25/10/2022

Chromatographie en phase Liquide (CPL)

Chromatographie en phase
1- Généralités sur la CPL
Liquide (CPL)
Le terme « chromatographie liquide » englobe un lexique de
techniques de séparation avec une seule caractéristique
commune, celle d'une phase mobile liquide.

CLS HPLC CCM

CLL CI

Chromatographie en phase Liquide (CPL) Chromatographie en phase Liquide (CPL)

1- Généralités sur la CPL 1- Généralités sur la CPL

Par rapport aux gaz, les liquides offrent une plus grande variété Par conséquent, les séparations en CPL sont généralement
de capacités de solvatation avec plus de possibilités effectuées avec un nombre modeste de plateaux théoriques à une
d'optimisation de la sélectivité, tandis que les gaz ont des sélectivité optimisée obtenue par une sélection appropriée du
propriétés cinétiques plus favorables, ce qui donne des mode de séparation, de la structure de la phase stationnaire et
rendements plus élevés et des temps de séparation plus courts. de la composition de la phase mobile. Comprendre la relation
complexe entre les trois derniers termes est la clé pour
comprendre comment les séparations se produisent en
chromatographie liquide

2- Techniques
de la CPL
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Chromatographie en phase Liquide (CPL)

Chromatographie Liquide
3-Domaines d’applications
Haute Performance
(HPLC)
Identification Quantification

Purification

Chromatographie Liquide Haute Performance (HPLC) Chromatographie Liquide Haute Performance (HPLC)

1- Généralités sur la HPLC 1- Généralités sur la HPLC

Mise au point vers 1967 par Huker et Hulsman, la
La chromatographie liquide haute performance, souvent chromatographie liquide à haute pression a rapidement fait une
désignée par son abréviation CLHP – HPLC en anglais –, concurrence presque déloyale à la CPG. En effet, alors que la
constitue une technique analytique très générale d’emploi. Elle CPG ne s’applique qu’aux composés volatils, la chromatographie
dérive de la forme la plus ancienne de la chromatographie liquide à haute pression n’est pas limitée par cette contrainte et
liquide sur colonne dont les performances, en termes de peut séparer pratiquement tous les mélanges, peu importe la
sélectivité et de résolution, se sont trouvées grandement volatilité des composés. Si la chromatographie en phase gazeuse
améliorées par l’utilisation de phases stationnaires très élaborées. existe encore aujourd’hui, c’est à cause de son seuil de détection
extrêmement bas que la HPLC n’arrive pas à rattraper.

Chromatographie Liquide Haute Performance (HPLC) Chromatographie Liquide Haute Performance (HPLC)

3- Appareillage 3- Appareillage

L'instrumentation HPLC de base se compose de:

 une ou plusieurs pompes
 un injecteur (injection manuelle ou
automatique)
 une ou plusieurs colonnes
 un détecteur Schéma simplifié d’un chromatographe HPLC
 un dispositif de traitement des données
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Chromatographie Liquide Haute Performance (HPLC) Chromatographie Liquide Haute Performance (HPLC)
3- Appareillage 3- Appareillage
Phase mobile Pompe

La phase mobile est un solvant ou un mélange de solvants qui doit Le rôle de la pompe en
être de pureté analytique et filtré pour éliminer les particules solides HPLC est de pousser l’éluant
qui risqueraient d’endommager la pompe ou de bloquer la colonne. à travers la colonne à une
Le filtre, en acier inoxydable d’une porosité de 2 μm, est placé à pression élevée et à un débit
l’extrémité dans le réservoir à solvant. constant. Elle doit être inerte
à la corrosion des solvants
utilisés, offrir un bon choix
de débits et être conçue pour
réduire les pulsations au
minimum.

Chromatographie Liquide Haute Performance (HPLC) Chromatographie Liquide Haute Performance (HPLC)
3- Appareillage 3- Appareillage
Injecteur Injecteur

Comme la pression dans le circuit pompe-colonne est très élevée, on

utilise un moyen indirect pour introduire l’échantillon à l’entrée de la
colonne. Celui-ci est d’abord introduit à l’aide d’une seringue dans un
injecteur à boucle externe, en position LOAD. On injecte toujours un
volume supérieur à celui de la boucle, en prenant soin de ne pas
introduire de bulles d’air dans la boucle. En tournant la valve en
position INJECT, seul le contenu de la boucle est dirigé en tête de
colonne. Cette méthode d’injection a l’avantage de donner des résultats
très reproductibles, d’une injection à l’autre.

Chromatographie Liquide Haute Performance (HPLC) Chromatographie Liquide Haute Performance (HPLC)
3- Appareillage 3- Appareillage
Colonnes HPLC Colonnes HPLC

Colonne analytique
Le type le plus courant de colonne HPLC est un tube en acier
⁂ Colonne analytique: qui est responsable de la séparation inoxydable d'un diamètre interne compris entre 2,1 mm et 4,6 mm et
d'une longueur comprise entre 30 et 300 mm. La colonne est remplie
de particules de silice poreuses de 3 à 10 nm de forme irrégulière ou
⁂ Colonne de garde: qui est placée avant la colonne analytique sphérique. Les rendements typiques des colonnes sont de 40 000 à 60
pour la protéger de la contamination. 000 plateaux théoriques/m.

Colonne garnie typique pour HPLC

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Chromatographie Liquide Haute Performance (HPLC) Chromatographie Liquide Haute Performance (HPLC)
3- Appareillage 3- Appareillage
Colonnes HPLC Phase stationnaires
En chromatographie liquide, la phase stationnaire est un film
Colonne analytique liquide enduit sur un matériau de garnissage, généralement des
particules de silice poreuses de 3 à 10 μm. Étant donné que la PS
Les colonnes capillaires utilisent moins de solvant et, comme l'échan- peut être partiellement soluble dans la PM, elle peut s'éluer ou
tillon est moins dilué, produisent des signaux plus importants au s'écouler de la colonne au fil du temps. Pour éviter la perte de la PS,
niveau du détecteur. Ces colonnes sont fabriquées à partir de qui raccourcit la durée de vie de la colonne, celle-ci est liée de
capillaires en silice fondue avec des diamètres internes de 44 à 200 μm manière covalente aux particules de silice. Les PS liées sont créées
et des longueurs de 50 à 250 mm. Des colonnes capillaires remplies de en faisant réagir les particules de silice avec un organochlorosilane
particules de 3 à 5 μm ont été préparées avec des efficacités de colonne de la forme générale Si(CH3)2RCl, où R est un groupe alkyle ou
allant jusqu'à 250 000 plateaux théoriques. alkyle substitué.

Chromatographie Liquide Haute Performance (HPLC) Exercice d’application

3- Appareillage
Détecteurs

 Détecteurs spectroscopiques
Spectre d'absorption UV/Vis
Spectromètre de masse

 Détecteurs électrochimiques
Ampérométrie, voltamétrie, coulométrie et la conductivité.

 Autres détecteurs
La mesure d'un changement de l'indice de réfraction de la
phase mobile • Calculer:
La surveillance de la conductivité thermique Facteur de sélectivité, facteur de résolution, nombre de plateaux
théoriques