HPLC/UPLC – Problemas e Soluções

Objetivos: Identificar as principais causas de problemas em análises de cromatografia à líquido propondo possíveis soluções.
Problema Causa Possíveis soluções
Parâmetros de Equipamento
Conexão mal apertada Apertar conexões ou trocar se necessário
Vazamento
Selos/pistões com desgaste ou riscado Trocar selos/pistões - Abrir nota de manutenção
Limpar a coluna em fluxo invertido
Coluna obstruída Realizar a regeneração da coluna
Substituir a coluna
Verificar o sistema de filtros: fase móvel, pré-coluna, canais (FRIT) e o injetor

Pressão alta Precipitação do sal na FM: Soltar conexões de tubulações desde o detector até ponto de
queda de pressão a zero. Sonicar ou trocar tubulação/conexões
Entupimento e/ou obstruções
Limpar os canais com solução de isopropanol, ácido nítrico 10% ou ainda água quente, se
a concentração do tampão for elevada.
Verificar pressão com a coluna desconectada (deve ser inferior a 30 Kfg)
Aumentar a temperatura do forno (máximo +10ºC)
Verificar aperto entre as conexões da coluna e pré-coluna
Vazamentos
Verificar a check valve (se estiver travada, sonicar ou trocar) e selos dos pistões
Verificar se os canais estão completamente dentro da solução
Purgar em fluxo alto puxando 25% de cada canal e/ou 100% no canal com bolhas
Pressão baixa Ar no sistema (bolhas)
Purgar 100% em isopropanol (devido a sua viscosidade)
Verificar pressão do degaseificador e status do módulo
Verificar funcionamento da bomba (Está ligada?) ou realizar teste de fluxo.
Sem pressão
ex.:10mL/10minutos
Coluna Inverter/regenerar a coluna conforme procedimento ou substituir.
Sobrecarga de amostra injetada na coluna Verificar o volume de injeção: teste de injeção, através da pesagem de vial (10x de 20uL =
(overload) ?? mg).
Pico quebrado Verificar se a etiqueta da solução está e acordo com a metodologia
Verificar e corrigir o pH
FM ou TP
Verificar a presença de fungos
Estabelecer processo de validade de FM e tampão.
Carry over (efeito de tranferência) da amostra
Deixar um tempo de corrida maior para avaliar contaminantes
anterior
Pico fantasma
Diluente errado Injetar diluente como branco
Coluna ou injetor sujo Limpar ou trocar
Spikes Linha de base ruidosa Degaseificar FM (bolhas) e guardar coluna de forma correta evitar vícios (utilizar os tights)
Sem pressão Verificar fluxo e se não tem vazamento conforme item: Pressão baixa > Sem pressão
Verificar energia da lâmpada e energia da amostra (SPL ENERGY E REF ENERGY) Ambas
devem ser similares e acima de 400 em 220nm
Sem detector
Verificar se a linha de base é uma reta, se sim, a lâmpada está desliga ou queimada,
ligar/trocar lâmpada
Puxando o solvente errado Verificar os canais e as soluções
Se for pareador iônico deixar estabilizar por no mínimo 2 horas
Sem pico Falta de estabilidade no sistema
Outras soluções ajustar o tempo de acordo com a necessidade
Aumentar o tempo de corrida e verificar onde o pico está saindo Exigir nas novas
Tempo de corrida metodologias com tempo de retenção ou RRT quando temos PI e/ou demais picos com
degradantes
Preparar nova FM/Diluente; reinjetar padrões; reinjetar padrões concentrados; repreparar e
Ausência de fase móvel/diluente ou de amostra,
reinjetar amostra. (nesta ordem)
erro no preparo de amostra
Verificar se o vial é o correto
Parâmetros Cromatográficos
Inverter/regenerar a coluna conforme procedimento ou substituir
Diminuir o volume de injeção desde que esteja no parâmetro de alteração aceitável pelo
Assimetria Pico com cauda ou com ombro MBPC vigente
Substituir a coluna
Verificar o pH da fase móvel
Ineficiência da coluna (empacotada, com
Pratos Teóricos
caminhos preferenciais) Inverter/regenerar a coluna conforme procedimento ou substituir
Ineficiência da coluna
Resolução
Proporção de solventes apolares e polares
Verificar se a colocação e proporção dos canais está de acordo com a metodologia

Verificar pH do tampão ou fase móvel.

Solução tampão ou Fase móvel incorreto
Tampar o frasco para evitar troca de CO2 e nova alteração de pH.
(Mudança na composição)
Verificar na etiqueta a concentração de solvente e dos tampões, trocar qualquer solução
suspeita!
Tempo de retenção Diminuição do fluxo Verificar fluxo e se não tem vazamento conforme item: Pressão baixa > Sem pressão
incorreto ou alteração. Perda dos grupos funcionais Verificar se pH está dentro da especificação da coluna e realizar teste de performance
Atrofiamento dos grupos funcionais (diminuição
Limpar a coluna e reativá-la novamente
do TR)
Verificar a quantidade do solução nos respectivos frascos
Outras soluções (MeOH, MeCN, etc) Verificar se a etiqueta corresponde com o produto do frasco
Trocar a solução em caso de suspeita

Cromatografistas responsáveis: Aline Chan; Alana Maria Escher; Ana Carolina Rapacci; Andressa Padilha Pedrozo; Diego Cristiano Anderle; Diego Dinis Bou; Diogo Willian Santos De Oliveira; Edilaine Cisersa; Francyne
Ferrari; Ionara Paula Lupatini; Kleber Hideo De Franca; Marcelo Jose Ferri; Maristela Tessaro; Marizandra Zanatta; Marjana Cristina Mohr; Mayara Denize Ferst; Nadir De Fatima Dos Santos Kresko; Paulo Roberto De Oliveira;
Silvana Fernandes; Sinara Oliveira Dal Farra; Tania Da Costa Calaca; Vanessa Lidiane Simsen.

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
ARGENTON, A. Conceitos Fundamentais de Cromatografia a Líquido de Alto Desempenho (HPLC). Minicurso Conselho Regional de Química - IV Região (SP), São José do Rio Preto, 2010.
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COSTA, G. M. Sugerencias para el Uso de Equipos de CLAE. Escola de Verão em Farmacognosia, Universidade Federal de Santa Catarina, Florianópolis, 2010.
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SANTOS NETO, A. J. Uma Visão Técnica para a Compreensão e Resolução de Problemas em Sistemas de Cromatografia Líquida. Revista Scientia Chromatographica, v. 1, n. 2, p. 83 – 96, 2009.