitation pour être ensuite amener au contact de l’électrode
dans un bécher en verre ou autre récipient similaire.
La lecture du résultat se fait après stabilisation du pH.

IV.4 EXPRESSION DES RESULTATS

Les mesures sont exprimées en unités de pH, à la température de 20°C.

TP 2 : Analyse Microbiologique de l’eau potable

I. Introduction
L’objectif de l’analyse bactériologique d’une eau n’est pas d’effectuer un inventaire de toutes les
espèces présentes, mais de rechercher soit celles qui sont susceptibles d’être pathogènes soit, ce
qui est souvent plus aisé, celles qui les accompagnent et qui sont en plus grand nombre souvent
présentes dans l’intestin des mammifères et sont par leur présence indicatrices d’une
contamination fécale et donc des maladies associées à la contamination fécale.
L’analyse débute par l’acte de prélèvement qui doit mettre en œuvre des méthodes propres à
assurer l’absence de contamination de l’échantillon et la survie bactérienne (conditions de
conservation). Ensuite au laboratoire, plusieurs méthodes générales d’examen bactériologique
des eaux sont indiquées, il est impératif de faire un choix de la technique appliquée à la recherche
des bactéries indicatrices de pollution et d’efficacité de traitement (bactéries aérobies

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revivifiables, coliformes totaux, coliformes thermotolérants, enterocoques, anaérobies sulfito-
réducteurs).

II. Méthode de prélèvement

Si l’échantillon est prélevé à un robinet, au griffon d’une source, au bord d’une rivière, il n’est pas
nécessaire de disposer d’un appareil particulier : le flacon peut être tenu directement par la main
de l’opérateur. Il n’en n’est pas de même lorsque le prélèvement doit être fait dans un puits, au
centre d’un cours d’eau, dans un lac ou dans une piscine. On s’intéresse dans ce TP au prélèvement
au robinet.

➢ Au Robinet
- Enlever les brises -jets et tuyaux de caoutchouc adaptés au robinet, se débarrasser des
concrétions calcaires, qui ont pu s’y déposer ;
- Se laver très soigneusement les mains et avant – bras, les rincer à l’alcool, laisser sécher ;
- Flamber le robinet pendant au moins 1 minute, exemple : briquer ou lampe à souder
portative au gaz butane ;
- Ouvrir le robinet et laisser couler 3 à 5 minutes avant de faire le prélèvement. Durant
cette attente, et durant le prélèvement, il est utile qu’un assistant maintienne la lampe à
souder allumée, un peu au-dessus du robinet, l’opérateur, dans ses manipulations,
pourra l’utiliser comme un bec bunsen au laboratoire ;
- Une fois le prélèvement est fait, tenir le bouchon de la main gauche, le rodage en bas si
possible au près d la flamme durant tout le prélèvement ;
- Prendre le flacon de la main gauche, l’approcher des doigts libres de la main droite,
enlever avec ceux -ci le coton bouchant le goulot ;
- Flamber rapidement le bord de ce goulot, remplir presque entièrement le flacon, flamber
à nouveau rapidement le bord du goulot et mettre le bouchon ;
- Le prélèvement terminé, inscrire sur l’étiquette les indications nécessaires à
l’dentification du prélèvement. Replacer le flacon dans des sachets et mettez-les à
conservation.

III. Transport et conservation au laboratoire

- Selon les normes Marocaine en vigeur (Norme Marocaine 03.7.050, 1995. B.O.N°4362 du
21 Mars 1996. 20. Norme Marocaine 03.7.051, 1995. B.O.N°4362 du 21 Mars 1996), Le
prélèvement doit être effectué dans des conditions d’asepsie rigoureuse pour éviter
toute contamination accidentelle durant la manipulation, il est réalisé dans des flacons
stériles qui sont soigneusement étiquetés, conservés dans une glacière maintenue à
basse température (4°C) et transportés au laboratoire dans la même journée pour les
analyses.
IV. Analyse de la potabilité
IV.1 PROTOCOLE EXPÉRIMENTALE DE DÉNOMBREMENT DES GERMES TOTAUX.

▪ Préparer une série de 2 boites de Petrie ; 1 pour 22 °C et 1 pour 37 °C, dans les conditions
d’asepsie
▪ Introduire 1 mL de l’échantillon dans les boites de Petri stériles. (série de 2 boites)
▪ Couler 15 à 20 mL du milieu de culture fondu et refroidi à (45 ± 1) °C au moyen d’un bain-
marie. dans les boîtes de Pétri.
▪ Mélanger le milieu et l’échantillon avec précaution par rotation lente.
▪ Laisser le milieu se solidifier sur une surface froide.
▪ Après solidification, retourner les boites et incuber un jeu à (36 ± 2) °C pendant (44 ± 4) h.

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▪ Incuber l’autre jeu à (22 ± 2) °C pendant (68 ± 4) h
Lecteur, dénombrement
Pour chaque température d’incubation, compter les colonies présentes dans chaque boite et
calculer le nombre de colonies (ufc) présentes dans 1 mL d’échantillon.

IV.2 PROTOCOLE EXPERIMENTALE DE DENOMBREMENT DES ESCHERICHIA COLI.

Pour notre travail pratique, nous s’intéressons au dénombrement des Escherichia coli, qui sont
des bactéries coliformes, espèces bactériennes de la famille des Enterobacteriaceae et parmi les
indicateurs de la pollution fécale dans les eaux. les bactéries coliformes sont des bactéries lactose-
positives pouvant former des colonies en aérobiose à 36 ± 2 °C sur un milieu de culture lactose
sélectif et différentiel avec production d’acide dans les 21 ± 3 heures.
Pour procéder à l’analyse deux techniques sont possible, le dénombrement du nombre le plus
probable (NPP) (voir le cours) et la méthode par Filtration sur membrane. Le choix de la méthode
dépendra de la nature de l’échantillon mais aussi de la sensibilité et de la précision souhaitées.

IV.1 DENOMBREMENT PAR FILTARTION SUR MEMBRANE

II.1.1 PRINCIPE
La méthode de filtration sur membrane consiste à recueillir, identifier et dénombrer à la
surface d'une membrane filtrante stérile les bactéries recherchées dans un échantillon
d'eau.
Pour l’Escherichia coli, il s'agit de filtrer à travers la membrane d'une porosité de 0.45 μm
un volume déterminé de l'échantillon et d'incuber ensuite cette membrane à 44 ± 0.5°C
pendant 21 ± 3 heures à 48 ± 4 heures sur un milieu sélectif gélosé lactosé.
II.1.2 MATERIEL ET EQUIPEMENTS POUR FILTRATION SUR MEMBRANES
Plusieurs modèles d’appareil de filtration sont commercialisés. Ils comprennent tous les éléments
de base suivants, dont l’assemblage est schématisé dans la figue ci-dessous.

Coupe schématique d’un appareil de filtration sur membranes

A. Matériels

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 • Membranes filtrantes stériles quadrillées de porosité 0.45 μm et de 47 µm de
diamètre
• Entonnoirs de filtration stériles
• Boites de pétri stériles de 55 mm de diamètre
• Pissette autoclavable

B. Equipement
• Etuve de 36 ± 2 °C
• Etuve de 44 ± 0.5°C
• Rampe de filtration et système d’aspiration sous vide

C. Milieux de culture et réactif :

• Eau de dilution ;
• Gélose lactosée au tergitol 7 et au TTC - selon AFNOR ;
• Gélose caséine - soja : TSA ;
• Bouillon au tryptophane ;
• Réactif de kovac’s.

II.1.3 MODE OPERATOIRE

A. Test présomptif

➢ Filtration
• Faire sécher à l'étuve à 44 ± 0.5°C la surface du milieu tergitol 7 TTC, la boite
de pétri ouverte le milieu vers le bas ;
• Désinfection de la paillasse
• Préparer la rampe de filtration.
• Inscrire sur le dos de la boite de pétri le N° de l'échantillon, la date de
filtration et la température d’incubation si nécessaire ;
• Prendre une membrane stérile près du bord, à l'aide d'une pincette stérilisée
par flambage et la déposer ensuite sur le support de filtre ;
• Placer les entonnoirs sur la rampe de filtration ;
• Agiter vigoureusement l'échantillon puis verser 100 mL dans l'entonnoir ;
• Mettre en fonction la pompe à vide, faire le vide pour filtrer l'échantillon ;
• Rincer au moins deux fois la paroi intérieure de l'entonnoir avec une quantité
de 20 à 30 mL d'eau de dilution stérile
• Retirer l'entonnoir et déposer la membrane filtrante à l'aide d'une pincette
stérile dans une boite de pétri contenant de la gélose tergitol 7 TTC en veillant
à ce qu’aucune bulle ne s'interpose entre la membrane et le milieu de culture.

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N.B. : les bouts de la pince sont trempés dans un bêcher contenant de l’alcool puis flambés
avant chaque prise de la membrane filtrante.
➢ Incubation
Placer les boites de pétri en position renversée dans une étuve à 44 ± 0.5 °C, pendant 21
± 3 heures à 44 ± 4 heures.
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 ➢ Lecture
Après 21 ± 3 heures d’incubation, dénombrer les colonies présentes dans les boites. Si
présence de colonies suspectes, procéder à la confirmation. Si absence de colonies
suspectes après 21 ± 3 heures prolonger le temps d’incubation à 44 ± 4 heures puis faire
une deuxième lecture.
➢ Dénombrement
Au terme de la période d’incubation, Compter toutes les colonies :
• Les colonies caractéristiques (typique) de couleur jaune et présence d'un
halo jaune (examiner les halos dans la couche de gélose sous-jacentes à la
membrane) appelées colonies typiques ;
• Les colonies non caractéristiques (atypique) de différentes couleurs et
morphologies sont appelées colonies atypiques.
Procéder à la confirmation des colonies typiques et atypiques

Le nombre des colonies représente le résultat du test présomptif

B. Test confirmatif
Le test présomptif signifie que la bactérie isolée est reconnue comme la bactérie cible
recherchée à l'aide d'une seule réaction biochimique caractéristique (fermentation du
lactose). Dans certains cas, cette unique réaction laisse passer de faux positifs qu'il faut
clarifier à l'aide de test de confirmation.
➢ Isolement
Procéder à l’isolement par une anse de platine sur le milieu gélose caséine soja (TSA) d’un
maximum de 10 colonies typique (jaune avec halo jaune) :
• de 10 colonies si le nombre de colonies détectées sur la membrane est
supérieur ou égale à 10.
• de l’ensemble des colonies détectées sur la membrane si le nombre est
inférieur à 10.
• Incuber à 36 ± 2°C pendant 21 ± 3 heures.

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 C. Confirmation (production d’indole)
• Repiquer *les cultures isolées sur le TSA dans le bouillon au tryptophane 3
ml dans le tube (10 colonies en 10 tubes) ;
• Incuber à 44 ± 0.5°C pendant 21± 3 heures ;
• Ajouter 0.2 à 0.3mL de réactif de Kovac’s ;

• Observer si production d’indole par l’apparition d’un anneau de coloration

rouge à la surface du le bouillon au tryptophane.
Considérer toutes les colonies ayant une réaction positive à l’indole comme étant des E.
coli.

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 Réaction positif de kovacs , présence d’ E. coli.

Réaction négatif de kivacs, absence d’ E. coli.

*le repiquage correspond au prélèvement d’une petite partie d’une culture de bactéries ou de tissus pour
la transplanter sur un milieu neuf où elle continuera sa croissance.

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II.1.4 EXPRESSION DES RESULTATS

A partir du nombre de colonies caractéristiques dénombrées sur les membranes et en

tenant compte des résultats d’essais de confirmation effectués, calculer le nombre
d’E .coli, présente positive dans l’indole en UFC par 100 ml conformément à la norme ISO
8199, dans le cas ou les deux méthode essai standard et essai rapide sont utilisées en
parallèle , le résultat final d’E.coli doit être le plus élevé des deux.
Ex : Test présomptif a donné 30 colonies, j’isole 10 colonie en milieu TSA comme test
confirmatif le résultat, si les 10 sont positifs je repique dans la confirmation indole dans
10 tubes et donc 4 positif seulement donc : 10 colonies correspond à 4 positif donc 30
correspond à X …le résultat est 12 UFC /100 ml.
IV.3 PROTOCOLE EXPERIMENTALE DE DENOMBREMENT DES COLIFORMES

 Filtrer 100 mL de l’échantillon à analyser sur une membrane filtrante (0,45µm).

 Placer la membrane sur la boite de Pétri contenant la gélose lactosée au TTC et
veiller à ne pas emprisonner de bulles d’air dessous
 Incuber à (36 ± 2) °C pendant (21 ± 3) h
IV.3.1 Lecture et différenciation
Examiner les membranes et considérer comme typiques toutes les bactéries lactose-
positives, quelle que soit leur taille, si le milieu sous la membrane présente une coloration
jaune.
Repiquer un nombre représentatif de toutes les colonies typiques obtenues sur une gélose
caséine soja non sélective afin de réaliser le test à l’oxydas..
IV.3.2 Tests de confirmation
- Il est préférable de faire les tests de confirmation pour toutes les colonies typiques ou
au moins 10 colonies.
- Compter comme coliformes toutes les colonies typiques pour lesquelles la recherche
de l'oxydase est négative.
- Toutes les colonies ayant une réaction négative à l’oxydase, mais positive à l’indole,
seront considérées comme étant des Escherichia coli.
IV.4 PROTOCOLE EXPÉRIMENTALE DE DÉNOMBREMENT DES ENTÉROCOQUES
INTESTINAUX

• Entérocoques intestinaux : Bactéries capables de réduire le chlorures de 2,3,5-

triphényl-tétrazolium en formazan et d’hydrolyser l’esculine à 44 °C sur les milieux
Slanetz et Bartley et sur la gélose à la bile, à l’esculine et à l’azoture.
• Les entérocoques intestinaux : sont des bactéries en forme de cocci ou ovoïdes à
Gram positif, formant généralement des chaines, catalase-négatives.

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IV.4.1 Principe :
❖ Filtration, incubation et dénombrement
• Le dénombrement des entérocoques intestinaux est fondé sur la filtration d’un volume
spécifié d’un échantillon d’eau à travers une membrane filtrante ayant une grandeur
de pore de 0,45 µm suffisante pour retenir les bactéries.
• Le filtre est placé sur un milieu sélectif solide contenant de l’azoture de sodium (pour
supprimer la croissance des bactéries Gram-négatif) et du chlorure de 2,3,5-
triphényltétrazolium, un colorant incolore qui est réduit en formazan rouge par les
entérocoques intestinaux.
• Les colonies typiques sont bombées, avec une couleur rouge, marron ou rose, soit au
centre soit sur l’ensemble de la colonie.

IV.4.2 Filtration et incubation

▪ Filtrer 100 mL de l’échantillon à analyser sur une membrane filtrante (0,45µm).
▪ Placer la membrane sur le milieu de Slanez et Bartley (ne pas emprisonner de
bulles d’air dessous)
▪ Faire incuber les boites, couvercle entrouvert à (36 ± 2) °C pendant (44 ± 4) h.

IV.4.3 Lecteur et dénombrement :

Après incubation, considérer comme bactéries typiques toutes les colonies bombées
montrant une couleur rouge, marron ou rose, soit au centre soit sur l’ensemble de la
colonie.

IV.4.4. Confirmation
S’il y a des colonies typiques, transférer la membrane et les colonies, au moyen de pinces
stérile, sans retournement, sur une boite de gélose à la bile, à l’esculine et à l’azoture
BEA qui a été préchauffée à 44 °C.
Faire incuber à 44 °C ± 0,5 °C pendant 2 h.
Lire la boite sans délai.
Considérer toutes les colonies typiques montrant une couleur brune à noire dans le
milieu environnant comme donnant une réaction positive, et les compter comme EI.

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 COMPTE RENDU
TP N°1 : Analyse physico-chimique d’une eau minérale
1. Préciser l’objectif de l’analyse physico – chimique d’une eau minérale
2. D’après les résultats, commentez la qualité de cette eau
3. Comparer dans un tableau trois types d’eau minérale et donner un
commentaire comparatif de leur qualité.
4. Donner une synthèse d’une composition d’une eau potable le mieux
recommander de point de vue physico-chimique.
TP N°2 : Analyses microbiologiques des eaux potables
1. Préciser l’objectif de l’analyse microbiologique d’une potable
2. Calculer résultats des 7 échantillons d’une eau destinée à la potabilisation
après traitement :
N° echantillon Nbre colonnies dans une eau de robinet avant traitement (barrage)
Test présomptif Test confirmatif Resulats UFC/100 ML
indole
1 89 J 10 colonies (+)
2 37 J 10 colonies (-)
3 86 J 10 colonies (+)
4 46 J 10 colonies (+)
5 25J 7 colonies (+)
6 67 4 colonies (+)
7 33 0 colonies (+)

3. Interpréter les résultats des échantillons apportés sur le tableau ci-dessus (charge en
Coliforme (E.coli,…), indication sur la pollution fécale, le risque de la consommation d’une
eau non traitée)
4. Recopier le tableau avec les résultats pratiques du TP et Donner un scénario de l’origine
de chaque échantillon.( barrage, puits, source, ….) justifier votre réponse.

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