Introdução à Microbiologia

Clínica
 Fases do Ciclo Diagnóstico:
• Fase Pré-analítica:
 Começa na coleta de material,
 Seja ela feita pelo paciente (urina, fezes e escarro)/seja feita no ambiente
laboratorial;
• Coleta
• Transporte

• Fase analítica:
 Corresponde à etapa de execução do teste propriamente
dita;

• Fase pós-analítica :
 Inicia-se no laboratório clínico e envolve os processos de validação e liberação
de laudos, encerrando-se após o médico receber o resultado final, interpretá-lo e
tomar sua decisão.
COLETA, TRANSPORTE E CONSERVAÇÃO DE AMOSTRA

 Todo resultado liberado pelo laboratório de microbiologia é consequência da

qualidade da amostra recebida;
 A coleta e o transporte inadequados podem ocasionar falhas no isolamento do
agente etiológico e favorecer o desenvolvimento da flora contaminante,
induzindo a um tratamento não apropriado;
 Portanto, procedimentos adequados de coleta devem ser adotados para evitar o
isolamento de um “falso” agente etiológico, resultando numa orientação
terapêutica inadequada;
 COLETA, TRANSPORTE E CONSERVAÇÃO DE AMOSTRA

 O profissional responsável pela coleta será também responsável por

identificar de forma legível e correta o material a ser encaminhado ao
laboratório de microbiologia.
Na amostra devem estar identificados:

 Nome e registro do paciente (se for o caso);

 Leito ou ambulatório e especialidade
 Material colhido
 Data, hora e quem realizou a coleta
 Considerações gerais da coleta microbiológica

 Colher antes da antibioticoterapia, sempre que possível;

 Instruir claramente o paciente sobre o procedimento;
 Observar a antissepsia na coleta de todos os materiais clínicos;
 Colher do local onde o microrganismo suspeito tenha maior probabilidade de ser
isolado;
 Considerar o estágio da doença na escolha do material:
ex. Patógenos entéricos causadores de diarreia, estão presentes em maior
quantidade e são mais facilmente isolados durante a fase aguda ou diarreica do
processo infeccioso intestinal.
Considerações de segurança

 Utilizar as barreiras de proteção necessárias a cada procedimento;

 Toda amostra deve ser tratada como potencialmente patogênica;
 Usar frascos e meios de transporte apropriados;
 Não contaminar a superfície externa do frasco de coleta e verificar se ele está
firmemente vedado:
 caso ocorram respingos ou contaminação na parte externa do frasco, fazer
descontaminação com álcool 70% ou outra solução descontaminante
disponível;
 Não contaminar a requisição médica que acompanha o material;
 As amostras deverão ser transportadas em sacos plásticos fechados;
 Identificar claramente a amostra coletada, com todos os dados necessários;
 Colocar a identificação no frasco de coleta e nunca na tampa ou sobre rótulos;
 Encaminhar os materiais imediatamente ao laboratório.
TRANSPORTE DAS AMOSTRAS

 Transportar as amostras IMEDIATAMENTE ao laboratório para:

 Assegurar a sobrevivência e isolamento do microrganismo, pois o laboratório

de microbiologia trabalha basicamente em função da viabilidade dos
microrganismos;

 Evitar o contato prolongado dos microorganismos com anestésicos utilizados

durante a coleta, pois eles poderão exercer atividade bactericida;

 Evitar erros de interpretação nas culturas quantitativas;

 Consultar o laboratório para verificar a disponibilidade dos meios

de transporte.
Principais erros de identificação

 Discrepância entre a identificação da amostra e o pedido médico;

 Falta de identificação da amostra;
 O
ƒ rigem da amostra ou tipo de amostra não identificada;
 Teste a ser realizado não especificado;
 Amostras Inadequadas;
 Material clínico recebido em solução de fixação (formalina);
 Material conservado inadequadamente com relação a temperatura (urinas
colhidas por mais de 24 horas, que ficaram guardadas em geladeira, ou
colhidas há mais de duas horas, sem refrigeração);
 Principais erros de identificação

 Frascos não estéreis;

 Presença de vazamentos, frascos quebrados ou sem tampa, com contaminação
na superfície externa;
 Mais de uma amostra de urina, fezes, escarro e ferida colhida no mesmo dia e
da mesma origem;
 Swab único com múltiplas requisições de testes microbiológicos;
 Swab seco;
 Amostras com as características acima descritas são inadequadas e demandam
um contato prévio com o médico solicitante para melhores esclarecimentos.
HEMOCULTURAS

 Lavar as mão e EPI;

 Remover os selos da tampa dos frascos de
hemocultura e fazer assepsia prévia nas tampas com álcool 70%;
 Garrotear o braço do paciente e selecionar uma veia adequada. Esta área não
deverá mais ser tocada com os dedos;
 Fazer a antissepsia com álcool 70% - de forma circular e de dentro para fora e
solução de iodo (1% a 2%);
 Coletar a quantidade de sangue e o número de amostras recomendados de
acordo com as orientações descritas ou se discriminadas no pedido médico;
 Remover o iodo do braço do paciente com álcool 70% para evitar reação
alérgica;
 Identificar cada frasco com todas as informações padronizadas e enviar ao
laboratório juntamente com a solicitação médica devidamente preenchida.
HEMOCULTURA  Amostra - 10% do volume do frasco de coleta;

 ANVISA – frascos que permitem a coleta de 10mL;

 anticoagulante recomendado é o SPS (Polianetolsulfonato

sódico) ;

 Número de frascos varia de acordo com a Patologia;

- 3 culturas (coletas #) bacteremia ou endocardite microbiana

 Crianças - Coletar amostras com 0,5 ml a 3 ml

- 2 culturas para diagnóstico de bacteremias em recém-
nascidos.
HEMOCULTURA
INSTRUÇÕES PARA PONTA DE CATETER INTRAVASCULAR

 Mesma assepsia para retirada;

 Manusear assepticamente;
 Cortar ~ 5 cm do cateter;
 Colocar em frasco estéril contendo meio de cultura.
 ESCARRO

 Não é considerado ideal para avaliação microbiológica do trato respiratório

hemocultura, lavado brônquico ou aspirado transtraqueal

podem fornecer resultados mais confiáveis (equipe médica).

 Coletar escarro – não saliva;

Tuberculose
Aspirado traqueal e secreção obtida por broncoscopia:
 Procedimento realizado por médico treinado. O material colhido deve ser
colocado em recipiente estéril.

Lavado Bronquio-Alveolar -
 Utilizado para obtenção etiológica das pneumonias associadas a ventilação
mecânica e em paciente imunodeprimidos, sendo considerado o método
mais fidedigno para investigação microbiológica do trato respiratório inferior.
 MUCOSA ORAL E OROFARINGE

 Coletar com “swab” estéril;

 Fazer esfregaços sobre as amígdalas e faringe posterior, evitando tocar na língua
e na mucosa bucal – a contaminação com saliva, que contém uma flora bacteriana
variada, pode dificultar o isolamento do verdadeiro agente infeccioso;
 Procurar o material nas áreas com hiperemia próximas aos pontos de supuração
ou remover o pus ou a placa, colhendo o material abaixo da mucosa – coletar da
área inflamada;
 Colher dois swabs.
 Mergulhar o “swab” umedecido em salina estéril e enviar o tubo ao laboratório;
Swab
 INSTRUÇÕES PARA FLUIDOS ORGÂNICOS ESTÉREIS
(Líquidos: Pleural, Ascítico, Biliar, de Articulações e outros)

 Promover a antissepsia com álcool 70%, iodo;

 Punção percutânea ou cirúrgica - Procedimento realizado por médicos;

 Direto no frasco de hemocultura ou em frasco estéril.

 LÍQUOR

 Procedimento realizado por equipe médica especializada.

 Fazer assepsia rigorosa no local da punção;

 Recomenda-se jejum;

 Caso a coleta permita somente a disponibilidade de um tubo, o laboratório de

microbiologia deverá ser o primeiro a manipulá-lo;

 Caso haja coleta de dois ou mais tubos, o Laboratório de Microbiologia deverá

ficar com o tubo que contiver menos sangue;

 Ao transportar a amostra,
nunca refrigerar – imediatamente para o
laboratório.
 INSTRUÇÕES PARA FERIDAS, ABSCESSOS E EXSUDATOS

 O termo “secreção de ferida” não é apropriado como informação da origem do

material coletado – definir o sítio anatômico;

 Descontaminação das margens e superfície da lesão - solução de povidine

iodine (PVPI) e soro fisiológico;

 Coletar o material purulento localizado na parte mais profunda da ferida -

aspirado com seringa e agulha – ou seringa de insulina;

 Swabs (menos recomendados) serão utilizados quando outros procedimentos

não forem possíveis.
INSTRUÇÕES PARA AMOSTRAS DE TECIDO SUBCUTÂNEO E AMOSTRAS DE
PELE

 Antissepsia com álcool 70% e iodo;

 Coletar amostra de punção de biópsia (3 mm a 4 mm) para cultura;

 Colocar num recipiente estéril contendo NaCl 0,85% estéril (solução fisiológica)
ou recipiente com meio de cultura líquido fornecido pelo laboratório;

 Não usar formalina.

Staphylococcus aureus - Osteomielite/pé diabético - Professor, Department of

Medicine, University of Washington.
INSTRUÇÕES PARA LESÕES SUPERFICIAIS - coleta para fungos -
micológico direto

 Limpar a superfície com água destilada ou soro fisiológico estéreis; não utilizar
iodo;
 Usando um bisturi, raspar as bordas da lesão;
 Amostra do couro cabeludo inclui cabelo, que é seletivamente coletado para
exame;
 Amostra de unha - obter raspado e/ou material abaixo da unha;
 Os materiais obtidos podem ser colocados em placa de Petri estéril e
identificados separadamente para cada sítio a ser investigado (por exemplo, unha
da mão direita, raspado do pé esquerdo, raspado da região plantar, etc.).
INSTRUÇÕES PARA SECREÇÃO DE OUVIDO

 Procedimento realizado por médico.

 Enviar ao laboratório no meio de transporte (Stuart).

 INSTRUÇÕES PARA SECREÇÃO OCULAR

 Antes da aplicação de antibióticos, soluções, colírios ou outros medicamentos;

 Desprezar a secreção purulenta superficial e, com swab colher o material da
parte interna da pálpebra inferior;
 Identificar corretamente a amostra e enviar imediatamente ao laboratório,
evitando a excessiva secagem do material.
 INSTRUÇÕES PARA MATERIAL GENITAL

Preparo da paciente:
Recomenda-se:
 Não estar menstruada;
 Evitar ducha e cremes vaginais na véspera da coleta;
 Três dias de abstinência sexual.

 Coleta realizada pelo médico – espéculo.

INSTRUÇÕES PARA MATERIAL GENITAL
INSTRUÇÕES PARA MATERIAL GENITAL
INSTRUÇÕES PARA MATERIAL GENITAL

Secreção Uretral

 N. gonorrhoeae - muito sensível e pode morrer rapidamente se não for

semeada imediatamente após a coleta;
 Desprezar as primeiras gotas da secreção;
 Coletar a secreção purulenta, de preferência pela manhã, antes da primeira
micção ou há pelo menos duas horas ou mais, sem ter urinado;
 Coletar com alça bacteriológica descartável ou swab estéril fino;
 Colocar a amostra em meio de transporte e realizar as lâminas para
bacterioscopia da secreção fresca;
 Encaminhar imediatamente para o laboratório.
INSTRUÇÕES PARA MATERIAL GENITAL
 INSTRUÇÕES PARA SECREÇÃO ANAL

 Inserir o swab cerca de 1 cm do canal anal e fazer movimentos de lado a lado

para coletar material;

 Colocar a amostra em meio de transporte e enviar o swab imediatamente ao

laboratório.
 INSTRUÇÕES PARA URINA

 Fazer limpeza prévia da região perineal com água e sabão, desprezar o

primeiro jato de urina da manhã, e colher 3 a 5 ml de urina em tubo de ensaio
estéril;
 Em crianças - lactentes – usar o saco coletor (trocar de 30 e 30 minutos);
 INSTRUÇÕES PARA FEZES

• Fazer lavagem prévia da região anal com água e sabão, coletar porções de
fezes em recipiente estéril com tampa ou “swab” anal, mergulhar o “swab” em
salina estéril e enviar o tubo ao laboratório.
QUAL O TEMPO MÁXIMO PERMITIDO ENTRE A COLETA E O
PROCESSAMENTO INICIAL DE MATERIAIS COLETADOS PARA EXAMES
MICROBIOLÓGICOS?

 A definição do tempo máximo permitido entre a coleta e o

processamento de um determinado material clínico é um fator
importante para um resultado confiável do exame;

 A temperatura de transporte é outro fator importante;

 Amostras de secreções do trato respiratório inferior, entre outras,

são consideradas de urgência e devem ser processadas o mais
rápido possível.
Transporte

 Swab para Coleta e Transporte de Amostras com Meio AMIES com

Carvão Estéril

 coletas em orofaringe,
secreções, pele e feridas.

 Swab para Coleta e Transporte de Amostras com Meio STUART Estéril

 Coleta de amostras
da garganta,
secreções vaginais,
pele e feridas.
Fase Analítica

• Seleção de meios de cultura primários;

• Transferência e cultura das amostras clinicas;

• Interpretação das culturas e análise dos resultados.

MEIO DE CULTURA

 Conjunto de substâncias, formuladas de maneira adequada, capazes de

promover o crescimento bacteriano, em condições laboratoriais;

 Para isso um meio de cultura necessita conter características básicas que

incluem:

Fonte de carbono e nitrogênio;

Fonte de energia - carboidratos;

Sais minerais;

Fatores de crescimento;

Indicadores de pH;

Inibidores;

Condições Físicas;

Esterilização.
MEIO DE CULTURA
Estado físico

 Líquidos – Também chamados de caldos;

Crescimento indiscriminado com turvação do meio;
 Sólidos - Produzidos com o acréscimo de ágar ao meio líquido;
Crescimentos de colônias isoladas, muito utilizado para culturas puras;
 Semi-sólidos – Adição de menor quantidade de ágar,
Mobilidade bacteriana – série de provas bioquímicas.
MEIO DE CULTURA
 Classificação dos meio de cultura

1. Meio de Enriquecimento:

 Geralmente líquido, de composição química rica em nutrientes, com a

finalidade de permitir que as bactérias contidas em uma amostra clínica
aumentem em número.

Ex.: Caldo Brain Heart Infusion (BHI) e Caldo Tetrationato.

Classificação dos meio de cultura

1. Meio de Enriquecimento:

Caldo Tetrationato

Peptona de caseína: 2,5 g/L; (FN)

Peptona de carne: 2,5 g/L; Sais biliares: 1 g/L;
Carbonato de cálcio: 10 g/L;
Tiossulfato de sódio: 30 g/L;
Água purificada: 1000mL
2. Meio de Transporte:

 Consiste em um meio pouco nutriente;

 Geralmente mantém o pH favorável, previne a desidratação de secreções
durante o transporte e evita a oxidação (agente redutor) e autodestruição
enzimática dos patógenos presentes.

Ex.: Meio de Stuart, Meio de Cary-Blair e Caldo Tioglicolato.

 3. Meio Seletivo

 A finalidade deste tipo de meio é selecionar as espécies que se deseja isolar

e impedir o desenvolvimento de outros microrganismos (adição de corantes,
antibióticos e outras substâncias com capacidade inibitória para alguns
microrganismos.
Ex.: Agar Manitol Salgado e Agar SS
Ágar SS - Tissulfato de sódio e o citrato férrico – H2S
 4. Meio Diferencial

 Possibilita a distinção entre vários gêneros e espécies de microrganismos, por

possuir substâncias que permitem uma diferenciação presuntiva, evidenciada na
mudança de coloração ou na morfologia das colônias.
 Enterobactérias e outros bacilos Gram negativos
Ex.: Agar Eosin Methilene Blue (EMB), Agar McConkey e Agar Hektoen

Cor verde: fermentação

da lactose e/ou sacarose

Inibe o crescimento
de G+
Agar McConkey
 Agar Hektoen

Seletivo: inibem o
crescimento das bact. G+
 5. Meio Indicador

 É utilizado no estudo das propriedades bioquímicas das bactérias, auxiliando,

assim, sua identificação;
 O mais simples é aquele usado no estudo das reações de fermentação;

Ex.: Agar Triple Sugar Iron (TSI) e Agar Citrato de Simmons

Agar Citrato de Simmons

 Indicador de pH – azul de bromotimol - A mudança da cor verde para azul -

indica que o microrganismo utiliza o citrato como fonte de carbono.
 SELEÇÃO DOS MEIOS DE CULTURA

 A escolha dos meios de cultura, para o processamento inicial das amostras é

muito importante e está condicionada à flora patogênica desse local;
 Em geral é usado mais de um tipo de meio, no sentido de fornecer condições de
crescimento a todos os patógenos possíveis de estarem presentes;
 Para cada caso em particular, existem os meios utilizados rotineiramente na
semeadura primária;
 SELEÇÃO DOS MEIOS DE CULTURA

 Atualmente, o procedimento mais utilizado é a aquisição de meios pré-

fabricados e fornecidos de forma desidratada, onde é necessário
apenas a pesagem criteriosa da quantidade necessária ao volume
desejado, seguido de dissolução e esterilização...
Meio de cultura não seletivos

• Crescimento:

• Ágar chocolate
• Ágar sangue
• Ágar Cled
• Ágar Mueller Hinton
Meios não seletivos
• Ágar chocolate
• meio nutritivo para a maioria bactérias
• Adicionado sangue de cavalo, carneiro ou coelho em temperatura alta, o que faz
com que as hemácias lisem, liberando hematina.
• Crescimento de microrganismos exigentes Haemophilus spp., Neisseria spp.,
Moraxella spp. , etc.

• Ágar sangue:
• meio não seletivo, crescimento de bactérias gram – e +

• Cled- Ágar cystine lactose eletrolyte deficient:

• meio que permite o crescimento de gram+ e gram- .

• Ágar Mueller-Hinton:
• Meio de cultura microbiológico (Neisseria spp.) e freqüentemente usado para testes
de susceptibilidade antimicrobiana.
Meio de cultura seletivos

• Ágar Manitol
• Ágar Mac Conkey, EMB
• Ágar Salmomella Shigella
• Ágar Sabouraud
• Ágar Bili-Esculina
• Ágar Dnase
• Ágar TSI
• Ágar Lowestein Jensen
Meios de cultura seletivos

• Ágar Manitol – isolamento de Staphylococcus aureus

• Ágar Mac Conkey, EMB
• Crescimento de bactérias Gram negativas e indicar a fermentação de lactose
• Ágar Salmomella Shigella
• Ágar Sabouraud - Identificação de fungos patogênicos e leveduras.
• Ágar Bili-Esculina - Isolamento e identificação de estreptococos.
• Ágar Dnase - Recomendado para a detecção da atividade
desoxiribonuclease de bactérias e fungos. Staphylococcus aureus.
• Ágar TSI - Diferenciação de patógenos entéricos (E. coli) pela capacidade
de determinar a fermentação do carboidrato.
• Ágar Lowestein Jensen - Mycobacterium tuberculosis
Caldos

• Caldo tetrationato
• Caldo selenito
• Caldo nitrato
• Caldo malonato
• Caldo triptona e SIM
• Caldo BHI
Caldos

• Caldo tetrationato
• Meio de enriquecimento para uso com Salmonella spp.-
• Caldo selenito.
• Diferenciar e identificar vários tipos de bactérias especialmente a família
Enterobacteriaceae. Inibem coliformes e outras espécies da flora intestinal como
estreptococos.
• Caldo malonato
• Usado para a diferenciação de bactérias gram-negativas com base na habilidade de
utilizar malonato e produzir ácido pirúvico.
• Caldo triptona e SIM.
• Diferenciar gêneros e espécies de enterobactérias, não fermentadores.
• Caldo BHI.
• Caldo infusão de cerebro e coração e um meio altamente nutritivo empregado para
a propagação de cocos.
 Meios de cultura para transporte e
conservação

 Ágar Nutriente
 Salina tamponada
 Cary Blair
 Meio Stuart
 Água peptonada
• Lag: período variável, onde ainda não há um aumento significativo da população.

• Log ou exponencial: nesta etapa, as células estão plenamente adaptadas, absorvendo

os nutrientes, sintetizando seus constituintes, crescendo e se duplicando. A taxa de
crescimento exponencial é variável, de acordo com o tempo de geração do organismo
em questão.

• Estacionária: Nesta fase, os nutrientes estão escasseando e os produtos tóxicos estão

tornando-se mais abundantes. Nesta etapa não há um crescimento líquido da
população, ou seja, o número de células que se divide é equivalente ao número de
células que morrem.

• Declínio: A maioria das células está em processo de morte

Cultura das amostras clínicas:

A cada novo espalhamento, que

deve ser feito girando a placa a
90 graus, a alça deverá ser
esterilizada para a diluição do
inóculo na superfície do meio

Padrão de estriamento para obtenção de UFC isoladas e puras

Padrão de estriamento para realização de contagem semiquantitativa das bactérias
Inoculação em meio líquido
Inoculação em tubo
Avaliação das colônias

• Tamanho: diâmetro em milímetros

• Forma
• Elevação
• Margem
• Cor: branca, amarela, preta, camurça, laranja...
• Superfície: brilhante, opaca...
• Densidade: opaca, translúcida, transparente
• Consistência: viscosa, membranosa...
Avaliação das colônias

• Odores:
• tênis sujo (citrobacter spp.),
• pútrido ( Clostridium difficile),
• pêlo molhado ( Haemophillus spp),
• chocolate queimado ( Proteus spp)

• Mudanças de cor no meio: indicadores de pH

Avaliação das colônias
Avaliação das colônias
Avaliação das colônias
Uso de corantes biológicos

• Coloração de Gram - bacterioscopia

• Coloração ácido resistente
• Coloração fluorescente (UV) – fluorocromos (ag/ac)
• Laranja de acridina
• Azul de Toluidina – biópsia de pulmão e secreções respiratórias