Fernando José Martins de Oliveira Carvalho

REPRODUÇÃO DE CRUSTÁCEOS PENEÍDEOS

Endocrinologia e Ultrastrutura da Ovogénese

 Fernando José Martins de Oliveira Carvalho

REPRODUÇÃO DE CRUSTÁCEOS PENEÍDEOS

Endocrinologia e Ultrastrutura da Ovogénese

Dissertação de candidatura ao grau de Doutor em

Ciências Biomédicas apresentada ao Instituto de Ciências
Biomédicas de Abel Salazar da Universidade do Porto

Laboratório de Fisiologia

Dep. Imuno-Fisiologia e Farmacologia

ICBAS- UP
Porto, 1997
À minha família,
à Madalena e Isabel
Agradecimentos

Esta prova foi realizada, quase na totalidade, no ICBAS. Tendo iniciado os meus
estudos universitários no primeiro curso deste Instituto, e fazendo parte também dos
primeiros licenciados do curso de Ciências do Meio Aquático, não posso deixar de lembrar
dois nomes que para mim serão para sempre sinónimo de ICBAS: o Prof. Corino de
Andrade e o Prof. Nuno Grande. Por constituirem referências de humanismo e tenacidade
que moldaram esta Escola, o meu reconhecimento.

Desde o inicio da minha carreira académica no ICBAS em 1982, como monitor no

Laboratório de Fisiologia e até à conclusão das Provas de Aptidão Pedagógica e Actividade
Científica em 1989, trabalhei sob a responsabilidade do Prof. João Coimbra. Recordo com
saudade este período, ainda marcado pela instabilidade e indefinição que faziam apelo à
capacidade de improvisação de cada um. Ficou a lembrança de um tempo de "carolice", de
"desenrascanço" mas também de amizade, de trabalho de grupo, de entusiasmo e de
determinação na defesa dos valores em que acreditamos. Embora "os tempos sejam outros"
obrigado Prof. Coimbra pela amizade ao longo de todos estes anos.

Acabadas as referidas provas em 1989, e depois de uma breve mas muito positiva
experiência como membro do Conselho Directivo do ICBAS, assisto à divisão do
laboratório de Fisiologia em dois: de um lado a Fisiologia Aplicada e de outro a Fisiologia
Geral. A chefiar este último laboratório, o Prof. Luís Baldaia, recém chegado de Paris onde
realizou a sua tese de doutoramento, aceitou, a meu pedido, ser o responsável pela minha
tese de doutoramento, no âmbito de um projecto de investigação financiado pela JNICT,
que deu início em 1991. Agradeço-lhe ter assumido esse compromisso e ao longo destes
anos o seu apoio solidário e a sua crítica inteligente, e principalmente a sua sólida amizade.
Durante estes anos que tenho trabalhado no Laboratório de Fisiologia Geral, o apoio
profissional (quer na docência quer na investigação), o carinho constante e o espírito de

i
equipa demonstrados pelos técnicos Sr José Andrade e Ma do Natal tornaram possível e
agradável a realização deste trabalho. Como em todos os laboratórios, a pessoa responsável
pela limpeza dos materiais, merece uma palavra de reconhecimento: o meu obrigado D.
Dores. Ao elemento mais "novo" no nosso laboratório, o Prof. António Rocha, estou muito
grato pelas ajudas nas traduções que normalmente resultavam em discussões científicas
profundas que muito me ajudaram na "leitura" dos resultados experimentais.

Como referi, este trabalho foi realizado no âmbito de um projecto de investigação

(Reprodução de Crustáceos Peneídeos) sob a responsabilidade do Prof. Luís Baldaia. Este
projecto contou com a participação dos elementos do laboratório de Química, Prof.
Magalhães Cardoso e Enga Amélia Cortez. Sob a responsabilidade e orientação do Prof.
Magalhães Cardoso, partilhei com a Enga Amélia um longo percurso de desenvolvimento
de técnicas de extracção, purificação, separação e quantificação de hormonas esteróides
desde a montagem do aparelho de HPLC até à validação das técnicas por nós
desenvolvidas. O exemplo de profissionalismo, de método, de rigor sempre acompanhados
por um profundo e sentido humanismo, demonstrado ao longo destes anos pela Enga
Amélia Cortez, permitiu-me de facto a realização deste trabalho com o elevado bónus da
sua querida amizade. Para sempre obrigado, Amélia. A importância do apoio moral e a
amizade pessoal que faz suportar os momentos "menos bons", senti-a muitas vezes no
laboratório de Química: Luís, Júlia e Augusta obrigado pelas "descompressões".

Ainda como aluno finalista do curso de Ciências do Meio Aquático iniciei os

primeiros passos na investigação no laboratório de Biologia Celular, dirigido pelo Prof.
Carlos Azevedo. O valor da organização e rigor, ligado à elevada produção científica,
tornaram-se, para mim, exemplos sólidos essenciais à carreira académica. Reconheço,
agradecidamente, as facilidades e a atenção que desde esse tempo até hoje mereci do Prof.
Carlos Azevedo. Mais recentemente, agradeço-lhe a autorização para, sob a orientação do
Prof. Mário Sousa, executar no seu laboratório a parte desta tese relativa aos estudos

H
ultrastruturais. Ao Prof. Mário Sousa estou profundamente agradecido pela orientação,
participação, discussão e crítica com que sempre acompanhou o trabalho (sobre a
ultrastrutura da ovogénese) e a forma entusiástica com que encara o processo investigativo
em curso. As perspectivas de investigação abertas pelos resultados neste trabalho são o
reflexo desta dinâmica criada pelo trabalho em equipa com a já referida liderança: à Elsa
Oliveira e ao João Carvalheiro a minha gratidão pelo vosso trabalho, pela vossa dedicação e
interesse e acima de tudo pela vossa amizade. Agradeço também ao Prof. Alexandre Cunha
por me ter demonstrado sempre a sua disponibilidade para, na sua área de especialidade,
resolver qualquer dúvida.

No laboratório de Anatomia, para além da grande amizade que me une a todos sem
excepção, realço e agradeço a participação "mais activa" neste trabalho do meu amigo e
compadre Joaquim Duarte (pelas "linhas de força" na estética da capa) e ao José Aurélio
nas várias tentativas de melhorar fotograficamente as peças "menos fotogénicas". Neste
trabalho, de fotografia e artes gráficas, contei igualmente com a "mão profissional" do Dr.
Abel Roldão, Sr. Gonçalves, na Iconografia, do Sr. Anselmo Carraça e D. Teresa no
Desenho, e do Dr. Bento Sousa, Dr. Rui Claro e da Cristina Abreu na Informática.

Como referi no início desta secção, este trabalho foi realizado quase na totalidade no
ICBAS. No entanto, o acolhimento e apoio recebido no Instituto de Acuicultura Torre de la
Sal, superiormente dirigida pelo Doutor Francisco Amat (a quem estou agradecido),
permitiu-me conhecer e trabalhar com o investigador espanhol que há mais anos trabalha
com peneídeos: o Dr. José Maria San Feliú Lozano. Autor de várias dezenas de trabalhos
científicos (incluindo o livro "La Acuicultura Marine en la Comunidad Valenciana", 1987),
o Dr. San Feliú representa, para mim, um exemplo do biólogo romântico que descreve a
vida com paixão, do biólogo expedicionário, do biólogo humanista e do homem de fé, que
para além da crença tem compreendido o mundo. A grande admiração que tenho por este
cientista resultou numa profunda amizade aumentada a cada encontro.

m
 Através do Dr. San Feliú e do seu colaborador Dr. Manuel Rédon foi possível
estudar a espécie Penaeus kerathurus: nos últimos três anos, durante a época reprodutiva
dos camarões, permaneci cerca de duas semanas no Instituto de Acuicultura Torre de la Sal
onde, para além da aquisição de animais e o início da preparação das amostras, encontrei os
interlocutores adequados para frutuosas discussões sobre o tema que nos unia, a reprodução
de crustáceos. A participação pontual de vários elementos daquele Instituto no meu
trabalho, bem como a simpatia e amizade ali sentida, nunca será esquecida. Obrigado a
todos pela vossa amizade.

Os animais da espécie Penaeus japonicus utilizados neste trabalho foram fornecidos

pela empresa algarvia Eurodáqua, através da Dra. Isabel Arrobas, investigadora do
IPIMAR, e uma das maiores especialistas de camarões em Portugal. Pela sua
disponibilidade, pelos seus conselhos e, principalmente, pela sua simpatia e amizade, os
meus agradecimentos.

O sentido de gratidão que acompanha este momento é potenciado pela recordação

de uma vivência que transcende o trabalho restrito desta tese. Ela é também fruto de uma
experiência anterior, que no meu caso teve os mesmos intervenientes: fui aqui no ICBAS o
estudante universitário, o monitor recompensado, o assistente estagiário, o doutorando no
percurso da carreira académica. Coincidente com esta experiência pessoal, o próprio
percurso de uma Escola nova, com cursos novos e de características inéditas no panorama
do ensino universitário. Neste contexto, sinto dever mostrar a minha gratidão a todos
quantos comigo fizeram esta caminhada e com ela fomos alicerçando as amizades que são a
"alma" desta nossa Escola.

Uma palavra de especial apreço pelo carinho e amizade demonstrado pelos

Professores Arala Chaves e Arnaldo Videira, que em tertúlias informais muito me
estimularam na finalização deste trabalho.

IV
 A todos os meus amigos "não-biomédicos", pelos bons momentos que juntos
passamos, pelo apoio e carinho constante, e a todos aqueles cuja amizade ultrapassa
ausências, o meu agradecimento. Uma palavra especial para o meu amigo Gaspar, ilustre
artista gaiense, pelas tertúlias, pelas calorosas discussões, pelo apoio sempre presente e
pelos conselhos estruturais e estéticos na linguagem e na forma.

Finalizo com um agradecimento profundo às "bases": ao imutável pano de fundo

familiar (pais, irmãos e avó), pelo sentimento de protecção e apoio, e à minha filha
Madalena pela recompensa do amor mágico que faz de mim pai (e mais filho). À minha
companheira Isabel, as palavras para exprimir a gratidão que sinto esgotam-se num
turbilhão de sentimentos profundos que deixam na sua passagem uma admiração inabalável
e um amor crescente. Para sempre obrigado.

V
 INDICE

página

INTRODUÇÃO GERAL 5

MATERIAL BIOLÓGICO 51

PARTE I - MORFOLOGIA 59

CAPÍTULO 1 - Identificação das Fases de Desenvolvimento do Ovário das

Espécies de Penaeus iaponicus e P. kerathurus 61

Introdução 63
Material e Métodos 70
Resultados e Discussão 76

CAPÍTULO 2 - Ultrastrutura do Ovócito. Estudo dos Aspectos Ultrastruturais

da Ovogénese em Penaeus kerathurus 113

Introdução 115
Material e Métodos 120
Resultados 122
Discussão 129

PARTE II - ENDOCRINOLOGIA 179

CAPÍTULO 3 - Extracção e Purificação Simultânea de Ecdisteróides

e Esteróides Sexuais. Validação do Método 181

Introdução 183
Material e Métodos 184
Resultados 196
Discussão 209
CAPÍTULO 4 - Perfil de Ecdisteróides ao Longo das Fases de Desenvolvimento
do Ovário das Espécies Penaeus japonicus e P. kerathurus 213

Introdução 215
Material e Métodos 219
Resultados 225
Discussão 237

CAPÍTULO 5 - Hormonas Esteróides no Ovário de Penaeus japonicus.

Perfil de Progesterona ao Longo das Fases de Desenvolvimento
do Ovário das Espécies Penaeus japonicus e P. kerathurus 245

Introdução 247
Material e Métodos 248
Resultados 251
Discussão 258

PARTE III - DIETA VIVA DE MATURAÇÃO 261

CAPÍTULO 6 - Presença de Ecdisteróides e Esteróides Sexuais em Poliquetas

Utilizadas em Aquacultura para a Indução da Maturação
Ovárica de Fêmeas em Cativeiro 263

Introdução 265
Materiais e Métodos 266
Resultados 267
Discussão 270

DISCUSSÃO GERAL E PERSPECTIVAS FUTURAS 275

RESUMO 281

RESUME 285

ABSTRACT 289
BIBLIOGRAFIA 293
Introdução Geral
 Introdução

Importância Económica dos Crustáceos em Aquacultura

Em 1984 o volume dos productos extraídos do meio aquático foi de cerca de 83

milhões de Ton., dos quais 3/4 correspondem a peixes (Laubier, 1987). Dez anos
depois, este valor aumentou para 110 milhões de Ton., sendo 77 milhões de Ton.
destinados directamente ao consumo humano. Este valor, que triplicou nos últimos 35
anos (em 1960 foi de 26 milhões de Ton.), conta actualmente com 25% proveniente da
aquacultura. Esta actividade é também responsável pelo aumento de 2 milhões de Ton.
verificado entre 1993 e 1994 (FAO, Fisheries Department, 1997).

Projecções para a produção pesqueira mundial efectuadas pela FAO, para o ano
2010 apontam para uma produção total de de 107 a 144 milhões de Ton., das quais 30 a
33 milhões de Ton. se destinam a farinhas e óleos, ficando para consumo humano entre
74 a 114 milhões de Ton., dos quais 27 a 39 milhões de Ton. serão provenientes da
aquacultura.

Entre os invertebrados, os crustáceos e os moluscos constituem os dois

principais recursos. A maior parte dos crustáceos explorados pertencem à sub-classe
Malacostraca, com duas excepções principais, de produção negligível- Brachiopoda
(Artemia) e Cirripídea (o percebe, Pollicipes cornucopia) (figurai).

Das três ordens de Malacostraca exploradas - Estomatopoda, Eufausiácea e

Decápoda, esta última contribui, só por si, com mais de 90% das capturas mundiais de
crustáceos. Os camarões, representando cerca de 65% das capturas totais de décapodes,
englobam dois grupos muito distantes, filogenética e sistematicamente: Caridea e
Penaeidea (figura 2) (Laubier, 1987; Laubier e Laubier, 1993).

Os valores de captura de crustáceos mostram ter sido alcançado o seu nível

óptimo de exploração (e algumas mesmo em sobre-exploração) o que juntamente com
o aumento da sua procura por parte de países industrializados e de alto nível da vida
(U.S.A. e Japão) explica a importância actual da produção em aquacultura destas
espécies (Laubier, 1987; Lee e Wickins, 1992).

7
Introdução

PHYLUM CLASSE SUBCLASSE ORDEM

Arthropoda Crustacea Malacostraca — Decapoda

Chelicerata Cefalocarida Bathynellacea
Uniramia Branchiopoda Anaspidacea
Pentastomida Ostracoda Stomatopoda
Mystacocarida Thermosbaenacea
Copepoda Spelaeogriphacea
Branchiura Mysidacea
Cirripedia Cumacea
Tanaidacea
Isopoda
Amphipoda
Euphausiacea
Amphionidacea
Nebaliaceae

Figura 1. Divisão sistemática da classe Crustacea, segundo Parker (1992).

Ordem Sub-ordem Secção Família Género Nome vulgar

Penaeidea. Penaeidae Penaeus camarão
Natantia Metapenaeus
Caridea Palaemonidae — Macrobrachium lagostins
Pandalidae Pandalus

Decapoda Astacidae Astacus lagostins

Cambaridae — Cherax
Macrura Parastacidae Pacifastascus
Procambarus
Reptantia - Nephropidae — Homarus lavagante
Palinuridae — Panulirus lagosta da rocha

Braquiura - Portunidae Portunus caranguejo

Figura 2. Classificação dos crustáceos utilizados em aquacultura. (Adaptado de Adiyodi e Adiyodi,

1970; Parker, 1982; Lee e Wickins, 1992).

8
 Introdução

A cultura de crustáceos aumentou cerca de 7 vezes entre 1975 e 1983 (Lumare,

1986). A aquacultura de peneídeos atingiu em 1983 entre 75 a 120 mil toneladas,
repartidas essencialmente pela Ásia e América do Sul e com uma pequena contribuição
da América Central. Uma previsão realizada em 1987 no Equador, um país com
elevada potencialidade neste domínio, apontava para o ano de 1990 uma produção
mundial de 150 a 300 mil toneladas de peneídeos (Laubier, 1987). De facto, em 1990,
mais de 20% do consumo mundial de crustáceos (2,8 milhões de Ton.), ou seja cerca
de 600 mil Ton., foi proveniente da produção em aquacultura (Lee e Wickins, 1992),
sendo a maioria camarões marinhos e de águas salobras na região do sudoeste asiático e
Equador (tabela 1). Em 1991, a produção em aquacultura de crustáceos foi de cerca de
700 mil Ton., das quais mais de 600 mil foram de camarões peneídeos (Laubier e
Laubier, 1993). Em 1995, a produção em aquacultura atingiu 27% do mercado de
consumo, produzindo mais de 700 mil toneladas cultivadas numa área de cerca de 1,14
milhões de hectares, o que representa uma produtividade média de 625Kg/ha/ano
(World Shrimp Farming, 1995). O estado actual da produção mundial de crustáceos e
as perspectivas para o futuro desta actividade estão detalhadamente expostas numa
revisão de Laubier e Laubier (1993).

Tabela 1. Estimativas de produção de crustáceos (Ton. x 1000) de pesca e de aquacultura. (Adaptado

de Lee e Wickins, 1992).

Pesca Aquacultura
Grupo/Espécie
(1988) (1988-90)
Camarões marinhos 2500 663
(ex. Penaeus japonicus)
Lagostins de água doce 48.5 19.4
(ex.Macrobrachium rosenbergii)
Lagostins de água doce 100 32.3
(ex. Astacus astacus)
Lavagantes 64.5 0
(ex. Homarus gammarus)
Lagostas 78.6 0.049
(ex. Panulirus spp. )
Outras "Lagostas" 80.7 0
(ex. Nephrops, Scyllaridae)
Caranguejos 1048 7
(ex. Portunus triturbiculatus)
Artemia 4 0.35

9
Introdução

Principais Países Produtores e Níveis de Produção Actual

Os crustáceos mais utilizados em aquacultura são o palaemonideo

Macrobrachium rosenbergii, que é um camarão de água doce (embora a reprodução e
fases larvares se realizem em água salobra), de grandes dimensões, originário da região
Indo-Pacífica (em 1991, produção de 25.970 Ton.), e os peneídeos (em 1991, produção
de 690.100 Ton.). Com particular incidência no Sudoeste Asiático, o cultivo de
crustáceos de água doce como o M. rosenbergii constitui apenas 5% da produção
global de crustáceos (New, 1990).

Desenvolvendo-se nas regiões tropicais e sub-tropicais, o peneídeo Penaeus

monodon, conhecido por camarão tigre, é produzido na Formosa, Filipinas e outros
países do Sudeste Asiático. Na Ásia, a produção total de peneídeos em 1991 foi de
556.500 Ton., sendo os principais países produtores a China, Indonésia e Tailândia e de
558.000 Ton. em 1995, tendo curiosamente sido invertida a ordem dos principais
países produtores. Na América (principalmente América Central), com uma produção
de 133.600 Ton. em 1991 e de 154.000 Ton. em 1995, as principais espécies cultivadas
são os peneídeos P. vannamei e P. stylirostris, com realce para o Equador (100.000
Ton. em 1991 e 1995) e a Colômbia. O México, de uma produção de 5.000 Ton. em
1991 passou para 12.000 Ton. em 1995, ficando em 2o lugar, entre o Equador e a
Colômbia (World Shrimp Farming, 1991, 1995; Laubier e Laubier, 1993).

Na Europa, essencialmente na região mediterrânica, a importância da espécie

autóctone P. kerathurus motivou vários investigadores ao seu estudo em Espanha (San
Feliú, 1964, 1969; Rodriguez, 1981), Portugal (Figueiredo, 1972; Luís, 1988), Itália
(Lumare, 1983), e França (Laubier, 1987), o que aprofundou o conhecimento biológico
da espécie mas também conduziu à conclusão de que se trata de uma espécie de difícil
aclimatação às condições de cultivo, face à espécie P. japonicus, importada do Japão
para produção em aquacultura (Arrobas e Ruano, 1986).

Em Portugal, foram realizados vários trabalhos de investigação sobre adaptação

e crescimento de larvas importadas de Penaeus japonicus (Arrobas, 1989; Arrobas et
ai, 1989 e Sobral et ai, 1991), e sobre reprodução e desenvolvimento larvar e pós-
larvar (Arrobas e Sampayo, 1989). Finalmente a partir de 1988, o ciclo biológico da
espécie estava controlado e dispunha-se da tecnologia necessária à produção a nível
industrial de pós-larvas (Arrobas et ai, 1990) com rendimentos da ordem de 1.200
Kg/ha em 3 meses (Arrobas et ai, 1992).

10
 Introdução

Em 1990, a produção global foi de 5 Ton. o que juntamente com uma área de
230 hectares projectada para a cultura do camarão fazia prever um aumento
significativo daquela produção. No entanto, o desenvolvimento da cultura de P.
japonicus em Portugal foi rapidamente travada por dificuldades de vária ordem,
dificilmente contornáveis, como as directivas da Secretaria de Estado do Ambiente
quanto à cultura desta espécie exótica em zonas protegidas e a complexidade dos
circuitos de comercialização no nosso país, às quais se juntaram alguns fracassos de
produção (falta de rigor na aplicação das técnicas de maneio). Desta conjuntura
resultou que, em 1995, existisse uma só empresa no estuário do Guadiana a manter a
produção em ciclo completo desta espécie (Arrobas, comunicação pessoal).

Técnicas de Cultivo

A deslocação das pós-larvas para as zonas estuarinas, nomeadamente da espécie

Penaeus monodon, acrescida da sua alta capacidade de adaptação à variação de
temperatura e salinidade, características das zonas lagunares costeiras, permitiu o
desenvolvimento na Indonésia de uma forma de aquacultura tradicional, na qual as pós-
larvas são confinadas por redes nas lagunas durante o seu crescimento e os adultos
pescados à saída no seu movimento natural para o mar. Actualmente, para além deste
tipo de aquacultura primitiva, podemos descrever três tipos de técnicas de cultivo de
camarões (Laubier, 1987; Laubier e Laubier, 1993):

• As pós-larvas são pescadas em zonas adequadas, normalmente por

pescadores especializados (no Equador são chamados "larveros") e
introduzidas em tanques de terra construídos junto à costa e para onde a água
é bombeada.

• As pós-larvas não são obtidas do meio da natural mas em "maternidades",

após desova controlada, de fêmeas selvagens sexualmente maduras,
capturadas pela pesca comercial. Esta técnica foi iniciada por nos anos 40
por Fujinaga (=Hudinaga), com a espécie Penaeus japonicus.

• Finalmente, a técnica pela qual o ciclo biológico da espécie (a qual pode não
existir naturalmente na região de cultivo) é totalmente controlado em
cativeiro, com especial atenção para o processo reprodutivo.

11
Introdução

Uma revisão detalhada e bem documentada sobre as técnicas de cultivo para

várias espécies de crustáceos, abordando desde a biologia das espécies até à
implementação de projectos e aspectos económicos, pode ser encontrada em Lee e
Wickins (1992). Especialmente dedicada à produção de crustáceos de água doce,
nomeadamente de M. rosenbergii, uma revisão de New (1990) desenvolve as questões
ligadas à investigação actual, às tecnologias de criação e ao mercado e economia.

Ecologia e Ciclo de Vida dos Peneídeos

Os Peneídeos são animais bentónicos de fundos móveis (arenosos ou vasosos),

que, na sua grande maioria, frequentam as águas da plataforma continental até algumas
dezenas de metros de profundidade. Geograficamente encontram-se nas águas
equatoriais e sub-tropicais de todo mundo, sendo limitadas a norte e sul, pelas
isotérmicas de superfície, dos 20°C. No mediterrâneo, a espécie autóctone mais
importante é o Penaeus kerathurus, sendo no entanto também encontrada a espécie
Penaeus japonicus depois de ter sido introduzida para produção em aquacultura
(Rodriguez, 1989).

São animais de sexos separados em que, na cópula, o macho transfere um par

de espermatóforos, através do órgão copulador, o petasma, para o receptáculo da
fêmea, o télico (revisão por Ogle, 1992). Segundo a conformação do télico são
distinguidos dois grupos de peneídeos, ditos de télico aberto e de télico fechado, no
primeiro dos quais a cópula é realizada antes da desova e no segundo logo após a muda
antes do endurecimento da nova carapaça, sendo a desova realizada após algumas
semanas. A grande diversidade de ciclos de vida nos crustáceos é demonstrada pelos
vários padrões de reprodução conhecidos (revistos por Quackenbush, 1991), entre os
quais os peneídeos constituem um exemplo pouco comum ao libertar para o meio ovos
fecundados, sem qualquer cuidado parental.

12
 Introdução

Figura 3. Ciclo de vida dos Peneídeos (Adaptado de Lee e Wickins, 1992)

Na desova são libertados cerca de 100.000 a 1.000.000 de ovos (de cerca de 220
micra), dependendo da espécie e peso da fêmea, podendo esta efectuar mais do que uma
desova em cada época de reprodução. Os ovos eclodem cerca de 12 a 18 horas depois,
consoante a temperatura da água, dando origem a um nauplius (figura 3), estádio
considerado como a larva primitiva de todos os crustáceos, caracterizada por possuir
três pares de apêndices - as antenulas, as antenas e as mandíbulas. A fase de nauplius
desenrola-se no ovo para todas as espécies com excepção única para os Peneídeos.
Depois de 5 a 6 estádios de nauplius e consequentes mudas, o nauplius dá origem a uma
larva capaz de se alimentar de pequenas microalgas, a zoea I (ou protozoea pois já
possui um par de olhos pedunculados) e logo a zoea II e III, estádios que duram pouco
mais de um dia cada. A larva seguinte, a mysis, com três estádios de cerca de 30 horas
cada, é já semelhante a um pequeno camarão embora de patas torácicas birramadas e
sem pinças. A mysis come vorazmente rotiferos, Artemia e nauplius (Lee e Wickins,
1992). Depois de uma metamorfose profunda a larva mysis III dá lugar a uma pós-larva

13
Introdução

semelhante ao adulto possuindo pleiópodes natatórios que não existiam na mysis (figura
3).

Os estádios das pós-larvas distinguem-se pelo número e disposição das espinhas

que ornamentam o rostro. São reconhecidos 22 estádios de pós-larvas de P. japonicus,
cuja duração vai aumentando de cerca de 30 para 40 horas. Depois de 3 a 4 dias os
jovens camarões adquirem um comportamento bentónico, dirigindo-se para os fundos
e, em certas espécies, enterrando-se activamente na areia durante o dia. Apresentam
além disso, um certo tropismo de actividade em função de flutuações de salinidade, que
as aproxima das zonas estuarinas e lagunas costeiras salobras (zonas de produtividade
elevada), onde vivem 3 a 4 meses e de onde saem para o mar com uma dezena de
centímetros de comprimento, onde completam o seu crescimento e finalmente se
reproduzem, num ciclo que pode durar 3 anos. Em condições de exploração intensiva,
este ciclo reduz-se a 18 meses ou mesmo 1 ano (Laubier, 1987)(figura 3).

Eco-Fisiologia da Reprodução

Sincronismo do Crescimento e Reprodução

Os factores externos como a luz, temperatura, salinidade, alimentação,

funcionando como relógios biológicos externos permitem, por um lado, o sincronismo
de vários ciclos internos independentes (crescimento, reprodução, etc.) no indivíduo, e
por outro, o sincronismo de comportamentos (p.ex., migração) e ritmos endócrinos
(p.ex., sincronismo de reprodução entre machos e fêmeas) entre vários indivíduos da
mesma espécie. A reprodução das espécies que vivem em latitudes médias, é realizada
geralmente na época estival local, ocorrendo a desova durante a noite. De uma forma
geral, o estímulo para o início da fase reprodutiva é o aumento da duração do dia
(Laubier, 1987: Penaeus japonicus e P. kerathurus; Ogle, 1992: P. vannamei). Desta
forma, o controlo do fotoperíodo tornou-se prática corrente em aquacultura quer para o
desencadear da maturação ovárica fora da época normal, quer inclusive, para a inversão
do ciclo de fotoperíodo de forma a obter as desovas durante o dia, com as óbvias
vantagens do método.

A técnica de reprodução em cativeiro, elaborada por Fujinaga e colaboradores

entre 1933 e 1960 (Laubier, 1987) para a espécie Penaeus japonicus, e posteriormente

14
 Introdução

aplicada com sucesso a outras espécies, parte da captura e triagem de fêmeas selvagens
com as gónadas desenvolvidas (visíveis através da carapaça), que são colocadas em
tanques e submetidas a um choque térmico: vindas do meio natural com uma
temperatura entre 18 e 25°C, esta é aumentada para 28-29°C no tanque. Após o início
da desova, que ocorre durante a 2o ou 3 o noite, as fêmeas são retiradas do tanque, onde
irão eclodir as larvas. As taxas de eclosão são normalmente inferiores a 50% e muitas
fêmeas maduras podem sofrer uma involução rápida no desenvolvimento do ovário,
também chamada "regressão" do ovário, resultante do "stress" provocado quer pela
captura quer pelo choque térmico.

Uma segunda técnica utilizada para a obtenção da maturação e desova nos

peneídeos é a ablação de um dos pedúnculos oculares (Meusy e Pay en, 1988; Lee e
Wickins, 1992). Depois do trabalho de Panouse (1943) (in Laubier, 1987), no camarão
Leander serratus (Palaemon serratus), ficou provada a existência no pedúnculo ocular
de um complexo sistema glandular - a glândula do seio - que acumula e liberta neuro-
hormonas entre as quais a hormona inibidora da gónada. A ablação unilateral do
pedúnculo ocular traduz-se na diminuição da hormona inibidora circulante, permitindo
a actuação de uma hormona estimuladora da gónada produzida pelo cérebro e pelos
gânglios torácicos (Ogle, 1992; Van Herp e Payen, 1991). A ablação é normalmente
unilateral uma vez que não existe compensação pelo outro pedúnculo e os resultados
são praticamente os mesmos com o corte dos dois pedúnculos, com o inconveniente
neste último caso da morte do animal no final da intermuda (Laubier, 1987). Esta
manipulação pode ocasionar porém uma ruptura do sincronismo dos diversos
mecanismos endócrinos, provocando um desequilíbrio fisiológico generalizado e
nomeadamente dos que intervêm na vitelogénese, responsáveis pela acumulação das
substâncias vitelinas dentro do ovo (Lee e Wickins, 1992). Estas falhas dão
frequentemente origem a ovos não viáveis por incompleta formação das vesículas
corticais, a larvas que não conseguem romper a membrana ovocitária e finalmente a
zoeas pouco activas e que acabam por morrer. Devido a estes problemas revela-se
necessário aprofundar a investigação sobre a regulação endócrina da reprodução, com o
objectivo de optimizar a técnica reprodutiva de forma a atingir uma verdadeira
domesticação das populações em cativeiro, sem o recurso obrigatório aos animais
selvagens.

O estudo dos factores internos e externos que regulam a reprodução, passa

também por outro fenómeno com a qual está estreitamente relacionada, o crescimento.

15
Introdução

De facto, existe um perfeito sincronismo entre a muda do exoesqueleto e a reprodução,

tendo a desova lugar antes da exuviação, não só porque ambos requerem um grande
consumo energético, mas também porque a exuviação de uma fêmea fertilizada
resultaria numa perda dos ovos ou do espermatófero.

Só a libertação de forma cíclica do exoesqueleto calcificado (exuviação ou

ecdisis) e o crescimento em tamanho, pela entrada de água através do intestino (e
brânquias) logo após a exuviação, permite o crescimento dos crustáceos (figura 4).

Em quase todos os décapodes a muda continua para além da puberdade,

variando a sua frequência segundo as espécies, tamanho e idade. Normalmente a
reprodução (desova) realiza-se durante a intermuda, estádio C4 do ciclo da muda, ou na
pré-muda. O ciclo da muda é normalmente dividido nas fases (ou estádios) de pós-
muda (Estádio A, sub-dividido em Ai e A2; Estádio B, sub-dividido em Bi e B2),
intermuda (Estádio C, sub-dividido em C\, C2 e C3) e pré-muda (Estádio D, sub-
dividido de D[ a D4) (Adiyodi e Adiyodi, 1970).

PRÉ-MUDA
MUDA

PÓS-MUDA INTERMUDA

Figura 4. Estrutura do tegumento de um crustáceo nas diferentes fases do ciclo

da muda. Na pré-muda as células da epiderme aumentam de tamanho,
separam-se da velha carapaça (apólise) e secretam a nova epicutícula.
Depois da muda (exuviação) está completa a exocutícula e é iniciada a
produção da endocutícula que fica completa no início da intermuda.
En, endocutícula; ep, epicutícula; ex, exocutícula; epid, epiderme; t,
glândula do tegumento. (Adaptado de Highnam e Hill, 1977).

16
 Introdução

Este processo engloba ao longo das referidas fases (ou estádios) os seguintes
acontecimentos (Lee e Wickins, 1992): 1) acumulação de reservas minerais e
orgânicas, 2) remoção de material da velha carapaça e formação de um novo
exosqueleto, 3) exuviação acompanhada por entrada de água no organismo, 4) reforço
molecular do exosqueleto por rearranjo da matrix orgânica e deposição de sais
inorgânicos, 5) substituição de fluído por tecido.

Uma vez completa a formação do esqueleto e o crescimento tecidular, a

intermuda (fase C4) constitui a fase de deposição de reservas principalmente a nível do
hepatopâncreas. A muda e a reprodução são os maiores acontecimentos metabólicos
que envolvem a mobilização cíclica das reservas orgânicas para a epiderme e ovário
respectivamente, constituindo duas importantes funções que, embora de certa forma
separadas no tempo, estão integradas através da acção hormonal (Adiyodi e Adiyodi,
1970).

Anatomia e Endocrinologia Geral

A maior parte dos conhecimentos relativos ao sistema endócrino dos

crustáceos foi adquirido através do estudo de décapodes, assim como de outros dois
grupos de malacostracas, os anfípodes e os isópodes. Na figura 5 está representada a
anatomia interna e externa de um decápode tipo.

Órgãos Neuro-Endócrinos

O sistema endócrino dos décapodes consiste em estruturas epiteliais do tipo

endócrino não-neuronal, como a glândula androgénica, e células neuro-secretoras com
componentes do tipo neuronal (neuro-endócrino), como a glândula do seio (figura 6).

17
Introdução

Região branquial 4o segmento

Antenula da carapaça abdominal

Carina
Antena dorsal
2° Maxilípede Telson

3o Maxilípede Urópodes
Pinça
Pereiópodes
Pedúnculos
oculares Hepatopâncreas Testículo

Abdómen Télson e
urópodes
Ovário
anterior médio posterior

Pereiópodes

Fêmea Macho

Figura 5. Anatomia interna e externa de um decápode tipo. A- plano lateral, B e

C- plano dorsal, D- plano ventral (Adaptado de Lee e Wickins, 1992).

As glândulas neuro-endócrinas dos décapodes são formadas pelas terminações

de axónios de células neuro-endócrinas e são estruturas de acumulação e libertação de
neuro-hormonas, situadas junto do sistema vascular e daí a designação de órgãos

18
 Introdução

neuro-hemais (Fingerman, 1992). Contrariamente aos vertebrados, o número de neuro-

hormonas nos décapodes é superior ao das não-neuronais (Fingerman, 1987), tendo
sido já descritos mais de 20 possíveis factores neuro-hormonais (Van Herp e Payen,
1991).

Figura 6. Diagramas de exemplos do sistema neuro-secretor do pedúnculo ocular dos

crustáceos. A negro estão representados os núcleos e a claro os terminais neuro-
secretores. A. camarão Lysmata seticaudata, B. camarão Palaemon serratus e C.
caranguejo Geocarcinus lateralis, bt, axónios vindos do cérebro e de outras partes
do SNC; me, mi, mt, medula externa, interna e terminal do gânglio do pedúnculo
ocular, respectivamente; nsc, células neuro-secretoras isoladas; sg, glândula do seio;
sp, poro sensitivo (órgão de Bellonci); x-o, órgão x (Adaptado de Tombes 1970).

19
Introdução

Glândula do Seio- Órgão X- (MTGX)

O complexo neuro-hemal glândula do seio é o maior componente dos centros

neuro-endócrinos dos crustáceos assim como a maior estrutura endócrina nos
décapodes. Este órgão, ao qual se atribui o controlo de 18 funções (Ogle, 1992),
constitui o local de libertação e armazenagem de uma ampla variedade de hormonas
como a hormona inibidora da muda (MIH), a hormona inibidora da gónada/ hormona
inibidora da vitelogénese (GIH/VIH), a hormona hiper-glicémica (CHH), as hormonas
que controlam os cromatóferos (PDH, RPCH) e pigmentos da retina (DRPH) e a
hormona depressora neuronal (NDH).

A designação de "glândula do seio" deve-se à sua localização, no pedúnculo

ocular, onde o seio dorso-lateral interno abre para um largo seio externo. A glândula do
seio é composta de células da glia e de terminais de axónios de células neuro-secretoras
(Bressac, 1988a; Fingerman, 1987). Estas células estão situadas principalmente na zona
próximo-ventral da medula terminalis, dos lóbulos ópticos (protocérebro) também
conhecido como "órgão X" e minoritariamente (até cerca de 10%) do cérebro e
gânglios torácicos (Fingerman, 1987, 1992). Os produtos de neuro-secreção
acumulados nas terminações nervosas são libertados essencialmente por exocitose,
registando-se no entanto a presença de vesículas sinápticas ligadas a este fenómeno
(Bressac, 1988a) (figurão ).

Através de estudos imuno-citoquímicos para a localização dos locais de síntese

das hormonas inibidora da vitelogénese (VIH) e hiper-glicemiante dos crustáceos
(CHH), Van Herp e Pay en (1991) concluíram que ambas as hormonas poderiam ser
sintetizadas nos mesmos "perikaria" mas por vias biossintéticas distintas, transcritas
pelo mesmo RNA e com origem num precursor comum. A hormona hiperglicemiante
dos crustáceos (CHH), cuja libertação é afectada pela 5-hidroxi-triptamina, é um
péptido com 6000 a 7000 daltons de peso molecular, sendo a sua acção mediada por
nucleótidos cíclicos, cAMP e cGMP (Fingerman, 1987). Na espécie Homarus
americanus, Chang et ai, (1993) encontraram 96% de similaridade nas sequências das
hormonas CHH e MIH.

A revisão dos vários trabalhos sobre a CHH, realizada por Van Herp e Payen,
(1991), permitiu tirar algumas conclusões que poderão ajudar nos futuros estudos sobre
a dinâmica do sistema celular produtor da VIH: 1) a secreção da CHH apresenta um
ritmo circadiano, controlada pelo fotoperíodo, cujo foto-receptor se encontra no

20
 Introdução

gânglio óptico do pedúnculo ocular. 2) durante o período de muda a actividade

secretora é reduzida ficando ausente o pico normal de actividade nocturna. 3) o sistema
desenvolve-se logo após a eclosão e apresenta-se activo já nas fases larvares. 4) as
sinapses dos axónios CHH são serotoninérgicas e os neuro-moduladores poderão ser a
dopamina e meta-enquefalina.

O facto da hormona inibidora da muda (MIH) ser também produzida no

complexo órgão X - glândula do seio (MTGX) pode ser significativa da relação que
existe nos crustáceos entre as actividades da reprodução e da muda. A caracterização da
hormona inibidora da muda (MIH), o seu efeito no orgão-alvo (órgão Y que sintetiza a
hormona da muda, MH) e o seu modo de acção, estão descritos na revisão de Lachaise
et ai, (1993)(ver também Mattson, 1986 e Spaziani et ai, 1994).

Finalmente, as hormonas CHH/MIH/VIH, parecem constituir uma nova família

de hormonas neuropeptídicas de crustáceos décapodes. Dadas as múltiplas actividades
biológicas demonstradas (p. ex. a MIH ter uma actividade CHH), parece ser ainda
prematuro designar qualquer destes péptidos como "a" hormona inibidora da muda ou
"a" hormona hiperglicemiante dos crustáceos de uma espécie particular (Chang et ai,
1993).

Para além dos factores inibidores já descritos, a presença de factores

estimuladores da vitelogénese (VSH) foi descrita por vários autores (revistos por Van
Herp e Pay en, 1991) em extratos hidro-solúveis do cérebro e gânglios torácicos.
Tratando-se possivelmente da mesma hormona, o trabalho de revisão de Ogle (1992)
refere-se à hormona estimuladora do ovário (OSH), com origem no cérebro, gânglios
torácicos, ovário ou órgão mandibular, como responsável pela estimulação da
vitelogénese secundária. O efeito estimulador no crescimento de ovócitos não-
vitelogénicos observado após injecção de CHH poderá não ser um efeito directo mas
uma consequência de um aumento da taxa do metabolismo dos hidratos de carbono
(Van Herp e Pay en, 1991).

Desta forma, o sistema neuro-endócrino e principalmente o complexo órgão X -

glândula do seio no pedúnculo ocular, têm uma função integradora na regulação da
reprodução, coordenando a resposta dos órgãos endócrinos e reprodutivos (órgão Y,
órgão mandibular, glândula androgénica e testículos ou ovário) às variações do meio
como a temperatura e fotoperíodo (Van Herp e Payen, 1991).

21
Introdução

Também na glândula do seio foi isolado um péptido (1200 daltons), que

deprime a actividade dos neurónios motores e sensitivos, denominado hormona neuro-
depressora (NDH), cuja libertação é estimulada pela 5-hidroxi-triptamina e inibida pelo
ácido gama-amino-butírico, e que tem como função modular a actividade circadiana
durante o dia nas espécies de maior actividade noturna (Fingerman, 1987).

Órgãos Post-Comissurais (PCO), Órgãos Pericárdicos (PO) e Ramificações

Anteriores (AR)

Fibras derivadas do cérebro (região do tritocérebro), com terminação em forma

achatada de prato ou lâmina nos músculos, num seio venoso, constituem os
denominados órgãos post-comissurais (PCO), cujo produto de síntese exibe actividade
de concentração de vários pigmentos cromatóferos (branco, vermelho, preto) (figura 7).

Órgão X
(pars ganglionar^)

Canal
Espetmático
último
Glândula Gânglio Torácico
Androgénica
primeiro
Gânglio Abdominal

Figura 7. Esquema geral do sistema endócrino de um

decápode (macho) (Adaptado de Tombes, 1970).

22
 Introdução

O único papel descrito para este órgão é o de acumulação e libertação de

hormonas relacionadas com mudanças de cor (Fingerman, 1987). A estrutura química
assim como a relação estrutura-actividade destas hormonas neuropeptídicas de
dispersão e concentração de pigmentos (PDHs e PCHs) foi recentemente revista no
trabalho de Rao e Riehm, (1991). Vários neuro-transmissores como a seretonina (5-
hidroxi-triptamina, 5-HT), norepinefrina e dopamina, existentes nos crustáceos,
mostraram-se selectivamente activas na estimulação da libertação das hormonas
cromatóforas e dos pigmentos da retina (Fingerman, 1987).

Na cavidade pericárdica, e separados da hemolinfa por uma lâmina basal

característica (Bressac, 1988a), estão localizados os chamados "órgãos pericárdicos"
(PO) (figura 7), formados pelos axónios e suas terminações, de células neuro-secretoras
dos gânglios torácicos, cuja função é a regulação do ritmo cardíaco (Bressac, 1988a;
Fingerman, 1987, 1992). A distribuição neuronal e os efeitos do péptido cardioactivo
dos crustáceos (CCAP) nos artrópodes foi revisto recentemente por Dircksen, (1994).

Também com características de órgão neuro-hemal (mas apenas descrito no

grupo Brachiura) e próximo dos PO, foram descritas as denominadas "ramificações
anteriores" (AR), que têm origem no primeiro segmento nervoso do gânglio torácico, o
qual se ramifica perto dos músculos que movem a maxila, dando origem às AR. Nestes
dois órgãos neuro-hemais, PO e AR foram encontradas evidências da presença de
monoaminas (catecolaminas e 5-hidroxitriptamina) (revisto por Fingerman, 1987,
1992).

Glândulas Endócrinas Não-Neuronais

Órgão Y

O órgão Y, órgão endócrino par, situado na região cefálica dos crustáceos

superiores (Malacostraca, pois nos inferiores como os Entomostraca estão ausentes), é
uma glândula endócrina ectodérmica (não-neuronal) e que sintetiza a hormona da
muda, a ecdisona (também conhecida como oc-ecdisona). Esta glândula tem origem na
epiderme (embriologicamente na ectoderme), à qual pode ficar ligada (lagostins) ou
tornar-se independente (Lachaise et ai, 1993). O órgão Y, é constituído por um par de
estruturas compactas de forma ovóide, situadas geralmente numa posição ventral à

23
Introdução

inserção da porção lateral do músculo adutor externo da mandíbula, por cima do ponto
onde o branquiostegito se liga à cutícula no extremo anterior da câmara branquial
(figura 7). Tem normalmente uma estrutura lobada, não inervada, composta de apenas
um tipo celular (Fingerman, 1987, 1992). A situação anatómica exacta, as diferentes
formas do órgão Y assim como a estrutura histológica e ultrastrutura, em distintos
grupos de crustáceos, são descritas detalhadamente numa revisão recente de Lachaise et
ai, (1993).

Este órgão tem como função mais importante o controlo da muda, cujo
processo é inibido por um neuropeptide, a hormona inibidora da muda (MIH)
produzida nos neurónios do órgão X dos pedúnculos oculares e acumulada na glândula
do seio, igualmente nos pedúnculos oculares. Detalhes sobre a função e controlo deste
importante órgão endócrino, assim como das hormonas eedisteróides a que dá origem
serão apresentados em capítulo próprio (capítulo 4).

Órgãos Mandibulares (MO)

Os órgãos mandibulares (MO), situados anteriormente aos órgãos Y, na base e

lado posterior do músculo adutor mandibular posterior, em posição dorsal aos
músculos maxilares, dão origem aos compostos terpenóides, fernezoato de metilo (MF)
e ácido farnesóico. Estes compostos estão estruturalmente relacionados com a hormona
juvenil dos insectos (Laufer e Landau, 1991). Os órgãos mandibulares, com
características ultrastruturais típicas de esteroidogénese, foram também comparados
com a glândula "corpora allata" dos insectos (Bressac, 1988b).

Embora a sua função nos crustáceos ainda não esteja completamente

estabelecida, parecem ter um papel estimulador no desenvolvimento do ovário e na
promoção da vitelogénese (revisões por Borst et ai, 1987, Fingerman, 1987, Van Herp
e Payen, 1991 e Fingerman, 1992).

Na espécie Libinia emarginata foi verificada uma flutuação do nível do MF

durante o ciclo vitelogénico, coincidindo os níveis mais elevados com o máximo de
síntese de vitelogenina (Borst et ai, 1987), o que juntamente com os resultados dos
implantes de MO em fêmeas não-reprodutivas, estimulando o desenvolvimento
ovárico, indicam uma intervenção directa do MF na reprodução (Laufer e Landau,
1991).

24
 Introdução

Em algumas espécies foram verificadas alterações ultrastruturais nas suas

células ao longo do ciclo da muda (revisto por Fingerman, 1987). Recentemente, foram
caracterizadas as proteínas da hemolinfa transportadoras de MF, as quais apresentam
variações (aumento de quantidade e/ou afinidade) ao longo do ciclo da muda. Novos
dados indicam uma possível acção estimuladora do MF sobre a síntese de ecdisteróides
(Change/ al, 1993).

A produção de MF pelos órgãos mandibulares (MO) parece ser estimulada pela

RPCH e inibida pela PDH (hormonas pigmentares) sendo também influenciada por
aminas biogénicas (serotonina) (Laufer e Landau, 1991).

Glândula Androgénica (AG)

A glândula androgénica, apenas presente no grupo Malacostraca (Fingerman,

1987), controla a diferenciação sexual dos machos, determinando o aparecimento dos
testículos, contrastando com a auto-diferenciação do ovário na ausência da hormona
androgénica (Adiyodi e Adiyodi, 1970).

Fazendo lembrar o gene do cromossoma Y que determina o aparecimento dos

testículos nos mamíferos, os primórdios da glândula androgénica são determinados
geneticamente (Hasegawa et ai, 1993).

Em todos os décapodes esta glândula está situada na região ejaculatória sub-

terminal dos canais deferentes (figura 7). Nos isópodes a sua localização é mais
variável, podendo estar completamente separada do canal deferente (Payen, 1980).
Apresentando um arranjo celular variável, nos peneídeos formam cordões que se
dobram sobre si mesmo e por vezes se anastemosam. Ultrastruturalmente ricos em
retículo endoplásmico rugoso (RER), mitocôndrias e complexos de Golgi, sugerem um
tipo celular secretor de proteínas mais que de esteróides, embora a não identificação
dos produtos de secreção retire consistência a esta hipótese.

Ovário

Os ovários, provavelmente as células foliculares primárias, são a fonte de uma

hormona que induz a formação das características sexuais secundárias nas fêmeas

25
Introdução

(Fingerman, 1987, 1992). Embora tenha sido demonstrado apenas nos anfipoda, as
células foliculares secundárias produzem uma hormona estimuladora da vitelogenina
(VSOH) (Payen, 1980) e, como parece representar um papel semelhante ao 17P-
estradiol nos vertebrados ovíparos, a sua natureza química poderá ser esteróide (Van
Herpe Payen, 1991).

Órgão de Bellonci

Inicialmente confundido com o órgão X - foi denominado "pars-distalis-orgão

X para o distinguir da medula terminalis (= pars ganglionaris)- órgão X (MTGX)-, ou
ainda "Papila sensitiva-orgão X" (Adiyodi e Adiyodi, 1970), o órgão de Bellonci é, nos
décapodes, uma estrutura compacta composta de um conjunto de algumas dezenas de
lóbulos. Nas espécies que possuem um poro ou uma papila sensitiva, o órgão de
Bellonci aparece intimamente a ela ligado. Um nervo liga o órgão de Bellonci à medula
terminalis nos casos em que ambos estão separados (figura 7). Este órgão parece ter
uma função dupla, sensitiva e secretora, pela qual as células respondem a um estímulo
fotónico libertando um produto de secreção. Poderá ainda funcionar como órgão
químioreceptor ou baroreceptor, constituindo assim um órgão sensitivo que secreta
substâncias fisiologicamente activas em resposta a estímulos do ambiente, como se fora
uma reminescência da glândula pineal da maior parte dos animais ectotérmicos,
glândula não só sensitiva mas que também secreta melatonina (Fingerman, 1992).

Glândulas Exócrinas

Glândulas exócrinas são encontradas em vários pontos do corpo dos crustáceos

décapodes e fazem parte normalmente de outros sistemas, como por exemplo, o
hepatopâncreas que desempenha na digestão uma função importante. Os canais
deferentes dos testículos, através de células epiteliais cubóides que revestem as suas
paredes, secretam o espermatóforo, invólucro que encerra um grupo de
espermatozóides. Poderão estar ainda na origem de uma feromona que estimula o
ovário (Takayanagi et ai., 1986, in Van Herp e Payen, 1991).

26
 Introdução

As glândulas do tegumento são constituídas por células secretoras, situadas

debaixo da epiderme e possuem um dueto que atravessa a cutícula. A sua função
dividem-nas em dois tipos: um envolvido na osmorregulação e outro no endurecimento
da nova carapaça. As que existem no aparelho digestivo secretam um muco, que no
esófago têm como função a lubrificação, para facilitar a passagem dos alimentos, e, na
sua parte terminal funciona como ligante para formar as "peletes" fecais (Fingerman,
1992).

As glândulas antenais, um par de estruturas que abrem para o exterior através de

um "nefróporo" na base da segunda antena, constituem os órgãos excretores dos
crustáceos décapodes. Estruturalmente são constituídos na sua parte mais interna por
um saco de fundo cego, o saco coelómico, o qual abre para um labirinto de canais que
depois se juntam para desembocar numa bexiga urinária, que finalmente abre no
nefróporo. Porém, em alguns décapodes existe um túbulo contornado, o canal nefrídio,
que nos animais de água doce é o local de absorção de sais, de forma a que a urina
formada é hipotónica em relação à hemolinfa (Fingerman, 1992). Enquanto que a
entrada massiva de água aquando da exuviação deverá ser controlada por eedisteróides,
a regulação dos fluxos de água durante a intermuda parece ser controlada por um
"factor diurético" proveniente da glândula do seio, ou ainda por dois factores de acções
osmorregulatórias antagónicas existentes no cérebro e gânglios torácicos (Fingerman,
1987).

Ovogénese e Vitelogénese

A ovogénese, caracterizada principalmente pela actividade mitótica e meiótica

das ovogónias, e a vitelogénese, processo pelo qual o ovócito produz e acumula as
reservas vitalinas, são os aspectos mais importantes e daí mais estudados na reprodução
das fêmeas de crustáceos.

Os aspectos citológicos e ultrastruturais da ovogénese e vitelogénese serão

discutidos detalhadamente nos capítulos 2 e 3, sendo aqui apenas abordados de forma a
introduzir os conhecimentos actuais do controlo hormonal destes processos.

27
Introdução

Na zona germinativa do ovário e durante toda a vida reprodutiva das fêmeas, as

gónias, separadas por células mesodérmicas que as inibem de entrar em gametogénese,
multiplicam-se por mitoses sucessivas (Charniaux-Cotton, 1980; Meusy e Payen,
1988). Por auto-diferenciação (a presença da hormona androgénica determina a
diferenciação espermatogénica das gónias ) saem desta zona em profase meiótica
tornando-se ovogónias (Adiyodi e Adiyodi, 1970; Payen, 1980). A ovogénese só tem
início quando as ovogónias primárias deixam o tecido mesodérmico, com a sua saída
da zona germinativa. A actividade mitótica e ovogenética das ovogónias primárias,
parece efectuar-se durante todo o ano, de forma contínua e sem regulação hormonal.
Depois da condensação dos cromossomas, as células mesodérmicas começam a
envolver os ovócitos, dando origem à formação de folículos primários (Payen, 1980,
Meusy e Payen, 1988). É então iniciada a previtelogénese, uma fase de crescimento do
ovócito através da produção endógena de glicoproteínas. Os ovócitos apresentam uma
importante acumulação de ribossomas e desenvolve-se o retículo endoplásmico rugoso.
Na continuação do seu crescimento, o ovócito aumenta a sua superfície através de
numerosas microvilosidades que atravessam a camada vitelina e tomam contacto com
as células foliculares, as quais envolvem os ovócitos em várias camadas. No ooplasma
formam-se numerosas vesículas com material glicoproteico. Estes fenómenos
caracterizam a previtelogénese (vitelogénese primária ou vitelogénese endógena) (Van
Herp e Payen, 1991; Meusy e Payen, 1988). Esta fase mantém-se estacionária, quando
o ovócito atinge um determinado tamanho, típico para cada espécie, por longos
períodos nas fêmeas jovens ou até à época de reprodução para as fêmeas púberes.
Como regra geral, a puberdade feminina é atingida quando uma camada de epitélio
rodeia pela primeira vez cada ovócito previtelogénico que alcançou o seu máximo
crescimento (Meusy e Payen, 1988). A fase de vitelogénese primária é pois
caracterizada pela grande actividade de síntese do ovócito (grande quantidade de
ribossomas e um desenvolvimento do retículo endoplásmico rugoso) de vitelo
endógeno e no seu final pelo desenvolvimento de microvilosidades e aumento da
actividade das células foliculares.

Seguindo a terminologia mais frequentemente utilizada na literatura sobre a

fisiologia reprodutiva de animais ovíparos, Meusy e Payen (1988) e Van Herp e Payen
(1991), consideraram a vitelogénese primária ou endógena como fazendo parte da
previtelogénese e assim a denominação de vitelogénese refere-se apenas à vitelogénese
secundária ou exógena (figura 8).

28
 Introdução

Vitelogénese

Com o início da época de reprodução, nas fêmeas púberes, os ovócitos que se

encontram no fim da previtelogénese (vitelogénese primária) entram em vitelogénese
(vitelogénese secundária ou vitelogénese exógena) (Van Herp e Payen, 1991).

A vitelogénese constitui a etapa da reprodução dos crustáceos, comum a outros

grupos (insectos, anfíbios, peixes e aves), durante a qual os ovócitos no final da
previtelogénese, acumulam grandes quantidades de vitelo, principalmente (mas não
exclusivamente), por inclusão de um precursor extra-ovárico, a vitelogenina (Meusy e
Payen, 1988).

Nesta fase, cada ovócito, com as microvilosidades bem desenvolvidas e a

atravessar a camada vitelina, fica envolvido por uma única camada de células
foliculares. Através de endocitose, o ovócito introduz e acumula a vitelina, proteína
maioritária das reservas vitelinas, a qual lhe é fornecida pela hemolinfa como um
percursor, a vitelogenina. É assim característica desta fase a formação no ooplasma
cortical de numerosas microvesículas de pinocitose, compostas de
lipoglicocarotenoproteínas, e o aparecimento de uma rede de microcanículas que as
conduzem em direcção aos glóbulos vitelinos (figura 8). A par desta "vitelogénese
exógena", o ovócito continua a produção de glicoproteínas que, quando associadas a
pigmentos carotenóides, dão a cor viva característica dos ovários vitelogénicos. A
formação e acumulação de glóbulos lipídicos (essencialmente triglicerídeos), cuja
origem ainda não foi determinada (Meusy e Payen, 1988), é também uma característica
da vitelogénese. A vitelogénese secundária, é iniciada com a foliculogénese secundária
(Charniaux-Cotton, 1980), fenómeno que prepara uma camada folicular a partir do
tecido mesodérmico e que, através da modificação da superfície do ovócito, com a
aquisição de vilosidades, torna possível a entrada da vitelogenina por micropinocitose
(Payen, 1980).

29
Introdução

Figura 8. Esquema sumário (sem escala) do desenvolvimento do ovócito (de Van

HerpePayen, 1991).

Ainda antes do final da vitelogénese, as microvilosidades e os processos

endocitóticos desaparecem e os ovócitos apresentam-se repletos de vesículas de vitelo e
gotícuias lipídicas, excepto na região peri-nuclear e na sua região cortical. Nesta última
região, formam-se as vesículas corticais, provavelmente originadas do "vitelo
endógeno" (Clark et ai, 1984; Goudeau e Lachaise, 1980), e que estão relacionadas
com a formação da camada vitelina (Anderson et ai, 1984; Meusy e Payen, 1988). Esta
camada vitelina parece ter a mesma função do denominado corion dos ovócitos no final
da vitelogénese da lagosta Homarus americanus, o qual é formado pelas células
foliculares (Talbot, 1981b).

30
 Introdução

Origem da Vitelogenina

Vários locais de síntese da vitelogenina, nome dado à proteína circulante na

hemolinfa de fêmeas vitelogénicas e que constitui o maior percursor proteico do vitelo,
têm sido apontados por vários autores em diferentes ordens de crustáceos: hemócitos,
hepatopâncreas, ovários e tecido adiposo sub-epidermal (revisões por Charniaux-
Cotton, 1980; Meusy e Payen, 1988; Quackenbush, 1991). Embora em alguns trabalhos
a hipótese de origem única intra-ovocítica (Beams e Kessel, 1963; Ganion e Kessel,
1972) ou essencialmente intra-ovocítica (Fainzilber et ai, 1992) ou extra-ovocítica
(Wolin et ai, 1973) seja defendida, a possibilidade de uma dupla origem, extra e intra-
ovocítica é uma das hipóteses mais apontadas, reforçada por vários estudos
ultrastruturais, aspecto que será abordado com maior detalhe no capítulo 2.

Devido à grande quantidade de proteína acumulada no ovócito durante a

vitelogénese, difícil será acreditar que seja apenas um só tecido responsável pela sua
produção, e assim, contribuições de vários tecidos deverão ser necessárias, variando a
sua importância ou momento de intervenção de espécie para espécie. A sua
coordenação e o controlo, desencadeado pelas variações ambientais, de forma a resultar
no sucesso do desenvolvimento larvar, parece variar também de espécie para espécie.
Nos peneídeos, obtiveram-se resultados tão diversos quanto as espécies utilizadas,
responsabilizando unicamente um tecido (ovário ou mais concretamente as células
foliculares) ou vários (ovário, hepatopâncreas, tecido adiposo sub-epidermal) de forma
que apenas possibilitam a conclusão de que os ovócitos recebem proteínas vitelinas
extra-ováricas de origem muito variável (Quackenbush, 1991). Além disso, neste grupo
de crustáceos, os já referidos bastonetes (ou vesículas) corticais que irão formar a
camada de geleia proteica após a activação do ovócito (Clark et ai, 1984), deverão
exigir uma elevada síntese proteica no ovócito, que junto com a proteína necessária
para constituir o vitelo, tornam obrigatória a existência de síntese proteica extra-
ovárica.

Entrada e Processamento da Vitelogenina

No início da vitelogénese, pode ser observada nas células foliculares que

rodeiam os ovócitos, uma rede tubular (túbulos com diâmetro de 0.15 micra), unida por
uma membrana unitária e encerrando material electrono-denso, e que faz a conexão

31
Introdução

com todos os compartimentos extra-celulares: hemolinfa, espaço inter-celular e espaço

entre os ovócitos e as células foliculares. Esta estrutura, que regride no final da
vitelogénese, facilita a passagem de material da hemolinfa para o ovócito vitelogénico.
Também as numerosas microvilosidades, que nesta fase se desenvolvem na superfície
dos ovócitos aumentando-a e que se dirigem para as células foliculares (penetrando
mesmo nos já referidos túbulos), parecem estar envolvidas na captura de material extra-
ovocítico. Este processo parece ser mediado por receptores com alta afinidade para a
vitelogenina. Finalmente, as vesículas de endocitose (100-140 nm de diâmetro)
formam-se no ooplasma cortical e algumas drenam o seu conteúdo para as vesículas de
vitelo através de uma rede de micro-canículas (45-60 nm de diâmetro). Estas vesículas
de vitelo vão-se fundindo e sendo "empurradas" para o ooplasma medular pelas novas
que se formam, tomando no final da vitelogénese uma forma poliédrica e um tamanho
de cerca de 40 micra (Meusy e Payen, 1988).

Se a captura de vitelogenina constitui uma característica específica da

vitelogénese, também é certo que o retículo endoplásmico rugoso, ainda presente nesta
fase, continua a síntese intra-ovocítica de vitelo proteico, assim como subsiste a
passagem de material nuclear para o citoplasma. De facto, parece haver uma grande
variação, entre espécies, da importância de cada uma das fracções, intra e extra-
ovocítica do vitelo. Se por um lado se dá muita importância à captura pelo ovócito da
vitelogenina durante a vitelogénese secundária, é de realçar que o nível máximo de
vitelogenina circulante na hemolinfa antecede sempre a máxima acumulação pelo
ovócito, e durante a queda rápida deste nível circulante e quando os ovócitos já não
apresentam endocitose, o seu conteúdo vitelino continua a aumentar até à ovulação,
argumentos que favorecem a produção endógena de vitelo.

A denominação de vitelina é normalmente atribuída à vitelogenina ("proteína

específica feminina") depois de esta entrar no ovócito e como ainda é pouco conhecida
a estrutura química de ambas, os dois termos referem-se mais aos compartimentos onde
são encontradas, ovócito e hemolinfa, respectivamente. De facto, vários estudos
mostram que não existem diferenças de resposta imunológica entre a vitelogenina e a
vitelina (revisto por Meusy e Payen, 1988). No entanto, sendo ou não a mesma
substância, o "processamento" da vitelogenina aquando da sua entrada no ovócito ou
dentro do ovócito não deixa de ser uma possibilidade, nomeadamente quanto à sua
porção proteica.

32
 Introdução

Maturação do Ovócito

Embora para muitos autores, o termo maturação seja aplicado como sinónimo
de desenvolvimento ovárico ou de vitelogénese, a maturação do ovócito ocorre apenas
no final da vitelogénese e é também designada de maturação meiótica, pois trata-se da
reiniciação meiótica dos ovócitos que se encontram bloqueados em profase I da
primeira méiose. A maturação ocorre no ovário e antecede a fertilização. Inicialmente
as células foliculares retraiem-se, as microvilosidades ovocitárias assim como as
vesículas de pinocitose e as microcanículas desaparecem, depois tornam-se visíveis as
vesículas corticais na periferia do ooplasma e, por último, desaparece o invólucro
nuclear (Payen, 1980), após o que se dá a reiniciação meiótica do ovócito, precedendo
a desova (Adiyodi e Adiyodi, 1970; Van Herp e Payen, 1991).

Só recentemente foi descrita cronologicamente a evolução dos aspectos

citológicos da maturação em décapodes {Palaemon serratus) e a sua estreita relação
com a preparação para a muda (Clédon, 1986). Nesta pré-muda, em D0, a membrana
nuclear invagina-se, os nucléolos dissociam-se, dá-se a condensação dos cromossomas
e o início da cisão da membrana nuclear. A cisão da vesícula germinal ("germinal
vesicle breakdown", GVBD) ocorre no final da fase D] ou início da D2, quando a
vesícula germinal ocupa uma posição central no ovócito. Assim, ovócitos imobilizados
na profase I retomam a méiose na pré-muda, isto é, no final da fase Dj (4 a 5 dias antes
da muda). Seguidamente, no final da fase D2, cerca de 4 horas antes da exuviação,
verifica-se a migração da vesícula germinal com os cromossomas. Cerca de 1 a 2 horas
antes da muda, os cromossomas divalentes, que ainda não estão organizados
equatorialmente em metafase, tornam-se visíveis à superfície do ovócito, numa região
nucleoplásmica desprovida de membrana nuclear. O primeiro fuso cromático meiótico
pode ser observado aquando da exuviação, ficando os ovócitos bloqueados em
metafase I até à desova.

Ovulação

Nas espécies Palaemon serratus e Macrobrachium rosenbergii, em que a

maturação se desenrola em sincronia com a pré-muda, a ovulação, a retração do
epitélio folicular e a separação da camada folicular dos ovócitos, ocorrem após a muda.

33
Introdução

Com esta retração do epitélio folicular, que normalmente se inicia na zona do ovário
junto dos oviductos, formam-se cristas de tecido mesodérmico folicular entre os
ovócitos ovulados, depois no espaço deixado livre pelos ovócitos desovados e
finalmente é concentrado na periferia do ovário para ser usado numa seguinte
foliculogénese (Meusy e Payen, 1988). Nos peneídeos, pelo contrário, as células
foliculares degeneram após a ovulação (Anderson et ai, 1984).

Activação do Ovócito

A activação do ovócito ovulado (bloqueado na primeira metafase meiótica)

consiste em:

1) libertação do precursor da geleia contido nas criptas corticais.

2) transformação deste precursor numa camada homogénea de geleia à volta do

ovo.

3) reiniciação e finalização da maturação meiótica.

4) elaboração de um invólucro extracelular de desova.

Embora a interacção ovo-espermatozóide seja necessária para o

desenvolvimento embriónico normal, o processo de activação do ovócito é
normalmente desencadeado pela exposição à água do mar, não requerendo a
fertilização (Lynn et al, 1991). Enquanto nos ovos fertilizados, a sua activação requere
apenas a presença externa de Mg , nos ovos não fertilizados, além deste catião
divalente é também necessário o Ca +.

Segunda Reiniciação Meiótica (Metafase I)

Nos anfípodes e em vários décapodes (Meusy e Payen, 1988), os ovócitos no

momento da desova encontram-se na primeira metafase meiótica, processo que é
recomeçado pouco tempo depois, isto é, o estádio de anafase tem lugar nos ovos
desovados. Se inicialmente foi sugerido que a fertilização desencadeava esta
reiniciação da metafase, trabalhos posteriores (Lynn et ai, 1991, entre outros)

34
 Introdução

demonstraram que o contacto com a água do mar, ou mais especificamente, a presença

9+ 9+

externa de iões Mg (mas não o Ca , sendo este necessário apenas nos ovos não
fertilizados) independentemente da fertilização, eram os directos responsáveis pela
• ■ 9+

activação do ovócito. De facto, o aumento de Mg no meio externo aquando da

desova, vai aumentar a permeabilidade da membrana do ovócito ao K+, provocando
uma hiperpolarização no ovócito (Goudeau e Goudeau, 1986). O aparecimento do
primeiro corpo polar segue-se à formação da camada homogénea de geleia e constitui
uma indicação de que a primeira divisão meiótica está completa. Durante a elevação ou
afastamento do invólucro de desova o primeiro corpo polar é afastado da superfície do
ovo e pouco tempo depois é formado o segundo corpo polar indicando o final da
maturação meiótica (Lynn et ai, 1991).

Electro-Fisiologia d a Fertilização

A resposta eléctrica à fertilização, já conhecida em muitos animais só

recentemente foi descrita nos malacostraca (Goudeau e Goudeau, 1986), evidenciando
o potencial de fertilização, que consiste numa hiperpolarização constante da membrana
do ovócito, desta vez desencadeada pelo espermatozóide. Novamente, é através de uma
permeabilidade selectiva ao K (antes da fertilização era para o Cl ), promovida por
1+

um aumento do Ca livre intracelular, que é criada uma hiperpolarização no ovócito e

se inicia a segunda reiniciação meiótica dos ovócitos bloqueados em metafase I.
Comparando o caso anterior com a resposta eléctrica dos ovócitos que não
requerem fertilização para a sua activação, e que passa também por uma
hiperpolarização com aumento interno do K+, poderemos supor a existência de duas
estratégias diferentes de fertilização sendo a primeira típica dos décapodes reptantia,
com uma fecundação interna, e esta última dos natantia com fecundação externa.

35
Introdução

Reacção Cortical

Embora este fenómeno, à semelhança da activação, possa ser iniciado com o

contacto com a água do mar, a reacção cortical é uma resposta do ovócito em
hiperpolarização depois da fertilização.

Nos peneídeos, a reacção cortical apresenta alguns aspectos peculiares como a

dimensão dos bastonetes corticais (40 micra de comprimento para um diâmetro do ovo
de cerca de 270 micra), a sua rápida expulsão e dissipação após contacto com a água do
mar e a diminuição do volume do ovo após esta reacção (Meusy e Pay en, 1988). Os
bastonetes, situados perpendicularmente à superfície em criptas da membrana
plasmática e separados do meio externo por um fino revestimento que envolve todo o
ovo (camada vitelina), são compostos de estruturas fibrilares compactadas. A medida
que os bastonetes corticais são expulsos na água do mar, forma-se uma coroa à volta do
ovo que rapidamente se dissipa e associada às criptas aparece uma extensa vesiculação
membranar que rodeia o ovo formando finalmente uma camada homogénea de geleia.

Controlo Hormonal do Processo Reprodutivo

O controlo hormonal da reprodução de crustáceos (ovógenese/vitelogénese) foi

detalhadamente revisto, entre outros, por Adiyodi e Adiyodi (1970), Meusy e Payen
(1988), Van Herp e Payen (1991), Quackenbush, (1991), Laufer e Landau, (1991) e
Hasegawa et ai, (1993).

Controlo do Início da Ovogénese e Previtelogénese

Diferenciação do Ovócito

A diferenciação sexual é controlada nos machos pela glândula androgénica,

determinando o aparecimento dos testículos, em contraste com a auto-diferenciação do
ovário na ausência da hormona androgénica (Adiyodi e Adiyodi, 1970). Assim, a
diferenciação da gónada em ovário é um processo de auto-diferenciação (Meusy e
Payen, 1988; Van Herp e Payen, 1991), e contrariamente à espermatogénese, cuja
iniciação é regulada por neuro-hormonas do pedúnculo ocular através da glândula

36
 Introdução

androgénica (AG) (Hasegawa et ai, 1993), a iniciação da ovogénese parece não ser
controlada por qualquer neuro-hormona (Meusy e Payen, 1988).

Manutenção da Zona Germinaiiva

A hormona androgénica (AH) para além de necessária para a manutenção da

zona germinativa (Hasegawa et ai, 1993) e para o desenrolar da espermatogénese,
determina o desenvolvimento das características sexuais secundárias (mesmo
comportamentais), a diferenciação dos testículos (para a qual é também essencial a
hormona da muda - MH) e o primórdio do dueto espermático (Adiyodi e Adiyodi,
1970; Fingerman, 1987; Meusy e Payen, 1988). Em contraste, nas fêmeas a
manutenção da zona germinativa do ovário não necessita da presença de qualquer
hormona (Meusy e Payen, 1988; Van Herp e Payen, 1991).

Crescimento do Ovócito até à Puberdade

O aumento do número de mitoses nas ovogónias e o número de ovócitos que

entram em profase meiótica parece ser controlada por factores neuro-hormonais (Van
Herp e Payen, 1991).

A hormona da muda (MH) parece ser necessária, particularmente nas fases pre-
pubertals, para a multiplicação mitótica nas gónadas (Adiyodi e Adiyodi, 1970), ainda
que os níveis envolvidos sejam diminutos (Meusy e Payen, 1988).

Os eedisteróides parecem ser assim essenciais para as fases iniciais do

desenvolvimento da gónada, especificamente nas mitoses das ovogónias e no
crescimento previtelogénico (Meusy e Payen, 1988). No entanto, o efeito destas
hormonas sobre a gónada, poderá ser apenas parte do efeito geral, em todos os tecidos
organizados (Adiyodi e Adiyodi, 1970).

Controlo da Vitelogénese

Controlo por Inibição

Hormona Inibidora da Vitelogénese (VIH) e Modo de Acção

Não sendo claro até ao momento, se constituem um conjunto complexo de

hormonas que interactuam em conjunto na vitelogénese, ou se hormonas de forma
isolada são responsáveis pelo processo, o fotoperíodo tem sido apontado como o

37
Introdução

estímulo externo que desencadeia a redução da hormona inibidora da gónada, GIH,

permitindo a expressão da hormona estimuladora do ovário, VSH, promovendo esta a
vitelogénese (Ogle, 1992). A hormona inibidora da gónada (GIH), proveniente da
glândula do seio, não é especifica de sexo nem de espécie, é termoestável e tem um
peso molecular entre 2000 e 5000 daltons (Fingerman, 1987). Recentemente, foi
isolada uma hormona inibidora da vitelogénese (VIH) na lagosta Homarus americanus,
que corresponde a um péptido de 9.135 Da e determinada a sua estrutura primária,
tendo sido reveladas algumas analogias com a hormona inibidora da muda (MIH) e a
hormona hiperglicemiante dos crustáceos (CHH) (Soyez et ai, 1991 in Hasegawa et
ai, 1993).

Figura 9. Esquema do controlo da ovogénese nas fêmeas de crustáceos (Van Herp e

Payen, 1991)

Uma vez estabelecida que a hormona inibidora da gónada (GIH) actua

principalmente na vitelogénese, a designação de hormona inibidora da vitelogénese
(VIH) tem sido preferencialmente usada por vários autores (Meusy e Payen, 1988).

O efeito inibidor da GIH nos testículos é indirectamente mediado através da

glândula androgénica (AG). A hormona estimuladora da gónada (GSH) pode estimular
a actividade da AG. Nos animais hermafroditas protândricos, o normal funcionamento

38
 Introdução

da AG parece depender de um nível óptimo de concentração da hormona GIH, e a sua

manutenção poderá ser dependente da GSH: a atrofia da AG, no final da fase em que o
animal é macho, está provavelmente relacionada com o distúrbio na relação GIH/GSH
(Adiyodi e Adiyodi, 1970).

A hormona inibidora da vitelogénese (VIH) pode exercer o seu controlo

directamente na síntese de vitelogenina (Hasegawa et ai, 1993), ou na sua entrada no
ovócito por endocitose (Van Herp e Payen, 1991; Hasegawa et ai, 1993). Neste caso
competirá com uma maior afinidade para os já referidos receptores na membrana do
ovócito (Meusy e Payen, 1988).

A inibição da vitelogénese secundária pela neuro-secreção do protocérebro e

possivelmente do gânglio torácico (VIH), poderá ainda resultar duma inibição da
actividade do tecido folicular secundário (Payen, 1980).

Antagonismo e Sinergismo entre a Hormona Inibidora da Muda (MIH) e a Hormona

Inibidora da Gónada (GIH)

Os vários exemplos de sincronismo entre o ciclo da muda e a reprodução,

sugerem a possibilidade de que os mecanismos hormonais neles envolvidos sejam os
mesmos (em que a MIH e a GIH representam a mesma hormona ou "princípio inibidor
do crescimento") ou que, sendo diferentes, actuam sinergeticamente (Adiyodi e
Adiyodi, 1970). De facto, o ciclo da muda é mais longo durante a época reprodutiva do
que durante a época de repouso, uma vez que a vitelogénese prolonga o ciclo (Meusy e
Payen, 1988).

Entre os décapodes, podem ser distinguidos dois tipos de ciclo de muda: um

denominado "diecdísico", caracterizado pela existência de várias mudas ao longo do
ano ou de uma época e no qual a fase de intermuda, C4, é muito curta, e o outro
"anecdísico", no qual a muda é anual e logo com um período de intermuda bastante
mais longo. Alguns décapodes cessam, de forma permanente, o ciclo de muda a partir
de um determinado estado adulto - anecdísico terminal ou permanente (estádio C4 T).
A continuação do processo reprodutivo nestas espécies em C4 T, ou de várias desovas
durante a mesma intermuda que é nesse caso prolongada, constituiem um forte
argumento para a distinção das duas hormonas, as quais podem, consoante a fase do
ciclo da muda, agir antagónica ou sinergeticamente. O sinergismo aparente da MIH e

39
Introdução

da GIH, característico durante a pós-muda, é transformado num antagonismo durante a

intermuda, dada a necessária mobilização das reservas metabólicas para o ovário, que
se sobrepõe temporariamente ao crescimento tecidular, (figura 10). De facto, um
elevado nível de MIH é essencial para a reprodução, inibindo o funcionamento do
órgão Y. Nos décapodes, as células p do órgão X, sob a influência de diferentes sinais,
poderão dar origem à MIH ou à GIH, hormonas estas que estarão quimicamente
relacionadas. Considerando o crescimento dos ovócitos em duas fases, em que na
primeira o ovócito cresce até ser capaz de acumular o vitelo e na segunda o vitelo é
depositado, o controlo por inibição da GIH parece exercer-se apenas na segunda fase,
sendo a primeira controlada positivamente pela hormona da muda (MH) (Adiyodi e
Adiyodi, 1970). Deste modo, os baixos níveis de 20- hidroxiecdisona observados no
início do ciclo da muda, poderão sincronizar a vitelogénese secundária e o ciclo da
muda(Payen, 1980).

Em conclusão, o crescimento somático e a reprodução, como processos

inseparáveis e integrados, necessitam de um mecanismo de controlo estreitamente
interligado: o desenvolvimento da gónada é possível através de uma transformação de
sinergismo entre a MIH e a GIH, como acontece na pós-muda, para um antagonismo
durante a intermuda e que possibilita o desenrolar do processo reprodutivo. A muda é
desencadeada quando os níveis das hormonas MIH e GSH são baixos e os níveis das
hormonas GIH e MH são elevados; por outro lado, o processo reprodutivo é iniciado
quando os níveis das hormonas MIH e GSH são elevados e os níveis das hormonas
GIH e MH são baixos. Nos animais ablacionados, a muda acontece se a actividade da
hormona GSH estiver suprimida pelo sistema nervoso central (SNC) ou/e pela MH, e a
reprodução pode ocorrer se a GSH, por estimulação do SNC, suprimir a acção da MH
(Adiyodi e Adiyodi, 1970).

40
 Introdução

,.•—•—•—•—

o
s

— • — • — • — • — • — •—•—• ^.^
PÓS-MUDA INTERMUDA PRÉ-MUDA

FASES DO CICLO DA MUDA

Figura 10. Gráfico simplificado sobre as variações das hormonas MIH, GIH, MH, GSH
ao longo do ciclo da muda durante a fase reprodutiva (Adiyodi e Adiyodi,
1970).

Controlo por Estimulação

Hormona Estimuladora da Gónada (GSH) ou Hormona Estimuladora da

Vitelogénese (VSH)

Se é certo que nos crustáceos, os principais factores conhecidos do controlo da

reprodução se traduzem por uma acção de inibição, foi desde logo pressuposto um
mecanismo antagónico, por estimulação, o qual explicaria diferentes respostas na
ausência dos factores inibidores.

Sob a influência de neuro-hormonas reprodutivas é iniciada, antes mesmo da

fase de intermuda, a síntese selectiva e acumulação na hemolinfa de lipoproteínas
específicas das fêmeas utilizadas durante a vitelogénese. O gânglio torácico e o cérebro
parecem ser a fonte de uma hormona de estimulação da gónada (GSH), que não é
específica nem de sexo nem de espécie (Adiyodi e Adiyodi, 1970). Dado que, actua nas
fêmeas a nível da vitelogénese, esta hormona é muitas vezes denominada de hormona
estimuladora da vitelogénese (VSH). A hormona estimuladora da vitelogénese (VSH),
um neuropéptido antagonista da hormona inibidora da vitelogénese (VIH), é

41
Introdução

responsável pela estimulação da incorporação de vitelo e tem um efeito positivo na

síntese proteica no ovário (Van Herp e Payen, 1991).

A presença de uma hormona estimuladora da vitelogénese, que deverá ter ainda

um papel na inibição da muda, parece explicar a situação dos décapodes aos quais lhes
foi retirado o pedúnculo ocular e que manifestam, por um lado, uma vitelogénese
precoce e por outro, uma ausência de resposta do órgão Y a qual sem a fonte de MIH
dos extirpados pedúnculos, pressupõe a existência de outro mecanismo de inibição.
Desta forma, a acção da GSH (VSH) parece ser dupla, promovendo o crescimento do
ovócito e inibindo a actividade do órgão Y de uma forma directa, ou então
indirectamente aumentando a MIH e/ou diminuindo o nível de GIH (VIH).

Nos machos, a hormona GSH pode estimular a actividade da AG (Adiyodi e

Adiyodi, 1970).

Hormona Ovárica Estimuladora da Vitelogenina (VSOH)

Uma hormona ovárica estimuladora da vitelogenina (VSOH), secretada pelas

células foliculares secundárias poderá, a exemplo do que acontece nos anfípodes
(Payen, 1980), contribuir para a estimulação da síntese de vitelogenina nos crustáceos
décapodes (Charniaux-Cotton, 1980; Hasegawa et ai, 1993). A sua natureza química é
provavelmente um esteróide (Van Herp e Payen, 1991) com uma função semelhante ao
17(3-estradiol nos vertebrados ovíparos (Meusy e Payen, 1988).

Ecdisteróides

Para além da estimulação da muda, tem sido demonstrado que os ecdisteróides

circulantes podem ter um papel no endurecimento da carapaça, nas modificações de
cor, na regeneração e na maturação da gónada (Adiyodi e Adiyodi, 1970), assim como
um papel na estimulação do ovário, na síntese proteica e na produção de vitelogenina
(Fingerman, 1987; Van Herp e Payen, 1991; Hasegawa et ai, 1993). Finalmente a
entrada da vitelogenina no ovócito parece ser também controlada pelos ecdisteróides
(Van Herp e Payen, 1991).

42
 Introdução

A síntese de vitelogenina, que no crustáceo Orchestia gammarela, tem lugar no

tecido adiposo sub-epidérmico (Junera e Croisille, 1980), é iniciada com uma taxa
baixa de 20-OH-Ecdisona e parece ser mantida também com um nível baixo, mas
suficiente, desta hormona (Charniaux-Cotton, 1980; Payen, 1980).

Não obstante vários autores terem demonstrado que não é possível a

vitelogénese em animais aos quais foram retirados os órgãos Y (produtores de
ecdisteroides), continua difícil de definir a relação entre a hormona activa 20-OH-
ecdisona e a vitelogénese não havendo ainda hoje provas da sua acção directa na
síntese de vitelogenina ou na vitelogénese, nem tão pouco da função e destino dos
ecdisteroides (especialmente a ponasterona A) acumulados no ovário no fim da
vitelogénese (Meusy e Payen, 1988). Uma das hipóteses poderá ser a sua utilização
pelo embrião para a coordenação de vários processos do seu desenvolvimento (Chang,
1991).

O papel dos ecdisteroides na reprodução parece ter sido encontrado como o de

estímulo exacto para a reiniciação meiótica na maturação (Lanot e Clédon, 1989). No
capítulo 4 será apresentada e discutida, de forma mais completa, a possível intervenção
dos ecdisteroides na reprodução dos crustáceos.

Hormonas Esteróides Sexuais do Tipo de Vertebrados

De forma idêntica a vários péptidos originalmente descobertos em vertebrados e

posteriormente identificados em invertebrados (endorfinas como a metionina-
enquefalina e a leucina-enquefalina e outros opióides, seretonina, norepinefrina e
dopamina, somatostatina, vasopresina, gastrina/colecistoquinina, etc.), e devido
principalmente, à evolução de várias técnicas de identificação e quantificação
(cromatografia, radio e enzimoimunoensaio, imunocitoquímica), diversos esteróides
(progesterona, testosterona, estradiol, etc.) têm sido encontrados em vários
invertebrados, nomeadamente nos crustáceos.

Além dos esteróides, outras substâncias derivadas dos ácidos gordos, os

eicosanóides e especialmente as prostaglandinas, constituem um grupo de hormonas
autócrinas que têm sido encontradas em crustáceos e relacionadas com diversas
funções, tais como o transporte iónico através da brânquia, vitelogénese ou
comportamentos sexuais dos machos (Fingerman et ai, 1993).

43
Introdução

Juvenóides

Os órgãos mandibulares (MO) dão origem aos compostos terpenóides,

farnesoato de metilo e ácido farnesóico, compostos estes estruturalmente relacionados
com a hormona juvenil dos insectos. Embora a sua função nos crustáceos ainda não
esteja completamente estabelecida, nas fêmeas parece ter um papel estimulador do
desenvolvimento do ovário (revisões por Van Herp e Payen, 1991, Fingerman, 1987,
1992 e Borst et ai, 1987) e na promoção da vitelogénese, nomeadamente na produção
das substâncias vitelinas (Van Herp e Payen, 1991). Curiosamente, os órgãos
mandibulares, implicados na secreção dos chamados juvenóides (farnesoato de metilo),
contêm 17p-estradiol e progesterona (Couch et ai, 1987).

Hormona Androgénica

Foram várias as substâncias implicadas nas secreções desta glândula (de

natureza polipeptídica a factores lipídicos), não havendo no momento acordo quer
quanto à natureza química, quer quanto ao modo de secreção da hormona androgénica,
a qual no entanto, não parece ser específica de espécie (Adiyodi e Adiyodi, 1970;
Fingerman, 1987, 1992; Payen, 1980).

Como já foi referido, esta hormona controla a diferenciação dos testículos, o

primórdio do dueto espermático, a manutenção do tecido germinativo e consequente
espermatogénese, assim como determina as características sexuais secundárias e
comportamentais (Adiyodi e Adiyodi, 1970; Fingerman, 1987).

O efeito inibidor da hormona GIH nos testículos é indirectamente mediada

através da glândula androgénica (AG). A hormona estimuladora da gónada (GSH) pode
estimular a actividade da AG (Adiyodi e Adiyodi, 1970).

A hormona androgénica, embora evidentemente não possa ser considerada um

factor normal para o controlo da vitelogénese, quando administrada em fêmeas produz
um efeito inibidor (directa ou indirectamente) na síntese da vitelogenina (Meusy e
Payen, 1988).

44
 Introdução

Factores dos Machos Estimuladores do Ovário e Feromonas Sexuais

Sinais de natureza diversa (química, visual, acústica, olfactória e táctil) são

exibidos pelos crustáceos, de forma a serem reconhecidos e atraídos os possíveis
parceiros sexuais resultando na cópula, sem a qual todos os processos do
desenvolvimento reprodutivo até aqui descritos não teriam qualquer sentido. Várias
feromonas, enquanto substâncias libertadas por um organismo que influencia o
comportamento de outros organismos da mesma espécie, foram já detectadas nos
crustáceos e induzem comportamentos pré-copulatórios nos machos (revisão por
Dunham, 1978).

Constituindo as condições climáticas locais um factor restritivo que condiciona

e limita a época reprodutiva, o período de cópula é ainda mais restrito, sendo
determinado pela receptividade das fêmeas e respectiva resposta comportamental dos
machos, ambas dependendo do respectivo estado fisiológico (muda e desenvolvimento
ovárico). Enquanto em algumas espécies as fêmeas são impregnadas (deposição do
espermatófero) apenas imediatamente após a muda, noutras isso acontece durante a
intermuda, com a carapaça rígida (Meusy e Payen, 1988). É interessante realçar que,
normalmente, o fluído da muda, composto por aminoácidos, enzimas e outros
componentes orgânicos derivados da digestão parcial da velha carapaça, constitui um
atractivo e estimulante do apetite nestes animais (Chang, 1991), e daí que na época
reprodutora seja fundamental, para as fêmeas, a existência de uma "mensagem" que
promova um comportamento protector pela parte de um macho.

Neste tipo de comunicação química, as poucas evidências disponíveis dizem

respeito à sua origem (nas glândulas antenais) e à sua detecção, por receptores
antenulares. Não só ainda não foi identificada nenhuma substância particular com
função de feromona, como também as evidências na implicação dos ecdisteróides
como feromonas são inconclusivas (Dunham, 1978; Meusy e Payen, 1988).

Várias aminas biogénicas, como a serotonina (5-HT), conhecidas pelo seu papel
nos mecanismos de libertação de várias neuro-hormonas (Fingerman, 1987; 1992),
parecem envolvidas em respostas comportamentais específicas que precedem a cópula
(Laufer e Landau, 1991).

Foi ainda verificada, ainda que de forma indirecta, a existência de uma

feromona, nos testículos e canais deferentes de uma espécie de camarão de água doce,

45
Introdução

que estimula o ovário (Takayanagi et ai., 1986, in Van Herp e Payen, 1991), assim
como a presença dos machos de um isópode parece acelerar o desenvolvimento do
ovário nas fêmeas (Jassen et ai, 1982 in Meusy e Payen, 1988).

Factores Ambientais (Luz e Temperatura)

De uma forma geral, o estímulo para o início da fase reprodutiva é o aumento

da duração do dia (Laubier, 1987: Penaeus japonicus e P. kerathurus; Ogle, 1992: P.
vannamei). No entanto, a temperatura parece ter também um efeito na reprodução,
ainda que de forma indirecta (Meusy e Payen, 1988). Embora não haja dúvidas de que
os factores ambientais actuam via hormona inibidora da vitelogénese (VIH),
possivelmente em conjunto com outras neuro-hormonas, a relação entre os receptores
dos factores ambientais e o sistema neuro-secretor continua por estabelecer.

Controlo da Maturação e Ovulação

Embora a existência de um controlo hormonal específico para o final da

vitelogénese ou para a maturação não tenha ainda sido demonstrada (Charniaux-
Cotton, 1980; Payen, 1980), os últimos trabalhos sobre o papel dos ecdisteróides na
reprodução indicam uma acção específica destas hormonas na primeira reiniciação
meiótica (profase I) (Lanot e Clédon, 1989), característica principal da maturação do
ovócito.

Papel da Nutrição na Reprodução

A importância da nutrição, como factor na maturação ovárica dos crustáceos,

sejam selvagens ou cultivados, está detalhadamente avaliada na recente revisão de
Harrison (1990). Este autor revela a inexistência de dietas completas adequadas às
necessidades da reprodução nestes animais, e daí o actual recorrer à suplementação
com alimentos naturais, frescos ou por vezes congelados (lulas, bivalves, poliquetas,
etc.), no sentido de proporcionar uma dieta adequada aos progenitores e promover a
maturação.

46
 Introdução

Este aspecto será abordado em pormenor no capítulo 6, no qual são

apresentados resultados do teor hormonal (ecdisteróides e esteróides sexuais) em
poliquetas, utilizadas em aquacultura para provocar a desova de crustáceos peneídeos.

Objectivos da Linha de Investigação

De uma forma geral, a investigação sobre a reprodução nas fêmeas de

crustáceos reparte-se em cinco áreas principais (Meusy e Payen, 1988):

• 1. Mecanismo da diferenciação do ovário.

• 2. Sequência morfológica das etapas que conduzem e constituem a vitelogénese, a

maturação do ovócito e a sua activação.

• 3. Regulação endócrina do início, manutenção e finalização das diferentes etapas da

ovogénese.

• 4. Influência dos factores externos como o fotoperíodo, temperatura, concentração

iónica da água do mar na gametogénese.

• 5. Resposta específica da superfície do ovócito ao espermatozóide que conduz à

fertilização.

Neste trabalho foram focados principalmente dois destes aspectos:

A) Sequência morfológica das etapas que conduzem e constituem a vitelogénese, a

maturação do ovócito e a sua activação:

Procedemos por um lado, ao estudo do desenvolvimento do ovário durante a

época reprodutiva, através da microscopia óptica, com o objectivo do estabelecimento
das distintas fases da vitelogénese (capítulo 1), e por outro, através da microscopia
electrónica de transmissão, ao estudo ultrastrutural da ovogénese e foliculogénese, com
particular interesse pela origem e acumulação do vitelo, pela formação das
especializações corticais (criptas e vesículas corticais) que na activação do ovócito
originam o invólucro de fertilização (capítulo 2).

47
Introdução

B) Regulação endócrina do início, manutenção e finalização das diferentes etapas da

ovogénese:

Relativamente a esta importante área de investigação, que nos crustáceos

apresenta enormes lacunas, a atenção foi centrada num tipo de hormonas, os esteróides.
Estes, quer através do frequente paralelismo com os dados já estabelecidos nos insectos
(ecdisteróides) (capítulo 4), quer por analogia com o seu papel nos vertebrados
(esteróides sexuais do tipo de vertebrados) (capítulo 5), parecem estar envolvidos na
reprodução. Com o objectivo de quantificar estes dois tipos de hormonas, em pequenas
quantidades de amostra (estudos individuais e não em "pools"), foi desenvolvida uma
técnica de extração, purificação e separação simultânea de ecdisteróides e esteróides
sexuais (capítulo 3).

Finalmente, e considerando a nutrição como um factor externo que influencia a

reprodução, são apresentados resultados preliminares da possível transferência de
hormonas esteróides via alimentação, uma vez que estas foram quantificadas em níveis
consideráveis em poliquetas (Nereis diversicolor e Americonuphis magna). Estas
poliquetas são frequentemente utilizadas na dieta de fêmeas em cativeiro, com o
resultado final de uma rápida indução da maturação ovárica (capítulo 6).

Constitui um objectivo deste trabalho o estabelecimento de parâmetros normais

de evolução de dois aspectos, sempre intimamente ligados, morfologia/função, do
ovário, ao longo do seu desenvolvimento. Para tal foram utilizandos animais selvagens
capturados no meio natural e de importância económica nas nossas pescas (a espécie
autóctone Penaeus kerathurus) assim como de outra espécie utilizada em aquacultura
(Penaeus japonicus) e cujos exemplares de estudo foram capturados em tanques de
terra batida utilizados para a sua produção (Material e Métodos). Pensamos que desta
forma, os resultados de futuros trabalhos utilizando uma metodologia mais interventiva
(manipulações de factores externos e internos), poderão ser comparados com os
presentemente obtidos em situações o mais próximas da normalidade dos processos no
ambiente natural.

Realçamos o interesse, a nosso ver, do estudo dos fenómenos primordiais que

caracterizam a ovógenese e a sua regulação nestes animais não apenas pela importância
no aspecto de conhecimentos básicos e de investigação fundamental mas
principalmente tendo em vista a sua aplicação em aquacultura. De facto, sem os
conhecimentos que permitam o completo controlo da reprodução em cativeiro dos

48
 Introdução

crustáceos de interesse económico (principalmente os décapodes) a sua produção

industrial será sempre limitada.

Em resumo, os estudos sobre o controlo neuro-endócrino da reprodução de

crustáceos são importantes em nosso entender, quer pelo interesse fundamental dos
mecanismos envolvidos quer principalmente pela sua aplicação na produção em
aquacultura destes organismos de elevado interesse económico. Dada a especificidade
entre diferentes grupos sistemáticos e mesmo entre espécies, os estudos sobre a
reprodução nos crustáceos, nomeadamente do perfil das hormonas intervenientes neste
processo, nos tecidos produtores, na hemolinfa e nos tecidos-alvo, em diferentes ciclos
biológicos (crescimento e reprodução), terá vantagens na escolha, para modelo
experimental, de espécies com potencial para a aquacultura ou de espécies autóctones
de importância pesqueira.

49
Material Biológico
 Material Biológico

Espécies estudadas: Penaeus japonic us e P. kerathurus

As espécies escolhidas para este estudo, foram os peneídeos Penaeus japonicus e

P. kerathurus, cuja posição sistemática é indicada na Tabela 2. A ordem decápoda é
ainda dividida, segundo Zariquiey (1968), em duas super-secções, Natantia e Reptantia,
pertencendo a família dos Penaeidae aos Natantia (Lumare, 1988).

Tabela 2. Classificação sistemática das espécies estudadas, segundo Waterman e Chace, 1960
(/«Parker, 1992).

Phylum Arthropoda

(Sub-phyla) Classe Crustacea

Sub-classe Malacostraca

Ordem Decápoda

Sub-ordem Dendrobranchiata

Superfamília Penaeoidea

Família Penaeidae

Género Penaeus

Espécie Penaeus japonicus

P. kerathurus

Penaeus japonicus Bate, 1888

Esta espécie foi escolhida como material experimental dada a sua utilização em
aquacultura. É uma espécie de ampla distribuição geográfica, para a qual conta com a
sua resistência a baixas temperaturas e adaptação a um amplo intervalo de salinidade (5-

53
Material Biológico

50%o). Originária do Japão, esta espécie pode ser encontrada hoje em dia no
Mediterrâneo, tendo passado possivelmente o Canal do Suez. Vive nas zonas costeiras e
estuarinas, em fundos arenosos, é carnivora e tem uma longevidade média de cerca de 2
anos. Possui uma carapaça lisa e brilhante. Apresenta dez listas castanhas ao longo do
cefalotórax e do abdómen. O telson é azul, amarelo e castanho. O cefalotórax termina
num forte rostro com 8 a 10 dentes dorsais e 1 a 2 no bordo ventral.

Na fêmea, o télico é fechado e de forma tubular. No macho, o petasma apresenta

no vértice dos seus lobos medianos protuberâncias bem desenvolvidas. A carena rostral
divide-se em duas carenas pós-rostrais com um marcado sulco pós-rostral, que não
atinge completamente a margem posterior da carapaça. O abdómen é dorsalmente
carenado desde a metade superior do quarto segmento até ao fim do sexto segmento. O
telson tem um sulco mediano e apresenta três pares de espinhas laterais.

Penaeus kerathurus (Forskal, 1775)

Espécie autóctone do Mediterrâneo e do Atlântico Oriental, desde Portugal a

Angola, vive nas zonas costeiras, em fundos arenosos, entre 5 e 50 metros. A sua
morfologia é muito semelhante à do P. japonicus. O rostro, robusto, apresenta 9 a 11
dentes dorsais e 1 ventral.

Nesta espécie, e constituindo um elemento que permite a distinção entre as duas

espécies, a carena cervical aproxima-se muito à carena rostral. O duplo sulco pós-
rostral, o qual atinge a margem posterior da carapaça, também constitui um elemento
diferenciador da espécie P. japonicus. A espécie P. kerathurus possui também bandas
transversais mais escuras e colorações vivas nas margens posteriores dos urópodes e no
telson. Na fêmea, o télico é fechado e formado por duas peças.

54
 Material Biológico

Material biológico. Processamento dos tecidos

Neste trabalho foram utilizadas apenas fêmeas das espécies Penaeus japonicus e
P. kerathurus. Os espécimens de P. japonicus, provenientes quer de uma empresa do sul
de Espanha, quer da empresa algarvia Eurodáqua, foram transportados vivos até ao
laboratório. Numa fase inicial este transporte foi efectuado em sacos de plástico com
água do mar, dentro de malas isotérmicas, nas quais era colocada previamente uma
mistura de gelo e serrim (ou aparas de madeira). A água do mar, contendo os animais,
foi continuamente oxigenada através de pedras difusoras ligadas a uma garrafa de ar
comprimido (ou mesmo oxigénio clínico).

Numa fase posterior foram tentados com êxito transportes "a seco". Os animais
foram colocados em caixas de "esferovite", lado a lado, e em várias camadas alternadas
com uma mistura de gelo, sal e serrim (com o objectivo de atrasar a descongelação).
Desta forma, o transporte foi facilitado (ausência de água do mar, garrafas de oxigénio,
tubos e pedras difusoras), assim como alguns riscos eliminados (em alguns transportes
faltou oxigenação ou a água aqueceu demais, ocasionando mortalidades de quase 100%)
e, como consequência, a sobrevivência foi superior. No entanto, e salvo alguns
transportes de animais em água mal sucedidos, a mortalidade foi sempre inferior a 10%.

Em Portugal, a espécie autóctone P. kerathurus é pescada na costa algarvia

sobretudo através da pesca artesanal (barcos de pequeno porte). No entanto, a sua pesca
está proibida durante a época de reprodução. Daí termos optado por uma solução
alternativa: a aquisição desta espécie em Espanha, país no qual não há época de defeso
para estes animais. Os exemplares de fêmeas necessárias ao nosso trabalho foram
adquiridos através de uma colaboração com a equipa do Dr. José Maria San Feliú do
Instituto de Acuicultura de Torre la Sal, Castellón, Espanha.

A pesca de arrasto ao camarão só é iniciada, depois de haver indícios de que os

animais estão nos bancos de pesca tradicionais, a caminho da sua migração em direcção

55
Material Biológico

às zonas estuarinas para a desova. Durante a pesca, que é nocturna, à medida que eram
levantadas as redes os animais foram retirados das malhas e colocados em bacias com
água do mar. Só assim foi possível obter animais vivos até à sua recolha (normalmente
cerca das 9 horas da manhã) na lota. Os animais foram transportados até ao laboratório
do Instituto de Acuicultura de Torre la Sal (que dista cerca de 15 km da lota de
Castellón) em tanques de plástico com água do mar com arejamento.

No laboratório os animais de ambas as espécies foram recolhidos um a um,

envolvidos em papel de estanho e colocados em gelo durante 2 a 3 minutos, de forma a
reduzir a sua actividade.

Em seguida foi retirada uma amostra de hemolinfa: utilizando uma seringa

descartável de 2.5 cc, com cerca de 400 \i\ de NEM (N-Etilmaleimida, 0.2 M em 3% de
NaCl) como anticoagulante, a hemolinfa foi retirada quer do coração, localizado
ventralmente à cutícula dorsal cefalotoráxica e dorso-posteriormente ao hepatopâncreas,
quer da aorta ventral abdominal. Esta última opção, mostrou-se mais eficaz dado a
localização do hepatopâncreas ventralmente ao coração com riscos de contaminação da
hemolinfa e o facto de que nos animais cuja gónada se encontrava bem desenvolvida o
ovário cobrir completamente o coração dificultando o procedimento. As amostras de
hemolinfa, com um volume de cerca de 1000 a 1500 ul, foram guardadas em tubos
ependorfes e congeladas imediatamente.

De seguida, os animais foram medidos: comprimento total (do início do rostro

ao final do telson), comprimento do cefalotórax (do início do rostro ao bordo dorsal
posterior do cefalotórax), comprimento total pós-orbitário (da espinha pós-orbital ao
final do telson) e comprimento pós-orbitário do cefalotórax (da espinha pós-orbital ao
bordo dorsal posterior do cefalotórax). As medidas pós-orbitárias são utilizadas quando
os rostra estão partidos, situação frequente nos animais pescados por redes de arrasto.

Depois de medidos, os animais foram pesados. Em seguida foram retirados

vários órgãos que depois de secos com papel absorvente foram pesados. Dos ovários,

56
 Material Biológico

depois de pesados, foi retirada uma pequena porção para histologia óptica e em alguns
casos outra mais pequena para microscopia electrónica.

Os órgãos assim obtidos foram congelados e posteriormente liofilizados. As

amostras liofilizadas foram guardadas em frascos de vidro num excicador até serem
analizadas.

57
Parte I - Morfologia
Identificação das Fases de Desenvolvimento do Ovário

das Espécies Penaeus japonicus e P. kerathurus

 Fases Vitelogénicas

Introdução

O aparelho reprodutivo da fêmea de um crustáceo decápode típico consiste num

par de ovários e seus oviductos associados, terminando num par de gonadoporos
situados na base do terceiro par de pereiópodes. Os crustáceos peneídeos possuem uma
estrutura especializada para a recepção de esperma, o télico. Esta modificação externa
das placas esternais torácicas posteriores, que em algumas espécies é aberta
ventralmente, tem como função receber o espermatófero (estrutura para transporte e
armazenagem de esperma). Noutras espécies o télico é fechado e cobre um espaço, o
receptáculo seminal ou espermateca, no qual o esperma é armazenado desde a cópula
até à fecundação (Krol et ai, 1992).

Nos décapodes, os ovários situam-se dorsalmente ao intestino. Nos décapodes

peneídeos, o ovário extende-se desde o cefalotórax ao longo de todo o abdómen até ao
telso. Nestas espécies o ovário está parcialmente fundido na região cefalotorácica e
consiste num par de extensões (cornos) antero-laterais e vários lóbulos laterais (Talbot,
1981a). Um par de lóbulos extende-se ao longo do todo o comprimento do abdómen
(ver figura 5c da Introdução Geral).

Uma cápsula (ou parede) de uma ou mais camadas de tecido conjuntivo envolve
o ovário dos décapodes (nos lagostins de água doce dos géneros Cambarus sp.,
Orconectes sp. e Procambarus sp.: Beams e Kessel, 1963; Astacus astacus e A.
leptodactylus: Zerbib, 1979; Procambarus clarkii: Kulkarni et ai, 1991; na lagosta
Homarus americanus: Talbot, 1981a; no caranguejo Ranina ranina: Minagawa et ai,
1993). Nesta parede podem ser também observados vasos, seios hemais e hemócitos
livres (Talbot, 1981a). Muito embora não exista geralmente nos crustáceos, de uma
forma geral, uma camada de tecido muscular a envolver o ovário (revisão de Krol et ai,
1992) na lagosta Homarus americanus, a parede do ovário possui células musculares
não estriadas, mas contendo microtúbulos, que poderão ter como função a expulsão dos
ovócitos maduros para o lúmen durante a desova, ou a circulação da hemolinfa através

63
Capítulo 1

dos vasos e seios hemais do ovário (Talbot, 1981a). Encerrado por esta parede encontra-
se o epitélio germinativo do qual se originam as oogónias e as células foliculares.

Na face luminal do ovário, junto a uma delgada lâmina basal, situa-se uma fina
camada de células epiteliais aplanadas que se projectam em direcção à parede. Estas
células epiteliais são contínuas (assim como lhes podem dar origem) com as células
foliculares que rodeiam o ovócito (Talbot, 1981a).

Nos peneídeos, o ovário é ainda separado por extensões de tecido conjuntivo em

sub-unidades - nódulos ou cistos - constituidos por células foliculares e germinais em
desenvolvimento. Entre estas sub-unidades de ovócitos rodeados de células foliculares
encontram-se vasos e seios hemais assim como hemócitos livres. No caso da lagosta
Homarus americanus esta divisão é produzida por extensões da parede do ovário
compostas por vasos e células musculares que se projectam na região folicular e se
inserem na parede e epitélio do folículo (Talbot, 1981a).

Na maior parte dos crustáceos décapodes, o epitélio germinal está situado

periférica ou centralmente no ovário. Esta camada germinal de oogónias que constitui a
zona de proliferação, pode ter diferentes localizações em diferentes espécies devido à
pressão exercida pelo crescimento dos ovócitos em desenvolvimento vitelogénico. A
localização periférica desta zona germinativa pode ser deslocada para uma posição
central no ovário duma fêmea adulta pelo crescimento e diferenciação dos ovócitos
(Charniaux-Cotton, 1980). As oogónias e os ovócitos previtelogénicos dos braquiúros
(caranguejos), situam-se na região central dos ovários e à medida que se diferenciam, os
ovócitos e as células foliculares que os rodeiam tomam uma localização mais periférica
(Libinia emarginata: Hinsch e Cone, 1969; Ranina ranina: Minagawa et ai, 1993). Na
lagosta, Homarus americanus, os folículos maduros situam-se junto à parede do ovário
(extendendo-se em direcção ao lúmen), adjacente a estes localizam-se os folículos de
desenvolvimento intermédio e os folículos mais pequenos junto ao lúmen (Talbot,
1981a).

As células foliculares, de origem mesodérmica, são as únicas células não-

germinativas dentro do limite das paredes do ovário. Com o desenrolar da vitelogénese

64
 Fases Vitelogénicas

e o crescimento dos ovócitos, as células foliculares deslocam-se do epitélio germinativo

para a zona de crescimento e reúnem-se finalmente na periferia de cada ovócito -
foliculogénese secundária (Favel, 1981). A vitelogénese secundária é iniciada com a
foliculogénese secundária (Charniaux-Cotton, 1980). Estas células, durante a
vitelogénese, tornam-se aplanadas e formam uma camada unicelular a rodear cada
ovócito (Rankin e Davis, 1990).

Ovogénese

Durante toda a vida reprodutiva da fêmea, grupos de oogónias secundárias são

produzidas por mitose na zona germinal onde são mantidas até que a desova ou uma
resposta sexual desencadeie a gametogénese.

Quando as oogónias deixam a zona germinativa entram imediatamente em

profase I da primeira méiose e evoluem desde oogónias imaturas, com grandes núcleos
redondos contendo cromatina granular, até ovócitos previtelogénicos com núcleos
centrais e com grandes nucleolus (Rankin e Davis, 1990). Assim, a divisão celular
interrompe-se no estádio de paquiteno da profase I e a actividade metabólica do ovócito
primário sobrepõe-se à actividade de divisão meiótica. Neste ponto ocorrem várias
modificações citoplasmáticas e nucleares, os ovócitos aumentam de tamanho e tomam a
sua posição final dentro do ovário - é a fase da ovogénese denominada de vitelogénese
e que consiste na acumulação e síntese de grandes quantidades de vitelo no ovócito.

Quando os ovócitos maduram ocorre a ovulação que é definida como a

separação entre o ovócito e as células (Yano, 1988; Chow et ai, 1993). Um
comportamento de pré-desova, uma natação persistente ao longo da coluna de água, que
é iniciada pela obscuridade, foi altamente correlacionada no decápode peneídeo,
Sicyonia ingentis, com a ovulação (Pillai et ai, 1988). Os ovócitos são ovulados no
início da fase de maturação e após a ovulação a divisão meiótica progride até à metafase
da primeira divisão de maturação (Yano, 1988). Na espécie Homarus americanus, a
ovulação parece ser iniciada pelo efeito da colagenase na fina lâmina basal de tecido
conjuntivo que rodeia as células foliculares (Talbot, 1981b).

65
Capítulo 1

A cisão da vesícula germinal (GBVD), que é iniciada na fase final da pré-

maturação e que continua até à última fase da maturação imediatamente antes da
desova, pode durar 5 a 11 horas, mas o tempo desde a ovulação até à metafase meiótica
e desova pode ser extremamente curto na espécie Penaeus japonicus (Yano, 1988). De
forma idêntica, na espécie Penaeus setiferus, a fase de cisão da vesícula germinal dura
menos de 12 horas e a ovulação pode ocorrer em poucos minutos ou mesmo simultânea
com a desova (Chow et ai, 1993).

A desova nas fêmeas do peneídeo Sicyonia ingentis, que apresentam um

comportamento de natação activa (dito de pré-desova) e com os oviductos de côr verde,
indicando ter ovulado e possuir ovócitos livres no oviducto, pode ser induzida através
da abertura, forçada fisicamente, de apenas um dos gonadoporos ("probing"), não
afectando esta manipulação a qualidade dos ovos nem a percentagem de fertilização
(Pillai et al, 1988).

Os ovócitos maduros que não são libertados na desova são reabsorvidos. No

camarão peneídeo Penaeus japonicus, em condições de cultivo em tanques, esta
reabsorção assim como a reparação do ovário ocorrem durante o processo de
rematuração que rapidamente se segue à desova, o qual compreende três fases (Yano,
1984): 1- absorção dos ovos maduros remanescentes e reparação do ovário,
2- aparecimento de ovócitos no estádio I de glóbulo de lípido, aumento do número e
rápido crescimento das células foliculares e 3- acumulação de grânulos de vitelo no
citoplasma dos ovócitos.

No caranguejo Ranina ranina os jovens ovócitos, junto ao parênquima iniciam o

seu crescimento após os ovócitos remanescentes da desova terem sido reabsorvidos,
processo que nesta espécie ocorre quer por autólise quer por acção de células foliculares
hipertróficas (Minagawa et ai, 1993).

No entanto, parece haver uma diferença, após a desova, nos ovários de animais
não manipulados e de animais aos quais foi ablacionado o pedúnculo ocular, técnica
usada na cultura de peneídeos para acelerar a maturação e desova (Tan-Fermin, 1991).
Nestes últimos são encontrados ovócitos em todos os estádios de maturação 2 horas

66
 Fases Vitelogénicas

após a desova, facto que pode ser explicado quer pela existência de um certo número de
ovócitos ainda não maduros quer pelo início de um novo ciclo de maturação antes do
anterior ter finalizado (Vougt et ai, 1989: Penaeus monodori). Estes resultados foram
confirmados, também em fêmeas de Penaeus monodon, selvagens não-manipuladas,
selvagens ablacionadas e de cultura, nas quais as ablacionadas a rematuração é
significativamente mais rápida e logo as sucessivas desovas mais frequentes mas com
menor número de ovos, não tendo sido encontradas diferenças no tipo e aparência entre
ovócitos nos mesmos estádios de desenvolvimento do ovário (Tan-Fermin, 1991).

Igualmente, não foi encontrada em fêmeas de Penaeus notialis, diferenças na

morfologia dos ovócitos maduros procedentes de desenvolvimento ovárico natural ou
induzido por ablação ocular, salvo uma maior regularidade na disposição das vesículas
corticais (Trujillo e Goméz, 1986).

Critérios de divisão do desenvolvimento do ovário

O desenvolvimento do ovário pode ser dividido numa fase proliferativa, na qual

as oogónias são produzidas continuamente na zona germinativa, e numa fase
diferenciativa que corresponde ao abandono da zona germinativa, dando lugar às
oogónias (bloqueadas na profase meiótica) e ao seu desenvolvimento desde um estádio
previtelogénico até à maturação (Charniaux-Cotton, 1980).

Meusy e Payen (1988) dividem a fase diferenciativa em quatro estádios:

1. previtelogénese, 2. vitelogénese, 3. crescimento do ovócito e 4. maturação.

Tan-Fermin e Pudera (1989), baseando-se em critérios qualitativos (histologia e

histoquímica) e quantitativos (morfometria) propuseram quatro estádios de maturação
do ovário no Penaeus monodon: previtelogénico (P), vitelogénico (V), bastonetes
corticais (C) e desova (S).

As classificações do estado de desenvolvimento ovárico, utilizando

características de escala macroscópica, como por exemplo, côr e tamanho do ovário

67
Capítulo 1

visto através da carapaça, tem tido uma importância fundamental, quer para a
aquacultura quer para a pesca. Relacionando o resultado de examinações microscópicas,
diâmetro médio dos ovócitos, índice gónado-somático e côr da gónada fresca logo após
a disseção, com o aspecto e côr do ovário através do exoesqueleto, Levi e Vacchi (1988)
proposeram uma divisão de I a IV para o desenvolvimento ovárico da espécie
Aristaeomorpha foliacea, um decápode peneido de grande importância económica na
pesca profissional. A distribuição de frequências de classes de diâmetros de ovócitos
encontrados em ovários, de fêmeas de Penaeus notialis, previamente classificados de I a
IV e a resultante bimodal, permitiu a Trujillo e Goméz (1986) encontrar o diâmetro
mínimo de 1 lOum para o ovócito maduro.

Numa revisão de 1980, Charniaux-Cotton descreve a ovógenese em seis fases:

1. Ovogónia; 2. Profase meiótica; 3. Previtelogénese; 4. Vitelogénese primária ou

endógena; 5. Vitelogénese secundária e 6. Maturação.

Utilizando a espécie Penaeus japonicus, Yano (1988) propôs a seguinte

classificação do desenvolvimento do ovário, tendo em conta os vários estádios de
desenvolvimento dos ovócitos, assim como das características das células foliculares
envolventes:

A) Ovários não desenvolvidos- Fase de multiplicação:

1. Estádio sináptico- formação dos característicos nucléolos em forma de meia-

lua.

B) Ovários no início de desenvolvimento- Fase de previtelogénese:

2. Estádio de cromatina nucleolar - aparecimento no núcleo de um nucléolo

redondo.

3. Estádio inicial perinucleolar - aumento de nucléolos no núcleo.

4. Estádio tardio perinucleolar - células foliculares envolvem o ovócito.

68
 Fases Vitelogénicas

C) Ovários em desenvolvimento- Fase de vitelogénese primária:

5. Estádio I de glóbulo lipídico - rápida expansão das células foliculares,

retração do núcleo e aparecimento de glóbulos lipídicos.

6. Estádio II de glóbulo lipídico - ligeiro achatamento das células foliculares e

re-expansão do retraído núcleo.

7. Estádio de ausência de vitelo (yolkless stage) - maior achatamento das células

foliculares, aparecimento de vesículas e continuação da expansão nuclear.

D) Ovários quase maduros- Fase de vitelogénese secundária:

8. Estádio de granulo de vitelo - acumulação de vesículas de vitelo e continuação

da expansão nuclear.

9. Estádio de pré-maturação - aparecimento e alongamento em forma de

bastonete das vesículas corticais, aplanamento das células foliculares,
retração e migração do núcleo.

E) Ovários maduros- Fase de maturação:

10. Estádio de maturação - ovulação e aparecimento da camada vitelina,

continuação da migração do núcleo e progressão da divisão meiótica até à
metafase da primeira divisão de maturação.

No caranguejo da espécie Ranina ranina a ovógenese foi também dividida, de

forma muito semelhante, em 5 fases subdivididas em 10 estádios, com base
fundamentalmente nas alterações no núcleo, grau de formação de vitelo e sua afinidade
a diferentes corantes (Minagawa et ai, 1993): I - Proliferação (1. oogónias), II -
previtelogénese (2. "bouquet "-cromatina em forma de "meia lua"; 3. cromatina
nucleolar inicial; 4. cromatina nucleolar tardia), III - vitelogénese primária (5. glóbulo
lipídico; 6. granulo de vitelo); IV - vitelogénese secundária (7. disco (platelet) de vitelo

69
Capítulo 1

primário; 8. disco de vitelo secundário; 9. prematuração) e V - maturação (10.

maturação).

No lagostim de água doce, Procambarus clarkii, foram caracterizadas 7 fases

morfologicamente distintas durante a ovogénese (Kulkarni et ai, 1991): 1. ovogonial, 2.
imaturo, 3. avitelogénico, 4. vitelogénico inicial, 5. vitelogénico intermédio, 6.
vitelogénico tardio, e 7. post-vitelogénico e em reabsorção.

O objectivo do nosso trabalho consistiu no estudo do desenvolvimento do ovário

de duas espécies de peneídeos (Penaeus japonicus e P. kerathurus) na época de
reprodução destes animais, daí que o estudo da ovogénese é particularmente centrado no
crescimento (vitelogénese) e maturação dos ovócitos. O estudo do desenvolvimento do
ovário através da histologia deste órgão tem como finalidade a identificação da fase
vitelogénica, de forma a ser relacionada com os níveis de várias hormonas ecdisteróides
e esteróides. Dada a relativa diversidade de critérios utilizados por vários autores
anteriormente descrita e consequentemente do número e significado das fases
vitelogénicas, estabelecemos e caracterizamos (comparativamante com os resultados de
outros autores) cinco fases vitelogénicas. Dos grupos assim formados foram
seleccionados para o estudo endocrinológico apenas os animais com características
muito semelhantes, quer relativamente ao principal critério que foi o desenvolvimento
dos ovócitos, quer ao seu tamanho/peso e consequentemente o seu indice gonado-
somático (peso do ovário/peso do animal x 100).

Material e Métodos

Segundo o material utilizado para a inclusão, foram desenvolvidas basicamente

duas técnicas histológicas para a microscopia óptica:

A - Blocos em parafina

B - Blocos em plástico

70
 Fases Vitelogénicas

A - Blocos em parafina

As amostras de ovário, para identificação da fase vitelogénica das fêmeas das

duas espécies estudadas, foram fixadas em Bouin ou DFA durante 24 horas.

Bouin

Solução saturada de Ácido Pícrico 15 cc

Formol 4 cc
Ácido Acético 1 cc

DFA (Davidson's A.F.A.)

Álcool Etilico 300 ml

Formol 220 "
Ácido Acético Glacial 115 "
Água Destilada 335 "

Depois de fixadas, as amostras foram desidratadas por uma série ascendente de

álcoois (álcool 75° - 1 hora; 90° - 30 minutos; 95° - 90 minutos e álcool absoluto- 90
minutos (onde foram efectuadas 2 renovações). A impregnação foi realizada com
parafina (ponto de fusão 56-58°C), durante 30 minutos, num primeiro banho seguida de
3 horas num segundo banho. A inclusão foi feita em moldes SHANDON. Os cortes
histológicos foram realizados com um micrótomo manual (Minot), tendo sido obtida a
espessura de cerca de 5 a 7 um. Posteriormente os cortes foram colados com água
albuminada seguindo-se a secagem numa estufa a 37°C durante a noite. Para se
proceder à coloração das lâminas, estas foram previamente desparafinadas através de
um banho de xilol durante 15 minutos (ou na estufa a 37°C para desparafinar mais
rapidamente), e rehidratadas com uma série descendente de álcoois (álcool absoluto - 2

71
Capítulo 1

min.; álcool a 95° - 2 min.; álcool a 90° - 2 min.; água corrente (até a peça ficar branca)
e finalmente água destilada durante 4 minutos.

Para a coloração das lâminas foram utilizadas 3 técnicas distintas:

a) coloração hemalúmen-eosina (Hemalúmen Mayer-Merk)

b) coloração de Cleveland-Wolfe

c) coloração mista de Azul de Alcião e Schiff-PAS.

a) Coloração Hemalúmen-Eosina

Foi a coloração mais utilizada, dada a sua simplicidade aliada à distinção de

células basófilas e células eosinófilas.

As lâminas foram mergulhadas numa tina com hemalúmen (hematoxilina Mc

Gill) durante cerca de 2 minutos, lavada com água corrente durante 10 minutos. De
forma a retirar o excesso de hemalúmen, foram colocadas umas gotas de uma solução
de HC1 a 1% em álcool a 70° sobre as preparações. Depois foram lavadas em água
destilada durante 5 minutos. Seguiu-se um banho numa tina com eosina (em solução
aquosa a 1% e com uma gota de ácido acético glacial na tina de coloração) durante 2
minutos. Depois procedeu-se à lavagem em água destilada durante 5 minutos (mudando
a água até deixar de ter cor). Depois deste passo segue-se a desidratação, montagem,
secagem e rotulagem.

Hemalúmen

Hemateína 0.2 g
Aluminio Potássico 5.0 g
Água Destilada 100 ml

ferver, filtrar e juntar 2 ml de ácido acético.

72
 Fases Vitelogénicas

b) Coloração de Cleveland-Wolfe

É um tipo de coloração tricrómica. Um dos resultados desta coloração é a

diferenciação das duas variedades de células acidófilas: umas aparecem em rosa e outras
em laranja.

Após a série descendente de álcoois (desidratação), as lâminas passaram por

Lugol (2 g de iodo e 3 g de iodeto de potássio em 100 ml de água destilada) durante 3
minutos seguidas de um banho de hidrogeno sulfito de sódio (NaHS03 -5% em H20)
até descolorar. Seguiu-se uma lavagem em água corrente durante 5 minutos. Coloração
com Hemalúmen durante 5 minutos seguindo-se nova lavagem em água corrente (5
min. mínimo) até ao aparecimento de uma coloração azul. As lâminas passaram por
água destilada sendo posteriormente colocadas numa tina com Eritrosina a 1% durante 5
a 10 minutos. Seguiu-se nova lavagem em água destilada. Os cortes foram diferenciados
rapidamente (2 minutos) em Orange G (2 g em 100 ce. de ácido fosfotúngstico a 1%) e
lavados em água destilada. Seguidamente foram tratados com Azul de Anilina 1% (1 g
de azul de anilina em 100 ml de água destilada- aquecer até à ebulição, filtrar e juntar 2
gotas de ácido acético) durante 3 minutos e finalmente lavados 3 a 4 vezes com água
destilada. Por fim seguiram-se as etapas da desidratação, montagem, secagem e
rotulagem.

c) Coloração mista de Azul de Alcião e Schiff-PAS.

A utilização deste tipo de coloração teve como objectivo diagnosticar o início da

vitelogénese através do aparecimento de material positivo ao Schiff-PAS, e a
diferenciação de polissacarídeos ácidos (cor azul celeste) e polissacarídeos neutros (cor
avermelhada).

As lâminas foram primeiramente coradas numa solução de Azul de Alcião a 1%

em ácido acético a 3% durante 30 minutos. Depois de lavadas em água corrente durante
3 minutos e passadas por água destilada foram mergulhadas numa tina com Ácido
Periódico a 1% durante 5 minutos. Foram novamente lavadas em água corrente durante
3 minutos e passadas por água destilada. Seguiu-se um banho com o Reagente de Schiff

73
Capítulo 1

durante 15 minutos, e no soluto sulfuroso (6 ml de metabissulfito de potássio a 10 %,

0.5 ml de HC1 normal, 100 ml água dest.) durante 2 minutos. Este soluto sulfuroso é
feito diariamente e actua para avivar o Reagente de Schiff.

As preparações foram depois lavadas em água corrente (entre 10 a 15 minutos) e

coradas rapidamente (metade do tempo usual) em hematoxilina seguindo-se uma
lavagem. Por fim, foram executadas as etapas da desidratação, montagem, secagem e
rotulagem.

Para a desidratação recorreu-se a uma série ascendente de álcoois: álcool a 90°

álcool a 95°, álcool absoluto I, álcool absoluto II, Xilol I, Xilol II. Estes passos tiveram
a duração de cerca de 3 minutos.

Seguiu-se a montagem em D.P.X. ou ENTELAN à temperatura ambiente. As

lâminas depois de secas (um dia à temperatura ambiente) foram rotuladas com etiquetas
próprias, contendo a seguinte informação: espécie, órgão, n° do bloco (que corresponde
ao n° do animal no livro de registo e no qual constam as características do mesmo) e
tipo de coloração.

B - Blocos em plástico

Já largamente utilizadas na microscopia electrónica, as resinas mais conhecidas

são as epoxidas e os poliésteres. Os acrilatos agora utilizados em M.O. são derivados
esteres do ácido metacrílico, e segundo o radical livre da molécula tomam diferentes
denominações. O que utilizamos é conhecido por Metacrilato de metilo. O radical livre
deste acrilato actua como um grupo alcoólico e é o responsável pelo carácter
hidrosolúvel deste tipo de plástico.

São várias as vantagens da utilização deste material para inclusão, que fazem
desta técnica a ponte entre a M.O. e a M.E.: Melhor conservação da estrutura celular, a
possibilidade de obtenção de cortes muito mais finos (± 1 um) com uma maior resolução
óptica e finalmente não necessita dos demorados passos de desidratação e

74
 Fases Vitelogénicas

desparafinação da técnica usual de parafina - de facto não é necessário "desplastificar".

Como inconveniente

Esquema geral da inclusão em plástico:

• Álcool 70°
" 96°
• monómero
• Bloco

A inclusão em plástico pode-se realizar a partir de peças não desidratadas de

todo ou mesmo hidratadas e a temperatura de reacção de polimerização do monómero é
relativamente baixa, não superando os 40°C. Os moldes utilizados para a realização dos
blocos (Kulzer) são em teflon os quais permitem uma temperatura uniforme em todo o
bloco em polimerização.

Técnica de Inclusão com Tecnovit 7100 (KULZER)

1. Inicia-se uma desidratação parcial com álcool 70° e 96° durante 30 minutos
cada.

2. A impregnação realiza-se com uma solução de monómero recém preparada:

Monómero (Tecnovit 7100-plástico de polimerização em frio) - 100 ml

Endurecedor I- uma embalagem de lg

As peças ficam nesta solução durante a noite.

3. Inclusão - Como meio de inclusão utiliza-se a mesma solução de impregnação

à qual se adiciona (agitando), na proporção de 15:1, 1 ml de endurecedor II.

4. Fixação do bloco ao suporte: introduzir o Histobloc (suporte especial para

fixação do bloco) na cavidade da base de teflon (molde). Juntar Tecnovit 3040
(-plástico de endurecimento rápido) numa proporção de 2 partes de pó e 1 parte
de liquido. Encher cerca de 2mm o fundo do bloco.

75
Capítulo 1

Os cortes deverão ser executados com um micrótomo de alta qualidade com

facas especiais podendo ser obtidos cortes de lum de espessura. São estirados fácil e
rapidamente num banho a 25°C e colados à lâmina numa placa de aquecimento a 45°C.
A coloração é realizada imediatamente sem necessidade de eliminar a matriz plástica,
assim como rehidratar as peças ou desidratar antes da montagem com bálsamo, DPX ou
outro.

Resultados e Discussão

7. Relações biométricas

O estudo biométrico efectuado nos animais amostrados teve como objectivo

principal a escolha de um grupo homogénio (tamanho e peso) para as análises
posteriores. Os animais foram assim selecionados após a determinação da fase
vitelogénica do ovário por histologia (capítulo 1), tendo sido excluidos os espécimes
cujos parâmetros biométricos se afastavam da média.

Desta forma foi obtida uma boa relação entre o tamanho do ovário (g), o índice
gonado-somático (relação entre o peso do ovário e o peso do animal) e a identificação
histológica do desenvolvimento dos ovócitos e consequente distribuição dos animais
por 5 fases de desenvolvimento da gónada, quer para a espécie P. japonicus (figura 1.)
quer para a espécie P. kerathurus (figura 2.).

76
 Fases V itelogénicas

Figura 1.1. Representação gráfica do peso dos animais da espécie P. japonicus utilizada nos
capítulo 4 e 5 assim como a variação do peso do ovário e IGS e sua relação com a
classificação dos mesmos animais segundo 5 fases de desenvolvimento do ovário
(n° total de animais = 21). As barras verticais indicam o erro padrão.

P. kerathurus
Variação do Indi ce Gonado-Somático (IGS)

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Fases da Vitelogénese

mam P. Ovário r^—i ES . P. Animal

Figura 1.2. Representação gráfica do peso dos animais da espécie P. kerathurus utilizada nos
capítulo 4 e 5 assim como a variação do peso do ovário e IGS e sua relação com a
classificação dos mesmos animais segundo 5 fases de desenvolvimento do ovário (n°
total de animais = 31). As barras verticais indicam o erro padrão.

77
Capítulo 1

II. Fases vitelogénicas

Os resultados obtidos dos cortes histológicos de ovário das duas espécies

estudadas permitiu estabelecer cinco fases vitelogénicas (I, II, III, IV e V) que
seguidamente iremos descrever, relacionando-os com os critérios já descritos por outros
autores e apresentados na Introdução.

Fase I

Previtelogénese

Na espécie P. japonicus, as fêmeas cujos ovários foram classificados nesta fase,

apresentaram um índice gonado-somático inferior a 2, enquanto para a espécie P.
kerathurus foi de cerca de 3.

O aspecto da gónada fresca é a de um fino cordão translúcido que não é visível

través da carapaça. A fase I, corresponde à fase estacionária de multiplicação e
crescimento dos ovócitos típica da época não-reprodutiva. As oogónias, situadas na
zona proliferativa junto à parede ventral do ovário, têm cerca de 10 um de diâmetro.
Com uma relação núcleo/citoplasma muito elevada, as oogónias apresentam um
citoplasma estreito e fortemente basófilo, e um grande núcleo com um nucléolo
principal com a forma típica de meia-lua. A medida que as oogónias se deslocam para
fora da zona de proliferação, iniciam o seu crescimento apresentando os ovócitos, nesta
fase, vários graus de desenvolvimento. Para além do aumento do tamanho dos ovócitos
(cuja média no P. japonicus foi de cerca de 79 um de diâmetro), a cromatina organiza-
se num grande e basófilo nucléolo central com outros mais pequenos perifericamente e
as células foliculares começam a rodear os ovócitos mais desenvolvidos situados à
periferia dos folículos (figuras 1-4).

Esta fase corresponde já ao início da denominada "fase de crescimento" por

Figueiredo (1972) ao descrever o ciclo maturativo do ovário de P. kerathurus. A "fase
de repouso", período fisiológico que ocorre normalmente durante o inverno, não foi

78
 Fases Vitelogénicas

encontrada nos animais estudados uma vez que as amostragens foram realizadas já na
época de reprodução ou seja na primavera.

Os ovócitos presentes nesta fase, para além das oogónias situadas na zona de
proliferação, encontram-se nos estádios de cromatina nucleolar e de cromatina
perinucleolar inicial e avançada. Estes estádios de desenvolvimento dos ovócitos estão
também na base da classificação da fase de previtelogénese do Penaeus japonicus,
proposta por Yano (1988).

Fase II

Previtelogénese avançada ou vitelogénese primária

Os animais de ambas as espécies classificados nesta fase apresentaram índices

gonado-somáticos inferiores a 4. Os ovários, mais volumosos e de coloração creme, são
já visíveis através do exosqueleto. Os ovócitos, com um diâmetro médio de 117 jam (P.
japonicus), encontram-se numa fase prévitelogénica que pode ser caracterizada por uma
diminuição do tamanho do núcleo e pelo aparecimento no citoplasma basófilo de
glóbulos acidófilos constituídos por gotículas lipídicas. A estes ovócitos que
progressivamente se vão tornando acidófilos, Figueiredo (1972) dá o nome de "ovócitos
de transição", pelo que esta fase (II) continua a corresponder à fase de crescimento na
classificação daquela autora. As células foliculares rapidamente se expandem para, na
periferia do folículo primário, rodearem os ovócitos mais desenvolvidos. Nesta fase de
previtelogénese, está incluída a vitelogénese primária ou seja a síntese de substâncias
vitelinas pelo ovócito (P. japonicus: figuras 5, 6; P. kerathurus: figuras 13, 14). Na
espécie P. monodon, esta fase juntamente com a fase por nós denominada de fase I, foi
classificada de fase P (de previtelogénese) por Tan-Fermin e Pudera (1989), o que numa
classificação em 4 fases (P, previtelogénese; V, vitelogénese; C, vesículas corticais e S,
desova) parece correcto juntar a previtelogénese inicial com a avançada isto é
vitelogénese primária ou endógena separando da vitelogénese propriamente dita quando
são visíveis as vesículas de vitelo. As diferenças encontrada nas frequências e nos

79
Capítulo 1

diâmetros médios e máximos apresentados pelos ovócitos nestas 4 fases, mostram ser
estas características indicadores fiáveis do estado de maturação do P. monodon. De
forma idêntica para a espécie Penaeus notialis, Trujillo e Gómez (1986) referem o
diâmetro do ovócito de 110 micra como indicador do estado de maturação. Esta fase,
designada por "vitelogénese primária" por Yano (1988) no P. japonicus é caracterizada
pelo aparecimento de gotículas lipídicas no citoplasma dos ovócitos e aumento das
células foliculares que os rodeiam. Este autor apresenta 3 estádios de desenvolvimento
dos ovócitos nesta fase fazendo corresponder à primeira delas, ("gotícula lipídica I"), o
aparecimento da vitelogenina na hemolinfa. A origem da vitelogenina nesta espécie foi
encontrada nas células foliculares que rodeavem os ovócitos no estádio de "gotícula
lipídica I" (Yano e Chinzei, 1987).

Fase III

Vitelogénese (vitelosénese secundária)

Está compreendida nesta fase a vitelogénese dos ovócitos, denominada por

alguns autores de vitelogénese secundária, período muito importante da ovogénese e na
qual são acumulados no ovócito as reservas vitelinas tanto de origem endógena como
exógena. Os índices gonado-somáticos das fêmeas nesta fase foram de cerca de 5 para a
espécie P. japonicus e 8 para a espécie P. kerathurus. Os ovários, bem visíveis à
transparência do tegumento como uma mancha escura ao longo do abdómen, ocupam
nesta fase cerca de 1/3 a 1/2 do aspecto dorsal do 2o segmento abdominal. Têm uma cor
alaranjada (P. japonicus) ou levemente esverdeada (P. kerathurus). Na espécie P.
kerathurus os ovócitos atingem, segundo Figueiredo (1972) nesta fase denominada de
"vitelogénese", dimensões normalmente compreendidas entre 160 e 230 micra.

Na espécie P. japonicus, o diâmetro médio dos ovócitos nesta fase foi de cerca
de 230 um. Os grânulos de vitelo são fortemente acidófilos e concentram-se
inicialmente perto do núcleo e daqui dispersam-se para a periferia do ovócito até o
preencherem por completo. O núcleo diminui de tamanho e o seu limite torna-se

80
 Fases Vitelogénicas

irregular (P. japonicus: figuras 7, 8; P. kerathurus: figuras 15, 16). Esta fase,
denominada de fase V (de vitelogénese) no P. monodon, é facilmente reconhecida pela
presença de vesículas vitelinas (que pela reacção PAS indicam a presença de
glicoproteínas) e de gotículas lipídicas, nos ovócitos que atingem cerca de 250 micra
(Tan-Fermin e Pudera, 1989). Esta fase III no P. japonicus foi designada de
"vitelogénese secundária" por Yano (1988) que inclui no entanto, um estádio posterior
ao aparecimento das vesículas de vitelo ("Yolk granule stage") denominado "estádio de
prematuração". Este estádio, que corresponde ao aparecimento das vesículas corticais
foi por nós incluído na fase IV (maturação).

Fase IV

Maturação (formação de vesículas corticais)

Caracterizamos esta fase com o inicio da formação das vesículas (também

denominados bastonetes) corticais na periferia dos ovócitos. É uma fase de pre-
maturação, na qual os ovócitos atingem o seu maior diâmetro (230 (am na espécie P.
japonicus). Nos animais vivos os ovários são visíveis através da carapaça e ocupam
cerca de 3/4 a 4/5 do aspecto dorsal do 2o segmento abdominal. Os ovários frescos têm
uma cor laranja-esverdeada (mais acentuada na espécie P. kerathurus). As vesículas
corticais começam por ser esféricas e acidófilas, sendo visíveis à periferia do ovócito.
Aumentando de tamanho e acidofilia durante esta fase, estas vesículas estão separadas
do citoplasma pela membrana citoplásmica do ovócito, e das células foliculares pelo
envelope vitelino que rodeia todo o ovócito. No final desta fase, que constitui a fase de
maturação propriamente dita, para além das vesículas corticais que atingem o seu
tamanho máximo, verifica-se a ovulação isto é, a retração das células foliculares que
deixam de envolver os ovócitos, e a migração para a periferia do núcleo e a sua cisão
(cisão da vesícula germinal-GVBD) (P. japonicus: figuras 9, 10; P. kerathurus: figuras
17-20). Esta fase é denominada de "amadurecimento" por Figueiredo (1972) e é
igualmente caracterizada pelo aparecimento das vesículas corticais na periferia do

81
Capítulo 1

ovócito. Trabalhando com a espécie P. kerathurus esta investigadora determinou um

diâmetro médio de cerca de 200-250 micra no início desta fase e de 250-300 micra para
o final, quando o ovário é considerado maduro: os "ovócitos maturantes" passam ao
estado de "óvulos" quando os bastonetes periféricos (vesículas corticais periféricas)
atingem um comprimento de cerca de 45 micra. Constituindo a presença das vesículas
corticais na fase de maturação dos ovócitos, pouco tempo antes da desova, uma
característica morfológica tão evidente, ela foi utilizada para descrever a fase C (de
"cortical rods") na espécie P. monodon (Tan-Fermin e Pudera, 1989). Como dissemos
anteriormente, este estádio de vesículas corticais é incluído na fase III- vitelogénese
secundária, na classificação de Yano (1988), sendo para este autor a fase de maturação
constituída pelo processo de ovulação, migração do núcleo e sua cisão (GVBD) até à
desova.

FaseV

Desova

Esta fase corresponde à desova. Foram, no entanto, utilizados dois critérios

distintos para o agrupamento de vários animais nesta fase:

a) pelo aspecto histológico do ovário

b) por sacrifício no dia seguinte à desova

No primeiro caso, é reconhecida uma certa desorganização do ovário, com a

presença de inúmeras vesículas corticais "soltas" e ovos maduros em reabsorção, assim
como espaços na periferia do ovário em reorganização após a saída dos ovos.
Possivelmente relacionado com o tempo decorrido desde a desova até ao sacrifício do
animal, os ovários nesta fase apresentam-se sinais de rematuração podendo ser
considerados em fase I, II ou mesmo III.

82
 Fases Vitelogénicas

No segundo caso, com a espécie P. kerathurus, foram vários os animais que

estando maduros foram colocados em tanques para desovar e sacrificados no dia
seguinte uma vez observada a desova. Se nos cortes histológicos do ovário destes
animais muitos apresentaram as características de pós-desova atrás referidas
(desorganização, restos de vesículas corticais), outros houve que apresentavam aspectos
normais de previtelogénese (fases I e II).

O índice gónado-somático dos animais nesta fase foi de cerca de 2 para a espécie
P. japonicus e de 3 para o P. kerathurus. O aspecto da gónada é semelhante à descrita
para as fases I e II, embora um pouco mais heterogenia principalmente nos animais em
que a desova foi parcial (P. japonicus: figuras 11,12; P. kerathurus: figuras 21-24).

Este aspecto de reorganização muito rápida dos ovários em situação de post-

desova, sugerindo a possibilidade de várias (duas ou mais) desovas na mesma época foi
já detalhadamente descrita por Figueiredo (1972) em P. kerathurus: ovócitos basófilos
da nova geração entram imediatamente em crescimento (60 a 120 micra) apenas se
notando a existência de alguns espaços vazios, deixados pelos óvulos expulsos.

O processo de rematuração em P. japonicus parece proceder-se em três etapas

(Yano, 1984): 1. Absorção de ovócitos maduros não desovados e reorganização do
ovário; 2. Aparecimento de ovócitos no "estádio I de gotículas lipídicas" (vitelogénese
primária) e aumento do número e tamanho das células foliculares (biosíntese de
vitelogenina); 3. Acumulação intensiva de vesículas vitelinas no citoplasma do ovócito.
Os resultados com esta espécie, e em condições de cultura, demonstraram que é possível
num curto espaço de tempo após a desova obter animais com ovários maduros (Yano,
1984). Na espécie Penaeus monodon, Tan-Fermin e Pudera (1989) denominou a fase de
desova de fase S (spent), correspondendo às características já referidas referindo-se
ainda à presença de alguns ovócitos primários de forma irregular e fortemente corados
(células atrésicas) e camadas compactas de células foliculares ) formadas por retração
após a ovulação. Dada a presença, após a desova, de apenas pequenos ovócitos
primários imaturos, levou os autores à conclusão de que esta espécie necessita de várias
semanas para rematurar e desovar novamente na mesma época de reprodução.

83
Capítulo 1

A divisão das fases vitelogénicas por nós utilizada neste trabalho pode ser
comparada com a apresentada nos trabalhos de Trujillo e Gómez (1986) e de Medina et
ai, (1996) apresentada no quadro seguinte:

Fase Estádio Trujillo & Gómez, 1986 Medina et ai, 1996

I Previtelogénese Imaturo Previtelogénese

II Previtelogénese Início de maturação Início da Vitelogénese

avançada

III Vitelogénese Maturação avançada Vitelogénese avançada

IV Maturação Maturo Maturo

V Desova Desovado Desova

A designação que utilizamos de "previtelogénese avançada" para a fase II,

corresponde à vitelogénese primária (ou também tradicionalmente dita de endógena) na
qual se verifica um aumento de tamanho e acidofilia do citoplasma dos ovócitos e o
aparecimento de gotícolas lipídicas. No entanto, nesta fase ainda não são reconhecidas
as vesículas vitelinas característica da vitelogénese, pelo que preferimos esta designação
à de "vitelogénese inicial" dada por Medina et ai, (1996). Uma classificação idêntica
em quatro fases (não inclui a desova) tinha sido já utilizada por Rodriguez (1977) em
Penaeus kerathurus.

A maioria dos trabalhos sobre a ovogénese em crustáceos não inclui a

importante fase de desova e suas consequências, ou seja a reorganização do ovário e
possível rematuração que nestes animais é muito frequente e rápida. Desta forma, ela
constitui a fase mais difícil de classificar e que, consequentemente, poderá conter
algumas imprecisões. Para se entender as possíveis diferenças nos estados fisiológicos
dos animais classificados na fase V- desova (e por consequência nas fases I e II de
animais selvagens amostrados em plena época de reprodução), descreveremos algumas

84
 Fases Vitelogénicas

situações observadas nos peneídeos estudados (P. japonicus e P. kerathurus) quando,

uma vez maduros, foram colocados em tanques de desova. Os diversos resultados
obtidos podem ser resumidos nas seguintes respostas:

a) ausência de desova e regressão (absorção) quase total do ovário (em 1 a 2

dias) com ou sem muda do exosqueleto.

b) Desova imediatamente seguida de muda. Neste caso após a muda alguns

animais retomam a vitelogénese secundária.

c) Desova e recuperação rápida do ovário (sem muda do exosqueleto) podendo

no curto espaço de tempo de 5 a 6 dias voltar a desovar.

d) Desova e recuperação lenta do ovário (sem muda do exosqueleto) podendo

voltar a desovar após algumas semanas.

Em conclusão, durante a época de reprodução destes animais as fases iniciais da

vitelogénese (fases I e II) podem corresponder à I a vitelogénese dessa época reprodutiva
ou à recuperação rápida e rematuração da gónada, situações que provavelmente
traduzem estados fisiológicos distintos. Nos animais selvagens, não sendo possível
descriminar a relação do ciclo reprodutivo com o ciclo da muda bem como o tempo
decorrido após a desova, esta situação poderá conduzir à inclusão de animais em estados
fisiológicos distintos na mesma fase do ciclo reprodutivo.

85
 Estampas de fotografias de microscopia óptica das
diferentes fases de desenvolvimento do ovário das espécies

P. japonicus e P. kerathurus
Figura 1. P. japonicus. Ovário em Fase I. Coloração hematoxilina-eosina. (Ampliação
108 x).

Figura 2. P. japonicus. Ovário em Fase I. Coloração hematoxilina-eosina. (Ampliação

217 x).
 mim
ÕVfífo

89
Figura 3. P. japonicus. Ovário em Fase I. Coloração hematoxilina-eosina. (Ampliação
434 x).

Figura 4. P. japonicus. Ovário em Fase I. Coloração hematoxilina-eosina. (Ampliação

434 x).
91
Figura 5. P. japonicus. Ovário em Fase H. Coloração hematoxilina-eosina. (Ampliação
217 x).

Figura 6. P. japonicus. Ovário em Fase H. Coloração hematoxilina-eosina. (Ampliação

217 x).
93
Figura 7. P.japonicus. Ovário em Fase HI. Coloração hematoxilina-eosina. (Ampliação
100 x).

Figura 8. P.japonicus. Ovário em Fase Hl. Coloração hematoxilina-eosina. (Ampliação

200 x).

<>4
95
Figura 9. P. japonicus. Ovário em Fase IV. Coloração Cleveland-Wolfe. (Ampliação
217 x).

Figura 10. P. japonicus. Ovário em Fase IV. Coloração Cleveland-Wolfe. (Ampliação

434 x).
97
Figura 11. P. japonicus. Ovário em Fase V. Coloração Cleveland-Wolfe. (Ampliação
100 x).

Figura 12. P. japonicus. Ovário em Fase V. Coloração Cleveland-Wolfe. (Ampliação

217 x).
99
Figura 13. P. kerathurus. Ovário em Fase H. Coloração hematoxilina-eosina.
(Ampliação 200 x).

Figura 14. P. kerathurus. Ovário em Fase H. Coloração hematoxilina-eosina.

(Ampliação 217 x).

100
101
Figura 15. P. kerathurus. Ovário em Fase IV (inicial). Coloração hematoxilina-eosina.
(Ampliação 217 x).

Figura 16. P. kerathurus. Ovário em Fase IV (inicial). Coloração hematoxilina-eosina.

(Ampliação 434 x).

102
103
Figura 17. P. kerathurus. Ovário em Fase IV (inicial). Coloração hematoxilina-eosina.
(Ampliação 217 x).

Figura 18. P. kerathurus. Ovário em Fase IV (inicial). Coloração hematoxilina-eosina.

(Ampliação 434 x).

104
105
Figura 19. P. kerathurus. Ovário em Fase IV (adiantada). Coloração hematoxilina-
eosina. (Ampliação 108 x).

Figura 20. P. kerathurus. Ovário em Fase IV (adiantada). Coloração hematoxilina-

eosina. (Ampliação 217 x).

106
107
Figura 21. P. kerathurus. Ovário em Fase V. Coloração hematoxilina-eosina.
(Ampliação 108 x).

Figura 22. P. kerathurus. Ovário em Fase V. Coloração hematoxilina-eosina.

(Ampliação 217 x).

108
109
Figura 23. P. kerathurus. Ovário em Fase V (adiantada). Coloração hematoxilina-
eosina. (Ampliação 108 x).

Figura 24. P. kerathurus. Ovário em Fase V (adiantada). Coloração hematoxilina-

eosina. (Ampliação 108 x).

110
Ill
Ultrastrutura do Ovócito. Estudo dos Aspectos
Ultrastruturais da Ovogénese em Penaeus
kerathurus.
 Ultrastrutura do Ovócito

Introdução

A ovogénese nos Malacostraca consiste em várias etapas que se desenrolam quer

de forma contínua, quer ciclicamente. A saída das ovogónias da zona germinativa, o
início e desenrolar da profase meiótica até à condensação dos cromossomas e a
previtelogénese, que inclui a vitelogénese primária (formação do vitelo endógeno),
constituem fenómenos contínuos da ovogénese. Apenas a vitelogénese secundária
(captação de vitelo exógeno) constitui um processo cíclico que se desenrola nas fêmeas
púberes, durante o período de reprodução (Payen, 1980).

A característica ultrastrutural mais notória dos ovócitos em previtelogénese é o

desenvolvimento de vários organelos citoplasmáticos, na região perinuclear e que
posteriormente se dispersam para a periferia (Papathanassiou e King, 1984; Komm e
Hinsch, 1985). Outra caractarística desta fase da ovogénese é a passagem de material do
núcleo para o citoplasma através dos numerosos poros nucleares (Beams e Kessel, 1963;
Hinsch e Cone, 1969; Zeni e Zaffagnini, 1989; Rankin e Davis, 1990). Com o início da
vitelogénese são observadas no ovócito várias alterações citoplasmáticas entre as quais
o desenvolvimento do retículo endoplásmico rugoso, com material granular denso no
interior das suas cisternas (Krol et ai, 1992), do aparelho de Golgi (Hinsch e Cone,
1969; Papathanassiou e King, 1984; Komm e Hinsch, 1987), o aparecimento de
mitocôndrias (Beams e Kessel, 1963) e de gotículas lipídicas (Beams e Kessel, 1963;
Papathanassiou e King, 1984; Zerbib, 1979; Yano, 1988).

A vitelogénese consiste na reunião dos componentes orgânicos e inorgânicos do

vitelo no ovócito em desenvolvimento. O vitelo é composto de água, proteínas e lípidos
sendo essencial para o desenvolvimento do embrião, quer como material estrutural para
a formação de tecidos quer como energia. A vitelina é a proteína
(lipoglicocarotenoproteina) maioritária identificada na maioria dos ovócitos (revisão por
Charniaux-Cotton, 1980; Meusy e Payen, 1988; Shafir et ai. 1992) constituindo a
vitelogenina a molécula precursora. A fracção proteica do vitelo está muitas vezes
associada a pigmentos carotenoides, que possivelmente servirá de protector do embrião
contra as radiações solares.

O processo de formação e acumulação de vitelo nos ovócitos de crustáceos,

como produção intraovocítica, extra-ovocítica ou a combinação das duas, tem sido

115
Capítulo 2

debatida por vários autores (Beams e Kessel, 1963; Hinsch e Cone, 1969; Wolin et ai,
1973; Zerbib, 1979; Komm e Hinsch, 1987; Papathanassiou e King, 1984;. Lepore et
ai, 1993, entre outros)

Um dos principais argumentos a favor da origem extra-ovocítica é a existência

na hemolinfa de uma proteína específica-de-fêmeas vitelogénicas serologicamente
idêntica à contida nas vesículas de vitelo (lipovitelina), entrando no ovócito por um
processo de pinocitose, o qual ocorre apenas quando os ovócitos acumulam reservas de
vitelo (Wolin et ai, 1973: Ucapugilator, Cambarus clarkii e Libinia emarginata).

A hipótese de produção extra-ovocítica de vitelo é ainda suportada pela

observação ultrastrutural de numerosas microvilosidades e vesículas de micropinocitose
na membrana plasmática de ovócitos em vitelogénese que sugerem uma produção
exógena de componentes do vitelo que desta forma entram no ovócito (Hinsch e Cone,
1969; Charniaux-Cotton, 1980; Lepore et ai, 1993). Vários estudos utilizando
marcadores demonstraram a captura de material exógeno pelo ovócito (Komm e Hinsch,
1987; Schade e Shivers, 1980; Wolin et ai, 1973). Estudos imunológicos em vários
décapodes identificaram locais extra-ováricos de síntese da vitelina e da vitelogenina
(molécula precursora da vitelina): hemócitos, hemolinfa (Krol et ai, 1992), tecido
adiposo subepidermal (Junéra e Croisille, 1980), e hepatopâncreas (Wolin et ai, 1973;
Vogt et ai, 1989). A vitelogenina poderia ainda ser sintetizada pelas células foliculares,
secretada para a hemolinfa e daqui captada pelos ovócitos em desenvolvimento (Yano e
Chinzei, 1987).

Segundo Zerbib (1979), o início da vitelogénese secundária nos ovócitos de duas

espécies de lagostim de água doce (Astacus astacus e A. leptodactylus) é caracterizada
por um considerável desenvolvimento da membrana plasmática ovocitária e um
acentuado aumento de endocitose: o ooplasma cortical e as macrovilosidades são o local
de importante actividade pinocitótica, acentuada pela existência de inúmeras "micro-
canalículas" as quais encerram um material equivalente às vesículas de pinocitose.

O facto do processo pinocitótico aparecer, nas espécies de cirripedes, Balanus

amphitrite e B. perfuratus, de forma semelhante a outros crustáceos, apenas durante a
vitelogénese secundária, parece indicar, segundo os autores, uma menor importância da
componente exógena do vitelo (Lepore et ai 1993). Os resultados obtidos por
Fainzilber et ai, (1992), no camarão peneídeo Penaeus semisulcatus, indicam também
uma contribuição extra-ovárica diminuta na vitelogénese, concluindo os autores ser o

116
 Ultrastrutura do Ovócito

ovário o principal local de síntese da vitelina nestes camarões. No mesmo sentido, e

tendo em conta o aumento simultâneo da concentração de vitelogenina e de vitelina no
ovário de P. semisulcatus, parece chegar-se à mesma conclusão de que a contribuição da
vitelogenina para a formação de vitelina no ovário é quantitavamente insignificante,
podendo a vitelogenina ter um papel no transporte de lípidos de tecidos extra-ováricos
(por exemplo do hepatopâncreas) até ao ovário (Shafir et ai, 1992).

A produção intraovocítica de vitelo, sugerida por vários autores, é apoiada por

estudos ultrastruturais que apontam para um significativo aumento do retículo
endoplásmico em ovócitos vitelogénicos indicando actividade de síntese proteica
(Beams e Kessel, 1963). Idênticas características do retículo endoplásmico (liso e
rugoso) foram observadas no caranguejo Libinia emarginata (Hinsch e Cone, 1969) e
no anfípode Orchestia gammarela (Charniaux-Cotton, 1980). A capacidade de síntese
proteica dos ovócitos vitelogénicos do lagostim de água doce Procambarus clarkii, foi
14
comprovada, in vitro, pela técnica de incorporação de C-leucina (Kulkarni et ai,
1991).

Finalmente a combinação dos dois processos de formação do vitelo,

intraovocítica e extra-ovocítica, é descrita no caranguejo Libinia emarginata (Hinsch e
Cone, 1969), nos lagostins de água doce, Astacus astacus e A. leptodactylus (Zerbib,
1979), do caranguejo-ermita Coenobita clypeatus (Komm e Hinsch, 1985; 1987), no
camarão Palaemon serratus (Papathanassiou e King, 1984), estando implicados
organelos citoplasmáticos (retículo endoplásmico, aparelho de Golgi) na sua síntese
assim como a incorporação de material através de microvilosidades e formação de
vesículas micropinocitóticas. Da mesma forma, Schade e Shivers (1980) comprovaram a
hipótese da dupla origem do vitelo proteico nos ovócitos vitelogénicos da lagosta
americana, Homarus americanus, uma vez que a actividade pinocitótica da membrana
plasmática é aumentada apenas no momento de máximo desenvolvimento do ovário
(vitelogénese) e é praticamente indetectável quer nos ovócitos imaturos, quer nos que
atingiram a maturação. No camarão Palaemon serratus, a produção de vitelo é
principalmente intra-ovocítica, possuindo no entanto um oolema bastante interdigitado.
Nas fases mais adiantadas, depois do início da formação da camada vitelina, as
microvilosidades permitem o contacto com as células foliculares, e as vesículas
micropinocitóticas formadas fundem-se no retículo endoplasmático, contribuindo assim
para o material vitelino do ovócito (Papathanassiou e King, 1984).

117
Capítulo 2

Os estudos ultrastruturais de ovócitos das espécies de cirripedes Balanus

amphitrite e B. perfuratus realizados por Lepore et ai. (1993), demonstraram a
existência, em ambas as espécies, de uma vitelogénese primária caracterizada pela
formação de numerosas vesículas ergastoplasmáticas com material electrono-denso em
várias fases de desenvolvimento (vitelo endógeno), e uma vitelogénese secundária na
qual, a par da presença das vesículas ergastoplasmáticas, são formadas grandes vesículas
de vitelo e gotículas lipídicas, assim como a presença de microvilosidades que se
projectam pela camada vitelina e vesículas de micropinocitose: a vitelogénese
secundária nestas espécies parece ser também um processo simultaneamente endógeno e
exógeno.

A descrição da ovógenese no anfípode Orchestia gammarela indica igualmente a

existência de uma vitelogénese primária ou endógena, na qual a síntese de proteínas e
glicoproteínas é realizada no retículo endoplasmático rugoso, e uma vitelogénese
secundária durante a qual, e a par da síntese endógena, através de processos
pinocitóticos e de uma rede de micro-canículas, é introduzido material extra-ovárico
(vitelogenina) e acumulado em vesículas de vitelo (Charniaux-Cotton, 1980).

Nas espécies Penaeus japonicus (Yano, 1988) e Palaemon serratus

(Papathanassiou e King, 1984), as vesículas de vitelo aparecem inicialmente
concentrados perto do núcleo dispersando-se posteriormente para a periferia do ovócito.
No entanto, em lagostins de água doce (gen. Cambarus e Orconectes sp.: Beams e
Kessel, 1963; Astacus astacus eA. leptodactylus: Zerbib, 1979) a concentração de vitelo
faz-se primeiro na periferia do citoplasma, sugerindo diferentes mecanismos de síntese
e/ou deposição de substâncias vitelinas no ovócito.

Os resultados obtidos por Zeni e Zaffagnini (1989) com a espécie não-

malacostraca, Leptestheria dahalacencis, em cuja vitelogénese a fracção proteica do
vitelo tem origem mista, mas de maior proporção endógena (que a aproxima mais dos
malacostraca do que aos não-malacostraca) levou estes autores a pôr a hipótese de que a
quantidade exógena de vitelo não depende da posição sistemática da espécie mas de
outros factores como o habitat, rapidez do processo ovogénico ou do número de ovos
produzidos.

Nos décapodes, é depositado no espaço perivitelino, ao longo do oolema e entre

as microvilosidades, um material electrono-denso o qual em estádios posteriores dá

118
 Ultrastrutura do Ovócito

lugar à camada vitelina ou corion. A camada vitelina torna-se depois uma camada
contínua que separa o ovócito das células foliculares (Papathanassiou e King, 1984).

No final da vitelogénese as microvilosidades desaparecem, a membrana

citoplasmática torna-se lisa e aparecem no citoplasma do ovócito as especializações
corticais (Charniaux-Cotton, 1980). Um dos aspectos mais notórios, nos peneídeos, é o
abundante número de grandes criptas corticais em forma de bastonetes, contendo as
estruturas do tipo "escova de garrafas", e que se situam claramente fora da membrana
celular que limita o ovócito (Rankin e Davis, 1990; Clark Jr. et ai, 1980, 1990). Nas
espécies Penaeus japonicus e P. vannamei estas vesículas ou bastonetes corticais
aparecem inicialmente como corpos esféricos na periferia do citoplasma do ovócito,
tornando-se alongados em direcção ao núcleo à medida que o ovócito se aproxima da
maturação. Na espécie Penaeus monodon a coloração histoquímica das vesículas
corticais indica a ausência de lípidos e a presença de glicoproteinas (Tan-Fermin e
Pudera, 1989).

A origem dos componentes das criptas (bastonetes) corticais não está ainda de
todo elucidada, embora as informações preliminares sugerem a sua proveniência no
próprio ovócito (Clark Jr. et ai, 1990). A utilização de anticorpos mono-específicos
contra um polipéptido existente nos bastonetes permitiram Rankin e Davis (1990)
demonstrar a sua síntese intraovocítica, no retículo endoplásmico, desconhecendo no
entanto o mecanismo da sua entrada no bastonete cortical o qual, na espécie estudada,
Penaeus vannamei, é claramente extra-ovocítico. No mesmo trabalho, estes autores
encontraram por imuno-reactividade, outro componente dos bastonetes (um polipéptido
vitelino de 175 kDa) comum em vesículas moderadamente densas, provavelmente
vesículas de vitelo e no espaço perivitelino.

Os bastonetes corticais do ovócito de P. japonicus ocupam as criptas extra-

ovocíticas formadas pela membrana plasmática do ovócito (Yano, 1988), de forma
idêntica ao descrito por Clark Jr. et ai, (1990) para a espécie Sicyonia ingentis. Estas
criptas, que parecem ser formadas fora do ovócito pela fusão de materiais
(provavelmente vesículas de pinocitose) secretados pelo ovócito, são cobertas pela
camada vitelina a qual é aparentemente formada pelas células foliculares que lhe ficam
adjacentes (Yano, 1988).

Nos ovócitos da lagosta americana, Homarus americanus, foram referenciadas

umas estruturas igualmente em forma de "escova de garrafas" (Talbot, 1981b), situadas

119
Capítulo 2

no endocorion (porção interna da camada vitelino) e que podem ser análogas às

bastonetes corticais dos camarões peneídeos. Na espécie Penaeus japonicus a pré-
maturação, caracterizada pela formação das criptas corticais e da camada vitelina e
durante a qual os ovócitos ainda acumulam grânulos vitelinos, é uma fase relativamente
longa (Yano, 1988).

Nos décapodes, o final da maturação do ovócito é acompanhado de vários

acontecimentos: a membrana nuclear desaparece e, algumas horas antes da desova, dá-
se a cisão da vesícula germinal (GVBD) como prelúdio à nova divisão meiótica. A cisão
da vesícula germinal é iniciada no final da pré-maturação e continua até à última fase de
maturação imediatamente antes da desova (Yano, 1988).

O objectivo deste trabalho foi a caracterização ultrastrutural da ovogénese em

Penaeus kerathurus, com particular atenção na vitelogénese, isto é na origem das
vesículas vitelinas, e na maturação especialmente na origem das especializações
corticais.

Material e Métodos
O estudo ultrastrutural da vitelogénese foi realizado em ovários da espécie
Penaeus kerathurus (ver Material e Métodos Gerais).

As peças para microscopia electrónica (M.E.) foram fixadas imediatamente após

a colheita em 2.5% glutaraldeído em tampão de Cacodilato de Sódio 0.15 M (pH 7.2)
durante 2 horas, a 4o C. Seguiu-se uma lavagem de 2 horas no mesmo tampão a 4°C.

Depois da lavagem, procedeu-se a uma pós-fixação com 2% Tetróxido de Ósmio

no mesmo tampão com 0,8% de Ferrocianeto de Potássio (K4[Fe(Cn)6]' 3H 2 0), durante
2 horas a 4°C. Algumas peças foram somente fixadas em glutaraldeído.

Seguiu-se a desidratação recorrendo a uma série ascendente de álcoois: 50°, 75°,

90°, 95°, 100°(I), 100°(H) (em banhos de 30 minutos cada), e finalmente Óxido de
Propileno (em dois banhos de 15 minutos cada), à temperatura ambiente.

A impregnação foi realizada com diferentes misturas de Óxido de Propileno e

Epon (3:1, 1:1 e 1:3) durante 1 hora em cada mistura, à temperatura ambiente.

120
 Ultrastrutura do Ovócito

Finalmente, as peças foram colocadas em Epon puro durante 1 hora, à temperatura

ambiente e depois na estufa a 60°C durante 30 minutos.

A inclusão, também em Epon, foi executada em moldes de inclusão de silicone.

Foram feitos 8 blocos (duplos) por animal. Os blocos permaneceram na estufa a 60°C
durante 3 dias.

Foram realizados cortes semi-fmos e ultra-finos num ultramicrótomo LKB, com

facas de vidro.

Os cortes semi-fmos foram corados com uma solução de Azul de Metileno e

Azur II (1:1) durante aproximadamente 1 minuto e observados ao microscópio óptico
para localização na peça do local para a realização dos cortes ultra-finos.

Posteriormente as grelhas contendo os cortes ultra-finos foram sequencialmente

contrastadas, no escuro, com Acetato de Uranilo em solução aquosa a 3% durante 20
minutos, seguida de lavagem em água destilada e Citrato de Chumbo (Reynolds)
durante 10 minutos, seguida de lavagem em água destilada. Foram colocados junto com
este banho algumas "lentilhas" de hidróxido de sódio para absorção do C02-

Os cortes ultrafinos assim obtidos foram observados num microscópio

electrónico de transmissão JEOL 100CXII, a operado a 60 kV.

Para estudos citoquímicos, os cortes ultrafinos, de material fixado apenas com

glutaraldeído, foram recolhidos em grelhas de ouro e executou-se a técnica de Thiéry
(1967), para detecção ultrastrutural do glicogénio e de glicoproteínas. Esta técnica conta
dos seguintes passos:

a) Ácido Periódico aquoso 1%, durante 30 minutos

b) Lavagem em água destilada durante 3 x 1 0 minutos

c) 0.2% Tiocarbohidrazida em 20% de ácido acético aquoso, durante 2 horas

d) 20% ácido acético aquoso - duas vezes uma passagem rápida

10% ácido acético aquoso - três vezes 20 minutos

5% ácido acético aquoso - 10 minutos

121
Capítulo 2

2% ácido acético aquoso - 5 minutos

Água destilada- duas vezes uma passagem rápida e três vezes 20 minutos

e) 1% Proteinato de Prata aquoso, durante 30 minutos, ao abrigo da luz

f) Agua destilada- duas vezes uma passagem rápida e mais 30 minutos

Resultados

Previtelogénese

Na espécie Penaeus kerathurus, os ovócitos previtelogénicos apresentam um

núcleo eucromático grande e oval, o qual contém vários nucléolos periféricos ligados ao
invólucro nuclear e compostos por grandes massas globulares densas interligadas por
uma rede de finos cordões (figuras 1, 2). O nucleoplasma, que contém também grandes
agregados de grânulos intercromatínicos (figura 3), está rodeado por um invólucro
nuclear perfurado por numerosos poros nucleares, através dos quais um fino material
fibrilo-granular é exportado para formar massas densas fibrilo-granulares ("nuages")
(figuras 1,2).

A aglomeração de organelos na região perinuclear contrasta com a sua escassez

no citoplasma periférico. Exceptuando as mitocôndrias, que são pleomórficas e
ramificadas (figura 5), e os microtúbulos, todos os organelos parecem ter origem directa
a partir do invólucro nuclear.

O retículo endoplásmico é formado a partir de expansões da membrana externa e

do espaço intermembranar do invólucro nuclear (figuras 1, 2). Pequenos grânulos
electrono-densos, de natureza glicoproteica, contidos neste espaço intermembranar, são
também exportados para as cisternas do retículo endoplásmico em formação (figuras 1,
2, 4). Quer o invólucro nuclear, quer o retículo endoplásmico, parecem não ter
ribosomas ligados à sua superfície.

O aparelho de Golgi é originado pela fusão de pequenas vesículas vesiculadas a

partir de pequenas e grandes expansões do invólucro nuclear. As grandes expansões,

122
 Ultrastrutura do Ovócito

contendo também pequenos grânulos densos, circundam a área de formação do Golgi,

constituindo assim a cisterna transicional do retículo endoplásmico que, por
vesiculação, origina o aparelho de Golgi (figuras 6-8).

O lado da cisterna transicional do retículo endoplásmico que fica oposto à área

de formação do Golgi, bem como algumas cisternas livres do retículo endoplásmico,
dão origem a pequenas vesículas de densidade intermédia. Estas vesículas incorporam o
fino material fibrilar que está contido no lúmen do retículo endoplásmico (figuras 7, 8).

Alguns vacúolos autofágicos foram também observados na região perinuclear,

frequentemente envolvidos no material das massas densas fibrilo-granulares ("nuages")
(figura 9). A origem dos vacúolos autofágicos é múltipla, integrando: 1) pequenas
estruturas vesiculares densas que inicialmente aparecem no espaço intermembranar do
invólucro nuclear (figura 10), que são posteriormente exportadas para as cisternas do
retículo endoplásmico (figura 11) e finalmente vesiculadas deste organelo (figura 12); 2)
figuras de mielina directamente libertadas do invólucro nuclear (figura 13); e 3)
pequenas vesículas provenientes directamente do aparelho de Golgi (figura 14).

A medida que estes organelos são formados, difundem para a periferia do

citoplasma do ovócitio (figura 15). Nesta fase da ovogénese observaram-se também
pontes intercelulares que interligam ovócitos adjacentes, não se notando quaisquer
diferenças ultrastruturais entre as células (figura 16).

As células foliculares que rodeiam os ovócitos previtelogénicos são estreitas e

possuem um núcleo eucromático em forma de S. No seu citoplasma apenas se observam
mitocôndrias de maior dimensão e de matriz clara, e numerosos feixes de microtúbulos
(figura 15).

Vitelogénese

Vitelogénese Inicial

Nesta fase, cada ovócito aparece rodeado por dois tipos de células foliculares.
Uma é estreita e apresenta um núcleo e o citoplasma muito densos. A outra, de grande
dimensão, exibe um núcleo e o citoplasma pouco densos (figuras 17-19). Ambos os
tipos de células apresentam cisternas de retículo endoplásmico rugoso (RER) e aparelho
de Golgi bem desenvolvido, mas apenas as células foliculares claras parecem secretar

123
Capítulo 2

um material fibrilar que é exocitado para o espaço perivitelino, onde parece participar na
formação da camada vitelina (figura 20).

O citoplasma do ovócito é preenchido por grandes vesículas redondas de RER,

as quais contêm pequenos grânulos densos numa matriz fibrilar (figuras 21-24). Além
deste organelo, podem também ser observados vários pequenos aparelhos de Golgi,
grandes agregados de gotículas lipídicas e agregados periféricos de cisternas de RER
(figuras 21-24).

Esta fase inicial da vitelogénese é caracterizada pela formação de vesículas

vitelinas, as quais têm uma origem simultaneamente exógena e endógena. Parece
também coexistirem dois tipos principais de vesículas vitelinas, uma de conteúdo denso
e outra de conteúdo de densidade média. As vesículas vitelinas densas são formadas
pela fusão de vesículas revestidas resultantes de endocitose e por vesículas claras de
origem Golgiana (figuras 21-24). Pelo contrário, as vesículas vitelinas de densidade
intermédia formam-se a partir de expansões de vesículas do retículo endoplásmico
rugoso, parecendo, no entanto, também incorporar os mesmos materiais que dão origem
às vesículas vitelinas densas (figuras 24-26). Não foi possível encontrar uma fase de
transição entre os ovócitos previtelogénicos e os ovócitos em vitelogénese inicial, o que
sugere uma passagem rápida para a fase de crescimento. Como não foi observada
qualquer evidência de exocitose, é pois provável que as vesículas de densidade
intermédia dos ovócitos previtelogénicos possam estar envolvidos na formação das
vesículas vitelinas. Outra alternativa poderá ser a sua contribuição, por exocitose, na
formação da camada vitelina.

Durante esta fase, as vesículas do RER dão também origem, por vesiculação, a
algumas vesículas que contêm estruturas em forma de cordão (figuras 27, 28).

Os núcleos dos ovócitos em vitelogénese inicial são muito grandes e

eucromáticos, exibindo nucleolus que são compostos de uma grande região central
densa rodeada por uma periferia reticulada (figura 29).

Vitelogénese intermédia e tardia

A vitelogénese intermédia é um curto período caracterizado pela formação de

um extenso retículo endoplásmico tubular rico num material finamente fibrilar, mas sem

124
 Ultrastrutura do Ovócito

os pequenos grânulos densos (figuras 30-33), seguido pela confluência e alargamento

das vesículas de RER pré-existentes (figuras 34-37).

Estas modificações da conformação do retículo endoplásmico estão directamente

dirigidas para a formação de grandes quantidades de vesículas vitelinas de densidade
intermédia na fase de vitelogénese avançada. A confluência das vesículas do RER
origina um retículo endoplásmico anastomosado que rodeia e suporta a formação das
vesículas vitelinas (figuras 38-41), enquanto que o retículo endoplásmico tubular é
directamente incorporado nesse vitelo. A confluência de RER parece ser mediada por
múltiplas finas expansões que interligam as vesículas de RER, apresentando uma
aparência de lamelas aneladas (figuras 37-41). Durante esta fase, o RER anastomosado
sintetiza um grande número de estruturas em cordão, já referenciadas no início da
vitelogénese, as quais são finalmente vesiculadas (figuras 34-37). Embora os pequenos
grânulos densos do RER corem positivamente para glicoproteínas, o mesmo não se
passa com os elementos em cordão (figura 53).

As gotículas lipídicas, antes observadas apenas em grandes agregados,

aparecem, nesta fase, isoladas e intimamente ligadas às vesículas do RER e às vesículas
vitelinas em formação (figuras 35, 37, 38).

Os aparelhos de Golgi mantêm-se pequenos mas parecem muito mais activos,

tornando-se também intimamente associados com as vesículas do RER e com as
vesículas vitelinas em formação (figuras 33, 40).

As mitocôndrias são numerosas, mostrando, nesta fase, uma aparência

frequentemente anelada (figura 40).

Embora esta fase seja caracterizada pela formação intensa de vitelo endógeno, a
via exógena inicial continua presente, mas em menor escala (figuras 38-40).

O núcleo dos ovócitos em vitelogénese intermédia e avançada é grande e

eucromático, apresentando uma forma irregular. Contém vários nucléolos, os quais são
compostos por grandes massas, densas e irregulares, interligadas por um retículo de
finos cordões (figura 42).

Os ovócitos em vitelogénese intermédia e avançada são rodeados não só por

células foliculares, umas claras e outras densas (figuras 38-41), mas também por

125
Capítulo 2

ovócitos aplanados. Estes ovócitos também apresentam características de crescimento

mas a um ritmo menor, o que sugere um papel de células nutritivas ("nurse-cells").

Maturação do vitelo

Apesar de no início da vitelogénese serem já observadas vesículas vitelinas de

densidade intermédia, com provável origem nas vesículas do RER, é durante a
vitelogénese intermédia e avançada que o retículo endoplásmico tubular se apresenta
como evidente precursor directo deste vitelo. Este processo é bastante intenso e inclui a
fusão e posterior absorção dos túbulos pelas vesículas vitelinas em formação (figuras
43, 44).

A maturação das vesículas vitelinas continua no micro-ambiente especial criado

pelo RER anastomosado que as circunda. O aparelho de Golgi, que continuamente
recebe pequenas vesículas do RER, produz pequenas e grandes vesículas, contendo
estas últimas um fino material grânulo-fibrilar, que se funde com o vitelo (figuras 45,
47, 48). Os grânulos, mas não as fibrilas, das grandes vesículas do Golgi, também coram
positivamente para glicoproteínas (figura 54).

As gotículas lipídicas individualizadas, foram também observadas em contacto

íntimo com as vesículas vitelinas (figuras 44, 54). Nesta fase, surgem grânulos de
glicogénio, inicialmente formados em restritas áreas claras do citoplasma, delimitadas
pelas ramificações do RER, mas que depois preenchem progressivamente o citoplasma
do ovócito (figuras 41, 45, 46, 54). Estes grânulos de glicogénio são, posteriormente,
também concentrados sob a forma de pequenos agregados, na periferia do vitelo (figuras
46, 54).

As vesículas de vitelo em maturação absorvem também três outros tipos de

componentes: 1) as vesículas vitelinas densas (figura 49); 2) figuras mielínicas,
originadas do retículo endoplásmico tubular (figuras 50, 51); e 3) as vesículas derivadas
do RER contendo estruturas em cordão (figura 52).

126
 Ultrastrutura do Ovócito

Formação das Vesículas Corticais

Depois da formação das vesículas vitelinas ter terminado, o ovócito sofre novas
e profundas alterações. O RER anastomosado da fase de vitelogénese avançada cinde-se
em vesículas, contendo ainda os pequenos grânulos densos, confirmando assim que a
fase anastomosada está directamente envolvida na formação intensiva das vesículas
vitelinas (figuras 55, 56).

Nesta fase, todo o citoplasma aparece agora repleto de pequenas vesículas

corticais, de forma irregular, e que contêm estruturas cujo aspecto morfológico é
semelhante ao dos proteoglicanos (figuras 55, 56). Na periferia do ovócito existem
mesmo algumas vesículas corticais de maior dimensão já fundidas com o oolema (figura
57). A origem das vesículas corticais pode ser claramente relacionada com o RER,
embora recebam também contribuição dos aparelhos de Golgi. Por esta razão, são aqui
denominadas de vesículas corticais em vez de criptas. A designação de criptas corticais
foi a denominação dada às profundas invaginações do oolema encontradas nos ovócitos
dos crustáceos, as quais, posteriormente, acumulavam o seu conteúdo por compactação
de materiais extracelulares. Este não é o caso desta espécie, uma vez que não foi
observada qualquer via endocitótica e, antes pelo contrário, foi claramente observada a
sua origem a partir de precursores intracelulares bem como a sua posterior exocitose. As
vesículas corticais formam-se a partir de expansões terminais do RER, cujo conteúdo se
diferencia então em estruturas do tipo proteoglicano (figuras 58, 59, 61). Noutras
espécies, estes elementos foram denominados estruturas do tipo "em escova de garrafa",
mas a sua aparência morfológica é tão próxima da dos proteoglicanos que preferimos
esta denominação. Na sua fase inicial de formação a partir do RER, as vesículas
corticais exibem finas expansões que limitam áreas claras do citoplasma, de forma
similar ao anteriormente ocorrido com o RER, as quais são progressivamente absorvidas
no seu interior (figuras 58-60, 76, 77).

O núcleo do ovócito nesta fase já não exibe grandes nucleolus mas sim múltiplos
nucléolos de pequena dimensão e finamente reticulados (figura 55).

A actividade do Golgi parece bastante diminuída e as gotículas lipídicas estão

reduzidas em número e ainda se encontram individualizadas.

127
Capítulo 2

Maturação das Vesículas Corticais

Nesta fase, o ovócito é caracterizado pela presença de grandes vesículas corticais

já fundidas com o oolema. O núcleo, de grande dimensão e eucromático, mostra
novamente nucleolus maiores, os quais são constituídos por pequenas regiões redondas
e densas circundadas por uma ampla rede de cordões reticulares densos (figura 62).

A região perinuclear está repleta com algumas vesículas vitelinas e grandes

quantidades de pequenas vesículas de RER, pequenas vesículas corticais e mitocôndrias
aneladas (figuras 62, 63). Esta região continua-se com uma área que contém numerosas
vesículas vitelinas com grandes agregados de grânulos de glicogénio na sua periferia
(figuras 64, 77). Ainda nesta fase, grandes vesículas de Golgi, contendo glicoproteínas,
foram observadas a fundir-se com as vesículas de vitelo, indicando assim um processo
de maturação contínuo para além da vitelogénese avançada (figuras 75, 76).

Mais externamente, existe uma outra região também rica em vesículas vitelinas,
as quais apresentam uma menor quantidade de glicogénio periférico e são rodeadas por
RER anastomosado (figura 65).

Acima desta região, aparece o lado interno das grandes vesículas corticais
periféricas. Nesta fase, diminui o número de vesículas vitelinas e torna-se evidente a
ramificação do tipo "lamelas aneladas" do RER (figuras 66, 67). A parte interna, basal e
lateral, das grandes vesículas corticais revela um processo de maturação contínua, o qual
é caracterizado pela fusão com vesículas corticais de menor dimensão e com pequenas e
grandes vesículas de Golgi e do RER (figuras 68, 69, 75, 78-81).

Embora as grandes vesículas corticais se fundam com o oolema, não foram

observados sinais de extrusão do seu conteúdo, excepto na região apical do seu
conteúdo exposto, a qual parece dispersar-se e fundir-se com a camada vitelina (figuras
70, 71, 82). Pelo contrário, na periferia do ovócito algumas vesículas corticais de
pequena dimensão fundem-se com o oolema, sendo o seu conteúdo completamente
exocitado e fundido com a camada vitelina (figura 72).

Na periferia do ovócito são também observadas algumas vesículas vitelinas,

mitocôndrias, gotículas lipídicas individualizadas, numerosas pequenas vesículas
corticais, e grandes vesículas de RER. As células foliculares são estreitas mas não
densas (figuras 70-73), e algumas regiões do ovócito mantêm-se rodeadas por ovócitos

128
 Ultrastrutura do Ovócito

aplanados, possivelmente representando células nutritivas ("nurse-cells"), por vezes com

um núcleo cuja disposição da heterocromatina em barras densas periféricas faz lembrar
o processo de apoptose (figuras 71, 74).

Discussão

O processo de formação e armazenamento das substâncias de reserva ou

vitelinas nos ovócitos, a vitelogénese, constitui um dos aspectos mais investigados da
ovogénese. Porém, a informação disponível sobre as poucas espécies de crustáceos
estudadas é controversa com respeito à origem e formação das vesículas vitelinas.
Igualmente, as especializações corticais que nos peneídeos são denominadas "criptas ou
bastonetes corticais" e que no momento da desova são extrudidas para formar a camada
de fertilização, têm uma origem desconhecida. O presente trabalho constitui o primeiro
estudo ultrastrutural da vitelogénese na espécie Penaeus kerathurus e demonstra a
presença permanente dos dois processos, intra e extraovocítico, na formação do vitelo,
com o predomínio de um deles caracterizando distintas fases da vitelogénese, bem como
a origem intraovocítica das vesículas corticais e o seu desenvolvimento até à localização
final extra-oolema.

Previtelogénese

O ovócito previtelogénico do P. kerathurus é caracterizado pela formação do

retículo endoplásmico, a partir de expansões da membrana externa e do espaço
intermembranar do invólucro nuclear, aparentemente sem ribossomas. Pequenos
grânulos electrono-densos, de natureza glicoproteica, contidos no espaço
intermembranar, são também exportados para as cisternas do retículo endoplásmico em
formação. No camarão Palaemon serratus, também a membrana externa do invólucro
nuclear produz pequenas vesículas que irão formar o retículo endoplásmico liso,
enquanto outros organelos são observados junto ao núcleo e depois a dispersar pelo
citoplasma (Papathanassiou e King, 1984). A origem do retículo endoplásmico a partir
da membrana externa do invólucro nuclear foi posta em hipótese por Beams e Kessel
(1963) em algumas espécies de lagostins de água doce, dada a relação morfológica
próxima entre elas. Nos ovócitos previtelogénicos do caranguejo-ermita Coenobita

129
Capítulo 2

clypeatus, os grânulos densos estão já presentes em vesículas, cuja membrana só

ocasionalmente parece estar em continuidade com o invólucro nuclear (Komm e
Hinsch, 1985). De forma idêntica, os ovócitos previtelogénicos do concostraca
Leptestheria dahalacencis apresentam todos os organelos desenvolvidos, sendo
observados pequenos grânulos, de aspecto reticular, nas cisternas do retículo
endoplásmico rugoso, mas com origem provável no aparelho de Golgi (Zeni e
Zaffagnini, 1989). O presente trabalho demonstra pois, pela primeira vez nestas
espécies, a formação do retículo endoplásmico a partir do invólucro nuclear, bem como
que os grânulos presentes no retículo endoplásmico são sintetizados previamente no
invólucro nuclear.

Nesta fase previtelogénica assiste-se também à transferência de material nuclear

para o citoplasma através dos numerosos poros nucleares. Este fino material fibrilo-
granular exportado forma no citoplasma massas densas fibrilo-granulares (nuages). Esta
aparente passagem de material nuclear, bem como a presença de nuages, foi também
observada no Coenobita clypeatus (Komm e Hinsch, 1985), no Palaemon serratus
(Papathanassiou e King, 1984) enquanto no não-malacostraca (concostraca)
Leptestheria dahalacencis o material extrudido aparece sob a forma de pequenos
grânulos que se unem em massas granulares no citoplasma perinuclear (Zeni e
Zaffagnini, 1989). Em três géneros de lagostins de água doce, Cambarus sp.,
Orconectes sp. e Procambarus sp. foi observada a passagem de partículas componentes
do nucléolo, sendo reagrupadas posteriormente na região perinuclear (Beams e Kessel,
1963).

Para além da formação do retículo endoplásmico, foi ainda registada no P.

kerathurus a formação do aparelho de Golgi directamente a partir do invólucro nuclear.
Esta observação previamente não descrita constitui a primeira descrição do género nos
crustáceos. O aparelho de Golgi tem origem na fusão de pequenas vesículas formadas
por vesiculação de pequenas e grandes expansões da membrana externa do invólucro
nuclear: as grandes expansões constituem a cisterna transicional do retículo
endoplásmico. Na espécie Palaemon serratus, o aparelho de Golgi é também bastante
activo, produzindo pequenas vesículas que se fundem com as cisternas do RER
(Papathanassiou e King, 1984).

Em P. kerathurus o lado da cisterna transicional do retículo endoplásmico que

fica oposto à área de formação do Golgi, bem como algumas cisternas livres do retículo

130
 Ultrastrutura do Ovócito

endoplásmico, dão origem a pequenas vesículas de densidade intermédia. Estas

vesículas incorporam o fino material fibrilar que está contido no lúmen do retículo
endoplásmico e poderão constituir o início da produção do vitelo endógeno que
caracteriza a vitelogénese primária. Nos ovários imaturos (mas que a nosso ver
possivelmente estão já em vitelogénese primária) da lagosta Homarus americanus são
também já proeminentes no ooplasma vesículas consideradas como parte do RER,
contendo material granular, e que são precursoras do vitelo (Schade e Shivers, 1980).

As vesículas autofágicas encontradas nesta fase no P. kerathurus integram: a)

pequenas estruturas vesiculares densas, as quais estão presentes no espaço
intermembranar do invólucro nuclear e são depois exportadas para as cisternas do
retículo endoplásmico e finalmente vesiculadas; b) figuras de mielina provenientes
directamente do invólucro nuclear e c) pequenas vesículas oriundas do aparelho de
Golgi. Estruturas semelhantes às vesículas autofágicas do P. kerathurus foram descritas
em lagostins de água doce por Beams e Kessel (1963) e denominadas "corpos
membranares complexos". São constituídos por grânulos densos e camadas de
membranas dispostas concentricamente, limitados por uma membrana, podendo esta
estar incompleta. Os autores consideraram a possibilidade de se tratar de áreas
localizadas de atrofia ou degeneração. Estes organelos foram também observados no
camarão Palaemon serratus, apenas durante parte da vitelogénese, desaparecendo no
final desta, sem que a sua função tenha sido determinada (Papathanassiou e King,
1984). A origem dos vacúolos autofágicos é pois neste trabalho demonstrada pela
primeira vez nos crustáceos. A presença de uma membrana lábil, como observada
também por Beams e Kessel (1963), sugere a integração activa de diversos elementos
para a sua organização. Porém, tal como sucedeu com os referidos autores, não nos
foi possível constatar a sua evolução.

Ainda durante a previtelogénese do P. kerathurus, foram observadas pontes

intercelulares entre ovócitos, não se distinguindo diferenças ultrastruturais entre eles. As
pontes intercelulares, indicando uma mesma origem para ambas as células, prossupõe
estarmos em presença da formação de células nutritivas (nurse-cells). Estas, sendo
comuns nos não-malacostraca não foram até agora descritas nos malacostraca (Zeni e
Zaffagnini, 1989), pelo que as nossas observações são as primeiras a demonstrar a sua
existência nesta sub-classe.

131
Capítulo 2

Vitelogénese

A vitelogénese, também referida como vitelogénese secundária ou exógena (Van

Herp e Payen, 1991), é a fase durante a qual se formam as vesículas vitelinas com
incorporação de material extraovocítico. Por isso, é muitas vezes determinada pela
existência na hemolinfa da chamada "proteína específica da fêmea" (Schade e Shivers,
1980).

As distintas características ultrastruturais apresentada pelos ovócitos da espécie P.

kerathurus permitiram a divisão desta fase em vitelogénese inicial, intermédia e final.

Vitelogénese inicial

A vitelogénese inicial caracteriza-se pelo predomínio dos fenómenos de

endocitose mediada por receptores. A fusão das vesículas revestidas (resultado da
endocitose mediada por receptores) com vesículas claras provenientes do aparelho de
Golgi e provavelmente com as vesículas formadas na previtelogénese originam
vesículas vitelinas que se fundem progressivamente entre si para formar grandes
vesículas vitelinas densas. Vesículas revestidas foram também observadas em ovócitos
vitelogénicos da lagosta Homarus americanus (Schade e Shivers, 1980) e no caranguejo
Libinia emarginata (Hinsch e Cone, 1969). Na fase vitelogénica das espécies P.
japonicus (Yano et ai, 1996), Coenobita clypeatus (Komm e Hinsch, 1987) e
Palaemon serratus (Papathanassiou e King, 1984) não foram observadas endocitose
mediada por vesículas revestidas mas apenas por vesículas lisas. A participação do
aparelho de Golgi, por vezes em associação com o RER, na síntese de vitelo parece não
ser comum a todos os crustáceos. Está presente no caranguejo Libinia emarginata
(Hinsch e Cone, 1969), no caranguejo-ermita Coenobita clypeatus (Komm e Hinsch,
1987) e no camarão Palaemon serratus (Papathanassiou e King, 1984), mas parece
não participar na vitelogénese de lagostins de água doce (Beams e Kessel, 1963;
Zerbib, 1979) sendo inclusive a sua presença escassa no peneídeo Penaeus vannamei
(Rankin e Davis, 1990). A entrada de material extraovocítico no Palaemon serratus
durante o início da vitelogénese apenas é possível na forma de baixo peso molecular,
uma vez que não se observa actividade pinocitótica, existindo esta apenas no final da
vitelogénese (Papathanassiou e King, 1984).

132
 Ultrastrutura do Ovócito

No citoplasma, o retículo endoplásmico é agora constituído por grandes

vesículas (com grânulos densos no meio de uma matriz fibrilar), cuja membrana possui
ribossomas (RER). A existência de cisternas do RER contendo grânulos densos (por
vezes em forma de disco ou de anel) é uma das características mais comum na
vitelogénese dos crustáceos (em lagostins de água doce: Beams e Kessel, 1963; no
caranguejo Libinia emarginata: Hinsch e Cone, 1969; nos peneídeos Penaeus aztecus e
P. setiferus: Duronslet et ai, 1975; na lagosta Homarus americanus: Shade e Shivers,
1980; no camarão Palaemon serratus: Papathanassiou e King, 1984; no caranguejo
Coenobita clypeatus; no não-malacostraca Leptestheria dahalacensis: Zeni e
Zaffagnini, 1989 e no peneídeo P. vannamei: Rankin e Davis, 1990).

Em P. kerathurus são ainda visíveis grandes agregados de gotículas lipídicas

cuja origem não foi possível determinar. De forma idêntica, a denominada "fracção
lipídica" do vitelo por Beams e Kessel (1963) em espécies de lagostins de água doce,
parece surgir de novo no citoplasma sem qualquer ligação morfológica com qualquer
organelo citoplasmático, o mesmo acontecendo com o camarão Palaemon serratus
(Papathanassiou e King, 1984). Gotículas lipídicas, elementos esféricos não limitados
por membrana, foram também encontradas por Zerbib (1979) em ovócitos de lagostins
de água doce {Astacus astacus e A. leptodactylus) em vitelogénese secundária, a par
da acumulação das reservas vitelinas de origem exógena e da síntese de vitelo a nível
do retículo endoplasmático rugoso. Durante a vitelogénese secundária nos ovócitos
das espécies de cirripedes Balanus amphitrite e B. perfuratus, são visíveis glóbulos
lipídicos rodeados de mitocôndrias, as quais poderão estar implicadas na sua síntese
(Lepore et ai, 1993). Nos peneídeos Penaeus aztecus e P. setiferus não foram
observadas gotículas lipídicas (Duronslet et ai, 1975) e no não-malacostraca
Leptestheria dahalacensis os lípidos estão presentes junto com polissacáridos (Zeni e
Zaffagnini, 1989).

Durante a vitelogénese inicial, os ovócitos de P. kerathurus estão rodeados de

dois tipos de células foliculares, uma estreita e densa e a outra grande e clara. Este
último tipo parece ser responsável pela síntese de material fibrilar que é exocitado. Não
foi possível averiguar neste trabalho se estes materiais exportados estavam relacionados
com material a endocitar pelo ovócito ou se participavam na formação camada vitelina.
A presença de dois tipos diferentes de células foliculares a rodear um mesmo ovócito
constitui a primeira descrição do género em crustáceos. Uma vez que este trabalho se
centrou fundamentalmente no ovócito, serão necessárias mais investigações para

133
Capítulo 2

determinar a função na ovogénese de cada um dos dois tipos de células foliculares

encontrados.

Vitelogénese intermédia

A vitelogénese intermédia compreende um curto período caracterizado pela

formação de retículo endoplásmico tubular a partir das vesículas do RER, contendo
material fibrilar mas sem grânulos densos, seguido pela confluência e alargamento das
vesículas do retículo endoplásmico rugoso (RER). A confluência das vesículas do RER
parece ser mediada por expansões finas dos mesmos, expansões essas que apresentam
uma morfologia similar à das lamelas aneladas. O RER anastomosado, sintetiza então
um grande número de estruturas em cordão, as quais são vesiculadas. Embora os
pequenos grânulos densos do RER corem positivamente para glicoproteínas, o mesmo
não se passa com os elementos em cordão. Não tendo sido encontrada, na literatura
revista, descrição semelhante para estas transformações do RER, esta fase constitui a
descrição de um mecanismo novo de preparação para a fase final da vitelogénese.

Vitelogénese tardia

Na fase de vitelogénese tardia verifica-se a formação de um novo tipo de

vesículas vitelinas, as quais irão constituir o vitelo definitivo do ovócito maduro. A
formação destas vesículas vitelinas dá-se em espaços restritos do citoplasma delimitado
pelo RER anastomosado. O precursor directo destas vesículas vitelinas é o retículo
endoplásmico tubular (RET). A grande característica deste tipo de vesículas vitelinas é o
carácter lábil da sua membrana limitante, mas que está relacionada com a forma pela
qual estas vesículas vitelinas incorporam os seus precursores. Na realidade, tudo se
passa como num processo de absorção activa de variadíssimos organelos pelas vesículas
vitelinas, e que inclui o RET, pequenas e grandes vesículas golgianas, vesículas
vitelinas densas e corpos mielínicos originados do retículo endoplásmico tubular. Às
vesículas vitelinas associam-se também grânulos de glicogénio, gotículas lipídicas e
vesículas com estruturas em cordão. A associação com as vesículas com estruturas em
cordão possivelmente poderá resultar numa posterior absorção, uma vez que após a
associação o número das vesículas com estruturas em cordão diminui drasticamente. A

134
 Ultrastrutura do Ovócito

participação do retículo endoplásmico e do aparelho de Golgi na formação das vesículas

vitelinas, também foi descrita no caranguejo Libinia emarginata (Hinsch e Cone,
1969). Nos lagostins de água doce as vesículas vitelinas parecem apenas resultar da
participação do RER (Beams e Kessel, 1963). Os nossos resultados constituem a
primeira observação nos crustáceos da formação de vesículas vitelinas com tamanha
capacidade de absorção de variadíssimas estruturas.

Em conclusão, na espécie P. kerathurus o vitelo tem uma origem mista, isto é,

intraovocítica e extraovocítica. No início da vitelogénese predominam os fenómenos de
endocitose mediada por receptores. No entanto, como as vesículas revestidas resultantes
da endocitose logo se fundem com vesículas claras de origem golgiana, as vesículas
vitelinas são de origem mista. Posteriormente, o processo vitelogénico neste crustáceo é
fundamentalmente intraovocítico, exibindo apenas escassos fenómenos de endocitose.

Nos malacostraca o vitelo pode ter origem exclusivamente exógena (P.

japonicus: Yano e Chinzei, 1987; Yano et ai, 1996), mista mas com predominância
endógena (Penaeus semisulcatus: Fainzilber et ai., 1992; Shafir et ai, 1992;
Palaemon serratus: Papathanassiou e King, 1984; Balanus amphitríte e B. perfuratus:
Lepore et ai., 1993), e exclusivamente endógena (gen. Cambaras, Orconectes e
Procambarus sp.: Beams e Kessel, 1963).

A topografia da formação das vesículas vitelinas também varia com as

espécies. Nos lagostins de água doce (gen. Cambaras e Orconectes sp.: Beams e
Kessel, 1963; Astacus astacus e A. leptodactylus: Zerbib, 1979) a concentração de
vitelo faz-se primeiro na periferia do citoplasma enquanto no peneídeo Penaeus
japonicus (Yano, 1988) e no camarão Palaemon serratus (Papathanassiou e King,
1984) as vesículas de vitelo aparecem inicialmente concentradas perto do núcleo
dispersando-se depois para a periferia do ovócito. Este é também o caso na espécie P.
kerathurus tendo em conta o aparecimento na região perinuclear das primeiras
vesículas de densidade intermédia durante a previtelogénese e a dispersão dos
organelos para a periferia. Contudo, na vitelogénese inicial a formação mista das
vesículas vitelinas densas processa-se na região periférica do citoplasma, deslocando-
se depois para o interior da célula. Por último, na vitelogénese final a participação do
RER anastomosado na formação das vesículas vitelinas e a incorporação dos túbulos,
provenientes do retículo endoplásmico tubular (ambos formados na fase de
vitelogénese intermédia), resulta numa distribuição generalizada, por todo o

135
Capítulo 2

citoplasma, das vesículas vitelinas agora num processo de maturação. Nesta fase da
vitelogénese, a rodear os ovócitos encontram-se para além dos dois tipos de células
foliculares já referidos, ovócitos aplanados e cuja possível função como células
nutritivas necessita mais investigação.

Após a vitelogénese está descrito para os crustáceos a formação de organelos

citoplasmáticos denominados especializações corticais, que são estruturas envolvidas
por membrana e que se acumulam no cortex dos ovócitos. Estas especializações são
extrudidas após a fertilização ou a desova para formar uma camada que protege o ovo.
Entre os crustáceos existe uma grande variação no tamanho, número, tipo, composição e
morfologia destas especializações corticais (Duronslet et ai, 1975; Goudeau, 1984;
Rankin e Davis, 1990). No peneídeo P. vannamei estas especializações corticais,
também denominadas "bastonetes corticais" ou "criptas corticais" são descritas como
invaginações fundas do oolema e cujo desenvolvimento se processa no exterior do
ovócito (Rankin e Davis, 1990). Porém, no mesmo trabalho, estes autores encontraram,
por imunocitoquímica, o mesmo polipéptido no retículo endoplásmico rugoso
anastomosado e nos bastonetes corticais e, embora não tenham encontrado explicação
para o seu modo de entrada, concluíram ser intraovocítica a origem dos componentes
extraovocíticos das especializações corticais. Diferentemente, nos peneídeos P. aztecus
e P. setiferus são descritas "grandes inclusões" (bastonetes corticais) na periferia do
ooplasma, encontrando-se nos ovócitos maduros fora do oolema, sendo extrudidas na
desova (Duronslet et ai, 1975).

Na espécie P. kerathurus, a denominação de "criptas corticais" não é correcta,

uma vez que o presente estudo demonstra, pela primeira vez nos crustáceos, que as
"criptas" são resultado não de uma invaginação do oolema mas da fusão de vesículas
corticais com o oolema. Pela primeira vez também se demonstra a origem directa destas
vesículas corticais a partir do RER.

Após a vitelogénese, na espécie P. kerathurus, expansões terminais do retículo

endoplásmico rugoso dão origem a pequenas vesículas, nas quais os grânulos densos do
RER se diferenciam em estruturas do tipo "escova de garrafas". Estas vesículas
contendo as referidas estruturas são as precurssoras das vesículas corticais. Dada a
semelhança morfológica dos componentes das vesículas corticais com a dos
proteoglicanos parece-nos mais correcta esta denominação do que o termo "escova de
garrafas". No seu crescimento as pequenas vesículas corticais fundem-se entre si para

136
 Ultrastrutura do Ovócito

originar grandes vesículas corticais que se fundem então com o oolema. Mesmo nesta
fase, a região baso-lateral das grandes vesículas corticais continua a receber
componentes do RER bem como vesículas golgianas, enquanto que na sua região basal
se continuam a fundir outras vesículas corticais de menor dimensão. Apesar das grandes
vesículas corticais ocuparem praticamente toda a periferia do ovócito, continua a existir
uma enorme população de pequenas vesículas corticais por todo o citoplasma.
Contrariamente ao descrito para a espécie Penaeus monodon (Tan-Fermin e Pudera,
1989), na qual a coloração histoquímica das vesículas corticais indica a ausência de
lípidos e a presença de glicoproteínas, na espécie P. kerathurus a técnica citoquímica
de Thiéry para glicoproteínas não marcou positivamente as vesículas corticais, apesar
de incorporarem glicoproteínas com origem no retículo endoplásmico e no aparelho de
Golgi.

Na espécie Penaeus kerathurus algumas pequenas vesículas corticais foram

observadas a exportar totalmente o seu conteúdo para o espaço perivitelino, o qual
parece incorporar-se de seguida na camada vitelina. Na lagosta da espécie Homarus
americanus, a camada vitelina ou corion está dividida num componente externo e
outro interno (Talbot, 1981b). O exocorion parece composto de glóbulos embebidos
numa matriz amorfa ou fibrilar enquanto que o endocorion para além dos elementos
globulares, contém estruturas de tipo proteoglicano. Nesta espécie, o corion tem a sua
origem nas células foliculares, incluindo os elementos do endocorion em forma de
proteoglicanos (Talbot, 1981b). Desta forma é possível a existência no P. kerathurus
de uma camada vitelina com origem mista, ou seja a partir de material exocitado quer
pelas células foliculares quer pelas pequenas vesículas corticais.

A periferia dos ovócitos maduros é revestida por três tipos de células: células
foliculares densas, células foliculares claras e ovócitos em processo limitado de
desenvolvimento citoplasmático. Estes ovócitos aplanados parecem não representar
uma estrutura celular abortiva mas sim uma transformação para funcionarem como
células tróficas (nurse-cells). Os argumentos a este favor incluem, a inexistência de
microvilosidades em direcção ao ovócito, o desenvolvimento de vitelo concomitante
com o do ovócito e a manutenção da "nurse-cell" em torno da superfície do ovócito
acompanhando as células foliculares. A constituírem células de específica função
trófica, e não ovócitos abortivos, a sua existência em crustáceos malacostraca é pela
primeira vez referida. De facto, as células nutritivas dos ovócitos constituem uma

137
Capítulo 2

característica primitiva dos crustáceos estando presentes em alguns não-malacostraca

mas ausentes em todos os malacostraca (Zeni e Zaffagnini, 1989).
Abreviaturas genéricas utilizadas nas microfotografias (microscopia electrónica de
transmissão)

AV - vesícula autofágica Mf - microfilamentos

BL - lâmina basal Mt - microtúbulos

C - agregados em cordão Mv - microvilosidades

CV - vesícula cortical N - núcleo

D-FC - célula folicular densa n - "nuages"

D-YV - vesícula vitelina densa Ne - nucléolo

ER - retículo endoplásmico np - poros nucleares

FC - célula folicular O - ovócito

G - aparelho de Golgi O-NC - célula nutritiva do ovócito

g - grânulo denso RER - retículo endoplásmico rugoso

Gg - glicogénio T - retículo endoplásmico tubular

ICB - pontes inter-celulares TER - cisterna transicional do retículo

endoplásmico (associado à
L - gotícula lipídica
formação do aparelho de Golgi)
L-FC - célula folicular clara
VL - camada vitelina
L-YV - vesícula vitelina clara
YV - vesícula vitelina
M - mitocôndria
Previtelogénese

Figura 1. Região perinuclear onde é visível a acumulação de mitocôndrias (M), retículo endoplásmico
(ER), aparelho de Golgi (G) e massas densas fíbrilo-granulares (n - "nuages"). No espaço
intermembranar do invólucro nuclear podem ser observados pequenos grânulos electrono-
densos que são exportados para as cisternas do retículo endoplásmico em formação (setas). No
núcleo (N), e ligados ao seu invólucro, vêm-se alguns nucléolos periféricos (Ne) compostos
por massas globulares densas interligadas por uma rede de finos cordões, x 16.000

Figura 2. Detalhe da formação de cisternas do retículo endoplásmico (ER) a partir de expansões da

membrana externa do invólucro nuclear e do espaço intermembranar (seta) onde também se
observam pequenos grânulos eletrono-densos (g) que são exportados para essas cisternas do
retículo endoplásmico. Do núcleo, onde é visível a rede de finos cordões que interligam os
nucléolos (Ne), é exportado através dos numerosos poros nucleares (np) material fibrilo-
granular que no citoplasma formam as nuages (n ). x 20.000

Figura 3. Pormenor de um agregado de grânulos intereromatínicos (*) no nucleoplasma. x 8.000

Figura 4. Técnica citoquímica de Thiéry. Os grânulos densos (g) do retículo endoplásmico (ER) marcam
positivamente para glicoproteínas. (G), aparelho de Golgi. x 26.000

Figura 5. Pormenor de um conjunto de mitocôndrias (M), no qual se pode observar o seu aspecto
pleomórfico e ramificado, x 10.600

Figuras 6 e 7. Formação do aparelho de Golgi (G) a partir da vesículação de expansões curta (b) e
alongada (TER) da membrana externa do invólucro nuclear. A expansão alongada circunda a
área de formação do Golgi e constitui uma cisterna transicional do retículo endoplásmico
(TER) à qual se associam grânulos densos (g). Nesta região perinuclear são ainda visíveis
várias mitocôndrias (M), material fibrilo-granular (n - "nuages"), e grânulos densos no interior
do invólucro nuclear (seta). Algumas cisternas livres do retículo endoplásmico (ER), bem
como o lado da cisterna transicional do retículo endoplásmico que fica oposto à área de
formação do Golgi, originam pequenas vesículas de densidade intermédia (V). Estas vesículas
incorporam o fino material fibrilar que está contido no lúmen do retículo endoplásmico. Fig. 6,
x 30.000; Fig. 7, x 24.000

140
141
Previtelogénese

Figura 8. Aparelho de Golgi (G), formado e independente das ligações ao invólucro nuclear. Note-se que
a cisterna transicional do retículo endoplásmico (TER), que dá origem por vesiculação a partir
de sua face côncava (*) ao Golgi, se apresenta ligado ao retículo endoplásmico (ER). A
cisterna transicional do retículo endoplásmico também origina, a partir da sua face convexa as
vesículas de densidade intermédia (V). M, mitocôndria. x 24.000

Figuras 9 - 14. Formação das vesículas autofágicas (AV). As vesículas autofágicas surgem na periferia
nuclear e apresentam-se rodeadas por nuages (n). No interior das vesículas autofágicas podem-
se descriminar estruturas de tipo vesicular e estruturas tipo corpos mielínicos (figura 9). As
vesículas autofágicas incorporam vários elementos: a) pequenas estruturas vesiculares que
surgem no interior de expansões da membrana externa e invólucro nuclear (figura 10, seta),
que são de seguida incorporadas no retículo endoplásmico (ER) (figura 11, seta), e finalmente
exportadas deste na forma de grandes vesículas (figura 12, seta); b) estruturas tipo corpos de
mielina exportadas directamente do invólucro nuclear (figura 13, recta); e c) vesículas
transgolgianas (figura 14, seta). Nas microfotografías também são evidentes a associação entre
os poros nucleares (np) e as nuages (n), grânulos densos (g) no interior do invólucro nuclear,
mitocôndrias (M), microtúbulos (Mt), aparelhos de golgi (G) em formação a partir de
expansões do invólucro nuclear que formam as cisternas transicionais do retículo
endoplásmico (TER), e vesículas de densidade intermédia (V). Figura 9 - 11, x 20.000; Figura
13, x 16.000; Figura 14, x 30.000.

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143
Previtelogénese

Figura 15. Acumulação na periferia do ovócito dos vários organelos difundidos do espaço perinuclear
onde são formados: mitocôndrias (M), cisterna transicional do retículo endoplásmico (TER),
aparelho de Golgi (G), cisternas livres de retículo endoplásmico (ER) e vesículas de
densidade intermédia (V). Rodeando o ovócito pode ser observada uma célula folicular (FC)
de núcleo alongado e eucromático. No seu citoplasma apenas se observam mitocôndrias (M),
e numerosos feixes de microtúbulos (Mt). x 20.000

Figura 16. Detalhe de uma ponte intercelular (ICB) interligando dois ovócitos adjacentes de aspecto
ultrastrutural idêntico. Limitando a ponte intercelular e separando os dois ovócitos podem ser
visualizadas pequenas porções das células foliculares (FC). No citoplasma de um dos
ovócitos encontramos vários organelos como mitocôndrias (M), uma cisterna transicional de
retículo endoplásmico (TER) a dar origem ao aparelho de Golgi (G) e a vesículas de
densidade intermédia (V), e cisternas livres de retículo endoplásmico (ER) a formar também
pequenas vesículas de densidade intermédia. Junto ao invólucro nuclear encontramos massas
densas fibrilo-granulares ("nuages"-n) situadas em oposição ao nucléolo (Ne), x 16.000

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145
Vitelogénese Inicial

Figura 17. Entre dois ovócitos (O) adjacentes podem ser observados dois tipos de células foliculares:
células foliculares densas (D-FC) e células foliculares claras (L-FC). x 5.600

Figura 18. A limitar um ovócito, cujo citoplasma para além de algumas mitocôndrias (M) se encontra
repleto de vesículas de retículo endoplásmico rugoso (RER) contendo inúmeros grânulos
electrono-densos (g), pode ser observada uma célula folicular densa (D-FC). A célula
folicular densa (D-FC), estreita, possui um núcleo (N) alongado e um citoplasma
preenchido com cisternas de retículo endoplásmico rugoso (RER). No citoplasma da célula
folicular densa (D-FC) podem ser ainda observadas mitocôndrias (M) e um aparelho de
Golgi(G). x 10.600

Figura 19. Constituindo outro tipo de célula folicular, a célula folicular clara (L-FC) é de maior
dimensão. Possui um núcleo claro, um citoplasma pouco denso rico em retículo
endoplásmico rugoso (RER) e mitocôndrias (M). No citoplasma pode ainda ser observado
um vacúolo (Va). Por fora da célula folicular observa-se uma porção da parede do ovário
separada por lâminas basais (LB) e contendo células alongadas ricas em microfilamentos
(Mf). x 8.000

Figura 20. Pormenor de uma célula folicular clara (L-FC), apresentando um grande núcleo (N) e um
citoplasma com mitocôndrias (M), retículo endoplásmico rugoso (RER) e algumas vesículas
contendo material fibrilar a ser exocitado (setas) para o espaço perivitelino, contribuindo
deste modo para a formação da camada vitelina. Nesta microfotografia pode-se também
observar um ovócito adjacente à célula folicular clara (L-FC). No seu citoplasma observam-
se vesículas de retículo endoplásmico rugoso (RER) com grânulos electrono-densos no seu
interior, gotículas lipídicas (L) e vesículas vitelinas (YV) em formação por fusão de vesículas
de menor dimensão (V). x 20.000

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147
Vitelogénese Inicial

Figura 21. A vitelogénese inicial caracteriza-se pela proeminência dos fenómenos de endocitose. O
citoplasma do ovócito está preenchido por grandes vesículas de retículo endoplásmico
rugoso (RER) de matriz fibrilar e com pequenos grânulos densos. Na periferia do ovócito,
junto à membrana citoplásmica, uma vesícula vitelina (YV) em formação funde-se com
pequenas vesículas (V) revestidas resultantes de endocitose. São visíveis algumas
microvilosidades (Mv) do ovócito. A célula folicular (FC), com um núcleo bem
desenvolvido (N), apresenta no seu citoplasma retículo endoplásmico rugoso (RER) e um
aparelho de Golgi (G). Algumas vesículas, presentes na periferia da célula folicular, parecem
exocitar o seu conteúdo no espaço perivitelino, contribuindo para a formação da camada
vitelina (seta), x 16.000

Figura 21 (inset). Detalhe da endocitose de material finamente granular existente no espaço perivitelino
(entre o ovócito e a célula folicular - FC). Por se tratar de uma vesícula revestida (seta), o
processo representa endocitose mediada por receptores. Após a endocitose, estas vesículas
revestidas perdem o seu revestimento e fundem-se com as vesículas vitelinas em formação, x
26.000

Figura 22. Na periferia do citoplasma do ovócito, limitado superiormente por uma célula folicular (FC),
observa-se uma vesícula vitelina (YV) em formação que se funde com vesículas (VI)
provenientes de endocitose (seta) e vesículas (V2) provenientes do aparelho de Golgi (G), x
20.000

Figura 23. As vesículas vitelinas (V) originadas por endocitose e por participação golgiana dispersam-se
da periferia do citoplasma para o interior da célula, acabando por se fundir entre si para
originar vesículas vitelinas densas de grande dimensão (YV). Para além das vesículas de
retículo endoplásmico rugoso (RER), contendo pequenos grânulos densos (g), e de
mitocôndrias, o citoplasma do ovócito apresenta nesta fase agregados de gotículas lipídicas
(L). x 16.000

Figura 24. Ocasionalmente observaram-se grandes vesículas de densidade intermédia (YV) oriundas de
expansões (seta) do retículo endoplásmico (ER). Estas vesículas constituem um segundo tipo
de vesículas vitelinas em formação e a sua membrana lábil parece receber por fusão vesículas
golgianas (a) e vesículas de endocitose (b). Nesta fase, encontram-se frequentemente à
superfície dos ovócitos agregados de cisternas de retículo endoplásmico rugoso dispostas
circunferencialmente (*). Na célula folicular (FC) que limita o ovócito, pode ser observado o
seu núcleo (N), bem como um vacúolo (Va) no seu citoplasma, x 20.000

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149
Vitelogénese Inicial

Figura 25. Pormenor de uma vesícula vitelina de densidade intermédia (YV) para evidenciar a sua
relação com componentes das vesículas de retículo endoplásmico rugoso (RER). No interior
da vesícula vitelina nota-se ainda a presença dos grânulos densos (g), específicos do retículo
endoplásmico rugoso. x 26.000

Figura 26. Pormenor dos dois tipos de vesículas vitelinas, densas (D-YV) e de densidade intermédia (L-
YV) rodeadas de vesículas de retículo endoplásmico rugoso (RER) com grânulos densos no
seu interior, gotículas lipídicas (L), e mitocôndrias (M), x 16.000

Figuras 27 e 28. Ocasionalmente, as vesículas do retículo endoplásmico rugoso (RER) formam no seu
interior agregados em forma de cordão (Cl) que são circundados por grânulos densos (g) e
progressivamente concentrados na periferia do retículo endoplásmico rugoso (seta) até à sua
completa vesiculação (C2). Fig. 27, x 26.000; Fig. 28, x 16.000

Figura 29. Nesta fase de vitelogénese inicial os ovócitos apresentam núcleos volumosos eucromáticos
com nucléolos (Ne) de grande dimensão. Os nucléolos compõem-se de uma grande região
central densa rodeada por uma estreita zona periférica reticulada. Excepto numa estreita faixa
na periferia do núcleo, o citoplasma perinuclear apresenta-se preenchido por vesículas de
retículo endoplásmico rugoso (RER), com grânulos densos no seu interior, mitocôndrias (M)
e vesículas vitelinas densas (YV). x 8.000

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151
Vitelogénese intermédia. Fase inicial.

Figuras 30 - 33. Esta fase caracteriza-se pela formação extensa de retículo endoplásmico tubular (T) a
partir de expansões (setas) do retículo endoplásmico rugoso (RER), expansões que não
possuem grânulos densos (g) e acumulam no seu lúmen um material finamente fibrilar.
Na figura 33 pode-se observar a continuidade das vesículas do retículo endoplásmico
rugoso (RER), com os seus prolongamentos, nomeadamente, a origem do retículo
endoplásmico tubular (seta) e a cisterna transicional do retículo endoplásmico (TER)
associado ao aparelho de Golgi (G). Fig. 30, x 16.000; Fig. 31, x 20.000; Fig. 32, x
20.000; Fig. 33, x 32.000

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153
Vitelogénese intermédia. Fase Final.

Figura 34 - 37. Esta fase caracteriza-se pela hipertrofia, dilatação e confluência anastomótica das
vesículas do retículo endoplásmico rugoso (RER), com deslocação preferencial dos seus
grânulos densos (g) para a sua periferia. Nesta fase ocorrem outros dois fenómenos: a) a
formação de pontes entre as vesículas do retículo endoplásmico rugoso (*), pontes essas
com aspecto de lamelas aneladas; e, b) a formação no interior do retículo endoplásmico
rugoso de inúmeros agregados de estruturas em cordão (Cl) dele delimitadas por
grânulos densos (g), e que são vesiculados (setas) para formar vesículas livres com as
estruturas em cordão e alguns grânulos densos (C2). Fig. 34, x 26.000; Fig. 35, x
32.000; Fig. 36 e 37, x 26.000.

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155
Vitelogénese tardia
A vitelogénese tardia caracteriza-se pela presença do retículo endoplasmics rugoso (RER) anastomotic»
extenso e pela formação extensiva de vesículas vitelinas (YV) essencialmente a partir de materiais
endógenos.

Figura 38. Uma célula folicular clara (L-FC), com um núcleo de grande dimensão, limita um ovócito em
vitelogénese tardia, o qual, apresenta microvilosodades (Mv) que atravessam a camada
vitelina (VL) que separa os dois tipos celulares. No citoplasma do ovócito, o retículo
endoplásmico rugoso (RER) anastomótico, limita áreas de citoplasma onde se concentram
gotículas lipídicas (L), mitocôndrias (M) e vesículas vitelinas em formação (a e b). As
vesículas de vitelo (a), com que se fundem as vesículas de endocitose são mais escassas nesta
fase. As vesículas vitelinas predominantes (b) são de muito maior dimensão e a sua origem é
essencialmente endógena, x 8.000

Figura 39. Pormenor de uma vesícula vitelina em formação (a) por fusão com vesículas de endocitose
(setas). A limitar o ovócito, pode-se observar para além das células foliculares, ovócitos (O-
NC) de forma aplanada e de desenvolvimento retardado, os quais parecem ter um papel de
células nutritivas ("nurse-cells"), x 16.000

Figura 40. O retículo endoplásmico rugoso (RER), altamente anastomosado nesta fase avançada da
vitelogénese, limita áreas do citoplasma onde se processa o crescimento e a maturação das
vesículas vitelinas. As grandes vesículas vitelinas (b) são de origem essencialmente endógena
e constituiem virtualmente todo o vitelo. No entanto, em menor quantidade, observam-se
também vesículas vitelinas de menores dimensões (a) resultantes de uma origem associada à
endocitose e que por isso se apresentam rodeadas por pequenas vesículas em fusão (setas).
Nesta áreas do citoplasma encontram-se gotículas lipídidas (L), aparelho de Golgi (G) e
mitocôndrias (M) anelares, x 8.000

Figura 41. Uma célula folicular densa (D-FC), com um núcleo (N) alongado e um retículo endoplásmico
rugoso (RER) muito desenvolvido e lamelado encontra-se adjacente a um ovócito em
vitelogénese avançada. A porção de citoplasma do ovócito vísivel na microfotografia é quase
completamente preenchida por retículo endoplásmico rugoso (RER) anastomosado contendo
grânulos densos (g). Frequentemente, o retículo endoplásmico rugoso forma finas expansões
do tipo lamelas aneladas (**) dirigidas para o oolema. O retículo endoplásmico rugoso
anastomosado também delimita pequenas áreas cujo citoplasma adquire uma textura menos
densa (*) onde parecem formar-se pequenas partículas densas de glicogénio. Entre o ovócito
e a célula folicular densa (D-FC) pode ser observada a camada vitelina (VL) interrompida
apenas por algumas microvilosidades (Mv) do ovócito. x 20.000

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Vitelogénese tardia

Figura 42. Os vários nucléolos (Ne) presentes no núcleo, de grandes dimensões, do ovócito em
vitelogénese tardia, são compostos de grandes massas densas e irregulares, interligadas por
um amplo retículo de finos cordões. O invólucro nuclear é perfurado de inúmeros poros
nucleares (np). No citoplasma perinuclear observam-se, no espaço deixado livre pelo retículo
endoplásmico rugoso (RER) altamente anastomosado, mitocôndrias (M), gotículas lipídicas
(L) e vesículas vitelinas (YV). x 10.600

Formação e maturação do vitelo

As vesículas vitelinas que ocuparão o citoplasma do ovócito maduro correspondem às grandes vesículas
vitelinas que se formam na fase de vitelogénese tardia. Este vitelo deriva, em primeira instância, de
expansões do retículo endoplásmico rugoso (Fig. 24) e da incorporação (Fig. 44) do retículo
endoplásmico tubular (T) formado na fase de vitelogénese intermédia (Figs. 30 a 33). Na formação do
vitelo intervêem ainda o glicogénio (Figs. 46 e 47), vesículas golgianas (Fig. 48), vesículas vitelinas
densas (Fig. 49), corpos lamelares originados do sistema tubular do retículo endoplásmico (Figs. 50 e 51)
e vesículas do retículo endoplásmico com estruturas em cordão (Fig. 52).

Figura 43. Vesícula de retículo endoplásmico rugoso (RER), contendo grânulos densos (g), ainda
apresentando conexões evidentes ao retículo endoplásmico tubular (T). x 26.000

Figura 44. Completamente rodeada de retículo endoplásmico rugoso (RER) anastomótico observa-se a
formação de uma vesícula vitelina em processo de fusão com o sistema tubular do retículo
endoplásmico (T) e sua posterior absorção (setas). Em contacto íntimo com a vesícula
vitelina em formação são observadas gotículas lipídicas (L) e pequenas vesículas claras (V)
provenientes do aparelho de Golgi. x 20.000

Figura 45. O aparelho de Golgi (G), continua a receber pequenas vesículas (v) do retículo endoplásmico
rugoso (RER) e produz vesículas (V). Nestas áreas observa-se a formação de partículas P de
glicogénio (Gg). x 40.000

Figura 46. Os grânulos de glicogénio (Gg) formados em pequenas áreas de citoplasma delimitadas por
ramificações do retículo endoplásmico rugoso (RER) anastomótico, migram para a periferia
das vesículas vitelinas (YV). x 40.000

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Vitelogénese tardia.

Formação e maturação do vitelo.

Figura 47. Detalhe de uma vesícula vitelina (YV) rodeada completamente pelo retículo endoplásmico
rugoso (RER) anastomosado, mostrando a sua associação com gotículas lipídicas (L) e
grânulos de glicogénio (Gg) bem como a fusão com pequenas vesículas (seta) provenientes
do aparelho de Golgi (G), x 20.000

Figura 48. Na área do citoplasma do ovócito limitada pelo retículo endoplásmico rugoso (RER)
anastomosado, e onde se encontra uma vesícula vitelina em processo de maturação, podem
ser observados vários elementos que nesta fase se fundem com a vesícula vitelina (YV):
vesículas grandes provenientes do Golgi (V) e elementos tubulares (T) do retículo
endoplásmico tubular. As vesículas grandes do Golgi contêm um material grânulo-fíbrilar. x
20.000

Figura 48 (inset). Detalhe da fusão (seta) de uma grande vesícula de origem golgiana (V), contendo um
fino material grânulo-fibrilar, com uma vesícula vitelina (YV) em processo de maturação, x
20.000

Figura 49. No elaborado processo de maturação das vesículas vitelinas (YV), estas também se fundem
com as vesículas vitelinas densas (setas) incorporando-as no seu interior (inset). No inset é
ainda evidente a fusão das vesículas vitelinas com vesículas (V) claras provenientes do
aparelho de Golgi. Fig.49, x 10.600; inset, x 20.000

Figura 50. O retículo endoplásmico tubular (T), elaborado a partir do retículo endoplásmico rugoso
(RER), dá também origem a figuras mielínicas (setas) que se fundem com a vesícula vitelina
(YV) em processo de maturação, x 26.000

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Vitelogénese tardia.

Formação e maturação do vitelo.

Figura 51. Fusão e incorporação dos corpos mielínicos (a, b, c) nas vesículas vitelinas (YV). Podem
também ser observadas inúmeras gotículas lipídicas (L) dispersas na pequena área do
citoplasma entre o retículo endoplásmico rugoso (RER) e as vesículas vitelinas (YV). x
16.000

Figura 51 (inset). Uma vez incorporadas na vesícula vitelina (YV) o conteúdo dos corpos mielínicos
parece dispersar-se (*). x 20.000

Figura 52. As vesículas derivadas do retículo endoplásmico rugoso (RER) contendo estruturas em cordão
(C) associam-se intimamente com as vesículas vitelinas (YV). Apesar de não terem sido
observados fenómenos de incorporação, o número de vesículas com estruturas em cordão
decresce significativamente após esta fase de interacção com as vesículas vitelinas. Na
imagem pode também observar-se a fusão continuada do retículo endoplásmico tubular (T)
com as vesículas vitelinas. x 20.000

Figura 53. Técnica citoquímica de Thiéry para detecção de polisacáridos e glicoproteínas. Note-se a
marcação intensa dos grânulos densos (g) do retículo endoplásmico rugoso (RER)-
glicoproteínas - e a presença de inúmeros grânulos de glicogénio (Gg) dispersos no
citoplasma. As membranas dos organelos ricos em glicoproteínas também estão
evidenciadas. A marcação das gotículas lipídicas (L) é um efeito secundário da técnica. Note-
se que o retículo endoplásmico tubular (T) e as estruturas em cordão (C) do retículo
endoplásmico rugoso não marcam para as glicoproteínas. x 20.000

Figura 54. Nas grandes vesículas (V) originadas no aparelho de Golgi (G), as fibrilas não reagem à
coloração citoquímica de Thiéry para o glicogénio, mas os grânulos contidos nas pequenas
vesículas, que têm a mesma origem (*), coram positivamente e parecem largar o seu
conteúdo na superfície (seta) da vesícula vitelina. x 26.000

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163
Formação das vesículas corticais

Figura 55. Região perinuclear. Nesta fase da ovogénese o retículo endoplásmico rugoso (RER)
anastomosado cinde-se em inúmeras vesículas, contendo ainda grânulos densos, que
juntamente com as vesículas vitelinas (YV), mitocôndrias (M) e gotículas lipídicas (L)
preenchem todo o citoplasma. Entre este conjunto de organelos citoplasmáticos aparecem
agora inúmeras pequenas vesículas corticais (CV), de superfície irregular, compostas por
estruturas cujo aspecto morfológico é semelhante ao dos proteoglicanos. Nesta fase, o núcleo
apresenta vários nucléolos (Ne), pequenos e reticulados, x 8.000

Figura 56. Região interna do citoplasma. O citoplasma está repleto de vesículas vitelinas (YV), entre as
quais se observam mitocôndrias (M), gotículas lipídicas (L), vesículas de retículo
endoplásmico rugoso (RER) e pequenas vesículas corticais (CV). x 8.000

Figura 57. Na periferia do ovócito, limitado neste caso por uma célula nutritiva (O-NC) e dela separada
pela camada vitelina (VL), observa-se uma vesícula cortical (*) de maior dimensão, fundida
ao oolema pela sua zona apical (setas). Este fenómeno, nesta fase, é, porém, ocasional. Nesta
zona periférica do ovócito estão também presentes pequenas vesículas corticais (CV),
vesículas vitelinas (YV), mitocôndrias (M), vesículas de retículo endoplásmico rugoso (RER)
e gotículas lipídicas (L). x 5.600

Figura 58. Origem das vesículas corticais. As vesículas corticais (CV) formam-se.a partir de expansões
terminais do retículo endoplásmico rugoso (RER), cujo conteúdo em grânulos densos (g) se
parece diferenciar (seta) em estruturas do tipo proteoglicano ( [ ] ). Nesta fase, as vesículas
corticais (CV) também exibem finas expansões (pontas de seta) que limitam áreas do
citoplasma com matriz menos densa (*). x 32.000

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165
Formação das vesículas corticais

Figura 59. Expansões (seta) do retículo endoplásmico rugoso (RER) originam as vesículas corticais
(CV). No interior e periferia das vesículas corticais, os grânulos densos do retículo
endoplásmico rugoso (g) desagregam-se para formar as estruturas de tipo proteoglicano ([ ]).
As gotículas lipídicas (L), agora em menor número, continuam individualizadas. Junto de
uma mitocôndria (M), pode observar-se uma vesícula com estruturas em cordão (C). x
32.000

Figura 60. As vesículas corticais (CV) apresentam num dos poios umas finas expansões (pontas de seta)
que delimitam pequenas áreas de citplasma (*) com matriz mais clara. Esta área do
citoplasma é depois incorporada na vesícula cortical (seta), x 26.000

Figura 61. Entre o núcleo (N) e uma vesícula vitelina (YV) encontra-se uma vesícula cortical (CV) em
formação. É ainda nítida a ligação tubular (T) ao retículo endoplásmico, bem como a
diferenciação do conteúdo do retículo endoplásmico (seta) nos elementos tipo proteoglicano
([ ]). Junto à vesícula cortical podem ainda observar-se uma vesícula com estruturas em
cordão (C) e gotículas lipídicas (L). x 26.000

166
167
 Ovócitos maduros

Figura 62. Região perinuclear. Nesta fase, caracterizada pela existência na periferia do ovócito de grandes
vesículas corticais fundidas com o oolema, o núcleo apresenta novamente nucléolos (Ne) de
maior dimensão constituídos por pequenas regiões redondas e densas rodeadas por uma ampla
rede de finos cordões. O citoplasma perinuclear apresenta vesículas vitelinas (YV), pequenas
vesículas de retículo endoplásmico rugoso (RER), pequenas vesículas corticais (CV),
mitocôndrias aneladas (M), agregados de glicogénio (Gg) e gotículas lipídicas (L). x 8.000

A região do citoplasma que se situa entre a região perinuclear e a base das vesículas corticais gigantes da
superfície denomina-se citoplasma interno e apresenta três estratos morfologicamente distintos: estratos
interno, médio e externo (Figs. 63, 64 e 65).

Figura 63. A seguir à região perinuclear, o citoplasma apresenta uma enorme densidade de pequenas
vesículas corticais (CV), mitocôndrias (M), pequenas vesículas de retículo endoplásmico
rugoso (RER), agregados de glicogénio (Gg) e gotículas lipídicas (L). Neste fundo observam-
se também várias vesículas vitelinas (YV). x 5.600

Figura 64. O estrato médio do citoplasma interno evidencia uma grande densidade de vesículas vitelinas
(YV), as quais apresentam à sua periferia grandes agregados de grânulos de glicogénio. Nesta
região, a densidade das pequenas vesículas de retículo endoplásmico rugoso (RER),
mitocôndrias (M) pequenas vesículas corticais (CV) e gotículas lipídicas (L) é muito menor.
x 8.000

Figura 65. O estrato externo do citoplasma interno é igualmente rico em vesículas vitelinas (YV), mas
praticamente sem glicogénio associado, estando envolvidas por um retículo endoplásmico
rugoso (RER) anastomosado. As mitocôndrias (M) voltam a ser aneladas, as gotículas
lipídicas (L) são escassas e as vesículas corticais estão virtualmente ausentes, x 8.000

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169
Ovócitos maduros

Figura 66. Na zona do citoplasma onde se encontra a parte basal das grandes vesículas corticais (L-CR)
já fundidas com o oolema, o número de vesículas vitelinas (YV) é menor e o retículo
endoplásmico rugoso (RER) torna-se menos anastomosado, apresentando pontes entre si que
tomam a forma de "lamelas aneladas" (*). Nesta zona encontram-se também várias pequenas
vesículas corticais (CV), mitocôndrias (M) e gotículas lipídicas (L). x 8.000

Figura 67. Detalhe das pontes entre o retículo endoplásmico rugoso (RER), com o seu aspecto tipo
"lamelas aneladas" (*). x 26.000

Figura 68. Região baso-lateral das grandes vesículas corticais (L-CV) periféricas. Na sua proximidade
encontram-se gotículas lipídicas (L) isoladas, pequenas vesículas corticais (CV), aparelho de
Golgi (G), retículo endoplásmico rugoso (RER), vesículas vitelinas (YV), e mitocôndrias
(M), algumas das quais com forma anelar, x 8.000

Figura 69. A região baso-lateral das grandes vesículas corticais periféricas (L-CV) funde-se com
vesículas de conteúdo granulo-fibrilar (seta) e com vesículas claras (*) golgianas. x 16.000

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171
Ovócitos maduros

Figuras 70 a 74. Região superficial do ovócito

Figura 70. No cortex do ovócito as grandes vesículas corticais (L-CV) apresentam-se fundidas com o
oolema. Podem também observar-se várias pequenas vesículas corticais (CV), gotículas
lipídicas (L) isoladas, vesículas vitelinas (YV) e vesículas de retículo endoplásmico rugoso
(RER). O ovócito está separado da célula folicular (FC) pela camada vitelina (VL). x 8.000

Figura 71. Pormenor da zona apical de uma grande vesícula cortical (L-CV). Apesar de todo o conteúdo
destas vesículas corticais estar exposto ao exterior, apenas a porção apical do conteúdo da L-
CV se parece dispersar e fundir com a camada vitelina (VL). Nesta zona o ovócito está
recoberto por uma célula nutritiva (O-NC). x 26.000

Figura 72. Contrariamente às grandes vesículas corticais, pequenas vesículas corticais (*) fundem-se com
o oolema e o seu conteúdo é completamente exocitado e fundido com a camada vitelina
(VL). A célula folicular (FC) adjacente ao ovócito é estreita e de tipo denso, x 8.000

Figura 73. Na periferia do ovócito podem ser observadas vesículas vitelinas (YV), pequenas vesículas
corticais (CV), gotículas lipídicas (L) isoladas, mitocôndrias (M) e vesículas de retículo
endoplásmico rugoso (RER), que nesta região já não é anastomosado. Entre o ovócito e a
célula folicular de tipo claro (FC) que a limita está bem vísivel a camada vitelina (VL). x
16.000

Figura 74. Algumas regiões da superfície do ovócito são rodeadas não por células foliculares mas por
ovócitos aplanados, representando provavelmente o papel de células nutritivas (O-NC). Nesta
fase de ovogénese estas apresentam, um núcleo (N) cuja disposição da heterocromatina em
barras densas periféricas lembra os processos de apoptose. Na região periférica do ovócito,
além das vesículas vitelinas (YV) estão presentes pequenas vesículas corticais (CV),
mitocôndrias (M), gotículas lipídicas (L) isoladas e um grande número de pequenas vesículas
de retículo endoplásmico rugoso (RER). x 16.000

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173
Ovócitos maduros

Figuras 75 a 78. Técnica citoquímica de Thiéry

Figura 75. Região do citoplasma junto à porção basal das grandes vesículas corticais. Pormenor do
aparelho de Golgi (G) para evidenciar a origem golgiana de vesículas com componentes
marcados positivamente para as glicoproteínas (V). Na imagem é também evidenciado
pequenos depósitos de glicogénio (setas) na periferia das vesículas vitelinas (YV) e dispersos
no citoplasma. Os grânulos densos (g) do retículo endoplásmico rugoso (RER), também
marcam positivamente para as glicoproteínas. x 16.000

Figura 76. Região baso-lateral das grandes vesículas corticais (L-CV). Verifica-se que pequenas
vesículas do retículo endoplásmico rugoso (RER) se fundem com a vesícula cortical sendo
absorvidas (setas) É também patente a fusão de uma vesícula golgiana (V) com uma vesícula
vitelina (YV). Nesta imagem estão marcados positivamente para as glicoproteínas os
grânulos densos (g) do retículo endoplásmico rugoso (RER) e o conteúdo da vesícula
golgiana (V). O glicogénio marcado apresenta-se na forma de pequenas partículas densas
dispersas pelo citoplasma (Gg). x 26.000

Figura 77. Estrato médio do citoplasma interno. Note-se a marcação positiva para o glicogénio (Gg) que
forma agregados na periferia das vesículas vitelinas (YV) e das vesículas corticais (CV). Os
grânulos densos (g) do retículo endoplásmico rugoso (RER) estão marcados positivamente
para glicoproteínas. x 8.000

Figura 78. Região basal e lateral das grandes vesículas corticais (L-CV). Na porção basal da grande
vesícula cortical (L-CV) ocorrem fenómenos de fusão (*) com pequenas vesículas corticais
(CV). A porção lateral da grande vesícula cortical (L-CV) funde-se com vesículas golgianas
(V). O conteúdo da vesícula golgiana (V) e os grânulos densos (g) do retículo endoplásmico
rugoso (RER) marcam positivamente para as glicoproteínas. No citoplasma os agregados de
partículas densas estão positivamente marcados para o glicogénio (Gg). x 16.000

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175
Ovócitos maduros

Figuras 79 a 82. Técnica citoquímica de Thiéry

Figura 79. Região baso-lateral de uma grande vesícula cortical (L-CV). Pormenor evidenciando a fusão e
incorporação (setas) de vesículas de retículo endoplásmico rugoso (RER) com a grande
vesícula cortical (L-CV). Os grânulos densos (g) do retículo endoplásmico rugoso marcam
positivamente para glicoproteínas. As partículas densas dispersas pelo citoplasma marcam
positicamente para o glicogénio (Gg). x 26.000

Figura 80. Região baso-lateral de uma grande vesícula cortical (L-CV). Note-se a fusão (setas) de uma
grande vesícula golgiana (V) com a grande vesícula cortical. Os grânulos densos (g) do
retículo endoplásmico rugoso e o conteúdo da vesícula golgiana marcam positivamente para
glicoproteínas. No citoplasma há depósitos dispersos de partículas densas marcadas
positivamente para o glicogénio (Gg). x 26.000

Figura 81. Região baso-lateral de uma grande vesícula cortical (L-CV). Grandes vesículas golgianas (V)
e pequenas vesículas do retículo endoplásmico rugoso (RER) fundem-se (setas) com a grande
vesícula cortical. Os grânulos densos (g) do retículo endoplásmico rugoso marcam
positivamente para glicoproteínas. Na imagem, a grande vesícula golgiana (V) possui um
conteúdo pouco rico em glicoproteínas (comparar com a Fig. 80). As partículas densas
dispersas pelo citoplasma estão marcadas positicamente para o glicogénio (Gg). x 16.000

Figura 82. Periferia do ovócito. Observe-se a fusão (seta) da porção apical de uma grande vesícula
cortical (L-CV) com o oolema. Estão marcadas positivamente para glicoproteínas os grânulos
densos (g) das vesículas do retículo endoplásmico rugoso (RER). As partículas densas
dispersas pelo citoplasma estão marcadas positicamente para o glicogénio (Gg). Note-se que
o conteúdo da grande vesícula cortical (L-CV), das pequenas vesículas corticais (CV) e das
vesículas vitelinas (YV) não marcam para as glicoproteínas. A camada vitelina (VL) também
não se apresenta marcada. A marcação dos lípidos das gotículas lipídicas é um efeito
secundário da técnica citoquímica. x 8.000

176
Parte II. Endocrinologia
Extração e Purificação Simultânea de Ecdisteróides
e Estervides Sexuais. Validação do Método.
 Extracção e Purificação de Esteróides

Introdução

Desde a sua descoberta nos insectos como reguladores de várias funções

importantes, os ecdisteróides foram considerados, durante algum tempo, o único tipo de
hormonas esteróides nos artrópodes. O aparecimento de outros tipos de esteróides
frequentes nos vertebrados (estrogénios, progestagénios, androgénios e corticosteróides)
foi assim, considerado como artefacto ou consequência da inespecificidade do bio-
ensaio utilizado.

Porém, nos últimos anos, o desenvolvimento de várias técnicas analíticas, mais

específicas, sensíveis e rigorosas, conduziu à identificação inequívoca e à quantificação
precisa de várias hormonas esteróides em invertebrados, nomeadamente em crustáceos
(daí denominadas "do tipo de vertebrados")(ver Introdução Geral e Introdução do
capítulo 5).

Presentemente, a cromatografia líquida de alta pressão (HPLC), que combinando

uma melhor selectividade com uma alta recuperação constitui uma vantagem em relação
à cromatografia em camada fina (TLC), tornou-se a técnica mais eficiente e a mais
utilizada para o estudo de esteróides em materiais biológicos. A cromatografia de gás
(GC), embora com maior capacidade de separação e detecção, requer um processo de
derivatização (transformação dos esteróides polares e termolábeis em esteres trimetilsilil
mais voláteis) o que constitui um factor limitante à aplicação mais generalizada desta
técnica. Normalmente combinados com a cromatografia utilizam-se métodos
espectrométricos (absorção U.V., espectrometria de infravermelhos e de ressonância
magnética nuclear, e espectrometria de massa-MS) para a sua detecção e quantificação.
No entanto, devido por um lado às misturas complexas que são os extractos biológicos e
por outro ao limite de detecção do HPLC (5 a 10 ng), as fracções provenientes da
separação são frequentemente sujeitas a métodos mais sensíveis de detecção e
quantificação como o RIA/EIA ou o MS (Hilde et ai, 1988).

183
Capítulo 3

Não obstante a existência de vários trabalhos que incluem a extracção e

purificação com subsequente quantificação de esteróides ou dos seus polihidroxilados
ecdisteróides (esteróides: Hines, 1992; Sasser e Singhas, 1992; ecdisteróides: Wilder,
1990, 91; Okumura, 1993, entre outros), apenas foi encontrado no trabalho de
Bradbrook (1990) uma metodologia para o tratamento simultâneo, i.e., na mesma
amostra, para os dois tipos de hormonas. Por outro lado, outra limitação encontrada foi a
grande quantidade de material biológico normalmente necessária para as extracções, de
tal forma que a maioria dos autores ou analisa animais inteiros ou "pools" de órgãos de
animais (p. ex., numa mesma fase de desenvolvimento). Por último, a recuperação final
das hormonas após a sua purificação, bastante variável nos vários trabalhos revistos e
entre as hormonas estudadas (desde 50%), pareceu-nos possível de optimizar. Desta
forma, desenvolvemos um método simples e rápido, de extracção e purificação de
ecdisteróides e esteróides sexuais na mesma amostra biológica, utilizando reduzidas
quantidadede (150 a 250 ul de hemolinfa e 100 a 300 mg de tecido liofilizado) o que
permite, a maioria das vezes, resultados individuais e com uma recuperação quase total
(acima dos 90%). Por fim, a reprodutibilidade dos resultados, assim como a rapidez e
economia do processo desenvolvido, legitimam a proposta desta nova técnica de
extracção.

Material e Métodos

O desenvolvimento da técnica de extracção simultânea de hormonas

ecdisteróides e esteróides, foi realizada utilizando vários tecidos (músculo, ovário,
hemolinfa, etc.) de P. japonicus.

A metodologia seguida para a optimização desta técnica foi a seguinte: partindo

de uma mistura de padrões de várias hormonas (esteróides e ecdisteróides) adicionada a
material biológico, foram estudados vários parâmetros de extracção e purificação tendo
em vista a máxima recuperação, através da sua quantificação final por HPLC.

184
 Extracção e Purificação de Esteróides

Finalmente, a técnica foi validada (quantificação das perdas ao longo do

processo de extracção, percentagem final de recuperação dos dois tipos de hormonas e
sua reprodutibilidade) com amostras de hemolinfa e posteriormente também testada
com amostras de ovário. Para avaliar a eficiência do método desenvolvido uma
quantidade conhecida de [l,2,6,7-3H(N)]-Progesterona e/ou de a-[23,24-3H(N)]-
Ecdisona, foi adicionada ao material biológico. As hormonas foram extraídas, e em
todas as fases do método retiradas alíquotas, com volumes proporcionais (5%), para
posterior medição dos níveis de radioactividade em contador de cintilação líquida.

A. Parâmetros estudados na optimização da técnica de extracção e

purificação

1. EXTRACÇÃO

Inicialmente foram realizadas algumas experiências de extracção de uma mistura

de padrões dos dois tipos de hormonas introduzidas (ca. 1 ug de cada) em tecidos
frescos (de 1 a 6 g), em tecidos liofilizados (100 a 300 mg), e em hemolinfa (150 a 250
(il) com o objectivo de estudar o melhor procedimento extractivo.

Esta extracção foi realizada testando como solvente éter dietílico (Merck) e
metanol p.a. (Merck), em quantidades variáveis de forma a obter a melhor
recuperação.

Mistura de padrões de ecdisteróides e esteróides a estudar:

Ecdisteróides: Ecdisona (Sigma E-9004)

20-OH-Ecdisona (Sigma H-5142)

185
Capítulo 3

Esteróides: Estriol (Sigma E-1253)

Estrona (Sigma E-9750)

P-Estradiol (Sigma E-8875)

Testosterona (Sigma T-1500)

17 a -OH-Progesterona (Sigma H-5752)

Progesterona (Sigma P-0130)

Soluções etanólicas (etanol p.a., Merck) dos padrões foram preparadas

individualmente com a concentração de ± 0,5 mg/ml. Destas, foi preparada uma mistura
com todos os padrões com a concentração final de ± 5 ug/ml de cada.

Foram igualmente testados dois processos de evaporação dos solventes: no

rotavapor e em corrente de azoto em blocos térmicos (Techne, Dri-Block, DB.3, Sample
Concentrator) ou em banho-maria (Jouan) a 50°C.

2. PURIFICAÇÃO

Com o objectivo de purificar o extracto metanólico, foram estudados dois

métodos:

- em fase sólida (SPE), com a utilização de mini-colunas de fase reversa Cl8

(Merck RP-18) de 400 ou 500 mg.

- extracção líquido-líquido com n- hexano p.a. (Merck) e purificação da fase

metanol/água (MeOH/H20) 90%, em mini-colunas Cl8 (SPE).

186
 Extracção e Purificação de Esteróides

No processo de purificação da amostra em fase sólida foram ainda

experimentados dois métodos:

a) ressuspensão da amostra em 5 ml de MeOH/H 2 0 30%, e extracção das

hormonas com a mini-coluna pré-acondicionada com 7 ml MeOH/H 2 0
30%, v/v, 4 ml MeOH, 5 ml MeOH/H20 30%, v/v e sua eluição com 4
ml de MeOH/H20 30%, v/v (fracção 1), 4 ml de MeOH (fracção 2) e
mais 4 ml de MeOH (fracção 3). Os esteróides e ecdisteróides são eluídos
na fracção 2.

b) ressuspensão da amostra em 5 ml de tampão fosfato (0.122 M

Na2HP0 4 .2H 2 0 e 0.078 M KH 2 P0 4 , pH=7.6), neste caso com a mini-
coluna previamente acondicionada com 2.5 ml MeOH e 5 ml H 2 0. As
hormonas são eluídas com 5 ml MeOH/H20 - 90%, v/v.

A utilização do tampão fosfato, como solvente da amostra, permitiu ainda

estudar a optimização da sua purificação (diminuição das contaminações visíveis nos
cromatogramas do HPLC), através da eluição das impurezas com água e misturas
MeOH/H 2 0 em diferentes concentrações.

O aparecimento ocasional, em extractos de ovário, na ressuspensão final (antes

da injecção no HPLC) de um certo precipitado, determinou a sua filtração (filtros de
nylon 66, Schleicher & Schuell, 0.2 um; 0 3 mm) no sentido de preservar a coluna
analítica do HPLC.

Finalmente, foi testada a possibilidade de concentração da amostra numa pré-

coluna (3 Nucleosil 120-5 Cl8, 30x4 mm ID, Macherey-Nagel) colocada no injector e
sua purificação através da lavagem com diversos volumes de água.

187
Capítulo 3

3. SEPARAÇÃO E QUANTIFICAÇÃO POR HPLC

Depois de algumas experiências preliminares utilizando a cromatografia em

camada fina (TLC), foram empreendidos vários estudos com o objectivo de estabelecer
as melhores condições de separação das várias hormonas por HPLC. As características
do HPLC utilizado foram as seguintes: Gilson:- bombas 305 e 306; Detector Universal
U.V. 117 de comprimento de onda variável; Câmara de Mistura - Dinamic Mixter 811C;
Manometric Module 805 Max. Press. - 60 Mpa; Coluna HPLC com enchimento C 18,
Merck 50833, RP-18 - 25 cm x 0.4 cm tipo Lickrocart® 250-4. Tamanho da Partícula -
5 mm; Injector - Rheodyne 7125 - 081; Loop - 100 ul.

Foram estudados vários eluentes (acetonitrilo/água e metanol/água) e vários

programas de separação (isocráticos, em gradiente linear ou por "patamares").

Os eluentes foram filtrados antes de serem usados no HPLC, em filtros de

membrana (Schleicher & Schuell, NL 16, 0.2 um, 0 50 mm). Posteriormente foram
desgaseificados no próprio frasco do HPLC por agitação com um magnete sob vácuo
(bomba de vácuo).

Com vista à optimização da reprodutibilidade dos tempos de retenção das várias

hormonas, foi estudada a possibilidade de termostatização da coluna de HPLC. A
coluna foi introduzida numa "manga" de PVC na qual se fez circular água de um banho-
maria (com a temperatura termostatada em 50°C) que continha igualmente os frascos
dos eluentes.

As várias fracções resultantes da separação por HPLC foram recolhidas num

colector de fracções programável (Gilson Fraction Controller 202, rack 21).

A quantificação das várias hormonas introduzidas (1 ug) extraídas do material

biológico foi feita por cálculo das áreas dos respectivos cromatogramas, injectando, com
uma seringa de precisão Hamilton, 10 ul da ressuspensão final de 200 ul. A recuperação

188
 Extracção e Purificação de Esteróides

foi calculada por comparação das áreas de iguais quantidades de padrões autênticos
injectados no HPLC.

4. TÉCNICA FINAL DE EXTRAÇÃO DE ECDISTERÓIDES E ESTERÓIDES

PROTOCOLO

1. Tecido liofílizado (± 150 mg) ou hemolinfa (± 150 u.1).

2. Num almofariz colocar a amostra de tecido liofílizado. Macerar com 4 ml (2+1+1)

de metanol e colocar num tubo de centrífuga. Agitar num vortex e centrifugar
(B.BRAUN, Sigma 3 K 12, Rotor n.° 11133; G= 864 g; 5500/min) a 4500 rpm a 4°C
durante 20 minutos. Recolher o sobrenadante.

Ressuspender em 1 ml de MeOH e centrifugar. Repetir este passo (volume final de + 6

ml).

2.1. No caso da hemolinfa juntar 1.5 ml de MeOH no tubo de centrífuga contendo a

amostra. Agitar num vortex e centrifugar a 4500 rpm a 4°C durante 20 minutos.
Recolher o sobrenadante.

Ressuspender em 1.5 ml de MeOH e centrifugar. Repetir este passo com 1 ml de

MeOH.Vf±4ml.

3. Evaporar sob corrente de azoto em blocos térmicos ou em banho-maria a 50°C.

4. Ressuspender em 5 ml de tampão fosfato 0.2 M (pH= 7.6). Deixar os tubos a agitar

durante a noite à temperatura ambiente.

NO DIA SEGUINTE

5. Extrair com uma mini-coluna RP-18 pré-acondicionada com 2.5 ml de MeOH e 5 ml

H20.

189
Capítulo 3

6. Lavar a coluna com: 5 ml de H2O

5 ml de MeOH/H20 (5%)

7. Eluir com 5 ml de MeOH/H20 (90%) com um fluxo inferior a 10 ml/minuto.

8. Evaporar (igual a 3).

9. Ressuspender em 200 u.1 de MeOH/H20 (90%). Filtrar esta solução (com filtros de
nylon 66) para um eppendorf. Lavar o filtro com 2x 100 u,l de MeOH; evaporar,
ressuspender em 150 p.1 de MeOH/H20 (90%). Retirar para 3 eppendorfs as
seguintes alíquotas:

1) 60 ul - evaporar e no momento de injectar no HPLC ressuspender em 60 pi

de MeOH/H20 (90%) e daqui injectar 2x 20 ul.

2) 20 ul - evaporar e no momento quantificar os ecdisteróides totais por EIA,

ressuspender em 240 ul de tampão de EIA (ver capítulo 4).

3) 40 u.1 - evaporar e no momento quantificar a Progesterona por RIA,

ressuspender em 240 u.1 de tampão de EIA (ver capítulo 5).

B. Validação da técnica com hormonas marcadas radioactivamente

para estudo das perdas ao longo do processo de extracção e

cálculo da eficiência e reprodutibilidade do processo

Para testar a eficiência do método (recuperação final das hormonas ecdisteróides

e esteróides) uma quantidade conhecida de [l,2,6,7-3H(N)]-Progesterona (3.3 p.g/ml;
lu.Ci/ul; 3xl()6 cpm/pl; actividade específica 95.0 Ci/mmol; pureza 99%) e de oc-
[23,24-3H(N)]-Ecdisona (0.52 u,g/ml; 0.1 p.Ci/u.1; 3x10^ cpm/ul; actividade específica

190
 Extracção e Purificação de Esteróides

88.57 Ci/mmol; pureza 99%) (NEM, Research Products), foi adicionada ao material
biológico.

Assim, utilizando hemolinfa, foram executadas 5 experiências, sendo cada uma

das hormonas testada isoladamente (em duplicado) e por fim uma experiência em que
foram juntas, de forma a que a quantidade de tritio fosse igual às experiências
anteriores. Esta última experiência foi repetida novamente e em duplicado usando
ovário liofilizado.

As hormonas foram extraídas como descrito anteriormente (com a técnica já

"afinada" com as hormonas "frias" e quantificadas no final por HPLC, ver pág. 6), e em
todas as fases do método retiradas alíquotas, com volumes proporcionais (5%), para
posterior medição dos níveis de radioactividade, em cintilações por minuto (cpm), num
contador de cintilação líquida (Beckman LS 3801). A percentagem de eficiência para o
tritio foi previamente testada resultando em 33.3% (teoricamente deveria ser de
40±2%). Foram também testados dois tipos de líquidos de cintilação (Universal e Insta-
Gell II), utilizando o volume de 2.5 ml para a leitura de cada amostra, tendo sido obtidos
idênticos resultados com ambos.

Procedimento para a recolha das várias alíquotas:

Experiência A - Extracção na hemolinfa de [1,2,6,7- H(N)]- Progesterona

(+ fria)

1. Num tubo de centrífuga colocar a hemolinfa (150 ul). Juntar 10 ul de uma

solução de [1,2,6,7- H(N)]- Progesterona, diluída 10 x da solução-mãe
(0.33 ug/ml) + 20 ul de padrões («50 ug/ml). Misturar. Vol. Total = 180
ul.

191
Capítulo 3

2. Retirar desta mistura a aliquota-1 (3x9ul) e colocar em três frascos (1,1'e

1") contendo 2.5 ml de líquido de cintilação (Universal).

3. Ao tubo de centrifuga contendo a solução anterior, juntar 1.5 ml de MeOH.

Vol. final de 1.653 ml (1.5+0.153).

Experiência B - Extracção na hemolinfa de H-Ecdisona (+ fria)

1. Num tubo de centrifuga colocar a hemolinfa (150 jul). Juntar 10 ul de H-

Ecdisona (0.52 ug/ml) + 20 ul de padrões ( «50 ug/ml). Misturar. Vol.
Total = 180 |il.

2. Retirar desta mistura a aliquota-1 (3x9ul) e colocar em três frascos (1,1'e

1") contendo 2.5 ml de líquido de cintilação.

3. Ao tubo de centrifuga contendo a solução anterior, juntar 1.5 ml de MeOH.

Vol. final de 1.653 ml (1.5+0.153).

Experiência C - Extracção na hemolinfa de [1,2,6,7- H(N)]- Progesterona (+ fria)

+ H-Ecdisona (+ fria)

1. Num tubo de centrifuga colocar a hemolinfa (150 ul). Juntar 5 ul de [1,2,6,7-

3
H(N] - Progesterona (0.33 ug/ml) + 5 ul de 3H-Ecdisona (0.52 ug/ml) + 20 ul
de padrões ( «50 ug/ml). Misturar. Vol. Total = 180 ul.

2. Retirar desta mistura a aliquota-1 (3x9ul) e colocar em três frascos (1,1'e 1")
contendo 2.5 ml de líquido de cintilação.

3. Ao tubo de centrifuga contendo a solução anterior, juntar 1.5 ml de MeOH. Vol.

final de 1.653 ml (1.5+0.153).

192
 Extracção e Purificação de Esteróides

=>Os passos seguintes da técnica foram executados igualmente para as 3

experiências (salvo quando referido o contrário):

4. Centrifugar a 4500 rpm a 4 ° C - 20 minutos.

5. Recolher o sobrenadante. Retirar alíquota 2 (3x 75 ul) e juntar aos frascos (2,2' e
2") de 2.5 ml de líquido de cintilação.

6. Ressuspender em 1.5 ml de MeOH e centrifugar. Retirar alíquota 3 (3x 75ul).

7. Ressuspender em 1 ml de MeOH e centrifugar. Retirar alíquota 4 (3x 50 ul);

8. Retirar alíquota 5 do tubo contendo os sobrenadantes (3x200 ul)(vol. aprox.

final « 4).

9. Evaporar em corrente de azoto em blocos térmicos ou em banho-maria a 50°C.

10. Ressuspender em 5 ml de tampão fosfato 0.2 M. (No dia seguinte:) Retirar

alíquota 6 (3x 250 ul).

11. Extrair com 1 mini-coluna RP-18 (acondicionada com 2.5 ml de MeOH e 5

ml H20). Retirar alíquota 7 (3x 250 ul).

12. Lavagem:

com 5 ml de H 2 0 - Retirar alíquota 8 (3x 250 ul).

com 5 ml de MeOH/H20 (5%)- Retirar alíquota 9 (3x 250 ul).

13. Eluir com 5 ml de MeOH/H20 (90%). Retirar alíquota 10 (3x 250 ul).

14. Eluir com 5 ml MeOH (100%). Retirar alíquota 11 (3x 250 ul).

15. Evaporar (igual a 9.) ambas 13. -MeOH/H20 (90%) e 14.-MeOH (100%).

193
Capítulo 3

16. Ressuspender ambas em 200 ul de MeOH/ H 2 0 (90%). Retirar alíquota 12

(3xl0ul) - MeOH/H20 (90%) e alíquota 13 (3x10 ul) -MeOH (100%).

17. Injectar - 10 ul (seringa de precisão Hamilton) da fracção 90 % MeOH/H20

e da fracção 100% MeOH.

18. Retirar alíquotas dos tubos 6 (Progesterona, vol. ± 4 ml) das injecções
anteriores (3 x 200(0,1) (Experiência A) e dos tubos 11 (Ecdisona, vol. ±1.6
ml) (3x 80 ul) (Experiência B) e de ambos (Experiência C e D).

Experiência D - Extracção no ovário de [1,2,6,7- H(N)]- Progesterona (+ fria)

+ H-Ecdisona (+ fria)

1. Num almofariz colocar cerca de 150 mg de ovário liofilizado. Juntar 5 ul de

[1,2,6,7- 3H(N)]- Progesterona (0.33 ug/ml) + 5 ul de 3H-Ecdisona (0.52
ug/ml) + 20 ul de padrões ( «50 ug/ml).

2. Macerar com 4 ml (2+1+1) de metanol e colocar num tubo de centrifuga.

Nota: a alíquota 1 não foi retirada, devido à grande quantidade de material em

suspensão que interfere na leitura da radioactividade.

3. Centrifugar a 4500 rpm a 4 °C - 20 minutos. Recolher o sobrenadante.

4. Ressuspender em 1 ml de metanol e centrifugar nas condições anteriores.Juntar ao

sobrenadante anterior.

5. Repetir o passo anterior. Volume final de ± 6 ml. Retirar uma alíquota de 300 ul

(equivalente à alíquota 5 das experiências anteriores).

6. Seguir o procedimento das experiências anteriores a partir do ponto 9.

194
 Extracção e Purificação de Esteróides

C. Tratamento da amostra para identificação de alguns esteróides por

Espectrometria de Massa

As hormonas existentes num "pool" de 1 g de ovário liofilizado de fêmeas

vitelogénicas de Penaeus japonicus, foram extraídas seguindo a metodologia descrita
(pág. 6), no entanto sofreu algumas alterações com vista à purificação exigida pela
técnica de identificação a ser usada.

Assim, o material lipídio existente na amostra ressuspendida em tampão fosfato

é extraído com n-hexano/isopropanol (3:2; 2 x 25 ml). A fase orgânica foi evaporada e o
resíduo misturado em 2 ml do gel Lipidex 1000 ®, formado pela mistura de 1 g de
Lipidex 1000 ® com n-hexano/isopropanol, (3:2; 3.5 ml) e equilibrado durante a noite a
4°C.

O solvente foi evaporado e o sólido resultante introduzido numa coluna de

cromatografia (ID 1 cm x 2.5 cm) e eluído sequencialmente com H 2 0 (15 ml),
MeOH/H 2 0 (9:1, 10 ml), MeOH (10 ml) e clorofórmio (CHC13)(10 ml).

A fracção MeOH/H20 (9:1) foi evaporada e enviada para o Departamento de

Química da Universidade de Aveiro, para identificação de vários esteróides por
Espectrometria de Massa.

Este procedimento foi previamente testado adicionando quantidades conhecidas

de padrões (0.5 ug) ao tecido biológico. A fracção MeOH/H20 (9:1) foi ressuspendida
em 100 \ú de MeOH e injectados 10 (il no HPLC.

195
Capítulo 3

Resultados

A. Parâmetros estudados na optimização da técnica de extracção e

purificação

1. EXTRACÇÃO

Na extracção dos padrões adicionados aos tecidos liofilizados obtiveram-se

resultados semelhantes aos inicialmente encontrados com os tecidos frescos, porém com
duas enormes vantagens: por um lado a grande quantidade de água existente nos tecidos
frescos (cerca de 70% em média) dificultava a execução de alguns dos passos da técnica
em desenvolvimento (necessidade de executar a extracção com os tubos refrigerados em
gelo, maior dificuldade nas evaporações, etc.) e por outro a manutenção, armazenagem,
preservação e transporte das amostras, depois de liofilizadas tornou o processo mais
fácil e expedito.

A extracção com éter dietílico dos padrões de hormonas adicionadas à hemolinfa

resultou em grandes perdas, verificadas pelo desaparecimento de algumas hormonas por
TLC. Estas perdas foram resultado da grande dificuldade de separação das duas fases e
da formação de emulsões na ressuspensão com MeOH/H20.

Pelo contrário, usando o metanol como solvente extractivo das hormonas, quer
no material biológico fresco quer no liofilizado, não foram encontradas grandes
dificuldades no procedimento.

Não obstante os bons resultados, a nível das recuperações, obtidos com a

evaporação no rotavapor, a necessidade de frequentes evaporações ao longo do processo
assim como o elevado número de amostras a serem processadas, determinou o uso de
uma corrente de azoto a 50°C em blocos térmicos ou em banho-maria, processo
igualmente eficiente e muito mais prático.

196
 Extracção e Purificação de Esteróides

2. PURIFICAÇÃO

As experiências efectuadas com o objectivo de purificar a amostra (em fase

sólida- SPE e com prévia extracção líquido-líquido com n- hexano) mostraram não
haver diferença significativa, quer a nível das impurezas obtidas nos cromatogramas,
quer a nível da recuperação das várias hormonas (idênticas áreas nos cromatogramas).

Com a ressuspensão em tampão fosfato, do resíduo resultante da evaporação do

extracto metanólico inicial, os resultados obtidos foram superiores (recuperação vs
pureza) aos outros métodos de extracção experimentados (especialmente quando a
experimentação se fazia com amostras de ovário). A dissolução do referido resíduo foi
optimizada com a agitação da mistura durante a noite. A eliminação de impurezas, sem
comprometimento das recuperações, foi optimizada através da "lavagem" das mini-
colunas com 5 ml de H 2 0 seguida de 5 ml de MeOH/H20 5%.

Esta técnica de extracção foi inicialmente desenvolvida, como já foi referido,

com a hemolinfa e posteriormente testada com ovário. Com este tecido os resultados
foram muito idênticos tendo-se porém, obtido ocasionalmente na ressuspensão final
alguns precipitados ou depósitos na solução. Daí que a técnica tenha sido melhorada,
com o objectivo de preservar a coluna do HPLC, filtrando a amostra, com filtros de
nylon 66, antes da injecção da amostra.

Os resultados obtidos nas experiências de purificação da amostra concentrada

numa pré-coluna de Cl8, colocada no injector, com diversos volumes de água,
mostraram perdas significativas de várias hormonas em estudo, pelo que se concluiu
pela melhor purificação possível antes da amostra ser injectada no HPLC e a
substituição da pré-coluna por um "loop" de 100 ul.

197
Capítulo 3

3. SEPARAÇÃO E QUANTIFICAÇÃO POR HPLC

Como foi referido em Material e Métodos, as recuperações das várias hormonas

esteróides e ecdisteróides nos vários processos e condições experimentadas foram
quantificadas pela área dos picos resultantes da separação por HPLC. Desta forma,
paralelamente ao desenvolvimento do processo extractivo, também vários programas de
HPLC foram aplicados ao longo do estudo. Além disso, a utilização de um sistema para
a termostatização da temperatura (50°C) na coluna conduziu a um aumento da
reprodutibilidade dos tempos de retenção dos vários padrões injectados (p. ex. 20 OH-
Ecdisona RT= 9.63±0.2 min; Ecdisona RT= 18.86±0.3 min), permitindo a recuperação
das várias hormonas no colector de fracções.

Vários eluentes (acetonitrilo/água e metanol/água) e programas de separação

(isocráticos, em gradiente linear ou por "patamares") assim como do colector de
fracções, foram experimentados, conduzindo por um lado, aos necessários resultados
das recuperações do processo de extracção em estudo, e por outro, ao próprio
desenvolvimento do(s) programa(s) para a melhor separação e recuperação (no colector)
das hormonas ecdisteróides e esteróides em estudo. Para a validação da técnica de
extracção foram utilizados os programas cujos cromatogramas estão representados nas
figuras 3.1. e 3.2.

198
 Extracção e Purificação de Esteróides

10 -

LEGENDA

1-desconhecido

2- 20-OH-Ecdisona
2
mV 5 50% MeOH/H20

3
\= 242 nm
« 1
-

^^./*—- , ^—i— \ /--....

0_
. . . . | * > . , | , , i . | , , ,

0 5 10 15

Tempo de Retenção (min.)

Figura 3.1. Cromatograma de separação de ecdisteróides por HPLC (coluna de fase

reversa, RP-18, 250 mmx4 mm, sistema isocrático MeOH/H 2 0 50% v/v)

10 -
6
LEGENDA
4 1-estriol
2- desconhecido
- 3- estrona
3 60%
.5
5- P~ estradiol
mV 5 - 1 2
6- progesterona
( vvjííww^r
30°/ j.y 30%
""-X.= 280nm

X=242nm

0 _ «tf
1
......
1 1 1 . i i
'" 1 1 | . ii . , . ,
) 10 20 30 40 60
50
Tempo de Retenção (min.)

Figura 3.2. Cromatograma de separação de esteróides por HPLC (coluna de fase

reversa, RP-18, 250 mmx4mm, gradiente de acetonitrilo/água 30-60%,
v/v)

Os métodos de extracção e purificação seguidos da separação por HPLC das

várias hormonas, descritos anteriormente permitiram calcular a percentagem de

199
Capítulo 3

recuperação das varias hormonas introduzidas no material biológico por comparação

com iguais quantidades de padrões autênticos injectados, tendo sido obtidos valores
superiores a 90%, confirmados posteriormente e de forma mais precisa, pela
quantificação da radioactividade das duas hormonas marcadas (pág.18).

PROGRAMAS DO HPLC E DO COLETOR

Tendo como objectivo principal o estudo do papel de várias hormonas

ecdisteróides (26-OH-Polipodina, 20,26-Ecdisona, 20-OH-Ecdisona, Ecdisona, 2-deoxi-
20-OH-Ecdisona e Ponasterona) e da Progesterona na reprodução de crustáceos
penaeidos (ver Introdução Geral), foram elaborados novos programas do HPLC para a
sua separação e recolha num colector de fracções.

A separação das referidas hormonas é iniciada com um programa (denominado

ECDIS) para a separação dos ecdisteróides que consiste num gradiente MeOH/H 2 0 45 a
50% (v/v) (30 minutos cada), com um caudal de 0.8 ml/min. No colector de fracções foi
introduzido um programa misto de "pico + tempo" com as seguintes características: 1)
através do "modo pico", recolhe hormonas previamente identificadas com padrões
autênticos e 2) com o "modo tempo" no intervalo entre os picos, durante o qual foram
colectadas fracções de 4 ml. Foram recolhidas, com este primeiro programa para
separação dos ecdisteróides, um total 14 fracções.

A este programa está ligado automaticamente outro (denominado ESTE) que

separa vários esteróides, sendo um programa isocrático de MeOH/H 2 0 a 80% (v/v),
com um fluxo de 0.8 ml/min., durante 30 minutos ao longo dos quais foram recolhidas 8
fracções. Finalmente, este programa está ligado, também automaticamente, um outro
(EST2) isocrático de MeOH/H20 a 45% (v/v), com um fluxo de 0.8 ml/min., durante 10
minutos para estabilização da coluna, findo o qual automaticamente inicia novo ECDIS
para injecção de nova amostra.

200
 Extracção e Purificação de Esteróides

Desta forma são recolhidas um total de 22 fracções (14 de ecdisteróides e 8 de

esteróides). Os cromatogramas das figuras 3.3. e 3.4., foram obtidos com estes
programas após injecção de uma mistura de padrões de 6 ecdisteróides e de
Progesterona.

Figura 3.3. Cromatograma de separação de ecdisteróides por HPLC

(coluna de fase reversa, RP-18, 250 mmx4mm, gradiente
MeOH/H 2 0 45-50% v/v; 0.8 ml/min. durante 60 minutos)

201
Capítulo 3

Figura 3.4. Cromatograma de separação de esteróides por HPLC

(coluna de fase reversa, RP-18,250 mmx4mm, sistema
isocrático MeOH/H 2 0 80%, v/v; 0.8 ml/min. durante 30
minutos)

B. Validação da técnica com hormonas marcadas radiactivamente

para estudo das perdas ao longo do processo de extracção e
cálculo da eficiência e reprodutibilidade do processo

Com esta técnica de extracção e purificação (na hemolinfa) obtiveram-se

recuperações finais de Progesterona de 94,2 % (com um desvio padrão de ± 12,4 %,
n=3) e de Ecdisona de 90,9 % (com um desvio padrão de ± 6,1 %, n=3) (figura 3.5.).

202
 Extracção e Purificação de Esteróides

Figura 3.5. Representação gráfica da recuperação (em percentagem) das duas hormonas
(Ecdisona e Progesterona) ao longo do processo extractivo.

Na Tabela 3.1. estão apresentados os resultados respeitantes aos níveis de

radioactividade encontrados em várias alíquotas retiradas ao longo do processo
extractivo na hemolinfa. Das 13 alíquotas retiradas a longo do processo, e apesar de
terem todas sido objecto de leitura dos níveis de radioactividade nelas contidos
(=quantidade de hormona marcada), apenas os valores de 6 são apresentados (quadro,
gráficos e estatística) uma vez que nas restantes o seu valor, como era desejável, foi
quase nulo (só seria elevado se nesses passos da técnica houvesse perdas significativas).

O valor inicial dos "teóricos" é a média de um elevado número de leituras de

alíquotas (± 20) retiradas de uma amostra idêntica às utilizadas nas experiências A e B.
Os restantes valores foram calculados admitindo um rendimento de 100%.

Os valores de radioactividade lidos na experiência C correspondem à mistura de

iguais quantidades de Progesterona e Ecdisona marcadas radioactivamente de forma a
poder ser comparada com as duas primeiras. As percentagens de recuperação foram
calculadas relacionando os valores lidos com os teóricos, resultando na recuperação

203
Capítulo 3

final de 94.2% (SD=12.4) e 90.9% (SD=6.1) para a Progesterona e Ecdisona

respectivamente.

Tabela 3.1. Quadro resumo dos níveis de radioactividade (cpm) na amostra ao longo do processo
extractivo e respectivas percentagens de recuperação final em 5 experiências com 3
réplicas em cada fase do processo. As fases não representadas correspondem a níveis de
radioactividade desprezáveis.

Alíquota 1 2 5 6 10 12 % REC.
Inicial 1° Ext.MeOH Ext.MeOH Ext. T. Fosf. Elu.90% Cone. FINAL MÉDIA±SD

PROGESTERONA
Teóricos 742583 631196 536516 456039 387633 329488

EXP.A1 790587 744342 650267 419887 376910 366760 104,6

EXP.A2 914669 730918 637965 365369 316358 326719 80,5

EXP.C 876053 737225 647384 409375 351924 379508 97,6 94,2 ±12,4

ECDISONA
Teóricos 822958 699514 594587 505399 429589 365151

EXP.B1 896032 728880 622085 396035 335985 340811 85,7

EXP.B2 857800 697136 558618 390261 274001 339435 89,2

EXP.C 876053 737225 647384 409375 351924 379508 97,6 90,9 ±6,1

As figuras 3.6. e 3.7. representam as rectas de regressão linear para cada uma das
experiências efectuadas e dos valores teóricos. A média dos valores obtidos das 3
réplicas, em cada uma das fases do processo extractivo, nas três experiências efectuadas
para cada hormona, foi comparada aplicando o teste estatístico ANOVA, tendo sido
demonstrada não existir diferenças significativas entre as três experiências efectuadas
para cada hormona (0.01<P<0.05 na alíquota 6 - fase de extracção com tampão fosfato,
e P>0.05 para as restantes fases do processo).

204
 Extracção e Purificação de Esteróides

PROGESTERONA

1000

750

500-

250

1 2 5 6 10 12
AUQUOTA

Figura 3.6. Regressão linear dos valores teóricos (linha a cheio) e experiências Al, A2 e
C, com [l,2,6,7-3H(N)]-Progesterona. Em abcissas são apresentadas as
alíquotas retiradas ao longo do processo extractivo na proporção de 5% .

ECDISONA

1000

750
CPMxlOOO

500

250

1 2 5 6 10 12
ALIQUOTA

Figura 3.7. Regressão linear dos valores teóricos (linha a cheio) e das experiências
BI, B2 e C, com cc-[23,24-3H(N)]-Ecdisona.

205
Capítulo 3

Verificada a não existência de diferenças significativas entre as três experiências

para cada hormona (inclinações e ordenadas na origem das rectas sem diferença
significativa, P<0,001), o conjunto das três experiências para cada hormona pode ser
representada por uma recta de regressão (figuras 3.8. e 3.9.). A inclinação desta recta
corresponde praticamente às perdas das hormonas (CPMs) nas várias alíquotas retiradas
(na proporção de 5% do volume de cada fase do processo extractivo - de 180 ul a 5 ml).

PROGESTERONA
nnn

t
800 -

CPM X 1000

400 -
! ^

0
1 2 5 6 10 12
ALIQUOTA

Figura3.8.- Regressão linear (R2 = 0,81; P<0,001) dos valores das experiências
Al, A2 e C ([l,2,6,7-3H(N)]-Progesterona).

ECDISONA

800-
♦^^"í--^^
•^^^
CPMx 1000

1 """■
400 -
^J
n.
1 2 5 6 10 12
ALIQUOTA

Figura3.9. Regressão linear (R2 =0,93; P<0,001) dos valores das experiências BI,
B2 e C (cc-[23,24-3H(N)]-Ecdisona).

206
 Extracção e Purificação de Esteróides

Finalmente a comparação dos resultados obtidos com os valores teóricos nas três
repetições da extracção, por análise de covariância, demonstra a reprodutibilidade da
técnica para a extracção de Progesterona. A probabilidade de haver covariância entre o
tratamento (execução da técnica) e a variável dependente (quantidade de hormona
recuperada) foi de p=0.370 (n=18, F=1.080, R2= 0.937), sendo plausível assumir que os
declives são homogéneos. Em relação à ordenada na origem o tratamento (3 ensaios da
técnica) ajustado à covariante (valores teóricos) não é significativo (p=0.881) (figura
3.10.).

PROGESTERONA
1000

200
300 400 500 600 700 800
TEÓRICOS (x1000)

Figura 3.10. Regressão linear dos valores observados e teóricos das experiências Al,
A2 e C (a= -133277; b= 1.375; R=0.924; n=18)

De forma idêntica para a ecdisona o mesmo estudo estatístico de análise de

covariância revela a elevada semelhança (R2=0.949) entre as três experiências (declive:
F=0.107 e p=0.899) e finalmente uma elevada correlação entre os valores observados e
os calculados (R2= 0.939) (figura 3.11).

A técnica foi igualmente testada para a extracção de ovário liofilizado

(Experiência D, pág. 11), tendo sido obtida a recuperação final de 94.3%.

207
Capítulo 3

Foram ainda calculadas as perdas na filtração (em filtros de nylon 66), injecção
no HPLC e posterior recolha no colector, tendo sido verificado serem no global
inferiores a 10 %.

ECDISONA
1000

900

^ 800
o
o
1 700

u. 500
LU
<n

§ 400

300

200
300 400 500 600 700 800 900
TEÓRICOS (x1000)

Figura 3.11. Regressão linear dos valores observados e teóricos das experiências BI,
B2 e C (a=-182747; b= 1.281; R2=0.939; n=18)

C. Tratamento da amostra para identificação de alguns esteróides por

Espectrometria de Massa

Neste método de extracção e purificação dos esteróides existentes no ovário foi

obtida uma recuperação de ± 80%, por comparação das áreas dos cromatogramas,
resultantes da injecção da mistura de padrões e do extracto da amostra com iguais
quantidades da mesma mistura.

208
 Extracção e Purificação de Esteróides

Foi possível, através de Espectrometria de Massa, detectar a presença de

Testosterona, Pregnenolona, 17a-Hidroxiprogesterona e Progesterona no ovário de
Penaeus japonicus (ver capítulo 5).

Discussão

A extracção de esteróides, normalmente realizada em tecidos frescos ou

congelados, pode ser realizada em tecidos liofilizados (Reis-Henriques et ai, 1990;
Dunstan, et ai, 1993), sem perdas significativas e com óbvias vantagens: por um lado a
menor quantidade de tecido processado, pois é reduzido em cerca de 30%, e por outro
lado a ausência de água, a qual conduz a um extracto metanólico de fácil evaporação. O
processo de liofilização, evaporação por vácuo ou a baixa pressão, embora normalmente
não utilizado nos tecidos, é frequentemente utilizado para concentração ou evaporação
dos extractos, antes da purificação ou da quantificação por RIA (Young et ai, 1992;
Wilder et ai, 1990, 91 ; Lee et ai, 1990; Fairs et ai, 1990, entre outros).

Para a extracção destas hormonas (extracto lipídico), quer na hemolinfa quer no

ovário, foi escolhido o metanol visto ser o mais utilizado para obtenção de uma só fase
orgânica (p. ex.: Reis-Henriques et ai, 1990; Chan, 1995; Garcia et ai, 1995; Okumura
et ai, 1992) embora o etanol também seja frequentemente utilizado (p. ex.: Swevers et
ai, 1991, 92; Young et ai, 1993a, b; Bradbrook et ai, 1990), hexano-propano-2-ol
(Fairs et ai, 1990). Também comuns são a utilização de misturas para formação de uma
fase orgânica/ fase aquosa como clorofórmio/metanol (Lee et ai, 1990), éter etílico e
água (do próprio tecido) (Sasser e Singhas, 1992), tampão fosfato/ cloreto de metilo
(Hines et ai, 1992), misturas estas que realizam simultaneamente uma extracção
líquido-líquido, constituindo um processo de purificação também por nós
experimentado (já no extracto metanólico), mas com fracos resultados.

209
Capítulo 3

O processo de evaporação ou concentração de extractos mais utilizado é a

corrente de azoto (com ou sem aquecimento dos tubos). Optamos também por este
processo uma vez que o rotavapor, utilizado por alguns autores (Bradbrook et ai, 1990;
Chan, 1995), constitui um processo mais demorado devido ao elevado número de
amostras.

Para a purificação do extracto são normalmente utilizadas duas técnicas (isolada

ou conjuntamente): extracção líquido-líquido (p. ex.: Lee et ai, 1990; Wilder et ai,
1991, 92; Hines et ai, 1992; Sasser e Singhas, 1992) e em fase sólida através de mini-
colunas de fase reversa Cl8, Sep-Paks ou RP-18 (p. ex.: Lee et ai, 1990; Young et ai,
1993a,b; Garcia et ai, 1995; Chan, 1995; Summavielle et ai, 1995; Fairs et ai, 1990).
Como coluna Cl8, pode ser utilizada para separação de vários esteróides e
ecdisteróides, com a utilização de misturas de solventes de diferente polaridade
(Bradbrook et ai, 1990) ou apenas para purificação do conjunto de esteróides e/ou
ecdisteróides (Fairs et ai, 1990; Lee et ai, 1990). A utilização da extracção em fase
sólida permitiu-nos uma boa purificação dos extractos, importante a nível do HPLC,
sem contudo sofrer grandes perdas no conjunto das hormonas esteróides e ecdisteróides
como pode acontecer numa utilização mais diferenciada (Bradbrook et ai, 1990).

A utilização de métodos de quantificação como o RIA (Swevers et ai, 1992;

Okumura et ai, 1993; Chan. 1995), em extractos purificados, pode resultar em reacções
cruzadas, pelo que alguns autores validam o método (Wilder et ai, 1990; Bradbrook et
ai, 1990; Sasser e Singhas, 1992; Hines et ai, 1992). A separação por HPLC com
recolha dos picos das diferentes hormonas pode obviar este problema. A optimização de
dois programas ligados para a separação de ecdisteróides e de esteróides, com a
programação do colector de forma a recolher os vários picos identificados com padrões
autênticos, permite uma posterior quantificação dos vários ecdisteróides presentes nas
amostras (por EIA) e de esteróides (no presente trabalho apenas é quantificada a
Progesterona). A quantificação por HPLC será possível no caso de utilização de maior

210
 Extracção e Purificação de Estervides

quantidades de amostra recorrendo a um "pool" de hemolinfa ou ovário de vários

animais (Summavielle et ai, 1995).

Dos trabalhos revistos dos vários grupos que investigam estes dois tipos de
hormonas apenas Bradbrook et ai, (1990) utiliza uma técnica de extracção e purificação
para obtenção de ambos, na mesma amostra. Em relação à técnica descrita por aqueles
autores, o desenvolvimento do método por nós apresentado orientou-se no sentido da
resolução de duas deficiências identificadas nesse método: por um lado a complexidade
de passos com a utilização ao longo do processo de 4 colunas sep-pak (com o custo
inerente) e o baixo rendimento apresentado (Progesterona-53,2%±4,7 e Ecdisona
55,9%±4,9). De facto, estas baixas recuperações têm um reflexo enorme quanto à
quantidade de material biológico necessário para os doseamentos posteriores das
hormonas (RIA ou EIA). Embora a maioria dos autores não especifique a recuperação
final do método e nas condições em que o utiliza, o certo é que a maioria utiliza
alíquotas de vários animais, órgãos, hemolinfa (p. ex.: Young et al, 1993a,b - 3 a 8
ovários e 3 ml de hemolinfa de vários; Chan, 1995 - "pool" de vários ovários;
Summavielle et al, 1995 - "pool" de hemolinfa de vários animais). Uma elevada
recuperação pode permitir o tratamento de amostras individualizadas e assim uma maior
aproximação à variabilidade individual e do processo em estudo (no nosso caso a
reprodução). O método por nós desenvolvido permite, através de uma recuperação quase
total, a utilização de pequenas quantidades de amostra biológica e assim a obtenção de
resultados individuais (excepto em casos como p. ex. quando o ovário está em
previtelogénese é quase inexistente!). A recuperação (assim como a sua
reprodutibilidade) foi estudada passo a passo ao longo da extracção e purificação até à
recolha no colector de fracções.

Os resultados obtidos com o teste estatístico ANOVA, permitem-nos concluir

não existirem diferenças significativas entre as médias obtidas para os vários passos das
cinco experiências realizadas (P>0,05), pelo que o método apresenta um elevado nível
de reprodutibilidade. Assim, não havendo diferenças significativas entre as três

211
Capítulo 3

experiências (P>0,05), foi traçada a recta de regressão com todos os valores lidos para
cada uma das hormonas estudadas. De notar que o declive desta recta traduz
praticamente o efeito das várias alíquotas retiradas pois apenas a diferença para o
declive da recta de regressão dos valores calculados (100% de recuperação) representa
as perdas ao longo do processo extractivo.
O rendimento final obtido foi na ordem dos 94,23 % (SD=12,38) para a
progesterona e de 90,85 % (SD=6,13) para a ecdisona (quadro 3.1. e figura 3.5.).

Comparativamente a outros resultados descritos na literatura (Bradbrook et ai.,

1990; Young et ai, 1993a,b), este método para além da maior facilidade e rapidez de
execução, apresenta níveis de reprodutibilidade e eficiência elevados.

Os resultados obtidos permitem-nos assim concluir que o método extractivo

descrito é de fácil e rápida execução, apresentando níveis de reprodutibilidade elevados
e rendimentos sempre acima de 90%, o que permite a utilização de quantidades de
material biológico conducentes a resultados individuais. Por fim o custo de cada análise
não é elevado, uma vez que as mini-colunas de fase reversa (RP-18- 400 mg, Merck ),
podem ser facilmente regeneradas.

212
Perfil de Ecdisteróides ao Longo das Fases de
Desenvolvimento do Ovário das Espécies Penaeus
japonicus e P. kerathurus.
 Hormonas Ecdisteróides

Introdução

A hormona da muda, a ecdisona (2p, 3p, 14p, 22R, 25-pentahidroxi- 5p-coles-7-

em-6-ona, também conhecida como a-ecdisona), tem origem numa glândula endócrina
ectodérmica (não-neuronal), o órgão Y. Este órgão endócrino par, está situado na região
cefálica dos Malacostraca (nos crustáceos inferiores como os Entomostraca estão
ausentes) (ver Introdução Geral). Nas suas células, de um só tipo (Fingerman, 1987,
1992), estão ausentes os produtos de secreção (normalmente libertam os produtos à
medida que os sintetizam sem os armazenar), à semelhança do que se passa nas células
secretoras de esteróides dos mamíferos. No entanto, as células do órgão Y apresentam
alterações ao longo do ciclo da muda: aumento do volume do núcleo e da actividade
mitótica (Bressac, 1988b), assim como variações do tamanho das células, que
apresentam o seu menor tamanho durante a intermuda, atingindo cerca do dobro no fim
da pré-muda, acompanhadas de alterações das dimensões das mitocôndrias, que
aumentam cerca de 15 vezes na intermuda e início de pré-muda (Fingerman, 1992). No
fim da pré-muda são observados, no espaço entre as células e a membrana basal, grupos
de vesículas derivadas provavelmente do retículo endoplasmático, e cujos grânulos
secretados poderão constituir a hormona da muda, que irá iniciar o processo que conduz
à libertação da carapaça (revisto por Adiyodi e Adiyodi, 1970; Fingerman, 1987, 1992).

Três diferentes mecanismos de secreção dos ecdisteróides têm sido propostos:

1. Simples difusão através da membrana, 2. Exocitose dos grânulos de secreção e 3.
Difusão facilitada ou co-transporte.

A entrada dos ecdisteróides nas células-alvo é, pelo contrário, um processo que

envolve energia (Na /K -ATPase), sugerindo um mecanismo de co-transporte idêntico
ao utilizado para a glicose ou aminoácidos (Lachaise et ai, 1993).

A ultrastrutura do órgão Y, idêntica à glândula protorácica dos insectos, é

sugestiva de um órgão responsável pela formação de esteróides a partir de um
percursor como o colesterol (Adiyodi e Adiyodi, 1970; Bressac, 1988b; Fingerman,

215
Capítulo 4

1987). Como no caso dos insectos, as vias metabólicas de biosíntese dos ecdisteróides,
esteróides da família denominada esteróides polihidroxilados C27, são na sua maioria
desconhecidas, excepto para o primeiro passo (conversão do colesterol a 7-
dihidrocolesterol) e os três últimos (hidroxilações nas posições 25, 22 e 2) (Lachaise et
ai, 1993).

O órgão Y secreta não só a ecdisona (E) mas também 25-deoxi-ecdisona (25dE)

e 3-dihidro-ecdisona (3DE) (Lachaise et ai, 1993). A hormona da muda (MH),
ecdisona, é hidroxilada na hemolinfa para se tornar na hormona activa 20-OH-ecdisona
(também denominada P-ecdisona, ecdisterona ou crustecdisona). Assim, este órgão tem
como função principal o controlo da muda.

Foi também descrito um efeito estimulador da secreção de ecdisona, pela

molécula terpenóide produzida no órgão mandibular (MO) e idêntica à hormona juvenil
dos insectos, o farnezoato de metilo (MF) (Chang et al, 1993).

O processo da muda é inibido por um neuropéptido - a hormona inibidora da

muda (MIH) (ver Introdução Geral), produzido nos neurónios do órgão X e acumulado
na glândula do seio, ambos situados nos pedúnculos oculares. A acção da MIH pode
ser directa, inibindo a secreção de MH pelo órgão Y, ou indirecta, agindo
antagonicamente na epiderme e regulando a resposta do tecido à hormona da muda
(Fingerman, 1987). A acção directa da MIH no órgão Y traduz-se no aumento do
AMPc, o qual inibe quer a entrada quer a utilização do colesterol, assim como inibe a
síntese proteica. O cálcio tem um importante papel regulador, activando a destruição
enzimática do AMPc e estimulando assim a síntese e secreção de ecdisteróides
(Spaziani et ai, 1994). Para além destes dois segundos mensageiros (AMPc e cálcio),
que actuam como mediadores da resposta celular a sinais extracelulares, foi encontrado
um terceiro, independente dos dois anteriores, a PKC (quinase da proteína C), que
estimula a síntese proteica e a esteroidogénese (Mattson, 1986).

Recentemente foi posto em evidência o efeito inibidor da biosíntese de

ecdisteróides pelo ácido xantorénico (XA), molécula isolada nos pedúnculos oculares.

216
 Hormonas Ecdisteróides

A sua acção traduz-se através da inibição directa da citocromo P-450 mono-oxigenase

(revisto por Lachaise et ai, 1993). Finalmente, os ecdisteróides inibem a libertação
(não a síntese) de MIH (Mattson, 1986), actuando directamente nas células neuro-
secretoras do órgão X ou através da inibição do controlo seratoninérgico de libertação
da MIH (Spaziani et ai, 1994).

O perfil típico da variação dos níveis de ecdisteróides circulantes é de uma

subida gradual ao longo do ciclo da muda atingindo um máximo no final na pré-muda
(fases D2-D3), para logo baixar antes da exuviação (Baldaia et ai, 1984). Está provado
que uma subida inicial dos ecdisteróides circulantes e uma descida rápida e coordenada
no final da pré-muda é absolutamente necessário para uma exuviação bem sucedida
(Chang et ai, 1993). Da forma idêntica, para a espécie Siriella armata (Cuzin-Roudy e
Saleuddin, 1989), são necessários baixos níveis de ecdisteróides para uma exuviação
normal.

Enquanto nos vertebrados os esteróides circulantes se encontram ligados a

proteínas, não são conhecidos para os crustáceos proteínas específicas de transporte dos
ecdisteróides (Hilde et ai, 1988), circulando pelo menos 95% destes na forma livre
(Fingerman, 1987). As variações dos níveis circulantes da hormona activa parecem ser
devidas a alterações na taxa de síntese e secreção de ecdisona pelo órgão Y, mais do
que pela taxa de hidroxilação da ecdisona a 20-OH-ecdisona, ou da taxa de degradação
e depuração ("clearence") da hormona na hemolinfa (Chang, 1991).

No entanto, o papel dos ecdisteróides parece não se esgotar no processo da

muda, relacionando-se com a reprodução, ainda que de forma pouco clara. O
crescimento e a reprodução constituem dois processos inseparáveis e integrados, logo
necessitando de um mecanismo de controlo estreitamente interligado. Assim, a muda é
desencadeada quando os níveis das hormonas MIH e GSH são baixos e os das hormonas
GIH e MH são elevados. Pelo contrário, o processo reprodutivo é iniciado quando os
níveis das hormonas MIH e GSH são elevados e os das hormonas GIH e MH são
baixos. Nos animais ablacionados (corte de 1 ou 2 pedúnculos oculares), a muda

217
Capítulo 4

acontece se a actividade da hormona GSH estiver suprimida pelo sistema nervoso

central (SNC) ou/e pela MH, e a reprodução pode ocorrer se a GSH, por estimulação do
SNC, suprimir a acção da MH (Adiyodi e Adiyodi, 1970).

Na reprodução, e mais concretamente na ovogénese, os ecdisteróides parecem

ser necessários, para a multiplicação mitótica nas gónadas, particularmente nas fases
pré-pubertais (Adiyodi e Adiyodi, 1970), ainda que aos níveis envolvidos sejam
diminutos (Meusy e Payen, 1988).

Assim, os ecdisteróides parecem ser essenciais para as fases iniciais do

desenvolvimento da gónada, especificamente nas mitoses das ovogónias e crescimento
previtelogénico (Meusy e Payen, 1988). No entanto, o efeito destas hormonas sobre a
gónada poderá ser apenas parte de um efeito mais geral exercido em todos os tecidos
organizados (Adiyodi e Adiyodi, 1970).

Tem sido também sugerido, que os ecdisteróides circulantes possam ter um

papel na regeneração e na maturação da gónada (Adiyodi e Adiyodi, 1970), assim
como de estimulação do desenvolvimento do ovário, da síntese proteica e da produção
de vitelogenina (Fingerman, 1987; Van Herp e Payen, 1991; Hasegawa et ai, 1993). A
síntese de vitelogenina é iniciada com uma taxa baixa de 20-OH-ecdisona e parece ser
mantida também com um nível baixo desta hormona (Charniaux-Cotton, 1980; Payen,
1980). Assim, a síntese de vitelogenina e a sua captura pelo ovócito parecem ter
correlação com os níveis circulantes de ecdisteróides (Van Herp e Payen, 1991).

Continua por definir a relação entre a hormona activa 20-OH-ecdisona e a

vitelogénese, não havendo na actualidade provas da sua acção directa na síntese de
vitelogenina ou na vitelogénese. Por outro lado, vários autores mostraram, que não é
possível a vitelogénese em animais aos quais foi retirado os órgãos Y (produtores de
ecdisteróides). Também continuam por esclarecer a função e destino dos ecdisteróides
(especialmente a ponasterona A) acumulados no ovário no fim da vitelogénese (Meusy
e Payen, 1988). A sua utilização pelos nauplius, para coordenação de vários processos
do seu desenvolvimento, parece ser uma hipótese plausível (Chang, 1991).

218
 Hormonas Ecdisteróides

A evidência mais forte de uma função directa dos ecdisteróides na reprodução,

parece ter sido encontrada como o estímulo exacto para a reiniciação meiótica na
maturação do ovócito (Lanot e Clédon, 1989).

O objectivo deste trabalho foi determinar a variação dos ecdisteróides totais e,

pela sua importância, de alguns ecdisteróides previamente identificados e isolados (p.
ex. ecdisona, 20-OH-ecdisona, ponasterona), na hemolinfa e no ovário, ao longo do
desenvolvimento do ovário durante a época reprodutiva, no sentido de a relacionar com
as diferentes fases vitelogénicas determinadas pelo aspecto histológico do ovário.

Material e Métodos

Quantificação de ecdisteróides por ELISA (EIA)

A técnica de EIA utilizada (Porcheron et ai, 1989) tem como marcador a enzima
acetilcolinesterase ligada covalentemente à derivada 20-hidroxi-ecdisona-6-
carboximetoxima. A reacção imunológica tem lugar numa placa de microtitulação de 96
poços (Nunc-Immuno Plate MaxiSorp F96) pré-revestida com o anticorpo secundário
(IgG (H+L) de cabra anti-coelho, (Kirkegaard & Perry Laboratories Inc.).

O doseamento foi realizado num volume total de 150 (0,1, sendo 50 ul de

ecdisteróide-padrão ou extracto biológico, 50 ul do marcador enzimático diluído (1/100)
e 50 ul do antisoro específico diluído (1/10000). Este antisoro é altamente específico
para a ecdisona e 20-OH-ecdisona. As reacções cruzadas com outros ecdisteróides estão
especificadas na tabela I.

O marcador enzimático (G4-AChE) e o antisoro específico (AS4919) utilizados

nas nossas experiências foram generosamente cedidos pelo Dr. P. Porcheron (ENS,
Paris). A actividade enzimática foi determinada pela adição do reagente de Ellman a
cada poço e a intensidade da cor amarela resultante medida 4-5 horas depois a 405 nm
num leitor de placas ELISA (Micro Plate Reader, Dupond, MRP-A4).

219
Capítulo 4

Tabela I. Reacções cruzadas do antisoro específico para a ecdisona e 20-OH-ecdisona com outros
ecdisteróides (Porcheron et ai, 1989).

ECDISTERÓIDE Reacção Cruzada ECDISTERÓIDE Reacção Cruzada

20-OH-Ecdisona 100 Podecdisona C 4,5

Ecdisona 100 Makisterona A 4

2-deoxi-20-OH- 26-OH-Ecdisona 1,4

88
Ecdisona
Munisterona A 1,2
Polipodina B 70
Kaladasterona 1
2-deoxi-Ecdisona 63
22-Epi-Ecdisona <0,1
Ponasterona A 43
Posterona <0,1
Ciasterona 5

As ligações não específicas (NSB) foram determinadas usando uma mistura de

incubação na qual o anticorpo primário e o ecdisteróide-padrão foram substituídos por
100 ul de tampão fosfato EIA. A actividade enzimática da ligação do marcador na
ausência de competidor (BQ) foi determinada em poços contendo 50 ul de tampão no
lugar do ecdisteróide-padrão. Todas as medições para NSB, padrões e amostras foram
executadas em duplicado e a de BQ em quadruplicado.

Os resultados são expressos como B/BQ x 100 em função do logaritmo da dose.

B representa a absorvância medida na fracção ligada na presença de competidor. Para o
ajuste da curva-padrão foi utilizada a transformação linear log-logit.

EIA - Protocolo

(Io DIA)

1. Lavar a placa com tampão lavagem (ciclo de 5 a 6 lavagens).

220
 Hormonas Ecdister aides

2. Colocar tampão EIA nos poços 2C e D - 100 pi

2E,F,G,H - 50 pi

3. Nas colunas 3 e 4 - curva padrão: de 1000 fmol a 8 fmol, em duplicado - 50 JLXI

4. Colocar as amostras nas colunas seguintes (em duplicado) - 50 pi

5. A partir do poço 2C, colocar em cada poço 50 pi do marcador enzimático (G4.0).

6. A partir do poço 2E, colocar em cada poço 50 pi do antisoro (49.19).

7. Incubação: 3 horas no agitador de placas, seguido de 1 noite no frigorifico (proteger

a placa).

(2 o DIA)

8. Lavagem da placa com tampão lavagem.

9. Colocar nos poços 2A e 2B, 5 pi do marcador usado no dia anterior, diluído lOOx.

10. Colocar 200 pi do reagente d' ELLMAN em TODOS os poços.

11. Colocar a placa (tapada com papel de alumínio) no agitador de placas. Ler ao fim
de cerca de 2 horas.

EIA - "COATING"

Protocolo para 30 placas

(Io DIA)

1. Marcar as placas com o dia do "coating".

2. Juntar a 570 ml de água tridestilada e filtrada, 30 ml de tampão fosfato 1M (com

azide) e 750 pi de anticorpo de carneiro ( 3/4 do frasco de lml que pode estar
congelado). Desta solução colocar 200 pi (com pipeta multicanal) em cada poço.

3. Deixar uma noite à temperatura ambiente (guardar numa caixa para evitar poeiras).

221
Capítulo 4

(2o DIA)
4. Colocar 100 JLXI de tampão-Coating em cada poço (com pipeta multicanal).
5. Tapar as placas com folhas adesivas para placas ELISA.
6. Guardar as placas no frigorifico.

EIA

RE A GENTES/SOL UÇÕES

1. Tampão fosfato 1M (para 1 litro)

139.34 g (P0 4 HK 2 )
27.22 g ( P 0 4 H 2 K )
0.1 g Azide Na (NaN3)

1 Litro H2O Dest. Ajustar pH= 7.4 (conservar no frigorifico)

2. Tampão Coating ( para 40 placas)

45 ml Tampão fosfato 1M
45 mg (NaN3)
4.05 g NaCl
0.167 g EDTAdiNa
1.35 g BSA

450 ml H2O Dest. (conservar no frigorifico)

3. Tampão EIA (para 1 Litro)

100 ml Tampão fosfato 1M
0.1 g Azide Na (NaN 3 )
9g NaCl
0.37 g EDTA diNa
1g BSA

1 Litro H2O Dest. (conservar no frigorifico)

4. Tampão (fosfato) Lavagem (para 1/2 litro)

5 ml Tampão fosfato 1M
250 11I Tween 20

1/2 Litro H2O Dest. (conservar no frigorifico)

222
 Hormonas Ecdisteróides

5. Antisoro 49.19 (conservar no congelador a -20°C ou no frigorifico).

- Juntar 5 ml de Tampão EIA para ficar com uma diluição de 1/100000.

6. Anticorpos de carneiro (para o "Coating" do Io dia)

- Rehidratar com 1 ml de tampão fosfato 0.05 M. Pode ser congelado a seguir. Para 30
placas são necessário 750 ul.

7. Reactivo de ELLMAN

Procedimento para 40 tubos: ao abrigo de luz forte juntar a 10 ml de tampão fosfato 1

M, 200mg de iodeto de acetiltiocolina e 215 mg de ácido 5-5' ditiobis-2-nitrobenzoico.
Dissolver e distribuir 250 ul por tubo e congelar a -20°C.

Foram realizados, através da técnica de EIA exposta, dois tipos de doseamentos,

a que corresponderão duas diferentes alíquotas resultantes da extracção e purificação
quer do ovário quer da hemolinfa (ver Cap. 3):

1. Ecdisteróides Totais:

Dos 150 ul de MeOH/H20 (90%) da ressuspensão final (ver ponto 10 da

Técnica Final no Cap.3), foram retiradas 3 alíquotas. Uma delas de 20 ul foi evaporada
e no momento quantificar os ecdisteróides totais por EIA, foi ressuspendida em 240 ul
de tampão de EIA.

2. Doseamento de vários ecdisteróides (entre os quais 5 identificados por co-eluição

com padrões autênticos):

Outra das 3 referidas alíquotas, de 60 ul foi evaporada e no momento de injectar

no HPLC foi ressuspendida em 60 ul de MeOH/H20 (90%) e daqui injectados 40 ul.
Um programa (denominado ECDIS) faz a separação dos ecdisteróides, e um programa
no colector de fracções que permite a recolha de 14 fracções de ecdisteróides. Este
programa consiste num gradiente metanol/água 45/55 a 50/50 (v/v) (30 minutos cada),
com um caudal de 0.8 ml/min. Um programa do tipo "peak+time" foi utilizado no

223
Capítulo 4

colector de fracções o que permitiu 1) através do "modo pico", recolher hormonas

previamente identificadas com padrões autênticos e 2) com o "modo tempo" no
intervalo entre os picos, durante o qual foram colectadas fracções de 4 ml. Foram
recolhidas, com este primeiro programa para separação dos ecdisteróides, um total 14
fracções. Porém, foram utilizados inicialmente programas muito semelhantes (no HPLC
e no colector de fracções) para a análise do ovário da espécie P. japonicus, de forma que
os resultados para esta espécie correspondem a 16 fracções (e não 14). Foi, no entanto,
estabelecida a respectiva correspondência relativamente às principais fracções, isto é, às
cinco fracções identificadas por co-eluição com padrões autênticos, apresentada no
quadro:

16 FRACÇÕES 14 FRACÇÕES

Hormona Fracção RT (min.) Fracção RT (min.)

26-OH-Polipodina+20,26 Ecdisona Fl 5.72 Fl 4,74

20-OH- Ecdisona F3 9.63 F2 8,40

Ecdisona F6 18.86 F4 15,5

2- deoxi- 20-OH- Ecdisona F8 26.43 F6 22,0

Ponasterona A F13 46.61 FIO 40,5

Para além dos ecdisteróides de reconhecida importância fisiológica, ecdisona,

20-OH-ecdisona e da ponasterona A, os restantes padrões foram utilizados apenas como
referência relativamente ás suas características cromatográficas (polaridade). As
hormonas 26-OH-polipodina e a 20,26 ecdisona sendo duas hormonas distintas apenas
são separadas cromatograficamente em fase normal, co-migrando no sistema, por nós
utilizado, de fase reversa.

224
 Hormonas Ecdisteróides

Resultados

Ecdisteróides Totais

P. japonicus

Os níveis de ecdisteróides totais no ovário da espécie P. japonicus no início do

seu desenvolvimento, situam-se na ordem dos 250 ng/g de peso seco (n=6) (figura 4.1.).

Este valor mostra uma tendência para uma ligeira descida nas fases seguintes (II
e III) sendo atingido o seu mínimo no final da vitelogénese (fase IV) com o valor de 115
ng/g (n=2). Desta fase para a seguinte, isto é na fase de desova (fase V) o seu valor
atinge o máximo, na ordem de 500 ng/g (n=3).

P. japonicus
Ecdisteróides Totais no Ovário
Ecdisteróides Totais
(ng/g ou ng/ovário)
Q
O)
O

T ..i... :
W
O
O
3

1 II Hl IV \i

Fases da Vitelogénese

. - - • * ■ -ng/ovário

Figura 4.1. Níveis de Ecdisteróides Totais no ovário de P. japonicus, ao longo da

vitelogénese. As barras verticais indicam o erro padrão.

A quantidade total de ecdisteróides por ovário é inicialmente reduzida (126 ng)

mas vai aumentando com o incremento da massa ovárica, parecendo estabilizar a partir
da fase III em valores de cerca de 300 ng (com um ligeiro máximo nesta fase de 362 ng)
até à desova (fase V) (ver figura 4.1.).

225
Capítulo 4

P. kerathurus

Nesta espécie, o ciclo de desenvolvimento do ovário é iniciado com um nível de

ecdisteróides totais na ordem dos 400 ng/g de peso seco (n=6) (figura 4.2.).
Aumentando ligeiramente para 480 ng/g na fase II, os níveis destas hormonas descem
nas fases III e IV, fase final de maturação esta que regista os níveis mínimos do ciclo:
155ng/g (n=5). Deste valor mínimo na fase IV, a concentração de ecdisteróides totais
sobe acentuadamente para o valor máximo do ciclo, no ovário em desova (fase V), que
se situa na ordem dos 600 ng/g (n=7).

Figura 4.2. Níveis de Ecdisteróides Totais no ovário e hemolinfa de P. kerathurus, ao

longo da vitelogénese. As barras verticais indicam o erro padrão.

A quantidade total de ecdisteróides presentes por ovário aumenta desde o valor

inicial (na fase I) de cerca de 230 ng para o dobro na fase II (por aumento ligeiro da
concentração hormonal conjugada com o aumento do peso da gónada) e para o máximo
na fase III (cerca de 500 ng) que se mantém na fase seguinte.

Na fase V, os níveis baixam para a ordem de 400 ng que, dado à diminuição

drástica de peso que o ovário manifesta com a desova, conduz à elevada concentração
de ecdisteróides encontrados nesta fase. O número de animais utilizado nestas análises
variou entre 5 e 6.

226
 Hormonas Ecdisteróides

Na hemolinfa, o perfil das variações do nível de ecdisteróides detectadas é

semelhante ao encontrado no ovário com a diferença de estas variações serem muito
mais acentuadas. Assim, na fase I os níveis médios encontrados em 6 espécimes foi de
26 ng/ml.

Uma subida algo acentuada foi verificada na fase II (49 ng/ml, n=5), valor
mantido na fase seguinte. De igual modo, foi detectado o mínimo de ecdisteróides totais
foi detectado na fase IV (9 ng/ml, n=5), para na fase seguinte, na desova, os valores
voltarem a subir até ao valor próximo do máximo com cerca de 44 ng/ml (figuras 4.2. e
4.3.).

Ecdisteróides Totais

I 800- "40
c
V) * I
Ecdisteróides Tota

30 £
(D

■20^
E
f/S V
X
10
"^^^^^rr^>

1 li III IV V
Fases da Vitelogénese

P. japonicus (ovário- ng/g) ~ « * Hemolinfa (ng/ml)

Figura 4.3. Comparação dos perfis de Ecdisteróides Totais (ng/g de peso seco) no
ovário de P. japonicus e P. kerathurus e na hemolinfa de P. kerathurus, ao
longo da vitelogénese.

A comparação dos resultados obtidos para as duas espécies e nos dois tecidos
estudados (numa das espécies) mostra uma certa semelhança no perfil das variações do
nível de ecdisteróides ao longo do ciclo vitelogénico, parecendo coincidir nos níveis
mínimos na fase IV e máximos logo na fase seguinte (V) isto é, aquando a desova.

Em P. kerathurus, o perfil apresentado pelas variações do nível de ecdisteróides

na hemolinfa segue quase paralelo com o do ovário, apenas sendo mais pronunciada a
subida dos níveis na fase II e por conseguinte também a descida mais brusca até à fase

227
Capitulo 4

IV. Comparando as duas espécies, as semelhanças também são grandes quanto aos
valores absolutos, principalmente nos pontos mínimos e máximos. Nas fases I e II os
valores da espécie P. japonicus são, no entanto, cerca de metade dos níveis
apresentados pela espécie P. kerathurus.

A comparação dos resultados em termos de quantidade de ecdisteróides totais

em todo o ovário (figura 4.4.) acentua as semelhanças anteriormente descritas, com
variações ao longo das fases vitelogénicas de tendências idênticas, sendo no entanto os
valores para a espécie P. kerathurus sempre superiores aos da espécie P. japonicus.

Ecdisteróides Totais

1(11) 100

tfl mo
% 10 I
t-f%
«•g 600
«•2 E

«•t
400 I
■D
O
Ul 200 1 i
0
I II III IV V
Fases da VitelogÉnese

P. japoricus (ngfafàio) - R leratturus (ngícvárto) - " » Hemolinfa (ngM)

Figura 4.4. Comparação dos perfis de Ecdisteróides Totais em todo o ovário de

P. japonicus e P. kerathurus e na hemolinfa de P. kerathurus, ao longo
da vitelogénese.

Identificação e quantificação de vários ecdisteróides

Todas as fracções obtidas pela separação de ecdisteróides por HPLC foram

quantificados por EIA, sendo o valor de cada fracção, de forma idêntica aos resultados
de ecdisteróides totais, expresso como equivalentes de ecdisona.

Os ecdisteróides foram doseados no ovário de P. japonicus e no ovário e

hemolinfa de P. kerathurus, com uma média de 4 a 5 animais por fase vitelogénica.
Uma vez que o número total de fracções separadas por HPLC é diferente nas amostras

228
 Hormonas Ecdisteróides

de P. japonicus e P. kerathurus, apenas serão analisadas em detalhe as 5 fracções

correspondentes a ecdisteróides identificados.

P. japonicus

A relação percentual relativa entre as 5 referidas hormonas (figura 4.5), realça

por um lado a presença constante, em todas as fases vitelogénicas, das hormonas 26-
OH-polipodina + 20,26 ecdisona, Ecdisona e 2-Deoxi-20-OH-ecdisona e por outro as
importâncias em termos quantitativos dos ecdisteróides 26-OH-polipodina + 20,26
ecdisona, 2- Deoxi- 20-OH-ecdisona e na fase III da hormona activa 20-OH-ecdisona.

^mÊãaeisammiíMiÊÊmÊSmÊimiÊÍíÊUÊm^^: ^ :
--"--— ^---i^-»^ ; .— ^^ljtimtjátíàiímiiaaâ^^

Figura 4.5. Variação percentual relativa de 5 ecdisteróides identificados no ovário de

P. japonicus ao longo da vitelogénese.

A separação por HPLC dos extractos purificados de ovário desta espécie

originou 16 fracções que foram quantificadas por EIA e cujos resultados estão
representados nafigura4.6.

A análise do resultados no seu conjunto mostra uma abundância relativa

importante, em todas as fases (com excepção da fase II), de produtos muito polares

229
Capítulo 4

(fracções fl a f6) que parece aumentar de importância à medida que o ovário se

desenvolve.

A partir da fase II, aparece um grupo de ecdisteróides pouco polares (de

polaridade inferior à f6 - Ponasterona), e que se manifestam com particular relevo nas
fases II, IV e V.

Figura 4.6. Quantificação de ecdisteróides por EIA (n=4 a 5 animais por fase, ng eq. Ecd./g) de 16
fracções provenientes da separação por HPLC, de extracto purificado de ovário de P.
japonicus, ao longo do desenvolvimento do ovário. Cinco destas fracções foram
identificadas por co-eluição com padrões autênticos (ver quadro na pág. 12).

De uma forma geral, os cinco ecdisteróides identificados, a Ecdisona, a 20-OH-

ecdisona, a Ponasterona A, a 2- Deoxi-20-OH-ecdisona e a mistura de 26-OH-
polipodina+20,26 ecdisona, apresentam uma evolução semelhante, ao longo do
desenvolvimento do ovário, com os mínimos nas fases iniciais e finais do ciclo (fases I
e V), com cerca de 1 a 10 ng/g de peso seco (n=4 a 5 por fase) (figura 4.7.).

Os valores máximos, para todas as hormonas presentes em todas as fases

(ecdisona, 2-deoxi-20-OH- ecdisona e a mistura de 26-OH-polipodina+20,26 ecdisona)
aparecem na fase III. A 20-OH-ecdisona (apenas detectada nas fases I e Hl), atinge

230
 Hormonas Ecdisteróides

valores da ordem de 200 ng/g (n=8) na fase III, constituindo nesta fase a fracção de
maior abundância relativa (figura 4.6).

No ovário desta espécie, e entre os ecdisteróides identificados, o ecdisteróide de

maior prevalência e abundância é a 2-deoxi-20-OH-ecdisona.

Apresentando uma variação paralela a esta hormona, mas de níveis ligeiramente

inferiores, foi encontrada a hormona precursora da hormona activa, a Ecdisona.

P. japonais
Ecdisteróides no Ovário

■
100

Bi 10,
c
*~~ '\^^"1^
1
■
n_
I II III IV V
Fases da Vrtelogênese

——2&OHftíipodina+2Q266xJisora ■ 2D OKBdsona Bxfisona — — 2 - decw- 2 0 O + Bdisona ♦ PonastercnaA

Figura 4.7. Variação ao longo da vitelogénese de 5 ecdisteróides identificados no

ovário de P. japonicus. Os valores são apresentados como equivalentes
de Ecdisona (ng/g).

A Ponasterona A não foi encontrada na fase II e IV, variando entre 2 ng/g

(mínimo na fase V) e o máximo na fase III com 12 ng/g (n=8).

As hormonas 26-OH-polipodina+20,26 ecdisona de níveis entre 1 e 10 ng/g têm

o seu máximo na fase III terminando o ciclo com cerca de 5 ng/g.

231
Capítulo 4

P. kerathurus

Ovário
As percentagens relativas, dos 5 ecdisteróides identificados, presentes no ovário
desta espécie mostra claramente a 20-OH-ecdisona como a hormona maioritária em
todas as fases do ciclo da vitelogénese (figura 4.8.).

g 26-OH-Pollpodlna+20,26 Ecdisona a 20-OH- Ecdisona p Ecdisona g 2- deoxi- 20-OH- Ecdisona a Ponasterona A

Figura 4.8. Variação ao longo da vitelogénese de 5 ecdisteróides identificados no ovário

de P. kerathurus.

Desta forma, todos os outros ecdisteróides apresentam uma abundância relativa

de menor importância: na fase I a ecdisona atinge a cota de 20%, valor este igual para o
conjunto de 26-OH-Polipodina+20,26 ecdisona na fase IV e para a ponasterona A na
fase III.

Nesta espécie, a separação por HPLC em 14 fracções dos extractos purificados

do ovário, em distintas fases do seu desenvolvimento vitelogénico, e sua posterior
quantificação por EIA resultou nos perfis apresentados nafigura4.9.

232
 Hormonas Eedisteróides

Figura 4.9. Resultado da quantificação de 14 fracções de eedisteróides provenientes da

separação por HPLC, de extracto purificado de ovário liofilizado de P.
kerathurus, ao longo de 5 fases vitelogénicas. Os valores são apresentados como
equivalentes de Ecdisona (ng/g).

Na fase I estão presentes grupos polares (f2- 20-OH-ecdisona e f3) e

medianamente polares (entre a f4- ecdisona e a flO- ponasterona A), notando-se a
ausência de substâncias muito polares (fl) assim como as de menor polaridade (após a
flO- ponasterona A).

Na fase seguinte (fase II) são evidenciados quatro grupos desde os muito polares
(fl) até aos mediamente polares, em quantidades significativas, as quais desaparecem na
fase III, dando lugar a dois grupos distintos, um muito polar e outro pouco polar.

No final da vitelogénese (fase IV), apenas um grupo de eedisteróides muito polar

é visível. Na desova (fase V), são evidenciados: um importante grupo muito polar e a
ausência de substâncias pouco polares bem como a presença de grupos de polaridade
média.

Nesta espécie foram detectados no ovário, em todas as fases vitelogénicas, os

cinco eedisteróides identificados (figura 4.10.).

233
Capítulo 4

Figura 4.10. Variação ao longo da vitelogénese de 5 ecdisteróides identificados no

ovário de P. kerathurus. Os valores são apresentados como equivalentes
de Ecdisona (ng/g).

A hormona activa da muda, a 20-OH- Ecdisona, é maioritária em todas as fases,

iniciando o ciclo com valores da ordem de 17 ng/g de peso seco (n=5), subindo
rapidamente na fase seguinte para 52 ng/g (n=6). Do máximo na fase II, o valor desta
hormona desce acentuadamente para o seu mínimo na fase seguinte (fase IH, 12 ng/g,
n=5). Mantendo-se na fase IV, o seu valor volta a aumentar na fase de desova para um
valor um pouco superior ao inicial (fase V, 23 ng/g, n=7).

A ecdisona, precursora da hormona activa, inicia o ciclo com uma concentração

de 6 ng/g (n=6) para logo baixar para níveis abaixo da unidade nas fases II, III e IV e
novamente subir para 3 ng/g na última fase (V, n=8).

A Ponasterona A apresenta um comportamento distinto: na fase I começa com 3

ng/g, diminuindo na fase II para 1 ng/g. Na fase III apresenta o seu máximo, com 4
ng/g, baixando na fase seguinte para 1 ng/g, mantendo-se com este valor até à desova
(fase V).

O ecdisteróide 2-deoxi-20-OH-ecdisona é o que apresenta menor variação ao

longo da vitelogénese.

234
 Hormonas Ecdisteróides

Os ecdisteróides mais polares, 26-OH-Polipodina+20,26 Ecdisona, têm o seu

máximo (4 ng/g) na fase IV, diminuindo para 3ng/g na última fase do ciclo, mostrando
no início do mesmo valores baixos de cerca de 1 ng/g (fases I, II e III).

Hemolinfa

Da análise da abundância relativa dos 5 ecdisteróides identificados, ao longo da

vitelogénese, ressalta a predominância da 20-OH-ecdisona, atingindo quase 100% na
fase II.

O início do ciclo é marcado pela presença de todas as formas hormonais,

situação que não se repetirá nas restantes fases do ciclo vitelogénico (figura 4.11).

hemolinfade P. kerathurus.

O resultado da quantificação, de todas as 14 fracções obtidas da separação por

HPLC de extractos purificados de hemolinfa da espécie P. kerathurus, estão
representadas graficamente nafigura4.12.

235
Capítulo 4

Figura 4.12. Resultado da quantificação de 14 fracções de ecdisteróides provenientes da

separação por HPLC, de extracto purificado de hemolinfa de P. kerathurus, ao
longo de 5 fases vitelogénicas. Os valores são apresentados como equivalentes de
Ecdisona (ng/g).

A abundância na fase I de vários ecdisteróides muito polares, de polaridade média e

pouco polares em quantidades significativas contrasta fortemente com a ausência de
produtos pouco polares e mediamente polares nas restantes fases.

As primeiras fracções, constituídas por ecdisteróides muito polares, depois de uma

ausência na fase II, reaparecem nas fases seguintes alcançando na fase V um nível
equivalente ao alcançado no inicio do ciclo vitelogénico.

Apenas três ecdisteróides foram encontrados na hemolinfa em todas as fases

vitelogénicas: 20-OH-ecdisona, Ecdisona e 2-Deoxi-20-OH-ecdisona.

A 20-OH-ecdisona, com um valor inicial de cerca de 4 ng/ml na fase I, atinge na

fase II o seu valor máximo de 74 ng/ml (n=5), diminuindo de seguida para valores
baixos nas fases m e IV (1 a 1.5 ng/ml). Na fase de desova (fase V) a 20-OH-ecdisona
retorna ao valor de início do ciclo ou seja de cerca de 4 ng/ml (n=8).

Os níveis da hormona ecdisona parecem manter-se constantes ao longo do ciclo

vitelogénico (cerca de 0.5 ng/ml) apresentando, no entanto um mínimo, na fase de

236
 Hormonas Ecdisteróides

maturação (fase IV). A variação da ecdisona evidencia um perfil quase simétrico à

hormona activa 20-OH-ecdisona, o que condiz com a sua condição de hormona
percursora da hormona activa.

O ecdisteróide Ponasterona A apenas aparece na fase I (2 ng/ml) assim como o

conjunto 26-OH-Polipodina+20,26 Ecdisona com o valor de apenas 0.8 ng/ml (Figura
4.13.).

Figura 4.13. Variação de ecdisteróides na hemolinfa de P. kerathurus ao longo da

vitelogénese. Os valores são apresentados como equivalentes de
Ecdisona (ng/ml).

Discussão

O ciclo de desenvolvimento do ovário dos peneídeos pode ser dividido nas

seguintes fases (ver capítulos 2 e 3): I- imaturos e início da previtelogénese; II-
previtelogénese avançada ou tardia (que corresponde à vitelogénese primária
classicamente descrita como vitelogénese endógena); III- vitelogénese (ou vitelogénese
secundária classicamente descrita como vitelogénese exógena); IV- maturação
(aparecimento das vesículas corticais, cisão da vesícula germinal, reiniciação meiótica e
ovulação) e V- desova.

237
Capítulo 4

Os resultados obtidos nas duas espécies de peneídeos estudadas revelam a

presença de ecdisteróides no ovário, bem como a sua variação ao longo do ciclo
vitelogénico. A presença de ecdisteróides no ovário foi já descrita em vários crustáceos
como por exemplo, em Penaeus vannamei (Chan, 1995), em Macrobrachium
rosenbergii (Wilder et ai, 1991; Young et ai, 1993), em Penaeus monodon (Young et
ai, 1993), em Palaemon serratus (Lanot e Clédon, 1989) e Homarus gammarus
(Goudeau et ai, 1990).

O perfil da variação de ecdisteróides totais nos ovários de P. japonicus e P.

kerathurus foi semelhante: diminuição progressiva desde a previtelogénese (fase I) até
ao final da maturação (fase IV) e aumento brusco na fase V, que corresponde à desova.

A diminuição dos níveis de ecdisteróides no ovário desde o seu estado imaturo

para o início de previtelogénese, seguida de uma queda brusca da previtelogénese até à
maturação foi descrita no peneídeo P. monodon (Young et ai, 1993). Na espécie
Macrobrachium rosenbergii, os mesmos autores encontraram um máximo no nível de
ecdisteróides totais no ovário imaturo para, depois de uma diminuição brusca na
previtelogénese, o nível subir novamente até à maturação. No entanto, estes resultados
não coincidem com os obtidos por Wilder et ai (1991) que, trabalhando com a mesma
espécie, mostraram que os ecdisteróides se acumulavam no ovário durante a
vitelogénese.

Considerando o aumento acentuado da massa do ovário durante a vitelogénese

(que na fase I é inferior a 1% do peso corporal e atinge na maturação cerca de 14%, na
espécie P. kerathurus) os valores podem ser expressos em nanogramas de ecdisteróides
por ovário. Expressos desta forma, o perfil de ecdisteróides totais aumenta gradualmente
até à fase III e mantém-se sensivelmente nos mesmos valores na fase IV. Resultados
semelhantes foram obtidos no ovário da espécie Macrobrachium rosenbergii (Young et
ai, 1993), no qual a diminuição da concentração dos ecdisteróides ao longo da
vitelogénese é "compensada" pelo aumento do peso da gónada durante esse processo.

238
 Hormonas Ecdister aides

Nos animais desovados (fase V) em que observa uma acentuada diminuição do

peso do ovário, como consequência da saída dos óvulos, o nível de ecdisteróides totais
por ovário diminui ligeiramente (no P. kerathurus) ou mantém-se num valor semelhante
à fase de maturação que precede a desova (no P. japonicus). Estes dados, de difícil
comparação dado que normalmente esta fase não é considerada nos trabalhos revistos,
parecem indicar a presença de ecdisteróides em elevadas quantidades nas células que
ficam no ovário após a desova ou seja nas células foliculares, ovócitos imaturos (mas
que podem iniciar imediatamente novo ciclo vitelogénico- ver capítulo 1) e alguns
ovócitos maduros assim como restos de vesículas corticais em processo de absorção.

Na hemolinfa da espécie P. kerathurus o perfil da variação do nível de

ecdisteróides totais parece seguir em paralelo as variações verificadas no ovário,
incluindo o aumento da concentração da fase IV para a fase V. No entanto, dadas as
diferenças encontradas nos níveis de vários ecdisteróides, identificados nos dois
compartimentos durante o ciclo vitelogénico, pensamos que a existência destes
compostos no ovário não deverá ser unicamente explicada pela sua perfusão pela
hemolinfa, mas sim pelos processos metabólicos e síntese de novo no seio daquele
órgão.

Na espécie Macrobrachium nipponense o ciclo reprodutivo coincide com o ciclo

da muda, sendo possível uma comparação entre os níveis de ecdisteróides durante o
chamado ciclo de muda reprodutivo e o ciclo de muda não-reprodutivo. No ciclo de
muda não-reprodutivo, após o máximo de ecdisteróides totais na hemolinfa observado
do na fase D3 (pré-muda), este valor vai diminuindo progressivamente nas fases de pós-
muda (A e B). Porém, no ciclo de muda reprodutivo, o valor máximo de ecdisteróides
totais na hemolinfa, observado igualmente na fase D3 (que antecede a muda e a
desova), diminui rapidamente, sendo observado outro máximo (de menor amplitude) na
pós-muda, coincidente com o aparecimento da vitelogenina na hemolinfa (Okumura et
ai, 1992). Desta forma, os valores máximos de ecdisteróides totais na hemolinfa da
espécie Macrobrachium nipponense coincidem com o início da vitelogénese e com a

239
Capítulo 4

desova, situação semelhante à encontrada neste trabalho para a espécie Penaeus

kerathurus.

A Ecdisona está presente no ovário e na hemolinfa de ambas as espécies

estudadas e em todas as fases do ciclo vitelogénico. Porém, o perfil da variação desta
hormona para uma espécie parece o oposto do perfil observado na outra. Enquanto em
Penaeus japonicus esta hormona apresenta o nível máximo durante a vitelogénese (fase
III) e os valores mínimos no início e fim do ciclo (fases I e V) na espécie P. kerathurus
esta hormona tem os seus máximos nestas fases e o valor mínimo na fase III. Em
Penaeus kerathurus, os níveis de ecdisteróides na hemolinfa são aproximadamente
constantes ao longo do ciclo, com um valor mínimo na fase de maturação (fase IV). Na
espécie Acanthonyx lunulatus a Ecdisona no ovário aumenta no início da vitelogénese e
novamente quando o ovócito atinge a maturação (Chaix e De Reggi, 1982). Resultados
semelhantes foram encontrados durante o ciclo de muda reprodutivo da espécie
Macrobrachium nipponense relacionando um máximo desta hormona, no ovário, com a
desova e outro de menor amplitude com o início da vitelogénese (Okumura et ai, 1992).
Curiosamente um máximo desta hormona no início do ciclo da muda foi também
observado em Palaemon serratus (Baldaia et ai, 1984), para o qual considerando
apenas o processo da muda, não foi encontrada explicação.

Da mesma forma que nos insectos, os crustáceos parecem poder sintetizar no

ovário a Ecdisona (além da 20-OH-ecdisona e Ponasterona A) a partir do colesterol,
através da células foliculares (Blanchet-Tournier, 1982). A síntese e o armazenamento
de Ecdisona nos ovócitos, e a sua presença nos ovos após a desova, sugere o
armazenamento da pro-hormona, que após hidroxilação (para dar lugar à hormona
activa 20-OH-Ecdisona) participa no desenvolvimento dos embriões (Chaix e De Reggi,
1982). O nível praticamente constante da Ecdisona na hemolinfa em todas as fases
vitelogénicas em Penaeus kerathurus parece indicar a síntese de novo desta hormona a
nível do ovário.

A variação da Ecdisona ao longo do ciclo vitelogénico na espécie Penaeus

monodon poderá ser similar à da espécie P. kerathurus uma vez que Young et ai

240
 Hormonas Ecdisteróides

(1993) observaram naquela espécie valores máximos da hormona nos ovócitos imaturos
e a sua diminuição até à maturação, não apresentando porém valores para animais em
desova os quais poderiam ser igualmente elevados.

No final da vitelogénese os ovócitos, que atingem o seu tamanho máximo, estão

bloqueados no estádio terminal (diploteno) da profase da méiose I. Neste estádio o
ovócito possui um grande núcleo que toma o nome de vesícula germinal. A maturação
do ovócito (ou maturação meiótica) consiste na progressão da méiose (do estádio
diploteno até ficar bloqueado novamente em metafase I ou II) que inclui a dissociação
nucleolar, condensação dos cromossomas e cisão da vesícula germinal. Em Palaemon
serratus os níveis de Ecdisona (bem como os de 20-OH-ecdisona) estão correlacionados
com a reiniciação meiótica (Lanot e Clédon, 1989) sugerindo estarem estas hormonas
envolvidas na maturação do ovócito. O nível elevado de Ecdisona encontrado na espécie
P. japonicus nos ovócitos no final da vitelogénese parece consistente com a possível
função dos ecdisteróides no desencadear da maturação dos ovócitos.

A hormona activa 20-OH-ecdisona foi detectada no ovário da espécie Penaeus

japonicus apenas no início do ciclo e durante a vitelogénese atingindo nesta última fase
altas concentrações. Com um comportamento distinto na espécie P. kerathurus, a
20-OH-ecdisona é a hormona maioritária em todas as fases vitelogénicas, apresentando
o seu máximo antes da vitelogénese e o mínimo nesta fase (III). O predomínio da
hormona activa 20-OH-ecdisona no início do ciclo vitelogénico (imaturos ou início da
previtelogénese) foi também descrita nas espécies Penaeus vannamei (Chan, 1995) e P.
monodon (Young et ai, 1993). Na hemolinfa de P. kerathurus esta hormona, que
representa na fase II quase 100% das hormonas identificadas, apresenta dois máximos,
nas fases II e IV, situação semelhante à descrita em P. orientalis, com valores máximos
no início do desenvolvimento do ovócito (que parece corresponder à fase II) embora não
tivessem sido analisados animais em desova (Weixin et ai, 1992).

A Ponasterona A (cujo precursor sintetizado no órgão Y é a 25-deoxiecdisona) é

a hormona maioritária nos ovos das espécies Homarus gammarus e Carcinus maenas,

241
Capítulo 4

parecendo estar relacionada com a finalização da secreção do invólucro embriónico do

ovo (Goudeau et ai, 1990). No entanto este ecdisteróide não foi encontrado durante a
vitelogénese do Penaeus monodon (Young et ai, 1993). Na espécie P. japonicus foi
detectado no ovário nas fases I e III e em todas as fases do ciclo vitelogénico na espécie
P. kerathurus (com o máximo em I e III).

O ecdisteróide 2-deoxi-20-OH-ecdisona, utilizado neste trabalho como

composto de referência, foi o que apresentou maior prevalência e abundância (máximo
na fase III) na espécie P. japonicus. Na espécie P. kerathurus, também aparece em todas
as fases quer na hemolinfa quer no ovário, sem contudo apresentar variações. Este
composto, utilizado igualmente como padrão autêntico no trabalho de Okumura et ai.
(1992), não foi porém detectado na espécie Macrobrachium nipponense.

Incluídos no grupo dos chamados "produtos muito polares" (HPP), que

cromatograficamente eluem antes da 20-OH-ecdisona, estão os dois ecdisteróides 26-
OH-polipodina e 20, 26-ecdisona (mas que no entanto em cromatografia de fase reversa
não são separados) que foram utilizados como referências neste trabalho. Este grupo
(HPP) está presente no ovário das espécies Penaeus japonicus e P. kerathurus em todas
as fases vitelogénicas e parecendo aumentar de importância até à maturação. Na
hemolinfa esta grupo apenas foi detectado no início do ciclo. Os HPP foram detectados
na hemolinfa de P. japonicus ao longo do ciclo da muda (Okumura et ai, 1989), em
Palaemon serratus (Baldaia et ai, 1984) e nos ovos (recém desovados) de Acanthonyx
lunulatus (Chaix e De Reggi, 1982). Os produtos de muito polares (HPP), para além de
formas livres de ecdisteróides (como os dois ecdisteróides utilizados como referência)
parecem incluir formas conjugadas de ecdisteróides que desta forma ficam inactivos
(Okumura et ai, 1989, 1992). Os "produtos de baixa polaridade" (LPP), que neste
trabalho são considerados como os de polaridade inferior à Ponasterona A, foram
detectados em P. kerathurus apenas na fase I quer na hemolinfa quer no ovário. No
ovário da espécie P. japonicus a sua importância parece aumentar no final do
desenvolvimento do ovário até à desova. Embora de pouca importância relativa estes
grupos (HPP e LPP) podem reflectir variações do metabolismo dos ecdisteróides ao

242
 Hormonas Ecdister aides

longo dos ciclos de muda e reprodutivo ou mesmo uma função fisiológica de algum dos
componentes ainda não isolado (Okumura et ai, 1989).

Em conclusão os resultados descritos sugerem a relação dos ecdisteróides com a

reprodução em vários níveis: como promotores da vitelogénese (síntese nas células
foliculares ou sua captura pelo ovócito), na maturação do ovócito (reiniciação meiótica),
no controlo da secreção do invólucro embriónico e finalmente actuando nos processos
embriológicos dentro do ovo. Porém, a imensa disparidade dos resultados obtidos sobre
as variações dos níveis de vários ecdisteróides ao longo do ciclo reprodutivo em
diferentes espécies de crustáceos, pressupõe, de forma idêntica ao observado nos
insectos, diferenças fundamentais no papel destas hormonas na reprodução dos
crustáceos. Desta forma, parece-nos necessário um aprofundamento substancial do
estudo para determinar o papel dos ecdisteróides na ovogénese nos crustáceos.

243
Hormonas esteróides no ovário de Penaeus japonicus. Perfil de
Progesterona ao Longo das Fases de Desenvolvimento do
Ovário das Espécies Penaeus japonicus e P. kerathurus.
 Hormonas Esteróides

Introdução

Como foi já referido (ver Introdução Geral), ao longo dos últimos 25 anos têm
sido observados em invertebrados diversos esteróides sexuais, originalmente
descobertos em vertebrados (daí a designação de esteróides do tipo de vertebrados).
São exemplos a progesterona, a testosterona, o estradiol, cuja possível função hormonal
ainda não está provada (Lafont, 1991). De facto, são vários os estudos incidindo sobre
os efeitos de hormonas reprodutivas de vertebrados em crustáceos, assim como sobre a
sua identificação e quantificação, quer na hemolinfa, quer em possíveis tecidos
produtores ou alvo, bem como a própria capacidade enzimática para uma síntese
endógena (revisões de Fingerman, 1987; Fingerman et ai, 1993; Sandor, 1980).

Em vários trabalhos de revisão sobre o controlo endócrino da reprodução em

crustáceos (Meusy e Payen, 1988; Laufer e Landau, 1991, entre outros) são descritos
vários resultados de estimulação da vitelogénese por hormonas sexuais de mamíferos
tais como a hormona coriónica humana (HCG) e a Progesterona. A detecção de vários
destes esteróides na hemolinfa, ovário, hepatopâncreas, órgão mandibular etc., em
diferentes espécies de crustáceos, indicia a necessidade de mais estudos para consolidar
a hipótese do seu papel como hormonas nos crustáceos. Argumentos a favor da
hipótese de que os esteróides (C2i, C19, e CI8) são moléculas universais e que
constituem mensageiros nativos dos invertebrados, ainda que de função fisiológica não
definida, estão revistos no trabalho de Sandor (1980). Como foi já referido na
Introdução Geral, a regulação da vitelogénese secundária é realizada através de factores
neuroendócrinos como a hormona inibidora da vitelogénese (VIH) dos pedúnculos
oculares e a hormona estimuladora da vitelogénese (VSH) dos gânglios torácicos.
Finalmente, uma hormona ovárica estimuladora da vitelogenina (VSOH), secretada
pelas células foliculares secundárias poderá, a exemplo do que acontece nos antípodes
(Payen, 1980), contribuir para a estimulação da síntese de vitelogenina nos crustáceos
décapodes (Charniaux-Cotton, 1980; Hasegawa et ai, 1993). Como parece representar
um papel semelhante ao 17|3-estradiol nos vertebrados ovíparos (Meusy e Payen,

247
Capítulo 5

1988), a sua natureza química poderá ser esteróide (Van Herp e Payen, 1991). De facto,
existe hoje um conjunto de evidências que levam a sugerir que as hormonas esteróides
sexuais do tipo de vertebrados podem representar um importante papel na regulação da
vitelogénese. A produção de várias hormonas esteróides tendo como precursor o
colesterol foi conseguida por Kanazawa e Theshima (1971) na espécie Panulirus
japonica. O trabalho recente de Summavielle et ai, (1997) demonstra a existência, no
ovário de P. japonicus, de vários sistemas enzimáticos (20cc-HSD, 17a-hidroxilase,
C] 7 - C2o liase, 17oc-HSD e aromatase) necessários para produção e conversão de
hormonas esteróides.

Na espécie Penaeus monodon os níveis de vários esteróides foram estudados ao

longo do ciclo reprodutivo (Fairs et ai, 1990). Foi também demonstrada uma
alternância de estrogénios e progestagénios no ciclo sexual da Artemia, tendo os
primeiros o seu máximo durante a vitelogénese e os segundos entre os ciclos
vitelogénicos (antes e depois da desova) (Van Beek e De Loof, 1988). Com o objectivo
de estabelecer o papel dos esteróides na regulação da ovogénese nos crustáceos,
determinamos a presença de vários esteróides no ovário de Penaeus japonicus através
de espectrometria de massa (MS) e a variação dos níveis de Progesterona no ovário e
na hemolinfa na espécie autóctone P. kerathurus.

Material e Métodos

A extracção dos esteróides foi realizada segundo a técnica cujo desenvolvimento

e validação é objecto do capítulo 3, onde é também apresentado o programa de HPLC
utilizado para separação de esteróides. Embora o programa esteja preparado para separar
vários esteróides assim como o colector de fracções programado para recolher
especificamente certos picos, foi utilizada a técnica de radio-imuno-ensaio (RIA), para o
doseamento de Progesterona, uma vez que a concentração existente nos tecidos se situa
abaixo do limite de detecção do HPLC.

248
 Hormonas Esteróides

No capítulo 3 é igualmente descrita a preparação das amostras de ovário da

espécie P. japonicus, nas quais o Departamento de Química da Universidade de Aveiro,
identificou várias hormonas esteróides, utilizando técnicas de espectrometria de massa
como a "Tandem Mass Spectrometry (MS/MS) e "Sequential Product Ion Scanning"
(MS/MS/MS).

Quantificação de Progesterona por RIA

Os níveis de Progesterona foram determinados utilizando "kits" I-RIA em

fase sólida COAT-A-COUNT, fornecidos por "Diagnostc Produts Corp. (Los Angeles,
CA). Nestas determinações os esteróides competem com um marcador (125I-
Progesterona), para um anticorpo específico ligado à parede de tubos de polipropileno.
O antisoro usado é também altamente específico. As quantidades de Progesterona foram
calculadas através da recta-padrão (com transformação log-logit) obtida de padrões
entre 0-40 ng/ml. Nas nossas condições este método apresenta os seguintes parâmetros
de qualidade:

- ligação máxima (MB) 39.8 % ± 3.3 (n=4)

- ligações não específicas (NSB) 0.86 % ± 0.23 (n=4)

- 50% B/B0, 2.78 ng/ml ± 1.63 (n=4)

Validação do RIA aplicado a tecidos de crustáceos

Como o "kit" de RIA para a Progesterona foi desenvolvido inicialmente para o

doseamento em soro humano, fizemos a sua validação para extractos brutos de ovário de
camarão através de testes de exactidão, de precisão intra e inter-ensaios e de possíveis
reacções cruzadas (Prat et ai., 1986).

A. Precisão: traduz a reprodutibilidade do método, medida através do coeficiente

de variação entre várias (mínimo 3) réplicas dentro do mesmo ensaio (intra-ensaio) e

249
Capítulo 5

entre vários ensaios (inter-ensaio).

B. Exactidão:
BI Teste de paralelismo: permite verificar a existência de possíveis reacções
cruzadas comparando a recta padrão com 3 rectas semelhantes à anterior usando o
extracto em estudo.

Para as rectas de diluição do extracto foram juntas várias porções de gónada

liofilizada de vários animais até perfazer um "pool" de 1250 mg. Foram depois pesadas
3 vezes 200 mg e extraídas cada uma com 10 ml de metanol (4+3+3), fazendo
centrifugações intermédias e juntando os respectivos sobrenadantes. Finalmente foram
evaporadas e ressuspendidas em 750 ixl de tampão fosfato (pH=7.4, 0.1 M, utilizado no
EIA, ver capítulo 4).

B2. Teste de sobrecarga: foram adicionadas quantidades conhecidas de

Progesterona aos extractos (mínimo 3) em estudo e posteriormente determinada a
correlação existente entre os valores obtidos e os valores esperados.

1. Preparação do extracto:

Foram pesados 200 mg de gónada liofilizada (em triplicado) e extraídos com 10

ml de MeOH. Depois de evaporadas com azoto e ressuspendidas em 750 ul de
tampão fosfato (pH=7.4, 0.1 M), foram retiradas alíquotas de 150 pi e adicionado
um volume fixo de padrão.

2. Preparação da solução padrão:

Foi evaporado 1 ml de Progesterona diluída em EtOH com uma concentração de

3.3(o,g/ml e ressuspendido em 50 ml de tampão fosfato ficando assim com uma
concentração final de 66 ng/ml.

3. Foram realizadas várias diluições procedendo de acordo com o quadro 5.1.

250
 Hormonas Esteróides

Quadro 5.1. Diluições do extracto + padrão para o teste de sobrecarga

V. a medir V f (EIA) Cone. Padrão V. Pa. + V. Ext. Cone. No Ext.

(ml) (ml) ng/ml (ul) (nl) ng/ml

0.04 4 0.66 100+150 0.264

0.125 4 2.063 100+150 0.825

0.250 4 4.125 100+150 1.650

0.5 4 8.25 100+150 3.3

1.0 4 16.5 100+150 6.6

2 4 33.0 100+150 13.2

0 - 66.0 100+150 26.4

Resultados

7. Identificação de esteróides por Espectrometria de Massa

Foram identificadas no ovário da espécie P. japonicus as seguintes hormonas

esteróides: Testosterona, Pregnenolona, 17oc-Hidroxiprogesterona e Progesterona. Estes
resultados foram obtidos no Departamento de Química da Universidade de Aveiro,
através de "Tandem Mass Spectrometry (MS/MS) e "Sequential Product Ion Scanning"
(MS/MS/MS) (Cardoso, etal, 1997).

251
Capítulo 5

II. V alidação do Método

A exactidão foi obtida pelo cálculo da regressão linear entre os valores

esperados do padrão (concentrações entre 0 e 40 ng/ml) e os valores esperados do
extracto com igual concentração (r=0.95 e p<0.001).

40-
ng/ml)
CO

• sS0^
• •

Bg
■§ 20 •s
•
l
Vi •
&
O
Valores
o

1 •
0 5 10 15 20 25 30 3E 40 45

Valores Esperados (Prog. ng/ml )

Figura 5.1. Regressão linear entre os valores esperados e observados (r=0.95 e

pO.001).

A precisão intra-ensaios, traduzida pelo coeficiente de variação (CV) de várias

réplicas (n=4), de quantidades conhecidas de Progesterona (concentrações entre 0.624 e
14.2 ng/ml) introduzidas em extractos, situou-se entre 4.47 e 8.55%. A precisão inter-
ensaios (n=3) testada com 2.103 ng/ml de Progesterona resultou num CV= 12.86%.

252
 Hormonas Esteróides

Quadro 5.2. Replicados de uma amostra no mesmo ensaio (1) e em diferentes ensaios (2). Média (X),
Desvio Padrão (SD) e coeficiente de variação (CV)

INTRA-ENSAIO ( 1 ) INTER-ENSAIO (2)

X=0.624 ng/ml SD=0.039 CV=6.18 % (n=4)

X=1.738ng/ml SD=0.093 CV=5.35 % (n=4) X=2.103 ng/ml SD=0.270 CV=12.86% (n=3)

X=2.063 ng/ml SD=0.176 CV=8.55 % (n=4)

X=4.678 ng/ml SD=0.345 CV=7.37 % (n=4)

X=14.2 ng/ml SD=0.634 CV=4.47 % (n=3)

Os efeitos de possíveis reacções cruzadas foram avaliados comparando curvas

log-logit de diluição de padrões com curvas log-logit de diluição de amostras biológicas
(extracção simples), com iguais concentrações de Progesterona.

O teste t aplicado ao estudo do paralelismo das curvas de diluição mostrou

pequenas mas significativas diferenças, indicando a existência de prováveis reacções
cruzadas.

Deste modo, e de forma a evitar as eventuais reacções cruzadas, os doseamentos

de Progesterona por RIA foram executados não no extracto purificado mas na fracção
correspondente após separação por HPLC.

253
Capítulo 5

Cone. ng/ml

Figura 5.2. Regressão linear das curvas Log-logit de Padrões (*-*) e do

extracto ( - ): tCal(|-3.71|)>tCrit. (2.086) e 0.1<P<1%

Cone. ng/ml

Figura 5.3. Regressão linear das curvas Log-logit de Padrões (*-*) e do

extracto ( - ): tCal(|-3.05|)>tCrit. (2.101) e 0.1<P<1%

254
 Hormonas Esteróides

A alíquota destinada à injecção em HPLC (eppendorf referido na técnica final

por 10.1, ver capítulo 3), foi ressuspendida, antes de injectar, em 60 ul de MeOH/H 2 0
(90%) e daqui injectados 40 ul com uma seringa de precisão Hamilton. Depois do
programa para separação dos ecdisteróides (denominado ECDIS, ver capítulo 4) e a ele
ligado automaticamente, é iniciado um outro (denominado ESTE) que separa vários
esteróides, sendo constituído por um programa isocrático de metanol a 80%
(MeOH/H20 80%, v/v), com um fluxo de 0.8 ml/min., durante 30 minutos ao longo dos
quais foram recolhidas 8 fracções. Uma das fracções recolhidas corresponde ao pico de
Progesterona (TR- 12 min. no programa ESTE).

III. Quantificação de Progesterona por RIA em Amostras de Ovário e

Hemolinfa de Penaeus japonic us e P. kerathurus

Penaeus japonicus

Na espécie P. japonicus, a concentração de Progesterona no ovário no inicio do

seu desenvolvimento (fase I) é de cerca de 4 ng/g de peso seco (n=6), constituindo este
o valor máximo encontrado em todo o ciclo vitelogénico (figura 4.4.).

Na fase seguinte (fase II), o valor da Progesterona situa-se abaixo de 1 ng/g,

(sendo no entanto este valor proveniente de um só animal). Na fase III, o valor é de
cerca de 2 ng/g (n=7) e torna-se ainda mais reduzido na fase IV para na fase final de
desova (fase V) voltar a atingir um valor próximo do inicial (cerca de 3 ng/g, n=4).

255
Capítulo 5

P.japonicus
Progesterona no Ovário
(ng/g ou ng/ovário
Progesterona

I
/ ^ ~' ~-m
i N. ,.

l II m IV V
Fases da Vitelogénese

, - - ♦ - -ng/ovário

Figura 5.4. Níveis de Progesterona no ovário de P. japonicus, ao longo da vitelogénese. As

barras verticais indicam o erro padrão.

Tendo em conta o aumento do peso do ovário ao longo da vitelogénese, foi

calculada a quantidade de Progesterona no ovário. Esta apresenta o seu menor valor no
inicio do ciclo, dado o reduzido peso do ovário nesta fase, aumentando nas fases III e IV
(cerca de 3ng/ovário), para durante a desova e devido à diminuição do peso do ovário
pela saída dos ovos, voltar a baixar a sua quantidade total (2 ng/g) em contraste com o
aumento da concentração nesta fase do ciclo (figura 5.4.).

Penaeus kerathurus

Os resultados obtidos nesta espécie dos níveis de Progesterona no ovário e

hemolinfa estão representados graficamente nafigura5.5.

O ovário da espécie P. kerathurus, apresenta no inicio do seu desenvolvimento

isto é nas fases I e II, os níveis de Progesterona mais baixos do ciclo (0.3 e 0.5 ng/g,
n=4), os quais são elevados para cerca de 2 ng/g nas fases seguintes, alcançando o
máximo na fase final de maturação e desova (fase V, 2.6 ng/g, n=5).

256
 Hormonas Esteróides

P. kerathurus
Progesterona

08

06

0.4 õ
E

lA 0.2

il ni IV
Fases da Vltelogénese

I I Ovário (ng/g) I 3(ng/ovário) ■ -Hemolinfa (ng/ml)

Figura 5.5. Níveis de Progesterona no ovário de P. kerathurus, ao longo da vitelogénese. As

barras verticais indicam o erro padrão.

O grande aumento do peso do ovário observado na passagem da fase III para a

fase IV resulta no aumento da quantidade total de Progesterona em todo o ovário
verificado na fase final da vitelogénese (IV) situando-se em 7.5 ng (n=5), o que
representa cerca do dobro da fase anterior (fase III). Finalmente, a saída dos ovócitos, e
não obstante o aumento da concentração da hormona nesta fase final, determina a
diminuição da quantidade existente no ovário na fase V, a qual se situa em cerca de 3 ng
(n=4).

Na hemolinfa, os resultados obtidos apontam para dois pontos máximos do

ciclo, na fase I (n=4) e na fase V (n=6) com 0.7 e 0.6 ng/ml respectivamente, mantendo-
se o nível de cerca de 0.25 ng/ml nas restantes fases do ciclo de desenvolvimento do
ovário (n=16).

Na figura 5.6. estão representadas as curvas obtidas para os valores de

Progesterona no ovário da espécie P. japonicus e no ovário e hemolinfa da espécie P.
kerathurus.

257
Capítulo 5

Progesterona

; , , , [ 0,0
I II III IV V
Fases da Vitelogénese

P japnnirm; (fwárin- nq/rj) P kffrathnrns (rwárin-nq/q) P kerathurus (herrolinfa- ng/rrl)

Figura 5.6. Comparação dos perfis de Progesterona no ovário de P. japonicus e

P. kerathurus, e hemolinfa de P. kerathurus ao longo da vitelogénese.

Exceptuando os baixos valores de Progesterona verificados no ovário da espécie

P. kerathurus no inicio do ciclo vitelogénico e que contrastam com os níveis elevados
na hemolinfa assim como no ovário do P. japonicus, a variação é semelhante em todas
as outras fases para as duas espécies e nos dois tecidos estudados.

Assiste-se a uma diminuição dos níveis da hormona (ou manutenção de um nível

baixo) da fase I para a fase II, seguida de uma tendência de aumento na fase III, mais
pronunciada no ovário, para depois de uma ligeira diminuição na fase IV voltar a
aumentar na fase V ou seja na desova, cujos valores são semelhantes aos da fase I
parecendo fechar de forma contínua o ciclo vitelogénico.

Discussão

Foram identificados, por espectrometria de massa, vários esteróides sexuais no

ovário da espécie P. japonicus. A presença inequívoca de Pregnenolona e Testosterona
nesta espécie vem confirmar os resultados obtidos, também por cromatografia de gás-
espectrometria de massa (GC-MS), por Fairs et ai. (1990), no ovário da espécie P.

258
 Hormonas Esteróides

monodon. Estes esteróides foram também detectados, por co-eluição com padrões
autênticos em HPLC, na hemolinfa de P. japonicus, por Summavielle et ai (1996). A
17cc-Hidroxiprogesterona foi também identificada no ovário de P. japonicus. Nesta
mesma espécie, Yano (1987) demonstrou a acção estimuladora deste esteróide na
síntese e/ou libertação de vitelogenina na hemolinfa.

Foi também detectada e identificada no ovário de P. japonicus a Progesterona,

esteróide já detectado nesta espécie, através de HPLC, por Summavielle et ai. (1996).
Igualmente por espectrometria de massa, Fairs et ai. (1990), identificaram este esteróide
no ovário da espécie P. monodon.

Não foi ainda estabelecido o papel fisiológico destes esteróides sexuais nos
invertebrados, nomeadamente nos crustáceos (Lafont, 1991). No entanto, a sua presença
inequívoca nestes animais, demonstrada por vários autores, assim como a evidência do
seu efeito na estimulação da vitelogénese (Yano, 1985, 1987) sugerem que o
desenvolvimento do ovário e a maturação dos ovócitos podem ser regulados por
hormonas esteróides de forma semelhante ao que acontece em peixes e anfíbios (Fairs et
ai, 1990). A variação dos níveis de vários esteróides ao longo da vitelogénese durante a
maturação dos ovócitos em crustáceos (Couch et ai, 1987, Fairs et ai, 1990,
Summavielle et ai, 1996) são um forte argumento de que os esteróides estão realmente
envolvidos nestes processos.

A variação dos níveis de Progesterona no ovário da espécie P. kerathurus ao

longo do ciclo vitelogénico revela serem as fases finais deste ciclo, isto é, o fim da
vitelogénese secundária (fase III), aparecimento das vesículas corticais e maturação do
ovócito (fase IV) e finalmente a desova (fase V), as fases que apresentam os níveis mais
elevados. A subida dos níveis de cerca de 0.4 ng/g das fases I e II para 2.3 ng/g na fase
III seguida de uma ligeira descida na fase IV para 1.7 ng/g está de acordo com os
resultados obtidos por Fairs et ai, (1990), na espécie P. monodon. Na fase III, esta
espécie apresenta 2.7 ng/g e na fase IV 1.3 ng/g. Estes autores não analisaram animais
em desova (fase V). Os nossos resultados nesta fase corresponderam ao máximo
encontrado de 2.6 ng/g. Dado que a fase V corresponde à desova, o elevado valor de

259
Capítulo 5

concentração de Progesterona nesta fase resulta numa quantidade da hormona inferior

em todo o ovário sendo a fase IV, que corresponde à maturação final do ovário aquela
que apresenta o valor mais elevado (7.5 ng/ovário). O perfil das variações de
Progesterona na hemolinfa da espécie P. kerathurus é semelhante ao do ovário com
excepção da fase I (início do desenvolvimento do ovário) a qual apresenta valores
próximos dos da fase V (0.68 e 0.63 ng/ml respectivamente). Curiosamente, na espécie
P. japonicus, a variação dos níveis de Progesterona no ovário segue um perfil idêntico
ao descrito para a hemolinfa de P. kerathurus, apresentando os máximos nas fases I e V,
os mínimos em II e IV. No crustáceo Artemia os níveis de Progesterona são aumentados
durante as últimas fases do ciclo reprodutivo em simultâneo com a descida dos níveis de
estrogénios (Van Beek et ai, 1988). Desta forma parece que à medida que se aproxima
a desova, os níveis de progestagénios aumentam e os dos estrogénios diminuiem. Nos
peixes e anfíbios os progestagénios estão envolvidos na estimulação da maturação dos
ovócitos (cisão da vesícula germinal-GVBD), e pelos nossos resultados, juntamente
com os obtidos por Fairs et ai, (1990) e Van Beek e De Loof (1988) poderá um sistema
análogo estar envolvido na regulação da ovogénese nos crustáceos.

260
Parte III. Dieta Viva de Maturação
Presença de Ecdisteraides e Esteróides Sexuais em Poliquetas
Utilizados em Aquacultura para Indução da Maturação Ovárica
de Fêmeas em Cativeiro.
 Esteróides na Dieta Viva

Introdução

Vários estudos biológicos e zootécnicos, com especial atenção para o processo

da reprodução (Redón e San Feliú, 1993, Rodriguez, 1985, San Feliú e Oltra, 1987),
têm contribuído para a evolução da produção dos peneídeos Penaeus japonicus e P.
kerathurus na Península Ibérica (ver Introdução Geral). O conhecimento do papel dos
ecdisteróides e esteróides sexuais do tipo de vertebrados na reprodução dos crustáceos,
bem como a sua presença e possíveis funções nos invertebrados que fazem parte da
alimentação dos crustáceos (ou incluídos na dieta no caso da aquacultura), poderá ser
utilizado para o incremento da produção em aquacultura.

Várias hormonas esteróides foram identificadas nos invertebrados. De facto,

ecdisteróides e esteróides sexuais do tipo de vertebrados estão presentes em todos os
invertebrados estudados, embora pouco se saiba quanto ao seu papel na reprodução
nestes animais.

Tem sido demonstrado que, para além do seu envolvimento na muda, os

ecdisteróides podem ter ainda uma função na estimulação da síntese proteica no ovário e
na produção da vitelogenina (ver capítulo 4). Por exemplo, foi encontrada em várias
espécies de crustáceos uma correlação entre os níveis de ecdisteróides e o
desenvolvimento vitelogénico (Okumura et ai, 1992, Summavielle et ai, 1995,
Walgraeve et ai, 1988, Wilder et ai, 1991, Young et a/.,1993a,b). Por outro lado, a
presença assim como a síntese de diversos esteróides sexuais foram detectados nos
ovários de crustáceos (ver capítulo 5), sugerindo um papel na vitelogénese destes
animais (Lafont, 1991).

As poliquetas constituem uma das dietas naturais preferenciais dos camarões. A

aquacultura de camarões veio aumentar a importância das poliquetas como suplemento
de alimento natural a fornecer aos camarões, principalmente às fêmeas reprodutoras.
Tem sido sugerido que os ácidos gordos poli-insaturados (Luís e Ponte, 1993, Lytle e
Lytle, 1990) e prostaglandinas (D'Croz et ai, 1988) presentes nas poliquetas são

265
Capítulo 6

responsáveis pela estimulação do crescimento e rápido desenvolvimento das gónadas.

No entanto, a existência e possível função na reprodução de crustáceos, de outros
constituintes das poliquetas como os ecdisteróides e esteróides sexuais do tipo de
vertebrados, não foi ainda estabelecida.

Neste trabalho, foram identificados e quantificados vários compostos esteróides

utilizando o método desenvolvido neste trabalho (capítulo 3) para a extracção e
purificação simultânea de ecdisteróides e esteróides sexuais. Baseados nos resultados,
discutimos o possível papel dos esteróides e ecdisteróides na reprodução e maturação
dos crustáceos e de uma possível origem adicional e exógena destas hormonas através
do consumo de um dos seus alimentos preferidos, isto é, as poliquetas.

Material e Métodos

Serão apresentados de forma sucinta neste capítulo os métodos utilizados, uma

vez que estes foram objecto de uma descrição detalhada na Parte II (capítulo 3, 4 e 5).

Extracção e purificação simultânea de ecdisteróides e esteróides

Os espécimes de Americonuphis magna foram capturados numa praia próxima

de Chacopata, Venezuela e os de Nereis diversicolor, são provenientes da foz do Rio
Douro, Porto. Para os primeiros, foi obtido um extracto etanólico dos animais (67.3 g
peso seco/l), por maceração a 4°C seguida de filtração por vácuo, e no segundo caso os
extractos foram obtidos com metanol em amostras (cerca de 300 mg) de animais
liofilizados. As hormonas foram purificadas dos extractos etanólico e metanólico
segundo o procedimento descrito detalhadamente no capítulo 3.

266
 Esteróides na Dieta Viva

Enzimo-imuno-ensaio (EIA) e Radio-imuno-ensaio (RIA)

Para a quantificação dos ecdisteróides foi utilizado o método enzimo-

imunológico (EIA) desenvolvido por Porcheron et ai. (1989) e descrito no capítulo 4.

A fracção correspondente ao pico de Progesterona, identificada por co-eluição

com o padrão autêntico, foi quantificada através de um kit comercial de fase sólida
125
COAT-A-COUNT I-RIA da Diagnostic Products Corp. (Los Angeles, CA) cujo
procedimento é detalhado no capítulo 5.

Resultados

Ecdisteróides

O nível de ecdisteróides livres totais, em extractos totais de A. magna, foram de

34.8 x 10" nmol/g de peso seco (17.4 ng/g). A análise destes extractos por HPLC é
mostrado no cromatograma da figura 6.1. Nas 14 fracções resultantes da separação por
HPLC, foram identificados quatro picos, por co-eluição com padrões autênticos:

a) 26-OH-Polipodina+20,26 Ecdisona (f1 ; RT=4.9 min.).

b) 20- OH-Ecdisona (f2; RT=9.4 min.).

c) Ecdisona (f4; RT=13.6 min.).

d) Ponasterona A (flO; RT=38.5 min.).

A fracção maioritária (42.6%) foi a 20- OH-Ecdisona (9.46 x 10" nmol/g peso
seco) e a ecdisona representou apenas 4.3% do total das fracções com reactividade no
EIA. A fracção (fl) correspondendo às hormonas 26-OH-Polipodina+20,26 Ecdisona
constituíram 10.2% e a (flO) Ponasterona A, 2.2%. Assim, os ecdisteróides
identificados representaram 59.3% dos ecdisteróides recolhidos.

267
Capítulo 6

140.0(1
C

120.00

100.00-

80.00-
a
mV b
60.00- Jl

u1/
40.00-

20.00- V d
A
^ - ^ _ __^-— ~--~~~-
! i i i i | i i i i ! i i • • • ■

10.00 20.00 30.00 40.00 50.00

Tempo de Retenção

Figura. 6.1. Cromatograma de separação de ecdisteróides em extractos purificados de todo o

corpo de A. magna, por HPLC (RP-HPLC -Gilson, coluna de fase reversa C18, 250
nun de comprimento e 4 mm 0), gradiente metanol/água 45/55 a 50/50 (v/v)
durante 60 minutos): a- 26-OH-Polipodina e 20-26 Ecdisona (fl), b- 20-OH-
Ecdisona (f2), c- Ecdisona (f4) e d- Ponasterona A (flO).

Foram igualmente detectados outros picos, com reactividade no EIA (figura

6.2). A fracção (f3) com uma polaridade entre a 20- OH-Ecdisona e a Ecdisona, foi a
mais representativa dos ecdisteróides não-identificados (12.1%). Ecdisteróides não-
identificados com polaridade inferior à Ponasterona A ainda representam 15.4% do total
de ecdisteróides. Não foram detectados níveis da hormona 2-deoxi-20-OH-Ecdisona,
correspondendo à fracção (f6, RT=22 min.) usada como padrão.

Na espécie Nereis diversicolor os níveis de ecdisteróides totais livres

encontrados variaram entre 0.8 e 4.2 x 103pmol/g ( peso seco) ou seja entre 400 a 2100
ng/g de peso seco, em sete amostragens efectuadas ao longo de cinco meses (de
Outubro a Fevereiro).

268
 Esteróides na Dieta Viva

Separação de Ecdisteróides por HPLC

E '•

■í 5

Fracções obtidas por HPLC

Figura. 6.2. Quantificação por EIA de cada uma das 14 fracções, obtidas por separação por
HPLC. Todos os valores são expressos como equivalentes à Ecdisona (nmol/g
peso seco). Cinco fracções foram identificadas como 26-OH-Polipodina+20,26
Ecdisona (fl; RT=4.9 min.), 20- OH-Ecdisona (f2; RT=9.4 min.), Ecdisona (f4;
RT=13.6 min.), 2-Deoxi-20-OH-Ecdisona (f6; RT=22.0 min.) e Ponasterona A
(flO; RT=38.5 min.) por co-eluição com padrões autênticos.

Esteróides

A análise por RIA do pico identificado como Progesterona resultou numa

concentração de 0.57 ng/g peso seco. Outros picos não identificados podem ser
observados no cromatograma da figura 6.3. Vários destes picos, representando produtos
de menor polaridade que a Progesterona, parecem revelar quantidades significativas a
julgar pelo tamanho relativo apresentado no cromatograma.

Na espécie Nereis diversicolor os níveis de Progesterona quantificados no

extracto bruto variaram entre 5.7 e 16.4 ng/g ( peso seco).

269
Capítulo 6

80.00-

70.00- Progesterona
60.00

50.00-
I

1.
mV 40.00-

\] w
30.00-
(1

1L
20.00-
\
10.00-

0.00 -
• ' ' ' I ' ' ' ' I ' ' ' ' I ' ' ' ' I ' ' ' ' I '
0. 90 5.00 10.00 15.00 20.00 25.00

Tempo de Retenção

Figura. 6.3. Cromatograma de separação de esteróides, em extractos purificados de todo o

corpo de A. magna, por HPLC. (RP-HPLC-Gilson, coluna de fase reversa C18,
250 mm de comprimento e 4 mm 0), usando um programa isocrático de
metanol/água 80/20 (v/v) durante 30 minutos.

Discussão

Os presentes resultados mostram a presença de consideráveis quantidades

(34.8xl0"3 nmol/g) de ecdisteróides livres em extractos totais de A. magna. Nestes
extractos foram também encontrados 0.57 ng de Progesterona por grama de peso seco, e
ainda vários picos não identificados, provavelmente representando outros esteróides,
que podem ser observados no cromatograma em níveis significativos.

A presença de ecdisteróides e esteróides na A. magna, bem como os conhecidos

efeitos zootécnicos na reprodução de crustáceos em cativeiro que se alimentam destes
organismos (Luís e Ponte, 1993, Redón e San Feliú, 1993), sugerem que hormonas
exógenas (vindas na dieta natural) podem ter um papel na indução da rápida maturação
do ovário. Estes efeitos podem ser sinergéticos ou independentes de outros

270
 Esteróides na Dieta Viva

do ovário. Estes efeitos podem ser sinergéticos ou independentes de outros componentes

como os ácidos gordos poli-insaturados (Luís e Ponte, 1993, Lytle e Lytle, 1990) e as
prostaglandinas (D'Croz et al, 1988).

A presença e possível papel dos ecdisteróides na reprodução dos invertebrados é

um tema que está a ser actualmente investigado em vários laboratórios. Por exemplo,
em Macrobrachium nipponense foi encontrada uma relação entre os níveis de
ecdisteróides e a vitelogénese (Okumura et ah, 1992). No ovário de M. rosenbergii, o
final da vitelogénese (incluindo a cisão da vesícula germinal) é sincronizada com o ciclo
da muda, com a cópula e a desova, e é acompanhada pelo aumento da acumulação de
ecdisteróides no ovário, mecanismo este similar ao descrito para os insectos (Young et
ai., 1993b). Outra analogia entre insectos e crustáceos foi claramente demonstrada com
a descoberta de que os ecdisteróides estão envolvidos na reiniciação meiótica nestes
dois grupos de artrópodes (Lanot e Clédon, 1989).

No presente trabalho foi encontrada uma variação nos níveis de ecdisteróides, ao

longo do ciclo de maturação, em extractos de ovário de P. japonicus e P. kerathurus
(capítulo 4 ). Em ambos os casos, e de forma idêntica ao que acontece na poliqueta A.
magna, a hormona activa 20-OH-Ecdisona representou sempre a maior fracção.

Em invertebrados não-artrópodes, os ecdisteróides parecem envolvidos em

diversos processos como o crescimento, desenvolvimento e gametogénese. Nas espécies
Paranemertes peregrina e P. californiensis (Nemertinea), a concentração de
ecdisteróides aumenta durante a época reprodutiva, sugerindo o seu envolvimento na
reprodução (Snyder et ah, 1992). Em alguns poliquetas, a gametogénese é controlada
negativamente por um neuro-peptido (nereidina) secretado no cérebro, tendo sido
sugerido que os ecdisteróides, libertados pelos ovócitos em crescimento, actuem por um
mecanismo de "feed-back" negativo no cérebro inibindo a secreção de nereidina
(Lafont, 1991). Os gastrópodes possuem ecdisteróides, mas como nos outros
invertebrados não-artrópodes, o seu significado biológico bem como a sua origem
permanece conjectural. Mais de 80% de ecdisteróides ingeridos (Ecdisona e 20-OH-
Ecdisona) permanece não-metabolizada e é excretada como tal (Garcia et ah, 1995).

271
Capítulo 6

As hormonas esteróides sexuais, que nos vertebrados regulam e coordenam

processos específicos, como a reprodução e a homeostase mineral, foram recentemente
isolados e quimicamente identificados em vários artrópodes incluindo crustáceos
(Couch et ai, 1987) e insectos (Bidmon e Stumpf, 1991)(ver revisão de Lafont, 1991).

Hormonas esteróides do tipo de vertebrados flutuam de acordo com o ciclo

sexual em diversos invertebrados (Couch et ai, 1987, Reis-Henriques et ai, 1990,
Summavielle et ai, 1995), e frequentemente o teor de esteróides no ovário aumenta com
a sua maturação. Proteínas transportadoras destes esteróides têm sido descritas em
vários invertebrados (Bidmon e Stumpf, 1991).

Alguns esteróides detectados em tecidos e fluídos corporais de várias espécies de

crustáceos têm mostrado ser biologicamente activos na estimulação da vitelogénese (ver
Lafont, 1991 para uma revisão). Assim, tem sido sugerido que o desenvolvimento
ovárico e a maturação do ovócito pode ser regulado por hormonas esteróides de forma
semelhante ao que acontece nos peixes e anfíbios (Fairs et ai, 1990).

Em fêmeas não-ablacionadas de P. japonicus, não só foi obtida uma maior

percentagem de maturação quando na dieta se incluíam poliquetas {Nereis diversicolor),
como também esta mesma dieta se mostrou essencial para se obterem rematurações
(Redón e San Feliú, 1993).

Naquala espécie, assim como em P. kerathurus, os níveis no ovário da hormona

esteróide Progesterona, variam ao longo do ciclo de maturação (capítulo 5).

Desta forma, ecdisteróides e esteróides sexuais do tipo de vertebrados poderão

ter um papel na reprodução de peneídeos, independentemente da sua origem. A
possibilidade do mesmo ser possível para as próprias poliquetas não pode ser excluído
sendo necessário aprofundar os estudos.

Tomados em conjunto, todos estes dados sugerem que, quer os ecdisteróides

quer os esteróides presentes na poliqueta A. magna, podem ser factores responsáveis
pela indução da rápida maturação do ovário, efeito zootécnico este já utilizado na

272
 Esteróides na Dieta Viva

aquacultura mediante a alimentação dos camarões com poliquetas.

273
Discussão Geral e Perspectivas Futuras
 Discussão Geral e Perspectivas Futuras

Discussão geral e perspectivas futuras

A importância da cultura de camarões peneídeos, principalmente no Sudoeste

Asiático e nos países Latino-americanos, contrasta com a diminuta produção destes
animais na Europa (principalmente Espanha e Itália) e mais acentuadamente com a sua
ausência na aquacultura portuguesa (Lee e Wickins, 1992; Laubier e Laubier, 1993). No
entanto, a presença na costa sul de Portugal do peneídeo autóctone Penaeus kerathurus,
constitui um imperativo ao seu estudo, nomeadamente em aspectos de aplicação prática
como seja o seu ciclo reprodutivo (Figueiredo, 1972; Luís, 1988). Por outro lado, vários
aspectos de investigação fundamental nos peneídeos, têm resultado em contribuições
para o conhecimento dos mecanismos gerais da ovogénese dos crustáceos
(Quackenbush, 1991). As investigações na área do controlo do ciclo reprodutivo de
peneídeos, passíveis de aplicação em aquacultura, poderão no futuro resultar numa
transferência tecnológica para países produtores. De facto, o interesse pelos resultados
obtidos ao longo deste trabalho, demonstrada por vários grupos sul-americanos com
quem mantemos relações de colaboração científica, é nessa perspectiva um bom
indicativo.

Os resultados presentes neste trabalho, fruto da investigação em animais

selvagens durante a época reprodutiva, podem constituir uma base de comparação em
trabalhos futuros de carácter mais interventivo e aplicadas em animais em cativeiro.
Assim, os resultados obtidos com as manipulações normalmente utilizadas para induzir
a vitelogénese e/ou a desova (alimento, ablação do pedúnculo ocular, choque térmico)
em populações em cativeiro, poderão ser agora monitorizados de forma a serem
comparados com este trabalho de base e desta forma ajudar a definir melhor o papel das
hormonas ecdisteróides e esteróides sexuais na reprodução dos peneídeos.

Este trabalho foi iniciado com o estudo das características morfológicas do

ovário durante a época reprodutiva, com o objectivo de estabelecer distintas fases do
ciclo vitelogénico. Tendo por base algumas classificações propostas por vários autores

277
Discussão e Perspectivas Futuras

(Meusy e Payen, 1988; Yano, 1988; Tan-Fermin e Pudera, 1989, entre outros) e
reconhecidas nas duas espécies objecto de estudo as características mais proeminentes
que permitissem distinguir inequivocamente distintas fases da ovogénese, foram os
animais agrupados em cinco fases vitelogénicas para o estudo posterior dos níveis
hormonais. Recentemente, o trabalho de Medina et ai. (1996) nas mesmas espécies de
peneídeos veio confirmar a validade dos critérios de divisão das fases vitelogénicas
utilizados ao longo deste trabalho. A inclusão de uma fase de desova, ignorada por
muitos autores, acarreta no entanto algumas incertezas tratando-se de animais selvagens:
a capacidade de rematuração rápida do ovário após uma desova é nestes animais
frequente e muito rápida (Yano, 1984). Desta forma é possível encontrar, dentro do
grupo de animais considerados em desova, animais em vários estádios fisiológicos
distintos e que só o estudo futuro com animais em cativeiro poderá vir a diferenciar.

O estudo da ultrastrutura do ovócito ao longo da vitelogénese permitiu a

descrição, inédita nestes animais, da formação dos organelos citoplasmáticos, da origem
das vesículas vitelinas e das vesículas corticais. Uma vez estabelecida cronologicamente
a sucessão destes acontecimentos e a sua caracterização morfológica, será possível a
utilização futura da microscopia electronica como potente "ferramenta" para vários
estudos de carácter interventivo (p. ex. as já referidas manipulações utilizadas na
aquacultura para induzir a maturação, a administração de doses biológicas de várias
hormonas). Por outro lado os resultados obtidos abrem novas perspectivas de estudo na
interface morfologia/função. Que significado terá a existência de dois tipos de células
foliculares encontradas ? Estarão relacionadas com a síntese de vitelogenina como
sugeriu Yano e Chinzei (1987) ? Ou com o controlo endocrinológico da reprodução
dando origem à "hormona ovárica estimuladora da vitelogenina, VSOH) como propõe
Payen (1980) ou a hormonas esteróides (Meusy e Payen, 1988; Van Herp e Payen,
1991) ? A descoberta nesta espécie de pontes intercelulares entre dois ovócitos e o
desenvolvimento de ovócitos aplanados e de crescimento lento, levanta a hipótese da
existência de verdadeiras células nutritivas até hoje não descritas nestes animais. O
próprio processo de apoptose apresentado por estas células e sua possível regulação (por

278
 Discussão Geral e Perspectivas Futuras

hormonas esteróides?) merece um estudo aprofundado. Dada a importância dos lípidos

como componentes do vitelo, merece maior atenção a origem das gotículas lipídicas
que, na maioria dos animais estudados, parecem surgir de novo, sem qualquer relação
aparente com organelos citoplasmáticos (Beams e Kessel, 1963; Papathanassiou e King,
1984). A possível entrada no ovócito de precursores extraovocíticos do vitelo, através de
endocitose mediada por receptores deverá ser objecto de estudos mais aprofundados,
quer quanto à especificidade dos receptores quer quanto à regulação da sua expressão.

O presente trabalho teve como objectivo o estudo da relação entre níveis de

ecdisteróides e esteróides sexuais e o desenrolar da vitelogénese. O desenvolvimento de
um método de purificação simultânea dos dois tipos de hormonas centrou-se apenas nas
hormonas livres, principalmente nas hormonas activas ou seus possíveis precursores. No
entanto, reconhecemos a importância que as hormonas conjugadas (sulfatos,
glucuronatos) têm, quer como indicadores do metabolismo hormonal (Fairs et ai, 1990;
Summavielle et ai, 1995), quer como eventuais sinais químicos ou mesmo
"feromonas". Daí que o método desenvolvido deva, no futuro, ser modificado de forma
a "recuperar" as formas hormonais conjugadas, usuais no metabolismo e/ou excreção
destas hormonas. Das várias hormonas esteróides separadas por HPLC centramos a
nossa atenção na Progesterona. Os estudos irão progredir no sentido da separação e
quantificação de outras hormonas esteróides que permitam demarcar a importância
relativa de cada uma delas bem como a sua relação com a vitelogénese.

Os resultados obtidos neste trabalho da variação dos níveis de ecdisteróides ao

longo da vitelogénese sugerem uma relação destas hormonas com a reprodução. No
entanto para o estabelecimento do papel exacto destas hormonas na ovogénese nestes
animais será necessário um estudo aprofundado. O estudo da vitelogénese numa
população selvagem acarreta, a nosso ver, algumas desvantagens. A maior entre elas é o
desconhecimento da "história" do animal. Como já foi referido, durante a época de
reprodução, estes animais podem realizar várias desovas. Deste modo poderá existir
alguma indefinição, em animais selvagens, entre animais em desova e animais em início

279
Discussão e Perspectivas Futuras

de previtelogénese traduzindo estados fisiológicos distintos em animais classificados

nessas fases vitelogénicas. Por fim, não deve ser menosprezada a própria variabilidade
biológica de que resulta a necessidade do estudo de um maior número de animais.

A conjugação do conhecimento dos níveis de várias hormonas ecdisteróides e

esteróides em estádios fundamentais da ovogénese dos camarões, bem como a
caracterização ultrastrutural da vitelogénese, possibilitará em consequência, a
experimentação quer in vivo quer in vitro da acção de doses biológicas dessas hormonas
(ou outras), ou de outros "estímulos" conhecidos, já referidos, como sejam a ablação do
pedúnculo ocular, o choque térmico e a alimentação com a devida monitorização através
de "ferramentas" tão potentes como a microscopia electrónica (modificações
ultrastruturais nos processos previamente caracterizados) e a cromatografia líquida
conjugada com processos quantitativos radio e enzimo-imunológicos (modificações no
perfil "normal" das hormonas esteróides). Finalmente, o "estímulo" alimentação vem
normalmente associado com rapidez e sucesso da desova em animais em condições de
cultura e está relacionado com a presença de poliquetas na dieta viva (Redon e San
Feliú, 1993). Nestes animais existe uma composição bem balanceada em ácidos gordos
poli-insaturados (Lytle e Lytle, 1990; Luís e Ponte, 1993), bem como a presença de
prostaglandinas (D'Croz et ah, 1988) factores estes que pareciam responsáveis pelo
efeito na indução da vitelogénese e/ou maturação nos camarões. O resultado deste
trabalho revelando a presença de níveis consideráveis de ecdisteróides e esteróides
sexuais em duas espécies de poliquetas poderá aumentar a lista de "indutores da
maturação" presentes nestes animais. Independentemente da questão do papel destes
compostos nas próprias poliquetas (serão hormonas? serão sintetizadas ou têm origem
exógena?), esta possível via de entrada de hormonas ou dos seus precursores com papel
preponderante na ovogénese deverá ser analizada nomeadamente com experiências de
incorporação de hormonas marcadas radioactivamente.

280
Resumo
 Resumo

Resumo

A importância da cultura do camarão peneídeo Penaeus japonicus, bem como a

existência no sul de Portugal da espécie autóctone P. kerathurus justificam o
aprofundamento dos conhecimentos sobre o seu ciclo reprodutivo. O presente trabalho
resulta de uma abordagem morfológica e endocrinológica da reprodução nestas espécies,
através do estudo das alterações morfológicas do ovário e da ultrastrutura do ovócito
bem como da sua relação com os níveis de hormonas ecdisteróides e esteróides sexuais
durante a ovogénese.

O estudo histológico do ovário de P. japonicus e P. kerathurus permitiu definir

cinco fases vitelogénicas: Fase I - Previtelogénese. Fase II - Previtelogénese avançada
ou vitelogénese primária. Fase III - Vitelogénese (vitelogénese secundária). Fase IV -
Maturação (formação de vesículas corticais). Fase V - Desova.

O presente trabalho constitui o primeiro estudo ultrastrutural da vitelogénese na

espécie P. kerathurus, demonstrando pela primeira vez nos peneídeos, a formação do
retículo endoplásmico e a origem dos grânulos densos. A origem dos vacúolos
autofágicos e a presença simultânea de dois tipos de células foliculares nos crustáceos,
bem como a presença de pontes intercelulares ("nurse-cells") na sub-classe
malacostraca, constituem igualmente observações inéditas deste trabalho. Em P.
kerathurus o vitelo tem uma origem mista, i. e., intraovocítica e extraovocítica. No
início da vitelogénese predominam os fenómenos de endocitose mediada por receptores.
Numa fase posterior, o processo vitelogénico é fundamentalmente intraovocítico,
exibindo apenas escassos fenómenos de endocitose. A síntese de vitelo endógeno, que
nesta espécie apresenta características peculiares, é descrito detalhadamente. Finalizada
a vitelogénese, observa-se a formação das especializações corticais (vesículas corticais
com estruturas do tipo "proteoglicano") cuja origem e desenvolvimento são descritas
pela primeira vez nos peneídeos.

Tendo como objectivo a quantificação de hormonas esteróides e ecdisteróides no

ovário e na hemolinfa de peneídeos foi desenvolvido um método de extracção,
purificação e separação simultânea para os dois tipos de hormonas. O método
compreende uma extracção em fase sólida do extracto metanólico bruto, seguida de uma
separação por HPLC em coluna de fase reversa, em dois programas interligados:
gradiente metanol/água para separação dos ecdisteróides e um sistema isocrático

283
Resumo

metanol/água para separação dos esteróides. A validação deste método resultou em

níveis de reproductibilidade elevados e rendimentos superiores a 90%. Os ecdisteróides
(totais e Ecdisona, 20-OH-ecdisona, Ponasterona A, entre outros) foram posteriormente
quantificados por enzimo-imuno-ensaio (EIA) e a Progesterona por radio-imuno-ensaio
(RIA), no ovário de P. japonicus e no ovário e hemolinfa de P. kerathurus ao longo das
cinco fases vitelogénicas. Os resultados revelam a relação possível dos ecdisteróides
com a reprodução a vários níveis: como promotores da vitelogénese, na maturação do
ovócito, no controlo da secreção do invólucro embriónico e finalmente actuando nos
processos embriológicos dentro do ovo.

Foram identificados, por espectrometria de massa, vários esteróides sexuais do

tipo de vertebrados no ovário da espécie P. japonicus: Pregnenolona, Testosterona, 17oc
-Hidroxiprogesterona e Progesterona. A variação dos níveis de Progesterona,
quantificada por HPLC/RIA, no ovário de P. japonicus e no ovário e hemolinfa de
P.kerathurus foi estudada ao longo do ciclo vitelogénico.

A indução rápida da maturação do ovário nos peneídeos em condições de

cultura, mediante a alimentação com poliquetas, é um efeito zootécnico conhecido e
utilizado amplamente em aquacultura. O doseamento de consideráveis quantidades de
vários ecdisteróides e de Progesterona (bem como a presença no cromatograma de
vários picos não identificados, provavelmente representando outros esteróides em níveis
significativos) nas poliquetas Americonuphis magna e Nereis diversicolor sustenta a
hipótese de que estas hormonas constituem os factores responsáveis pela referida
indução da maturação.

284
Résumé
 Résumé

Résumé

L'importance de l'élevage de la crevette peneidae Penaeus japonicus, aussi bien

que l'existence , au sud du Portugal, de l'espèce autochtone P. kerathurus justifient
l'approfondissement de la connaissance de leur cycle de réproduction. Ce travail est le
résultat d'une approche morphologique et endocrinologique de la réproduction chez ces
deux espèces, par l'étude des modifications morphologiques de l'ovaire et de
l'ultrastructure de l'ovocyte en même temps que l'étude de leur rapport avec les niveaux
des hormones ecdystéroides et stéroides sexuelles au cours de l'ovogenèse.

L'étude histologique de l'ovaire de Penaeus japonicus et de P. kerathurus nous a

permi de définir cinq phases vitellogéniques: Phase I - Prévitellogenèse. Phase II -
Prévitellogenèse avancée ou vitellogenèse primaire. Phase III - Vitellogenèse
(vitellogenèse secondaire). Phase IV - Maturation (formation de vésicules corticales).
Phase V - Ponte.

Ce travail décrit la première étude ultrastructurale de la vitellogenèse chez P.

kerathurus, métant en évidence, par la première fois, la formation du reticulum
endoplasmique et l'origine des granules denses. L'origine des vacuoles autophagiques et
la présence simultanée de deux types de cellules foliculaires chez les crustacés, aussi
bien que la présence de ponts intercellulaires ("nurse-cells") chez la sub-classe des
malacostracra, sont également des observations inédites décrites au cours de ce travail.
Chez P. kerathurus le vitellus presente une origine mixte, i.e., intraovocitaire et
extraovocitaire. Au début de la vitellogenèse les phénomènes d'endocytose à médiation
par des récepteurs sont prédominants. Plus tard, le processus vitellogénique est d'origine
essentiellement intraovocytaire, présentant un petit nombre de phénomènes
d'endocytose. La synthèse du vitellus endogène, qui chez cette espèce présente des
caractéristiques particuliaires, est décrite en détail. Dés que la vitellogenèse est
terminée, nous observons la formation des specializations corticales (vésicules corticales
présentant des structures dites proteoglicanes) dont la décrition de l'origine et du
développement sont inédites chez les penaidés.

Dans le but de la quantification des hormones stéroides et ecdystéroides dans

l'ovaire et l'hemolymphe des penaidés nous avons développé une méthode d'extraction,
purification et séparation simultanée de ces deux types d'hormones. La méthode utilize
une extaction en phase solide de l'extrait methanolique brut, suivie d'une séparation par

287
Résumé

HPLC en colonne de phase reverse, par deux programmes interliés: gradient

methanol/eau pour la séparation des ecdystéroides et un système isocratique
methanol/eau pour la séparation des stéroides. La validation de cette méthode a mis en
évidence des niveaux de reproductibilité élevés et un rendement toujours supérieur à
90%. Les ecdystéroides (ecdystéroides totaux et ecdysone, 20-OH-ecdysone,
ponasterone A, parmi d'autres) ont été quantifiés en suite par enzyme-immuno-essai
(EIA) et la progesterone par radio-immuno-essai (RIA), dans l'ovaire de P. japonicus et
dans l'ovaire et l'hemolymphe de P. kerathurus tout au long des cinq phases
vitellogeniques. Les résultats obtenus montrent un possible rapport entre les
ecdystéroides et la reproduction, à plusieurs niveaux: comme promoteurs de la
vitellogenèse, dans la maturation de l'ovocyte, dans le controle de la sécrétion de
l'envellope embryonnaire et finalement en agissant dans les processus embryologiques
au sein de l'oeuf.

Nous avons identifié, par spectrométrie de masse, plusieurs stéroides sexuels du

type des vertébrés, dans l'ovaire de P. japonicus: pregnenolone, testoterone, 17a-
hydroxiprogesterone et progesterone. La variation des niveaux de progesterone,
quantifiée par HPLC/RIA, a été étudiée tout au long du cycle vitellogénique dans
l'ovaire de P. japonicus et dans l'ovaire et l'hemolymphe de P. kerathurus.

L'induction rapide de la maturation de l'ovaire chez les penaidés d'élevage, par

le biais d'une alimentation riche en polichaetes, est un effect zootechnique bien connu et
largement utilisé parmi les éleveurs. L'observation de quantités non négligeables de
plusieurs ecdystéroides et de progesterone (aussi bien que la présence significative
d'autres composés non identifiés, probablement des stéroides) chez les polichaetes
Americonuphis magna et Nereis diversicolis renforce l'hypothèse que ces hormones sont
les réponsables par l'induction de la maturation observée par les éleveurs.

288
Abstract
 Abstract

Abstract

The need for detailed studies of the reproductive cycles of penaeid shrimps is
clearly warranted, due to the economic importance of Penaeus japonicus and the
existence of the native specie P. kerathurus in southern Portugal.

In this dissertation results on the study of morphological and endocrinological

aspects of the reproduction in these species are presented. Our studies focused on
ovarian morphological alterations and oocyte ultrastructure, as well as their relationship
with ecdysteroids and steroids concentration during oogenesis.

Five vitellogenic phases were defined through ovarian histological study of these
two species: I - Previtellogenesis; II - Late Previtellogenesis or Primary Vitellogenesis;
III - Vitellogenesis or Secondary Vitellogenesis; IV - Maturation (cortical vesicle
phase); V - Spawning.

These work represents the first ultrastructural study done on the vitellogenesis of
the P. kerathurus. The formation of endoplasmic reticulum and the origin of dense
granules were demonstrated for the first time in the family Penaeidae. The origin of
autophagic vacuoles and the simultaneous presence of two different forms of follicular
cells in crustaceans, as well as the presence of inter-cellular bridges (nurse-cells) in the
sub-class malacostraca, were also described here for the first time.

In P. kerathurus the yolk has a dual origin, i.e., intraoocytic and extraoocytic. At
the beginning of the vitellogenesis there is a predominance of a receptor-mediated
endocytosis mechanism. Later on, the vitellogenic process is mainly a intraoocytic one,
with very few endocytosis phenomena. The unique endogenous yolk synthesis in this
specie is described in detail. Cortical specialization occurs at the end of the
vitellogenesis, with the formation of cortical vesicles displaying proteoglican-like
structures, which origin and development are described in Penaeidae family for the first
time.

Specific methodology for the simultaneous extraction, purification and

separation of steroids and ecdysteroids hormones in the ovary and hemolymph was
developed, in order to determine the concentration of these hormones by
radioimmunoassay (RIA) and enzymeimmunoassay (EIA). This methodology included
solid-phase extraction, followed by reverse phase HPLC separation, using two inter-

291
Abstract

connected programs: - a methanol/water gradient for separation of the ecdysteroids,

followed by an methanol/water isocratic system for steroid separation. This method was
validated by a high repeatability and recovery rates in excess of 90%. During the five
vitellogenic phases, concentrations of ecdysteroids (total ecdysteroids, Ecdysone, 20-
OH-Ecdysone and Ponasterone A among others) were determined by EIA and
concentrations of Progesterone by RIA. These hormones were measured in the ovary of
P. japonicus, and in the ovary and hemolymph of P. kerathurus. The results suggest a
relationship between peaks of these hormones with several reproductive features
characteristic of these species, namely induction of vitellogenesis, oocyte maturation,
control of embryonic envelope secretion, and participation in the embryonic
development and differentiation.

Several vertebrate-type sex steroids, namely Pregnenolone, Testosterone, 17a-

OH-Progesterone and Progesterone, were identified in the ovary of P. japonicus, using
mass spectrometry. Furthermore, quantification of Progesterone concentration in the
ovary of P. japonicus, and in the ovary and hemolymph of P. kerathurus was
determined by HPLC/RIA, for the five stages of the vitellogenic cycle.

The feeding of penaeids with polichaets is a well known and commonly used
method to induce rapid ovarian maturation in shrimp aquaculture. The finding of large
concentrations of ecdysteroids and Progesterone in the polichaets Americonuphis magna
and Nereis diversicolor support the hypothesis that these hormones are responsible for
the above mentioned accelerated ovarian maturation.

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