UNIVERSIDADE FEDERAL DO PAMPA

CAMPUS URUGUAIANA
CURSO DE MEDICINA VETERINÁRIA

RELATÓRIO DE ESTÁGIO CURRICULAR

SUPERVISIONADO EM MEDICINA VETERINÁRIA

Orientadora: Profa. Débora da Cruz Payão Pellegrini

Isis Burtet Jankus

Uruguaiana, dezembro de 2015

 
  
 

ISIS BURTET JANKUS

RELATÓRIO DE ESTÁGIO CURRICULAR SUPERVISIONADO EM

MEDICINA VETERINÁRIA

Relatório do Estágio Curricular Supervisionado

em Medicina Veterinária apresentado ao Curso
de Medicina Veterinária, Campus Uruguaiana da
Universidade Federal do Pampa, como requisito
parcial para obtenção do título de Bacharel em
Medicina Veterinária.

Orientadora: Débora da Cruz Payão Pellegrini

Médica Veterinária, Msc, Dra.

Uruguaiana
2015

 
  
 

ISIS BURTET JANKUS

Relatório do Estágio Curricular Supervisionado

em Medicina Veterinária apresentado ao curso
de Medicina Veterinária, Campus Uruguaiana da
Universidade Federal do Pampa, como requisito
parcial para obtenção do título de Bacharel em
Medicina Veterinária.

Área de concentração: Sanidade de aves e

suínos.

Relatório apresentado e defendido em 11 de dezembro de 2015.

_________________________________________________________
Profa. Dra. Débora da Cruz Payão Pelegrini
Orientadora

_______________________________________________________
Prof. Msc. Carlos Alexandre Oelke
Curso de medicina veterinária – UNIPAMPA

_______________________________________________________
Profa. Dra. Irina Lubeck
Curso de medicina veterinária - UNIPAMPA

 
  
 

Dedico esse trabalho a minha mãe, por todo

apoio e dedicação para que eu pudesse enfim
realizar esse grande sonho.

 
  
 

AGRADECIMENTOS

A equipe do Laboratório de Saúde Animal, pelo aprendizado e convívio. Em especial

a Anne Caroline de Lara, minha supervisora, que possibilitou essa oportunidade e a Taís
Regina Michaelsen, por sua amizade, paciência e ensinamentos.
A professora Débora da Cruz Payão Pellegrini, por todas as horas dispensadas com
sua orientação durante o período do estágio.
Aos Professores Tiago Gallina Corrêa, Mário Celso Sperotto Brum, Bruno Leite dos
Anjos, e Irina Lubeck, pela inspiração através de seus exemplos e valores.
A professora Francielli Weber dos Santos Cibin por todo o apoio, dedicação e atenção.
Aos meus colegas do laboratório Biotech e do laboratório de DIC, por me ensinarem
que vamos mais longe quando vamos juntos.
As minhas amigas e cúmplices Ana Paula Maurique e Eduarda Gabrielly, que sempre
estiveram presentes, e que me apoiaram em todos os momentos.
As minhas amigas Andressa Silva Lachno, Bruna Dias Espindola e Ingryd
Merchioratto pelo companheirismo, acolhimento e aventuras.
A todos os outros amigos e colegas que fizeram parte dessa jornada.
A minha tia Jô, que considero uma segunda mãe, por todos os cuidados dispensados
durante a minha vida.
Ao meu irmão Odir, por sua amizade, apoio e compreensão em todos os momentos,
sua colaboração foi essencial para a conclusão dessa etapa tão importante na minha vida.
A Francine, minha irmã de coração, por nunca deixar de acreditar na minha
capacidade e sempre me presentear com palavras reconfortantes nos momentos mais difíceis.
A minha mãe, Odete, por todo o apoio e amor incondicional, por não me deixar
desistir na primeira nem na milésima adversidade. Sem sua amizade e carinho eu não teria
conseguido chegar até aqui. A você minha eterna gratidão.

 
  
 

O analfabeto do século XXI não será aquele que

não consegue ler e escrever, mas aquele que não
consegue aprender, desaprender, e reaprender.

Alvin Toffler

 
  
 

ESTÁGIO CURRICULAR SUPERVISIONADO EM MEDICINA

VETERINÁRIA – ÁREA DE SANIDADE DE AVES E SUINOS

O estágio curricular supervisionado em medicina veterinária foi realizado na área de sanidade

de aves e suínos no Laboratório de Saúde Animal da JBS Foods, localizado na cidade de
Seara/SC, acreditado pela norma ABNT NBR ISO/IEC 17025:2005, no período de 17/08/15 a
02/12/15, totalizando 450 horas. O objetivo principal do estágio foi o diagnóstico de doenças
de suínos através de ensaios microbiológicos e moleculares, a monitoria de enfermidades de
interesse veterinário e de saúde pública através de ensaios sorológicos e moleculares, bem
como a pesquisa pré-abate de Salmonella em aves. O estágio foi realizado sob a supervisão da
Médica Veterinária Anne Caroline Lara, Gerente dos Laboratórios de Saúde Animal da JBS
Foods e orientação da Profa. Débora Payão Pellegrini do curso de Medicina Veterinária da
UNIPAMPA.

 
  
 

LISTA DE ILUSTRAÇÕES

Figura 1: Salmonella Enteritidis no ágar MSRV (motilidade positiva). Fonte:

Regnum Prokaryotae, 2015............................................................................. 34
Figura 2: Salmonella Gallinarum no ágar MSRV (motilidade negativo). Fonte:
Regnum Prokaryotae, 2015............................................................................. 34
Figura 3: Cultura de Salmonella Enteritidis em ágar Hektoen. Fonte: Biomedicina
Padrão, 2011.................................................................................................... 35
Figura 4: Cultura de Salmonella sp. em ágar BPLS. Fonte: Global Salm-Surv,
2003................................................................................................................. 35
Figura 5: Imagem demonstrativa do meio IAL. Fonte: Biomedicina Brasil,
2011................................................................................................................. 37
Figura 6: Lista de sorotipos identificados através de sorotipificação molecular rápida.
Fonte: Check&Trace, 2015............................................................................. 38
Figura 7: Diferença entre escores corporais em animais do mesmo lote, sugestivo de
SRM – Fonte: a autora..................................................................................... 44

 
  
 

LISTA DE TABELAS

Tabela 1: Carga horária dedicada a cada uma das atividades desenvolvidas durante o
estágio.............................................................................................................. 17
Tabela 2: Sorovares de Salmonella isolados pelo laboratório de ornitopatologia da
FMVZ – Unesp – Botucatu............................................................................. 51

 
  
 

LISTA DE QUADROS

Quadro 1: Agentes infecciosos identificados através do diagnóstico bacteriológico

em suínos....................................................................................................... 24
Quadro 2: Monitorias sorológicas através de SAR realizadas pelo laboratório em
aves................................................................................................................ 29
Quadro 3: Monitorias sorológicas através de ELISA realizadas pelo laboratório em
aves................................................................................................................ 30
Quadro 4: Utilização de PCR em tempo real para a detecção de agentes infecciosos
em suínos....................................................................................................... 32
Quadro 5: Utilização de PCR em tempo real para a detecção de agentes infecciosos
em aves.......................................................................................................... 32
Quadro 6: Caracterização antigênica de Salmonella sp................................................. 38
Quadro 7: Ação dos probióticos sobre Salmonella sp.................................................... 53

 
  
 

LISTA DE ABREVIATURAS

ABNT Associação Brasileira de Normas Técnicas

ABPA Associação Brasileira de Proteína Animal
ANVISA Agência Nacional de Vigilância Sanitária
APPCC Análise de perigos e pontos críticos de controle
APT Água peptonada tamponada
BHI Brain heart infusion
BPLS Ágar verde brilhante de fenol lactose sacarose
BPP Boas Práticas de Produção
CAMP Christie, Atkins e Munch-Petersen
CEDISA Centro de Diagnóstico de Sanidade Animal
CLSI Clinical and Laboratory Standarts Institute
CO2 Gás carbônico ou dióxido de carbono
DIC Doenças infectocontagiosas
DNA Ácido desoxirribonucleico
EC European Community
ELISA Ensaio imunoenzimático de absorção em fase sólida
EUA Estados Unidos
FAO Food and Agriculture Organization
FDA Food and Drug Administration
FMVZ Faculdadade de medicina veterinária e zootecnia
HIS Hibridização in situ
IAL Instituto Adolfo Lutz
IgG Imunoglobulina G
IgM Imunoglobulina M
IHQ Imuno-histoquímica
INMETRO Instituto Nacional de Metrologia, Qualidade e Tecnologia
ISO International Organization for Standardization
JBS José Batista Sobrinho
LIA Ágar lisina-ferro
MAPA Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento

 
  
 

MSRV Modified semisolid rappaport vassiliadis

NAD Nicotine adenine dinucleotide
NH3 Amônia
OMS Organização Mundial da Saúde
ONU Organização das Nações Unidas
PCA Ágar padrão para contagem
PCR Reação em cadeia de polimerase
PCV2 Circovírus suíno tipo 2
PCVD Doenças associadas ao circovírus suíno
pH Potencial hidrogeniônico
PNSA Programa Nacional de Sanidade Avícola
ppm Partes por milhão
PPV Parvovírus suíno
PR Paraná
RNA Ácido ribonucléico
RS Rio Grande do Sul
SA Sociedade Anônima
SAR Soroaglutinação rápida
SC Santa Catarina
SEM Síndrome de refugagem multissistêmica
SIM Motilidade indol sulfeto
SMD Síndrome multissistêmica do definhamento
sp. Espécie
spp. Espécies
TNT Tecido não tecido
TSI Triple sugar iron
UFC Unidades formadoras de colônias
UFRGS Universidade Federal do Rio Grande de Sul
UFT Universidade Federal do Tocantins
UPL Unidade produtora de leitões
VP Voges-Proskauer
WTF Wean to finish

 
  
 

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO............................................................................................... 14
2 ATIVIDADES DESENVOLVIDAS............................................................... 16
2.1 Histórico da empresa....................................................................................... 16
2.2 Organização do laboratório de saúde animal................................................... 16
2.3 Recepção de amostras...................................................................................... 18
2.4 Descontaminação, descarte, lavagem, preparo e esterilização........................ 18
2.4.1 Preparo de materiais...................................................................................... 19
2.4.2 Procedimentos para assegurar a qualidade do preparo dos materiais.............. 20
2.5 Preparo de meios de cultura........................................................................... 21
2.6 Diagnóstico bacteriológico.............................................................................. 22
2.6.1 Exame microscópico....................................................................................... 22
2.6.2 Isolamento....................................................................................................... 22
2.6.3 Identificação bioquímica presuntiva................................................................ 23
2.6.4 Agentes infecciosos identificados através do diagnóstico bacteriológico....... 23
2.6.4.1 Actinobacillus pleuropneumoniae................................................................... 24
2.6.4.2 Bordetella bronchiseptica............................................................................... 24
2.6.4.3 Clostridium perfringens................................................................................... 25
2.6.4.4 Escherichia coli............................................................................................... 25
2.6.4.5 Haemophilus parasuis..................................................................................... 26
2.6.4.6 Pasteurella multocida...................................................................................... 26
2.6.4.7 Streptococcus suis........................................................................................... 26
2.6.5 Antibiograma................................................................................................... 27
2.7 Ensaios sorológicos......................................................................................... 28
2.7.1 Coleta de amostras........................................................................................... 28
2.7.2 Soroaglutinação Rápida (SAR)....................................................................... 29
2.7.3 Ensaio Imunoenzimático de Absorção em Fase Sólida (ELISA) ................... 30
2.8 Reação em Cadeia da Polimerase (PCR)......................................................... 31
2.9 Pesquisa de Salmonella................................................................................... 32
2.9.1 Pré-enriquecimento.......................................................................................... 33
2.9.2 Enriquecimento seletivo.................................................................................. 33

 
  
 

2.9.3 PCR em tempo real.......................................................................................... 34

2.9.4 Isolamento em meios seletivos indicadores.................................................... 35
2.9.5 Identificação bioquímica presuntiva................................................................ 36
2.9.6 Caracterização antigênica................................................................................ 37
2.9.7 Pesquisa de Salmonella em aves matrizes....................................................... 39
2.9.8 Pesquisa de Salmonella em aves de corte........................................................ 39
2.9.9 Pesquisa de Salmonella em incubatórios......................................................... 40
2.10 Pesquisa de Salmonella em suínos.................................................................. 40
2.11 Atividades paralelas à rotina do laboratório.................................................... 40
3 DISCUSSÃO................................................................................................... 42
3.1 Doenças Associadas ao Circovirus suíno (PCVD).......................................... 42
3.2 Importância do controle de Salmonella na cadeia produtiva de aves.............. 47
4 CONCLUSÕES............................................................................................... 55
REFERÊNCIAS................................................................................................................ 56
ANEXOS........................................................................................................................... 63

 
 14  
 

1 INTRODUÇÃO

De acordo com o Relatório anual da Associação Brasileira de Proteína Animal

(ABPA, 2015) o Brasil é o 3o maior produtor mundial de carne de frango (12,691 milhões de
toneladas), sendo que a Região Sul (PR, SC e RS) é responsável por 75,01% de todas as
exportações realizadas pelo país nesse período. Com relação a carne suína, o Brasil é o 4o
maior produtor mundial (3,344 milhões de toneladas), sendo que a Região Sul é responsável
por 76,59% de todas as exportações realizadas nesse período.
Em conjunto, as cadeias suinícola e avícola somam 4,155 milhões de empregos diretos
e indiretos. Em 2013, as exportações de aves e suínos totalizaram cerca de US$ 10 bilhões, o
equivalente a 10% das exportações do agronegócio brasileiro e 4,1% das exportações totais do
Brasil (ABPA, 2015).
Em novembro de 2015, 22 frigoríficos brasileiros foram habilitados para exportar
carne para a China e o México. Destes, seis são frigoríficos localizados no estado de SC, dois
exportarão carne de frango para a China e quatro exportarão carne suína para o México
(AGROLINK, 2015).
A interação positiva e a tecnificação em todas as áreas envolvidas no setor produtivo
são as responsáveis por esse volume de negócios tão expressivo. Tanto a indústria avícola
quanto suinícola, investe cada vez mais em melhoramento genético, manejo e nutrição afim
de melhorar seus índices de produtividade (CARDOSO; TESSARI, 2015). No entanto, esse
rápido desenvolvimento impôs condições extremas a saúde animal, onde geralmente,
associam-se criações com alta densidade animal em uma área geográfica bastante restrita
(SESTI, 2005). Essa característica propicia a ocorrência de surtos pela maior facilidade na
disseminação dos agentes patogênicos e é cada vez mais comum a associação com micro-
organismos responsáveis por outras doenças, dificultando o diagnóstico, devido a
apresentação clínica extremamente variável (BARCELLOS, et al. 2008).
Dentro desse contexto, para garantir que os índices de produção sejam mantidos e
novas barreiras sanitárias sejam quebradas, faz-se necessário a implantação de medidas de
controle sanitário específicas para cada uma das fases de criação, organizadas em um
programa de biosseguridade (BARCELLOS, et al. 2008).

 
 15  
 

Programas de biosseguridade caracterizam-se por um conjunto de normas e

procedimentos que visam assegurar a saúde dos planteis em que são empregados, através da
proteção contra a entrada de qualquer micro-organismo patogênico (ANDREATTI, 2006).
Para que um programa de biosseguridade seja eficiente é necessária à compreensão e a
participação de todas as pessoas envolvidas. Controle de tráfego, isolamento dos núcleos,
desinfecção, higienização, quarentena, vazio sanitário, vacinação, educação continuada, são
algumas das etapas a serem implantadas dentro de um programa de biosseguridade
(ANDREATTI, 2006).
O monitoramento periódico, bem como o diagnóstico definitivo rápido, direcionado a
produção de animais saudáveis, capazes de gerar produtos seguros para o consumo, têm sido
cada vez mais exigidos.
Diante disso, conhecer as particularidades de cada fase de criação para assim associar
com as principais enfermidades endêmicas e exóticas que podem estar relacionadas ao quadro
clínico, a obtenção e o envio correto das amostras, a escolha e a execução dos testes
laboratoriais, o envio dos resultados e a interpretação dos mesmos, é de fundamental
importância para o médico veterinário que atua nessa área.
O objetivo do estágio foi conhecer a gestão necessária para garantir a saúde animal em
uma grande empresa, que fornece alimentos de origem animal, para diversos tipos de
mercados consumidores e que segue rigorosamente, uma diversidade de especificações
técnicas que garantem que o produto final tenha sua inocuidade garantida, com foco principal
nas monitorias periódicas e no diagnóstico das principais enfermidades de impacto econômico
e de saúde pública na produção de aves e suínos, relacionando o aprendizado teórico ao
aprendizado prático, fundamental para a capacitação profissional na área escolhida.
Este relatório descreve as atividades acompanhadas e desenvolvidas durante o período
de estágio curricular supervisionado obrigatório do curso de medicina veterinária na área de
sanidade de aves e suínos, no Laboratório de Saúde Animal da JBS Foods, com o objetivo de
cumprir o requisito parcial para obtenção de título em Bacharel em Medicina Veterinária.

 
 16  
 

2 ATIVIDADES DESENVOLVIDAS

2.1 Histórico da Empresa

A Seara Alimentos S.A. foi fundada em 1956, na cidade que leva seu nome, em SC.
No início da década de 80, a Ceval Alimentos S.A. adquiriu a empresa conservando sua
marca e aumentando os investimentos. Em 1982, foi a primeira empresa brasileira a exportar
cortes de frango para a Europa. Em 1996 obteve a certificação ISO 9002 para toda a cadeia
produtiva de frango. No ano de 1997, a Bunge Internacional assumiu o controle da Ceval e
deu início a uma nova organização. No ano seguinte, a empresa Seara S.A. tornou-se
independente e focada no mercado de aves, suínos e carnes processadas. Em 1999 abriu
escritórios comerciais em vários países, afim de estimular os negócios internacionais, e como
consequência, no ano de 2003 já exportava para 27 países. Em 2005, passou a ser controlada
pelo grupo Cargil e em 2013 pelo grupo JBS, líder mundial em processamento de carne
bovina, ovina e de aves (SEARA, 2015).

2.2 Organização do Laboratório de Saúde Animal

O Laboratório de Saúde Animal realiza suas análises na planta do frigorífico de Seara,

SC. As atividades realizadas contemplam tanto a cadeia suinícola quanto avícola.
As monitorias internas e acreditadas pelo INMETRO de pesquisa de Salmonella em
aves constituem a principal atividade do laboratório. Além disso, efetua monitorias através de
ensaios sorológicos e moleculares para o controle de enfermidades de importância econômica
e de saúde pública e recentemente, começou a atuar na área de diagnóstico bacteriológico em
suínos.
O laboratório é composto por uma equipe multiprofissional. Um auxiliar de
laboratório é responsável pela limpeza, um realiza a lavagem, esterilização, preparo e envio
de materiais para coleta de amostras, um é responsável pela preparação dos meios, reagentes e
soluções, um recepciona, avalia e registra as amostras, três biólogos e um engenheiro de

 
 17  
 

alimentos realizam a pesquisa microbiológica, um zootecnista e um auxiliar de laboratório

realizam os ensaios sorológicos, um biólogo efetua os ensaios moleculares, um médico
veterinário realiza o diagnóstico microbiológico específico em suínos, um farmacêutico efetua
a análise de resíduos por cromatografia líquida (em fase de implantação), dois
administradores organizam a emissão dos documentos e relatórios, dois médicos veterinários
supervisionam e coordenam a equipe.
São efetuados treinamentos internos com o objetivo de capacitar os empregados a
atuar em funções diferentes daquelas em que são os responsáveis, para que dessa maneira,
sempre que necessário, um setor colabore com o outro, tornando a rotina do laboratório muito
dinâmica. A frequência dos treinamentos varia de acordo com a modificação ou emissão dos
documentos técnicos que regem as atividades desenvolvidas e sempre que um novo membro é
integrado a equipe do trabalho.
Devido às normas da empresa, o estagiário assinou um termo de sigilo e
confidencialidade. O uso de mídias eletrônicas (registro de imagens), bem como a divulgação
de informações relevantes e documentos internos sem prévia autorização, é proibido para
qualquer visitante.
Para melhor compreensão do tempo dedicado a cada atividade, abaixo foi organizado
na tabela 1 a quantidade de tempo aproximado, dedicado a cada uma das atividades durante o
estágio.

TABELA 1- Carga horária dedicada a cada uma das atividades desenvolvidas durante o
estágio
Atividades Carga horária (horas) Porcentagem (%)
Recepção e triagem das amostras 20 4,44
Lavagem, esterilização e preparo de materiais 20 4,44
Preparo de meios, soluções e reagentes 20 4,44
Ensaios sorológicos 20 4,44
Ensaios moleculares 40 8,9
Diagnóstico microbiológico 180 40
Pesquisa de Salmonella 90 20
Atividades paralelas a rotina do laboratório 60 13,34
Total de horas 450 100

 
 18  
 

2.3 Recepção de amostras

O objetivo da recepção de amostras é fazer a triagem de todas as amostras que chegam

ao laboratório verificando se estão em condições de serem encaminhadas para análise. As
amostras são registradas no livro ata de registros de amostras. As amostras devem chegar em
embalagem íntegra e identificada. A inspeção é efetuada tanto nas embalagens quanto nas
amostras para detectar possíveis danos que possam causar contaminação cruzada.
Quando a amostra é rejeitada por problemas de acondicionamento, é também
registrada no livro de protocolo de amostras e em planilha própria, descrevendo o ocorrido e
as ações tomadas.
As amostras são registradas no livro ata de registros e recebem uma identificação. Em
cada registro é preenchido o número do protocolo, a data do recebimento, a procedência, o
tipo de material, o número de amostras, o responsável pelo registro, o exame solicitado e se
necessário, outros dados.
Para o envio de material para laboratórios externos todas as amostras são protocoladas
e registradas em uma planilha de solicitação de análise laboratorial ou planilha específica do
laboratório externo.
As amostras recebidas e registradas são conservadas em geladeira entre 2 e 8 oC até o
momento da análise ou envio a laboratórios externos, excetuando-se, as amostras fixadas em
formol.

2.4 Descontaminação, descarte de materiais biológicos, lavagem, preparo, esterilização e

verificação de materiais

O fornecimento de resultados de análises confiáveis depende da lavagem e preparo das

vidrarias e demais materiais, seguidos de esterilização. Por esse motivo, os procedimentos
realizados no laboratório de saúde animal são rigorosamente seguidos e estão de acordo com
as normas ISO 7218/2007 (Exigências gerais e orientações para análises microbiológicas).
A descontaminação dos materiais utilizados nas análises é efetuada através da
esterilização em autoclave a 121±3 oC (aproximadamente 1,1 kgf/cm2) por 30 minutos. Todos
os resíduos decorrentes da descontaminação são descartados em sacos plásticos resistentes e

 
 19  
 

colocados em lixo apropriado. Em hipótese alguma é descartado material contaminado, sem

prévia descontaminação.

2.4.1 Preparo de materiais

O preparo do material de laboratório para utilização em análises microbiológicas

envolve todas as atividades necessárias para garantir que os utensílios, vidrarias, frascos e
instrumentos utilizados durante as análises se encontrem limpos, estéreis e livres de resíduos.
O preparo de materiais para a realização de análises varia de acordo com cada tipo de
material.
Os suabes de arrasto podem ser obtidos a partir da esterilização em um recipiente de
toucas de tecido não tecido (TNT) que são distribuídas com o auxílio de uma pinça em pares
em sacos estéreis e posteriormente são embebidas com água peptonada tamponada (APT), ou,
pode optar-se por embeber o par de toucas de TNT em APT 1% e distribuir em embalagem
plástica para alimento, remover o ar, fechar as embalagens e esterilizar em autoclave.
As gazes úmidas (chiffonettes) podem ser confeccionadas com panos ou esponjas.
Estas são esterilizadas em autoclave e após são transferidas individualmente para uma
embalagem estéril e embebidas em solução de APT 1%. Se na superfície for utilizado
desinfetante, a solução utilizada é a de rinsagem inativadora ou neutralizante (letheen broth
base).
As gazes com barbante são esterilizadas juntas em um recipiente e após são
distribuídas em embalagens plásticas estéreis, aos pares, com o auxílio de uma pinça. A
seguir, são embebidas com APT 1%.
Após o preparo dos suabes de arrasto, chiffonettes, e gazes com barbantes, estes são
mantidos em refrigeração em temperatura entre 2 e 8 oC com validade de 3 meses. Além
disso, são submetidos a uma avaliação de esterilidade, onde separa-se pelo menos um
exemplar de cada tipo após a confecção, acrescenta 50 mL de APT, homogeneíza, incuba a 36
o
C por 18 a 24 horas e observa se há ou não turvação. Se houver turvação, é repicado em ágar
sangue, ágar nutriente ou ágar padrão para contagem (PCA) e para identificação das bactérias.
Como padrão para utilização, não deve ocorrer crescimento nos meios, nem turvação. Caso
houver crescimento, o lote é descartado.

 
 20  
 

Os microtubos são acondicionados em um recipiente grande, em seguida adiciona-se

20 mL de silicone dentro desse recipiente para cada 1000 microtubos, com o auxílio de uma
tampa, os microtubos são agitados e o silicone é espalhado por todos eles igualmente. Após
isso, para secagem, os tubos são colocados em estufa a aproximadamente 42 oC por 8 horas.
Os frascos para coleta de água são adquiridos prontos, com a pastilha de tiossulfato de
sódio, indicadas para análises microbiológicas. Para as análises de cloro, essas pastilhas
devem ser removidas sem perder a esterilidade dos tubos.
Para realizar a rastreabilidade dos materiais, são preenchidas planilhas que indicam o
responsável pelo procedimento, o dia da esterilização, a validade e o número do lote. Essas
informações também são colocadas em todos os materiais, por meio de carimbos e tarjas. A
validade da esterilização é de 90 dias.

2.4.2 Procedimentos para assegurar a qualidade do preparo dos materiais

São realizadas algumas verificações durante os procedimentos descritos anteriormente

afim de assegurar a qualidade de todo o processo de preparação de materiais, que consistem
em mensuração do pH após processo de lavagem de vidrarias, adição de ampolas que indicam
se o material esterilizado foi submetido a temperatura requerida e a utilização de fitas de
autoclave.
A mensuração do pH é efetuada através da adição de algumas gotas de solução de azul
de bromotimol 0,04%, em alguns frascos submetidos ao processo de lavagem e enxague,
observando a cor formada. Em pH neutro a solução mantêm-se verde, indicando que a
lavagem e enxagues foram eficientes. Em condições ácidas (pH 6,5 ou menor) a cor torna-se
amarela e em condições alcalinas (pH 7,3 ou maior) azul. Essa verificação é efetuada uma vez
por semana e sempre que mudar o lote do detergente.
O teste biológico utilizado é o Sterikon®, que consiste em ampolas com esporos de
Bacillus stearothermophilus (não patogênico). Esses esporos somente são destruídos se
submetidos a uma temperatura de 121 oC ± 3 oC (1,1 kgf/cm2). Essas ampolas são colocadas
em todas as autoclaves, junto ao material que será esterilizado ou descontaminado. Após o
tratamento em autoclave, elas são então incubadas em banho-maria a 60 ± 2 oC por ± 48 horas
(é incubada em paralelo uma ampola controle que não sofreu autoclavação). Se a
descontaminação ou esterilização foi eficiente o conteúdo da ampola permanecerá inalterado

 
 21  
 

(cor violeta), indicando que o Bacillus stearothermophilus não resistiu a autoclavação. Se a

descontaminação ou esterilização foi ineficiente o conteúdo da ampola estará alterado (cor
amarela ou laranja) indicando que o Bacillus stearothermophilus resistiu a autoclavação.
Além disso, é efetuado um controle através de fitas de autoclave (3M 1222®), que são
tiras de papel impregnadas com tinta termocrômica que muda de coloração quando exposta as
condições mínimas necessárias ao processo de esterilização a vapor. Essas fitas permitem
identificar e lacrar o material que será autoclavado. O aparecimento da cor no dorso da fita
indica que o material passou pelo processo de autoclavação.

2.5 Preparo de meios de cultura

 

Os meios de cultura e reagentes para análises requerem uma avaliação para verificar
se atendem aos requerimentos mínimos necessários que assegurem sua qualidade. Por isso,
avaliações antes do uso são necessárias para verificar se estes produtos estão adequados com a
finalidade do seu uso.
O desempenho e a transparência de um meio de cultura pronto são, na maioria das
vezes, determinado pelo processo e cuidados empregados na dissolução do meio de cultura
desidratado.
Os meios de cultura passam pelos testes de produtividade, seletividade, especificidade,
condição da embalagem, esterilidade, controle positivo e negativo, qualidade física e visual,
contaminação microbiana, entre outras avaliações requeridas individualmente.
De maneira geral, a preparação de meios consiste na pesagem e reidratação do meio
com água purificada (conforme orientações do fabricante), dissolução por agitação contínua,
medição e ajuste de pH, distribuição em recipientes apropriados (geralmente balões
volumétricos ou erlenmeyers) e esterilização em autoclave (15 minutos a 121±3 oC).
Após a esterilização uma nova avaliação é efetuada, verificando pH, cor, esterilidade e
consistência física. Em seguida aguarda-se o resfriamento até atingir uma temperatura entre
45 a 50 oC para verter os meios em placas de petri estéreis em capelas de fluxo laminar. Após
o ágar solidificar, se for o caso, armazena-se em câmara fria entre 3 e 5 oC. Alguns tipos de
meios, possuem características diferentes tanto de preparo, quanto de armazenamento.
Todos os lotes de meios preparados são submetidos ao teste de esterilidade, que
consiste na incubação de pelo menos uma placa ou tubo em estufa a 37 oC por 24 a 48h.

 
 22  
 

2.6 Diagnóstico bacteriológico

O diagnóstico bacteriológico inicia com o recebimento das amostras, que são

coletadas pelos médicos veterinários ou técnicos agrícolas da empresa nas granjas dos
produtores integrados. A coleta deve ser feita de maneira asséptica, imediatamente após a
morte, ou o mais rápido possível. O processamento de cada material varia de acordo com o
diagnóstico presuntivo, elaborado com base na associação entre os sinais clínicos, histórico da
propriedade e dados epidemiológicos.
Os protocolos para isolamento e identificação bioquímica presuntiva são baseados em
documentos internos da empresa que foram elaborados de acordo com o Manual de detecção
e identificação de bactérias de importância médica (ANVISA, 2004) e Microbiologia
veterinária e doenças infecciosas (QUINN, et al. 2005).
De maneira geral, os materiais que são utilizados como pinças, tesouras, espátulas são
mergulhados em álcool 92% e flambados a cada coleta. O acondicionamento das amostras é
efetuado em embalagens estéreis sob refrigeração, de acordo com a característica do micro-
organismo alvo e conforme o exame a ser realizado.

2.6.1 Exame microscópico

O exame microscópico é um teste rápido que pode auxiliar no diagnóstico presuntivo

de determinadas doenças. A coloração usada no laboratório é a de Gram, mas também são
bastante comuns, as colorações de Giemsa e Azul de Metileno.

2.6.2 Isolamento

O isolamento é a transferência do micro-organismo do meio natural para um meio

artificial e a propagação deste para a obtenção de uma cultura pura (QUINN, et al. 2005).
Quando os suínos ou as aves apresentam lesões primárias, é realizado o isolamento
diretamente em placas com meios de cultura, em razão de grandes quantidades de bactérias.

 
 23  
 

Sangue, órgãos, exsudatos, entre outros, são repicados diretamente no meio de cultura a partir
de suabes (CRITTER, et al. 2006).
Para realizar o isolamento de bactérias aeróbias são utilizados com maior frequência
no laboratório, o ágar sangue e o ágar macconkey. O ágar sangue é o meio padrão para micro-
organismos aeróbios, enquanto o ágar macconkey determina a presença de micro-organismos
entéricos (HIRSH; ZEE; CASTRO, 2012). Após, as placas são incubadas por 18 a 48 horas,
entre 35 e 37 oC, em aerobiose.
Algumas bactérias possuem particularidades e necessitam meios de cultura seletivos
ou enriquecidos e condições de incubação diferenciais, com tempo e temperatura adequados.
Existem ainda, micro-organismos que necessitam da adição de suplementos no meio de
cultura, como por exemplo, o fator V (nicotine adenine dinucleotide – NAD), fornecido pelo
Staphylococcus aureus, estriado perpendicularmente ao inóculo, por exemplo.

2.6.3 Identificação bioquímica presuntiva

Algumas bactérias podem ser identificadas presuntivamente através de suas

características de crescimento e aparência. Por esse motivo, as colônias que crescem nos
meios de cultura são avaliadas quanto ao formato, coloração, produção de hemólise, número
de colônias e características de crescimento. As características de coloração, realizadas pelo
método de Gram, e as formas dos micro-organismos são revelados por microscopia. No
entanto, o diagnóstico definitivo depende da avaliação das características bioquímicas e
sorológicas para a grande maioria das cepas ou micro-organismos.
Os testes bioquímicos são realizados através da inoculação de colônias isoladas em
meios bioquímicos diferentes. Com base em suas características é possível determinar qual o
micro-organismo envolvido.

2.6.4 Agentes infecciosos identificados através do diagnóstico bacteriológico

No quadro 1 é possível verificar os micro-organismos isolados durante o

acompanhamento das atividades no setor de diagnóstico bacteriológico.

 
 24  
 

A publicação de dados referentes a quantidade e a frequência desses isolamentos não foi

autorizada.

QUADRO 1 - Agentes infecciosos identificados através do diagnóstico bacteriológico em

suínos
Agente infeccioso Consequências da infecção
Actinobacillus pleuropneumoniae Pleuropneumonia suína
Bordetella bronchiseptica Bordetelose pulmonar; Rinite atrófica
Clostridium perfringens Tipo A: enterocolite necrosante. Tipo C: enterite hemorrágica
Escherichia coli Colibacilose neonatal; Diarreia pós-demame; Doença do Edema
Haemophilus parasuis Doença de Glässer
Pasteurella multocida Pneumonia; Rinite atrófica
Streptococcus suis Meningite; septicemia; artrite

2.6.4.1 Actinobacillus pleuropneumoniae

São bacilos ou cocobacilos Gram-negativos, imóveis e anaeróbios facultativos, que

não formam esporos. Promovem hemólise em ágar sangue, não crescem em ágar macconkey.
O isolamento inicial de Actinobacillus pleuropneumoniae é efetuado em ágar sangue a 37 oC,
em jarra de anaerobiose por 48 a 72 horas. As colônias formadas são pequenas (1 mm),
brancas, lisas, rodeadas por zona clara de hemólise. O teste de Christie, Atkins e Munch-
Petersen (CAMP) com Staphylococcus aureus é positivo. Bioquimicamente é urease positivo,
catalase e oxidase variável, capaz de fermentar glicose, manitol, xilose e sacarose. Em função
dos seus requerimentos de NAD se classifica em dois biotipos, o biotipo 1 agrupa as cepas
dependentes do fator V (NAD) e o biotipo 2 agrupa as cepas NAD-independentes.

2.6.4.2 Bordetella bronchiseptica

São bacilos ou cocobacilos Gram-negativos pequenos (0,2 a 0,5 x 0,5 a 1,5 µm),
aeróbios, catalase, oxidase e urease positivos, utilizam carbono a partir do citrato, reduz

 
 25  
 

nitrato, são móveis por flagelos peritríquios, não fermentam carboidratos e não necessitam de
requerimento especial para crescimento. O isolamento inicial de Bordetella bronchiseptica é
efetuado em ágar sangue e ágar macconkey a 37 oC por 24 a 48 horas em aerobiose. Em ágar
sangue, as colônias são pequenas, brancas, lisas e hemolíticas. Em ágar macconkey formam
colônias claras, não fermentadoras de lactose.

2.6.4.3 Clostridium perfringens

São bacilos Gram-positivos grandes, imóveis, produzem endósporos, são anaeróbios,

catalase e oxidase negativos. Em ágar sangue, as colônias são rodeadas por zona de dupla
hemólise. Necessitam meios enriquecidos para crescimento. Os requerimentos atmosféricos
apropriados são fornecidos pela cultura em jarras de anaerobiose com geradores de
anaerobiose. A incubação é feita a 42 oC por 18 a 24 horas. As colônias apresentam coloração
negra. Esfregaços diretos da mucosa ou de conteúdo intestinal que apresentam um grande
número de bacilos Gram-positivos podem ser indicativos de enterotoxemia por clostrídios.
Fermentam glicose, lactose, maltose e sacarose.

2.6.4.4 Escherichia coli

São bacilos Gram-negativos, anaeróbios facultativos que não formam esporos,

geralmente móveis, com flagelos peritríquios e fimbrias. O isolamento inicial é efetuado em
ágar sangue e ágar macconkey com incubação a 37 oC por 18 a 48 horas. Em ágar sangue
formam colônias cinza, com hemólise variável. No ágar macconkey, formam colônias rosa,
devido à produção de ácido a partir da lactose. Bioquimicamente são catalase positivos,
oxidase negativos, fermentam glicose, maltose e lactose. Reduzem nitrato a nitrito. Quando
inoculado em ágar triple sugar iron (TSI), que contém 0,1% de glicose, 1% de lactose, 1% de
sacarose e indicadores químicos para a produção de H2S, apresentam coloração amarela na
base e no ápice (pH ácido) sem a produção de H2S.

 
 26  
 

2.6.4.5 Haemophilus parasuis

São bacilos Gram-negativos pequenos e móveis, anaeróbios facultativos, fastidiosos e

que requerem o fator V (NAD) para crescimento. O crescimento ótimo ocorre em ágar sangue
com inoculação de uma estria de Staphylococcus aureus, em jarra de anaerobiose a 37 oC por
24 a 48 horas. As colônias formadas em ágar sangue, são brancas, lisas, pequenas (1 mm),
não hemolíticas, com satelitismo positivo. Bioquimicamente fermentam glicose e sacarose,
são catalase positivos e oxidase negativos.

2.6.4.6 Pasteurella multocida

São Bacilos Gram-negativos, imóveis, anaeróbios facultativos. O isolamento inicial é

efetuado em ágar sangue e ágar macconkey, com incubação a 37oC por 18 a 48 horas. Em
ágar sangue formam colônias não-hemolíticas, cinzas, redondas, mucóides, brilhantes e com
odor característico. Não crescem em ágar macconkey. Bioquimicamente são catalase e
oxidase positivos, produzem indol, fermentam sacarose. A classificação com base nos
antígenos capsulares A e D é efetuada através do teste da acriflavina neutra 1:1000 para a
caracterização das cepas tipo D e o teste da hialuronidase para a identificação das cepas tipo
A.

2.6.4.7 Streptococcus suis

São cocos Gram-positivos, em duplas. O isolamento inicial é efetuado em ágar sangue

e ágar macconkey com incubação a 37 oC por 18 a 48 horas. No ágar sangue formam colônias
pequenas, cinzas, esverdeadas, α-hemolíticas. Não crescem em ágar macconkey.
Bioquimicamente são catalase negativos, produzem amilase e o teste de Voges-Proskauer
(VP) é negativo.

 
 27  
 

2.6.5 Antibiograma

Com o isolamento e identificação bioquímica do micro-organismo, é possível efetuar

o antibiograma, que é o teste de susceptibilidade in vitro do patógeno frente aos
antimicrobianos. O método utilizado pelo laboratório é o teste de difusão em disco de Kirby &
Bauer, conforme padronização técnica The Clinical and Laboratory Standards Institute
(CLSI, 2013).
O procedimento consiste no preparo de uma suspensão bacteriana e inoculação desta
na superfície de uma placa de ágar Mueller Hinton, utilizando um suabe estéril e a adição de
discos de papel impregnados com antimicrobianos em concentrações padronizadas. Após a
incubação em estufa, é analisada a inibição ao redor de cada disco através de medição do
tamanho dos halos e o resultado é pesquisado em tabelas apropriadas.
As amostras devem ser compostas de colônias puras de bactérias gram-positivas ou
gram-negativas, provenientes de cultivo bacteriano recente (18 a 24 horas), isoladas a partir
de meios de cultura não seletivos.
Com alça estéril, seleciona-se entre três e cinco colônias, isoladas, do mesmo tipo
morfológico e as suspende em solução salina estéril (NaCl 0,85%) até a obtenção de uma
turvação compatível com o grau 0,5 da escala de Mac Farland (1 x 106 UFC/mL). Um suabe
estéril é então embebido na suspensão bacteriana, e semeado em toda a extensão da placa,
procurando abranger toda a superfície.
Após aguardar a superfície do ágar secar, os discos são colocados na superfície do
meio inoculado com o auxílio de uma pinça estéril, exercendo uma pressão com a ponta da
pinça para uma boa adesão. Em placas com tamanho de 90 x 15 mm são colocados até cinco
discos, enquanto placas com tamanho de 140 x 15 mm são colocados até 12 discos. Em
seguida a placa é incubada a 37 oC por 18 a 24 horas.
Com o auxílio de uma régua, o diâmetro dos halos inibitórios é medido em cada disco
e então é possível determinar se a bactéria em análise é sensível, intermediária ou resistente
ao antimicrobiano testado.
Como padrão, o laboratório associa o diagnóstico microbiológico a, pelo menos mais
um tipo de diagnóstico antes da emissão do laudo técnico. Em geral, o diagnóstico
microbiológico é associado ao histopatológico, efetuado por um laboratório terceirizado.

 
 28  
 

2.7 Ensaios sorológicos

A sorologia é uma ferramenta de grande importância no monitoramento sanitário tanto

na indústria avícola quanto suinícola, uma vez que possibilita o diagnóstico de doenças e a
monitoração de lotes por meio de provas sorológicas.
Quando ocorre a exposição a antígenos são produzidos anticorpos específicos para o
mesmo. As análises sorológicas detectam essa resposta específica do hospedeiro por
mensuração dos complexos antígeno-anticorpo por meio do soro. As provas sorológicas
podem medir reações com dois tipos de imunoglobulinas, a G (IgG) e a M (IgM), dependendo
de qual etapa da resposta imune estiver ocorrendo no momento da coleta da amostra; a
produção de IgM se dá na primeira etapa da resposta imune e é seguida por elevação nos
níveis de IgG.
Cada procedimento sorológico é mais eficiente na detecção de um tipo de
imunoglobulina e, portanto, esse fato deve ser considerado quando se opta pelo exame em
diferentes fases (início de surtos, após surtos e após vacinações).
Alguns testes sorológicos apresentam o resultado apenas como positivo ou negativo
para exposição de antígeno, enquanto outros resultam em títulos de anticorpos.

2.7.1 Coleta de amostras

A realização de testes sorológicos com resultados confiáveis não depende apenas dos
procedimentos sorológicos, é necessário que as amostras sejam suficientes e se apresentem
em condições adequadas para análise.
O sangue das aves pode ser coletado do coração, por punção cardíaca, das veias
jugular e braquial. O sangue de suínos pode ser coletado das veias jugular, cava cranial,
cefálica, vasos da cauda e da orelha e seio orbital.
Após a coleta, o sangue é colocado em tubos de plástico estéreis tratados com silicone.
Esses tubos permanecem em posição horizontal ou inclinados para que ocorra a coagulação, a
temperatura ambiente até dessorar adequadamente, posteriormente, o sangue é refrigerado (4-
8 oC). A quantidade mínima de soro a ser coletado é de 1 mL.

 
 29  
 

Os métodos sorológicos utilizados na rotina do laboratório são: Soroaglutinação

Rápida (SAR) e Ensaio Imunoenzimático de Absorção em Fase Sólida (ELISA).

2.7.2 Soroaglutinação Rápida (SAR)

O teste de soroaglutinação rápida é utilizado como teste de triagem para Mycoplasma

gallisepticum, Mycoplasma synoviae e Salmonella Pullorum obedecendo às diretrizes do
Programa Nacional de Sanidade Avícola (PNSA).
Nessa prova é misturado o soro ao antígeno, corado para facilitar a visualização, e
observa-se a formação de grumos. A aglutinação demonstra a presença de anticorpos
específicos para o antígeno utilizado.
Esse exame exige testes confirmatórios, pois pode gerar reações falsos-positivas e
falsos-negativas por ser de especificidade variável. Para reduzir a incidência de resultados
duvidosos, são usadas somente amostras frescas ou resfriadas, pois o congelamento aumenta a
chance de reações falsos-positivas e falsos-negativas.
Durante a rotina, se a primeira prova for positiva, procede-se então a diluição do soro
em solução salina 0,85% na proporção de 1:10 (exceto para Salmonella Pullorum) e é
efetuada uma nova prova. Se o resultado for positivo novamente, a amostra é então
encaminhada para a realização de ELISA. No quadro 2 é possível verificar a periodicidade
com que o ensaio de SAR é efetuado.

QUADRO 2 - Monitorias sorológicas através de SAR realizadas pelo laboratório em aves

Aves Agente Periodicidade
Mycoplasma gallisepticum 15, 30, 42, 54 e 65 semanas
Mycoplasma synoviae 15, 30, 42, 54 e 65 semanas
Matrizes
Salmonella Pullorum 8 a 12 semanas, antes de vacinar contra S. Enteritidis
pelo laboratório credenciado ao MAPA
Progênies de terceiros Mycoplasma gallisepticum Todos os lotes recebidos

 
 30  
 

2.7.3 Ensaio Imunoenzimático de Absorção em Fase Sólida (ELISA)

O ELISA é uma prova de imunoensaio enzimático que mensura a reação antígeno-

anticorpo, detectando principalmente as imunoglobulinas IgG e IgM (QUINN, et al. 2005).
Essa técnica é uma das mais usadas atualmente para medir os níveis de anticorpos em
lotes de aves. Apresenta vantagens como especificidade e sensibilidade, sendo possível
detectar níveis mínimos de anticorpos e titular anticorpos contra uma variedade de agentes
patogênicos (UFRGS, 2015).
O ELISA pode ser direto ou indireto. O direto detecta antígenos, enquanto o indireto
detecta anticorpos. No laboratório, é utilizado principalmente o ELISA indireto, onde o soro
diluído é incubado em um orifício impregnado com o antígeno desejado em microplacas de
96 poços. Dessa forma, os anticorpos específicos, formam um complexo antígeno-anticorpo,
que continuam aderidos as placas mesmo após a lavagem. Após a lavagem da placa, um
conjugado de enzima e antiglobulina é adicionado, ligando-se a todos os complexos antígeno-
anticorpo presentes na placa. No passo final do ensaio, o conjugado não aderido é retirado
pela lavagem e um substrato cromogênico é adicionado ao orifício. Esse substrato reage com
a enzima do conjugado ocorrendo o desenvolvimento de uma cor, que varia de acordo com a
quantidade de anticorpos presentes no soro, sendo a cor mais intensa quanto maior a
quantidade de complexos antígeno-anticorpo-conjugado. A densidade da cor é então
mensurada por um fotocolorímetro ou por espectrofotometria. Os resultados são expressos em
título de anticorpos e geralmente como média aritmética ou geométrica (UFT, 2015). No
quadro 3 estão listadas as monitorias sorológicas efetuadas no laboratório através de ELISA.

QUADRO 3 - Monitorias sorológicas através de ELISA realizadas pelo laboratório em aves

Objetivo Agente infeccioso Periodicidade
Vírus Doença de Newcastle 15 e 48 semanas
Pneumovirus aviário 25, 36 e 48 semanas
Vírus da Doença Infecciosa da Bursa de Fabricío 15, 25, 36, 48 e 60 semanas
Imunidade Vacinal
Vírus da Bronquite Infecciosa 15, 25, 36, 48 e 60 semanas
Vírus da Anemia Infecciosa
18 semanas
Vírus da Encefalomielite Aviária
Abate Vírus Doença de Newcastle 12 lotes anualmente

 
 31  
 

2.8 Reação em cadeia da polimerase (PCR)

O PCR é um método de diagnóstico que detecta o material genético de um patógeno, a

partir de uma amostra. Para a realização desse ensaio, é necessário o uso de fragmentos de
nucleotídeos curtos, denominados, primers, que são complementares ao DNA buscado, a
DNA polimerase (enzima Taq) e desoxirribunocleotídeos precursores. Divide-se em 3 etapas,
a extração, a amplificação e a detecção do DNA. No laboratório, são utilizados 3 métodos
para a extração do material genético: tecnologia baseada em sílica, método das colunas e
separação magnética (em fase de implantação). Inicialmente a amostra é submetidas a ciclos
de aquecimento para a separação das fitas de DNA, que permite o anelamento dos primers,
esses têm a função de sinalizar a região do DNA a ser ampliada e a síntese do DNA. Os vírus
RNA, necessitam uma etapa complementar ao PCR convencional, que é o uso da transcriptase
reversa (RT-PCR), que permite a produção de uma cópia de DNA a partir do RNA (WINN, et
al. 2010).
Os produtos do PCR podem ser avaliados pela eletroforese horizontal em gel de
agarose. Na eletroforese, pode-se obter o peso molecular das bandas e comparar com os
controles positivos. A eletroforese horizontal em gel de agarose é utilizada no laboratório para
a detecção de cepas patogênicas de Escherichia coli, isoladas através do diagnóstico
microbiológico, onde é possível verificar a presença de genes fimbriais (K88, K99, 987P, F18
e F41) e toxinas (LT, Stb, StaP, Stx2e).
O PCR em tempo real diferencia-se do convencional por ser capaz de detectar o
material genético ao longo dos ciclos de amplificações através de sistemas fluorescentes
(WINN, et al. 2010). No laboratório é utilizado para o monitoramento e também para a
detecção de vários agentes patogênicos de interesse veterinário e de saúde pública. Nos
quadros 4 e 5 estão listados os agentes infecciosos identificados por PCR em tem real em
suínos e aves, respectivamente.

 
 32  
 

QUADRO 4 - Utilização de PCR em tempo real para a detecção de agentes infecciosos em

suínos
Agente Infecioso Enfermidade Objetivo
Brachyspira hyodysenteriae Disenteria suína Diagnóstico
Lawsonia intracellularis Enteropatia proliferativa suína Diagnóstico
Mycoplasma hyopneumoniae Pneumonia enzoótica Diagnóstico
Haemophilus parasuis Doença de Glässer Diagnóstico
Actinobacillus pleuropneumoniae Pleuropneumonia suína Diagnóstico

QUADRO 5 - Utilização de PCR em tempo real para a detecção de agentes infecciosos em

aves  
Agente infeccioso Enfermidade Objetivo
Mycoplasma gallisepticum Micoplasmose aviária Monitoria
Mycoplasma sinoviae Micoplasmose aviária Monitoria
IBV Bronquite Infecciosa das Galinhas Monitoria
 

2.9 Pesquisa de Salmonella

O isolamento de Salmonella envolve etapas adicionais as técnicas de cultura

convencionais, envolvendo as etapas de pré-enriquecimento, enriquecimento seletivo e
isolamento em meios seletivos – indicadores e ainda a caracterização antigênica.
Os monitoramentos internos seguem uma sequência diferente das monitorias oficiais
realizadas de acordo com a portaria 126/1995 - Normas de Credenciamento e Monitoramento
de Laboratórios de Diagnóstico das Salmoneloses Aviárias (Salmonella Enteritidis,
Salmonella Gallinarum, Salmonella Pullorum e Salmonella Typhimurium).
A pesquisa de Salmonella no laboratório de saúde animal é realizada através de uma
adaptação da metodologia proposta pela Food and Drugs Administration (FDA - 2014).

 
 33  
 

2.9.1 Pré-enriquecimento

O objetivo do pré-enriquecimento é diminuir a injuria nas células de Salmonella

deixando-as em uma condição fisiológica estável, sem inativá-las biologicamente e inicia a
partir da hidratação da amostra em água peptonada tamponada a 1% ou caldo brain heart
infusion (BHI) na proporção de 1:10 (LAZARO et. al., 2008).
Orgãos, gemas e mecônios são hidratados com caldo BHI, enquanto outros materiais
como propés, rações e chiffonetes, são hidratados com água peptonada. Após a hidratação, as
amostras são incubadas a 36±1°C por 18 a 24 horas.

2.9.2 Enriquecimento seletivo

Após diminuir o estresse das células, a segunda etapa visa selecionar as salmonelas,
aumentando sua concentração continuamente e restringindo a proliferação de outras bactérias
através de agentes inibitórios adicionados aos meios de cultura seletivos (LAZARO et. al.,
2008).
Os meios de cultura utilizados são, o caldo rappaport vassiliadis, o caldo tetrationato e
o meio modified semisolid rappaport vassiliadis (MSRV). Ambos possuem constituintes que
estimulam a seletividade da microbiota acompanhante e o crescimento de Salmonella.
O caldo tetrationato inibe a multiplicação de coliformes. Sorovares de Salmonella
(exceto Cholerasuis, Typhisis, Gallinarum e Pullorum) possuem a enzima tetrationato
redutase e, consequentemente são capazes de multiplicar-se no meio (LAZARO et. al., 2008).
O caldo Rappaport Vassiliadis contém cloreto de magnésio e verde de malaquita e
inibe totalmente o crescimento de micro-organismos competitivos (LAZARO et. al., 2008).
O meio MRSV detecta sorotipos de Salmonella dotados de flagelos, que conferem
motilidade ao micro-organismo, resultando num crescimento característico e de fácil
visualização (FRANCHIN, 2008). No enriquecimento seletivo a incubação passa a ser a 42°C
por 18 a 24 horas. Na figura 1 é possível verificar a presença de halo característico de
micro-organismos com motilidade, enquanto na figura 2 é possível verificar que o
crescimento ocorreu apenas na área de inoculação.

 
 34  
 

FIGURA 1 – Salmonella Enteritidis no ágar MSRV (motilidade positiva). Fonte: Regnum Prokaryotae, 2015.
 

FIGURA 2 – Salmonella Gallinarum no ágar MSRV (motilidade negativo). Fonte: Regnum Prokaryotae, 2015.

2.9.3 PCR em tempo real

Em paralelo as etapas de pré-enriquecimento e enriquecimento seletivo, as amostras

de monitoramento interno são submetidas a PCR em tempo real. Amostras de frangos de corte
são submetidas ao ensaio de PCR em tempo real após 18 a 24 horas de pré-enriquecimento,
enquanto as amostras provenientes das granjas de matrizes e incubatórios, após 18 a 24 horas
de enriquecimento seletivo. Amostras positivas passam para análise bacteriológica para
isolamento e identificação do agente.

 
 35  
 

2.9.4 Isolamento em meios seletivos indicadores

Os meios indicadores seletivos permitem a diferenciação de Salmonella devido o

aspecto macroscópico das colônias e suas propriedades de inibição (LAZARO et. al., 2008).
Através da inoculação (a partir do meio de enriquecimento seletivo), busca-se o isolamento e
seleção das colônias de Salmonella, para posterior identificação bioquímica. São utilizados o
ágar verde brilhante de fenol lactose sacarose (BPLS), com alto poder de seletividade e o ágar
entérico hektoen, com médio poder seletivo (LAZARO et. al., 2008).
Após a incubação das placas a 37°C por 18 a 24 horas, procede-se a avaliação
macroscópica das colônias. A avaliação compara as características macroscópicas das
amostras com as de um controle positivo para Salmonella.
Na figura 3, visualiza-se o crescimento característico de uma cultura de Salmonella
Enteritidis em ágar hektoen, enquanto na figura 4, observa-se o crescimento de Salmonella sp.
em ágar BPLS. Todas as placas com características sugestivas de Salmonella são
encaminhadas para identificação bioquímica.

FIGURA 3 – Cultura de Salmonella Enteritidis em ágar Hektoen. Fonte: Biomedicina Padrão, 2011.

FIGURA 4 – Cultura de Salmonella sp. em ágar BPLS. Fonte: Global Salm-Surv, 2003.

 
 36  
 

2.9.5 Identificação Bioquímica Presuntiva

Através da seleção de uma colônia sugestiva de Salmonella, pretende-se chegar a

confirmação das propriedades fisiológicas e metabólicas das culturas suspeitas através de
provas bioquímicas.
O ágar lisina-ferro (LIA) identifica enterobactérias através da reação de
descarboxilação e desaminação da lisina além da produção de H2S. A descarboxilação ocorre
quando a glicose é fermentada e o ácido é neutralizado adquirindo uma coloração amarela. A
desaminação é evidenciada através da coloração vermelha no ápice e a produção de H2S
através da coloração negra na base do tubo (LAZARO et. al., 2008).
O ágar ferro-açúcar triplo (TSI) diferencia bacilos Gram-negativos com base na
fermentação da glicose, sacarose e lactose, produção de gás e sulfeto de hidrogênio (H2S).
Quando ocorrer fermentação da glicose pela bactéria a base torna-se amarelada. Quando
ocorre a fermentação da sacarose e da lactose a parte superior do tubo torna-se amarela. A
coloração negra na base indica a produção de H2S, e a formação de bolhas ou o deslocamento
do ágar, a formação de gás (LAZARO et. al., 2008).
O meio motilidade indol sulfeto (SIM) é um meio semi-sólido usado para a
determinação da produção de indol, H2S e motilidade. O ferro peptonizado e o tiossulfeto de
sódio são os indicadores de produção de H2S (precipitado de coloração negra). Micro-
organismos com motilidade apresentam um crescimento difuso turvando o meio, enquanto
organismos sem motilidade crescem apenas ao longo da linha de inoculação. O indol é
detectado pela adição de reagentes químicos após o período de inoculação (LAZARO et. al.,
2008).
A hidrólise da uréia ocorre através da enzima urease e a mudança de coloração do
meio ocorrer através da produção de amônia em quantidade suficiente para elevar o pH do
meio (LAZARO et. al., 2008).
O meio instituto adolfo lutz (IAL) é composto por nove provas bioquímicas em um
tubo de ensaio: presença de indol, H2S, gás, motilidade, fermentação da glicose e sacarose,
fenilalanina desaminase (FD), hidrólise da uréia, descarboxilação da lisina (LAZARO et. al.,
2008) conforme ilustração na figura 5.

 
 37  
 

FIGURA 5 - Imagem demonstrativa do meio IAL. Fonte: Biomedicina Brasil, 2011.

2.9.6 Caracterização antigênica

A caracterização antigênica é definida pelo esquema de Kauffmann & White e é

efetuada através da reação antígeno-anticorpo com consequente aglutinação do antígeno
frente ao antissoro específico para Salmonella através do teste de SAR (LAZARO et. al.,
2008). A caracterização é feita através das reações com os grupos, os antígenos somáticos e
flagelares.
A cepa isolada é semeada em ágar nutriente inclinado e incubada a 37oC por 18 a 24
horas. Em uma lâmina de vidro é adicionado 10 microlitros (µl) de solução salina e uma
alçada da bactéria, em seguida é adicionado 10 µl de antissoro polivalente, homogeinizando
através de movimentos rotatórios durante dois minutos até a observação de aglutinação
(formação de grumos). No quadro 6, foram listados os sorovares testados por esse método,
bem como os antígenos utilizados.
Quando for verificado que trata-se de uma amostra de Salmonella Rugosa, procede-se
então ao repique em placa de ágar nutriente. Após o crescimento (18 a 24 horas) é selecionada
uma colônia isolada, com aspecto uniforme e o processo para caracterização antigênica é
efetuado novamente. Caso a amostra permaneça rugosa, é repetido o repique mais uma vez.
O número de sorovares identificáveis através desse método é limitado aos sorovares
descritos no quadro 6. Para os sorovares que não podem ser identificados por esse método a

 
 38  
 

empresa conta com um equipamento que possui a capacidade de identificar 102 sorovares de
Salmonella sp. através de sorotificação molecular rápida (figura 6).

QUADRO 6 - Caracterização antigênica de Salmonella sp.

Sorovares Salina Antígeno Somático (O) Grupo Antígenos Flagelares (H)
S. Typhimurium Negativo Positivo B H:i, H;2
S. Heidelberg Negativo Positivo B H:2, H:r
S. Enteritidis Negativo Positivo D H:g, m+H:g, P+H:M+H:p
S. Mbandaka Negativo Positivo C1 S65 + Hz10
S. Senftenberg Negativo Positivo E4 H6 + HS + HT
S. Minessota Negativo Positivo 0:21 H:b + S65
S. Gallinarum Negativo Positivo D NA
S. Pullorum Negativo Positivo D NA
S. Rugosa Positivo NA NA NA

NA: Não se aplica.

FIGURA 6 – Lista de sorotipos identificados através de sorotipificação molecular rápida. Fonte: Check&Trace,
2015

 
 39  
 

2.9.7 Pesquisa de Salmonella em aves matrizes

A pesquisa de Salmonella em aves matrizes é efetuada em todos os recebimentos de

matrizes de um dia através da coleta de 10 machos e 10 fêmeas; após a lavagem e
higienização dos aviários através de suabes de arrasto e superfície em no mínimo 10 pontos;
nas camas aviárias através da coleta de 50 gramas de amostra mensalmente além de todos os
recebimentos de cargas.

2.9.8 Pesquisa de Salmonella em aves de corte

No recebimento de aves de 1 dia (origem terceiros), a pesquisa de Salmonella é

efetuada através da coleta de no mínimo 10 pintos. No pré-alojamento, a pesquisa de
Salmonella é efetuada após a fermentação da cama através de suabes de arrasto e suabes de
superfície de equipamentos (comedouros, bebedouros, ventiladores e telas) ou após lavagem e
desinfecção em todos os aviários antes do alojamento do novo lote. Instalações positivas para
Salmonella não poderão ser alojadas antes de obter resultado negativo.
No pré-abate a pesquisa de Salmonella é efetuada na cama do aviário, por meio de
suabes de arrasto em 100% dos lotes. As coletas são realizadas entre 22 a 35 dias de idade do
lote. Em caso de positividade, o Serviço de Inspeção Federal da Unidade é informado para
programar abate no final do turno. A cama deve ser trocada ou fermentada e deverá ser
efetuado um vazio sanitário de no mínimo 10 dias.
Nos veículos transportadores de frangos, a pesquisa de Salmonella é efetuada por meio
de suabes de superfície ou suabes de arrasto nas gaiolas após lavagem e higienização, no
mínimo, em um veículo quinzenalmente. A coleta é efetuada preferencialmente a partir de
lotes que foram positivos para Salmonella em propés pré-abate. Em casos positivos, o
processo de lavagem e desinfecção é revisado e é efetuada nova limpeza e sanitização. O
desinfetante pode ser substituído e o monitoramento nas gaiolas é intensificado.

 
 40  
 

2.9.9 Pesquisa de Salmonella em Incubatórios

A pesquisa de salmonela no ambiente do incubatório é efetuada através de suabes de

arrasto da superfície de equipamentos, instalações, nascedouros e sala de incubação (pontos
de difícil acesso) mensalmente.
A monitoria consiste em pesquisar Salmonella em materiais de mecônio, ovos bicados,
instalações como sala de sexagem, nascedouros, incubadoras, bandejas e caixas de incubação,
vacinadoras e triturador. Todas as monitorias de equipamentos são realizadas por meio de
suabes de superfície.
A pinteira (veículo de pintos) e a oveira (veículo de ovos) são monitoradas
mensalmente através de chiffonettes ou suabes de arrasto. A periodicidade das monitorias é
mensal, sendo que a cada 3 meses todos os lotes devem ser monitorados enviando amostras de
mecônio e ovos bicados para laboratório externo credenciado pelo MAPA, seguindo o PNSA.

2.10 Pesquisa de Salmonella em suínos

A pesquisa de Salmonella em suínos é efetuada após a lavagem e desinfecção de

granjas e caminhões quinzenalmente, nas baias e equipamentos no intervalo entre lotes
através de suabes de arrasto e de superfície. Em casos de positividade para Salmonella,
efetua-se uma nova higienização e recoleta com intensificação das boas praticas de
biosseguridade.

2.11 Atividades paralelas a rotina do laboratório

Durante o estágio foram efetuadas algumas visitas as granjas de produtores de suínos

integrados a empresa, com o objetivo de conhecer as medidas de biosseguridade já
implantadas, os principais desafios das criações, as enfermidades mais comuns e o seu
tratamento. Junto com os extensionistas da empresa, foi possível conhecer as granjas

 
 41  
 

multiplicadora e recria das avós e matrizes, unidades produtoras de leitões (UPLs), crechários
e terminações.
Além das visitas as granjas, dois dias de estágio foram destinados a conhecer a fábrica
de rações, localizada no município de Xanxerê, Santa Catarina.

 
 42  
 

3 DISCUSSÃO

3.1 Doenças Associadas ao Circovirus suíno (PCVD)

  A PCVD é uma enfermidade infectocontagiosa causada pelo circovirus suíno tipo 2

(PCV2), presente na maioria dos países produtores de suínos, incluindo o Brasil. O PCV2 é o
agente etiológico necessário, mas não suficiente para desencadear PCVD. A natureza ubíqua
do PCV2 faz com que muitos animais estejam infectados em todo mundo, mas apenas uma
parte deles manifeste a doença (SEGALÉS; KEKARAINEN; CORTEY; 2013).
A Síndrome de Refugagem Multissistêmica (SRM) ou do Definhamento (SMD) é a
mais frequente e importante apresentação clínica dessa enfermidade, que desde os surtos
quase simultâneos na Europa e América do Norte na década de 1990, tornou-se uma das mais
importante doenças suínas no mundo, sendo disseminada através da comercialização e
movimentação de animais assintomáticos (FIRTH, et al. 2009).
O PCV2 pertence à família Circoviridae, não é envelopado, apresenta simetria
icosaédrica e mede 15 a 17 nm, um dos menores vírus já descritos. O genoma, DNA circular
de fita simples, também é um dos menores já identificados, cerca de 1.76 kb (MORÉS;
BARCELLOS; ZANELLA; 2007).
O PCV2 pode ser classificado filogeneticamente em 4 genótipos, PCV2a, PCV2b,
PCV2c, PCV2d, sendo o primeiro o mais prevalente antes dos grandes surtos em todo mundo,
enquanto o segundo tornou-se o mais prevalente durante os surtos, até o momento. As
diferenças sequenciais existentes entre o PCV2a e o PCV2b estão diretamente relacionada a
diferenças antigênicas funcionais na neutralização viral in vivo. Essa característica pode afetar
a eficácia de vacinas devido a diferenças na neutralização cruzada entre diferentes estirpes de
PCV2 (KURTZ, et al. 2014).
Leitões entre 5 e 12 semanas de idade são os mais acometidos. A morbidade e a
mortalidade variam de acordo com a granja, o manejo e a fase em que ocorre. A SEM é
considerada um doença multifatorial, onde fatores infecciosos e não-infecciosos podem
exacerbar os sinais clínicos e a gravidade da enfermidade. (MORÉS; BARCELLOS;
ZANELLA, 2007).
Os fatores infecciosos e não-infecciosos estão presentes em maior ou menor grau, na
grande maioria das criações e a concomitância com outras enfermidades agravam ainda mais

 
 43  
 

os sinais clínicos. Já foi constatado a associação do PCV2 com Escherichia coli, Brachyspira
hyodisentereae, Lawsonia intracellularis, Salmonella Typhimurium (ZLOTOWSKY, et. al.
2009), Salmonella sp. (SCHWARZ, et al. 2010) e Torque teno vírus (RITTERBUSCH, et. al
2011).
A transmissão pela via oronasal é a mais frequente, mas o contato com as fezes e a
urina de animais infectados, e a transmissão via fômites também é uma importante forma de
transmissão nas criações onde as medidas de biosseguridade não são rigorosamente seguidas.
A transmissão vertical pode ocorrer mas não é tão importante para a patogênese do PCV2,
devido ao baixo número de fetos infectados. No entanto, em casos de aborto e fetos
mumificados, deve-se considerar o PCV2 bem como a associação do PCV2 ao Parvovirus
suíno (PPV), como diagnóstico diferencial (PESCADOR, et al. 2007).
Além de suínos domésticos, o mesmo perfil filogenético de PCV2 foi isolado em
javalis no Brasil, no entanto, são necessários mais estudos para verificar se esses animais
atuam como reservatórios para suínos domésticos localizados na mesma área geográfica
(CASTRO, et al. 2012).
Os sinais clínicos são bastante variáveis, mas o emagrecimento é o sinal mais típico,
geralmente rápido e progressivo (figura 7). Percebe-se ainda dispneia, linfoadenopatia,
palidez, icterícia, diarreia, apatia, anorexia e finalmente caquexia (SEGALÉS, 2012; MORÉS;
BARCELLOS; ZANELLA, 2007).
Em criações onde o vírus está presente é comum a forma subclínica, onde percebe-se
apenas um aumento variável no número de refugagem. Os animais acometidos não
acompanham o desenvolvimento dos demais, ou seja, diminuem o ganho de peso diário sem
qualquer sinal clínico associado. Nesses animais, não são observadas lesões macroscópicas e
as lesões microscópicas são inexistentes ou caracterizadas apenas por uma leve diminuição
linfocitária com inflamação granulomatosa nos tecidos linfoides (SEGALÉS, 2012).

 
 44  
 

FIGURA 7: Diferença entre escores corporais em animais do mesmo lote, sugestivo de SRM – Fonte: a autora.

As lesões macroscópicas mais comumente associadas ao PCV2 incluem hipertrofia

dos linfonodos, pulmão não colabado com áreas de hepatização vermelha, fígado com áreas
descoloridas e pontos brancacentos nos animais ictéricos, pontos multifocais brancacentos na
superfície e no parênquima renal, lesões cutâneas caracterizadas por manchas avermelhadas e
arredondadas de tamanho variável, polisserosite e colite. Quando presente em UPLs leva a
falhas reprodutivas: abortos, fetos mumificados e natimortos, aumento no número de
nascimentos de leitões fracos e de mortalidade pré-desmame (MORÉS; BARCELLOS;
ZANELLA, 2007).
As lesões microscópicas mais evidentes são as presentes no tecido linfóide, no pulmão
e nos rins. O pulmão encontra-se não colabado devido a proliferação de células septais e
infiltração de linfócitos e histiócitos que levam ao espessamento da parede alveolar. Nos
linfonodos ocorre perda da arquitetura tecidual, depleção linfoide, necrose e infiltração de
histiócitos. Os rins apresentam áreas focais de nefrite e glomerulonefrite (MORÉS;
BARCELLOS; ZANELLA, 2007).
O diagnóstico de PDCV deve ser baseado na associação entre os sinais clínicos, as
lesões macroscópicas e microscópicas e a detecção de altas quantidades do antígeno viral ou
de DNA nas lesões. Entre as técnicas laboratoriais mais utilizadas para o diagnóstico estão, a
hibridização in situ (HIS) e imunohistoquímica (IHQ) (CHAE, 2004).
Testes sorológicos como ELISA não são recomendados para o diagnóstico da doença,
mas são efetuados para o estudo de soroprevalência nas criações (MORÉS; BARCELLOS;
ZANELLA, 2007).

 
 45  
 

O controle da PCDV é bastante complexo, mas as principais medidas adotadas no

campo são baseadas nos “20 pontos de Madec” (MADEC, et al. 2000). Nas maternidades: 1 –
Dar preferência ao sistema "all in, all out" e eliminar todos os dejetos incluindo as canaletas
entre lotes; 2 – Antes do parto, efetuar higienização nas porcas e vermifugar; 3 – Evitar os
reagrupamentos de leitões na maternidade, se possível só efetuar trocas nas primeiras horas
após o parto.
Nos crechários: 4 - Dar preferência para baias ou gaiolas pequenas, com divisórias
resistentes; 5 - Dar preferência ao sistema "all in, all out" e eliminar todos os dejetos
incluindo as canaletas entre lotes; 6 - Ajustar a lotação para níveis iguais ou menores que 0,33
m² por leitão; 7 - Ajustar o espaço dos cochos para valores acima de 7 cm por leitão; 8 -
Manter a qualidade do ar, com níveis de amônia (NH3) abaixo de 10 ppm, dióxido de carbono
(CO2) abaixo de 0,1% e umidade do ar abaixo de 85%; 9 - Controlar a temperatura ambiental;
10 - Evitar misturar leitões de diferentes origens no período de permanência nas creches.
Na fase de terminação: 11 - Dar preferência para baias ou gaiolas pequenas, com
divisórias resistentes; 12 - Dar preferência ao sistema "all in, all out" e eliminar todos os
dejetos incluindo as canaletas entre lotes; 13 - Não misturar leitões de diferentes origens
durante o período de permanência nas recrias; 14 - Não misturar leitões de diferentes origens
durante o período de permanência nas terminações; 15 - Ajustar a lotação para um espaço
acima de 0,75 m² por leitão; 16 - Manter a qualidade do ar e o controle da temperatura
ambiental; 17 - Utilizar um programa de vacinação com base no desafio sanitário da criação;
18 – Controlar o fluxo de ar e de animais nos galpões; 19 – Para os manejos de corte de
dentes, cauda, injeções e outros manter a higiene e boas práticas; 20 – Animais doentes
devem ser tratados em baias hospital, isoladas das demais assim que iniciarem os sinais
clínicos ou ainda serem eutanasiados.
Nas maternidades, o reagrupamento de leitões é uma pratica comum que dificilmente
fica restrita apenas as primeiras 24 horas após o nascimento dos leitões. As leitoas de
reposição apesar de ficarem em baias separadas, com a presença de uma fêmea descarte para
serem imunoestimuladas, não passam por uma quarentena antes de serem agregadas ao
plantel. De acordo com Monroy et al. (2014), porcas nulíparas podem estar infectadas com
PCV2 antes de entrar nas granjas de criação e podem ser infectadas por transmissão
horizontal durante a quarentena e a gravidez. A exposição e infecção viral durante a gestação
pode resultar em infecção subclínica de leitões recém-nascidos.
A idade e o peso ao desmame varia de acordo com o manejo adotado em cada granja,
mas de maneira geral são desmamados animais em grupos desde 21 até 32 dias idade e com

 
 46  
 

um peso que varia de 4 até 12 kg. Leitões mais pesados, acima de 6,7 kg ao desmame
desenvolvem melhor durante a fase de creche (KUMMER, et al. 2009).
Nos crechários, a qualidade do ar, em vários casos não é mantida, principalmente nas
épocas mais frias do ano, quando os gastos para a manutenção da temperatura são mais altos.
Opta-se erroneamente por reduzir o manejo das cortinas, não renovando o ar de maneira
eficaz, para manter a temperatura por mais tempo a um custo mais baixo. Segundo Kummer
et al. (2009), o manejo das cortinas é essencial para manter a temperatura do ar adequada e
permitir a renovação do ar.
Nos crechários e nas terminações a mistura de diferentes lotes é comum também, pois
são recebidos animais de diferentes origens e com grande variabilidade de peso. Para a correta
classificação, e para o arraçoamento adequado, faz-se então uma divisão com base no
tamanho e no peso desses animais. De acordo com Kummer et al. (2009) conforme aumenta o
número de origens, aumenta o risco do desenvolvimento de doenças.
A maior parte dos trabalhadores das granjas compreendem a importância da limpeza,
desinfecção e vazio sanitário, no entanto, muitas vezes não dispõem de tempo hábil entre a
saída e a chegada de um novo lote de animais. Recentemente, Jacques et al. (2015)
demonstrou a persistência de importantes patógenos suínos, entre eles o PCV2 em biofilmes
bacterianos por vários dias.
O uso de vacina inativada contra PCV2 nas leitoas e porcas antes da cobertura, esta
disseminado em praticamente todas as UPLs e protege passivamente os leitões via colostro,
diminuindo os sinais clínicos e lesões provocadas pelo PCV2. Além disso, observa-se uma
diminuição na mortalidade e número de animais refugos, melhora no ganho de peso diário, na
taxa de conversão alimentar. A vacina ainda atua na prevenção de abortos, no aumento na
taxa de fertilidade e na redução de retornos ao estro em matrizes e leitoas (SEGALES, 2015).
Por outro lado, uma nova estirpe do PCV2 foi isolada em criações no sudeste do Brasil
após um surto de SEM em setembro de 2013, onde todos os animais haviam sido vacinados,
indicando, dessa forma uma falha da vacina que até o momento não havia sido descrita no
Brasil (SALGADO, et al. 2014).
A infecção dos rebanhos suínos pelo PCV2 ainda é muito frequente no Brasil, mesmo
nas populações vacinadas, por esse motivo têm sido sugerido que o vírus possa estar passando
por uma evolução filogenética, considerando a sua capacidade de mutação e uma possível
modulação promovida pela vacina (SEGALÉS; KEKARAINEN, 2015).

 
 47  
 

Diante desse contexto, mais estudos sobre o PCV2 são necessários para controlar
PCDV, uma vez que se trata de uma enfermidade multifatorial, que culmina com prejuízos
econômicos importantes na suinocultura.

3.2 Importância do controle de Salmonella na cadeia produtiva de aves

A qualidade e a segurança dos produtos de origem animal é mantida graças a

programas de segurança alimentar que devem proporcionar um controle efetivo em toda
cadeia alimentar que envolve desde a criação dos animais até a distribuição dos alimentos
(SANTOS, et al. 2013).
O objetivo desses programas é aumentar a segurança e a qualidade dos produtos
produzidos, preparando o mercado produtor do Brasil para atender as exigências dos
importadores, aumentando ainda mais as exportações (CARDOSO; TESSARI, 2008).
A utilização dos programas de Boas Práticas de Produção (BPP) e a Análise dos
Perigos e Pontos Críticos de Controle (APPCC) foi estabelecida no Brasil através da Portaria
no 1428/93 e tem como objetivo principal estabelecer as orientações necessárias que permitem
executar as atividades de inspeção sanitária, de forma a avaliar as Boas Práticas para a
obtenção de padrões de identidade e qualidade de produtos e serviços na área de alimentos
com vistas à proteção da saúde da população. O Programa BPP é utilizado para inspecionar a
produção através de condições sanitárias adequadas enquanto o Programa de APPCC
identifica perigos potenciais tanto químicos, quanto físicos e microbiológicos e determina
ações para garantir a inocuidade dos alimentos (CARDOSO; TESSARI, 2008).
Em 1963, foi criado um fórum internacional de normatização do comércio de
alimentos estabelecido pela Organização das Nações Unidas (ONU), por ato da Organização
para a Agricultura e Alimentação (FAO) e Organização Mundial de Saúde (OMS), o Codex
Alimentarius (MAPA, 2015).
O Codex Alimentarius abrange os principais alimentos, sejam estes processados,
semiprocessados ou crus. Também trata de substâncias e produtos usados na elaboração de
alimentos. Suas diretrizes referem-se aos aspectos de higiene e propriedades nutricionais dos
alimentos, abrangendo o código de prática e normas de aditivos alimentares, pesticidas,
resíduos de medicamentos veterinários, substâncias contaminantes, rotulagem, classificação,
métodos de amostragem e análise de riscos (MAPA, 2015).

 
 48  
 

O comitê do Codex Alimentarius no Brasil têm como principal atividade a

participação e a defesa dos interesses nacionais nos comitês internacionais e a
responsabilidade de observar as normas do Codex Alimentarius como referência para a
elaboração e atualização da legislação e regulamentação nacional de alimentos (MAPA,
2015).
A presença de Salmonella nos produtos alimentícios derivados de aves desempenha
um papel importante na saúde pública, quando se trata de toxinfecções alimentares
(enfermidades causadas pela ingestão de alimentos contaminados por micro-organismos e
suas substâncias tóxicas). Nesse contexto, o controle de Salmonella em toda a cadeia de
produção é muito importante para garantir a inocuidade do produto que chega aos
consumidores. Nos Estados Unidos (EUA), estima-se que anualmente as Salmonellas
paratíficas acometem 1.000.000 de pessoas, sendo que 19.000 necessitam de hospitalização e
380 vem a óbito, apenas nos Estados Unidos (CDC, 2012).
Acredita-se que a ocorrência de Salmonelose (grupo de doenças causadas por qualquer
membro do gênero Salmonella) na população humana é subestimada já que a maior parte dos
quadros de gastroenterite ocorre sem a necessidade de hospitalizações e sem o isolamento do
agente causal no alimento incriminado (SANTOS; NASCIMENTO; FLORES, 2002).
O gênero Salmonella é o mais relevante da família Enterobacteriaceae e é dividido em
duas espécies: Salmonella enterica e Salmonella bongori. Salmonella enterica é subdividida
em seis subespécies: enterica, salamae, arizonae, diarizonae, houtenae e indica. Cada
subespécie apresenta diferentes sorovares, totalizando 2.610, com base na caracterização de
seus antígenos somáticos (O) e flagelares (H) e de acordo com a espécie e subespécie tendo a
seguinte distribuição: Salmonella enterica subspécie enterica (1.547 sorovares); Salmonella
enterica subspécie salamae (513); Salmonella enterica subspécie arizonae (100); Salmonella
enterica subspécie diarizonae (341); Salmonella enterica subspécie houtenae (73); Salmonella
enterica subspécie indica (13); Salmonella bongori (23) (GUIBOURDENCHE, et al. 2010).
As salmonelas são bacilos, Gram-negativos, anaeróbios facultativos, não formadores
de esporos, que possuem flagelos (com exceção da Salmonella Pullorum e Salmonella
Gallinarum), catalase positivos, oxidase negativos, redutores de nitrato a nitrito, que
fermentam açucares e descarboxilam aminoácidos. Possuem vários fatores de virulência como
antígenos de superfície, fatores que permitem a invasividade, a produção de endotoxinas,
citotoxinas e enterotoxinas. O papel de cada um desses fatores na patogenia das infecções
varia de acordo com o sorovar (QUINN, et al. 2005).

 
 49  
 

As infecções causadas em aves são classificadas em três tipos: pulorose (Salmonella

Pullorum), tifo aviário (Salmonella Gallinarum), ambas espécie-específicas de aves e paratifo
aviário, causado por qualquer outra salmonela que não a Salmonella Pullorum e a Salmonella
Gallinarum. Os dois primeiros sorovares determinam sérios prejuízos à produção avícola e
não se relacionam com a doença em humanos. As Salmonellas paratíficas contrapõem essa
característica, sendo responsáveis por graves surtos de doença gastrintestinal em humanos
(ANDREATTI, 2006).
As Salmonellas paratíficas atravessam a camada epitelial intestinal e alcançam a
lâmina própria (camada na qual as células epiteliais estão ancoradas), onde proliferam. São
fagocitadas pelos monócitos e macrófagos, resultando em resposta inflamatória, decorrente da
hiperatividade do sistema reticuloendotelial. Ao contrário do que ocorre na febre tifóide, nas
enterocolites, a penetração de Salmonella spp. fica limitada à lâmina própria (SHINOHARA,
et al. 2008).
As Salmonellas que não são espécie-específicas, possuem a capacidade de colonizar o
trato gastrintestinal de diferentes espécies. Nos homens desenvolvem um quadro de infecção
gastrointestinal, tendo como sintomas dores abdominais, diarréia, febre baixa e vômito, sendo
raros os casos clínicos fatais. Os sintomas aparecem entre 12 a 36 horas, podendo perdurar até
72 horas. Trata-se da manifestação mais comum de infecção por Salmonella e o episódio
geralmente sofre resolução em dois a três dias, não necessitando de tratamento com
antibióticos (SHINOHARA, et al. 2008). Nas aves, elas tem a capacidade de persistir no
intestino, entrar na corrente sanguínea e chegar em diferentes órgãos, facilitando a
contaminação da carcaça e dos ovos, sem provocar sinais clínicos. Troxell et al. (2015)
demonstraram recentemente que parâmetros fisiológicos, como a temperatura corporal,
podem ter um papel significativo na expressão da virulência, justificando assim a ausência de
sinais clínicos em aves se comparados a mamíferos.
As aves jovens são mais suscetíveis a colonização intestinal por Salmonella spp. pois
apresentam baixa imunidade e uma microbiota intestinal reduzida. Os sinais clínicos variam
de acordo com o grau de exposição e pela virulência da amostra. Diarreia profusa, cegueira,
claudicação, apatia, penas arrepiadas e asas caídas são sinais que podem estar presentes em
aves jovens infectadas, mas raramente são observados em aves adultas (ANDREATTI, 2006).
De acordo com o CDC (2014) os sorotipos que mais causam a infecção em humanos
são Enteritidis, Typhimurium, Newport e Javiana. Estes sorotipos são responsáveis por cerca
de metade de todas as culturas isoladas nos laboratórios de saúde pública.

 
 50  
 

No Brasil, a Salmonella Enteritidis é a mais prevalente (CARDOSO et al. 2015) e os

surtos de toxinfecções alimentárias geralmente estão associados ao consumo de alimentos
contendo carne e ovos contaminados (THOMAS et al. 2009).
Segundo Humphrey (2004) para causar gastroenterite em humanos saudáveis, a dose
infectante de Salmonella oscila entre 10x106 a 10x108 UFC, embora já tenham sido relatados
salmoneloses com doses infectantes bem menores, entre 1 - 10 UFC.  
A salmonelose é a doença bacteriana de maior impacto econômico na avicultura
brasileira e mundial devido ao paratifo aviário que engloba sorovares ubiquitárias, com várias
possibilidades de contaminação e transmissão dentro dos plantéis avícolas (ANDREATTI,
2009), por esse motivo a salmonelose é um fator limitante a criação de aves quando criadas
sem um programa específico de controle.
Diante disso foi criado o PNSA, que define normas para o monitoramento das
salmoneloses em estabelecimentos avícolas de comercialização nacional e internacional,
destinados a reprodução e produção de aves e ovos férteis. Os estabelecimentos são
certificados como livres de Salmonella Gallinarum, Salmonella Pullorum e livre/controlado
para Salmonella Enteritidis e Salmonella Typhimurium (AVICULTURA INDUSTRIAL,
2009).
O controle dos plantéis reprodutores, o monitoramento microbiológico da ração e dos
insumos de origem animal, bem como do ambiente em que as aves são criadas, é essencial
para evitar a disseminação do agente (CARDOSO; TESSARI, 2008).
De acordo com estudo da faculdade de medicina veterinária e zootecnia (FMVZ),
demonstrado na tabela 2, a análise de diferentes materiais (entre os quais incluem matriz
pesada, poedeira, frango de corte, ração, cama, farinha de origem animal entre outros),
revelou alta incidência de Salmonella spp. além de posicionar o sorovar Enteritidis como o
mais prevalente.

 
 51  
 

TABELA 2 – Sorovares de Salmonella isolados pelo laboratório de ornitopatologia da FMVZ

– Unesp - Botucatu
Matriz Frango Carcaça de Farinha
Sorovares Poedeira Ração Cama Total %
pesada de Corte frango animal
Enteritidis 3 5 25 1 - - - 34 46,6
Anatum - - - - - - 5 5 6,8
Mbandaka - - 3 - - 1 - 4 5,5
Senftenberg - - - 1 - - 3 4 5,5
Montevideo - - - - - - 4 4 5,5
Cubana 1 - 1 - - - 1 3 4,1
Bredeney - - - - 1 - 1 2 2,7
Agona - - - - - - 2 2 2,7
Pullorum - 2 - - - - - 2 2,7
Rugosa - 1 1 - - - - 2 2,7
Dublin - - - 1 - - - 1 1,4
Outros - - - - - - 10 10 14
Total 4 8 30 3 1 1 26 73 -
% 5,5 11 41 4,1 1,4 1,4 35,6 - 100
Fonte: ANDREATTI, et al. 2001.

Em criações industriais, as aves e seus produtos estão expostos a Salmonella spp. em

todas as fases de criação o que torna o controle da enfermidade extremamente difícil e
oneroso. Para um controle eficiente é preciso compreender como a disseminação ocorre e
assim estipular medidas de controle (ANDREATTI, 2006).
  Uma vez nas granjas, o contato entre os animais facilita a transmissão horizontal, pela
água, fezes, rações, fômites e as pessoas que trabalham no local. Animais domésticos e
silvestres que possam ter contato com as aves também são potenciais disseminadores. Matéria
orgânica e umidade constituem nichos onde diversos sorotipos podem sobreviver e se
multiplicar por períodos prolongados (BRADEN, 2006).   Os roedores merecem atenção
redobrada já que a incidência de ratos contaminados é alta em lotes positivos, o que não
ocorre em granjas negativas (ANDREATTI, 2006).
A detecção rápida e eficaz de lotes de aves infectados por Salmonella spp. tornou-se
fundamental para reduzir a frequência da transmissão entre os lotes de aves e aos
consumidores de produtos avícolas. O diagnóstico definitivo é realizado através do
isolamento e identificação da bactéria (ANDREATTI, 2009).
A erradicação das Salmonellas paratíficas nas criações de aves é praticamente
impossível no atual contexto. A grande variedade de possibilidades de contaminação
existentes, tornam os controles difíceis e onerosos, porém extremamente necessários. Em
2013 a incidência das infecções provocadas por Salmonellas, diminuiu 9% em comparação
aos anos de 2010 a 2012 nos EUA (CDC, 2014).

 
 52  
 

No incubatório, o monitoramento deve ser rigorosamente seguido através da exposição

de placas e suabes de arrasto nos diversos ambientes, além de análises de todos os resíduos,
caixa de transporte de pintos, suabes cloacais, exames de fezes, ovos bicados e mecônio. O
controle de roedores deve ser efetuado em todos os tipos de criações através da limpeza dos
arredores dos núcleos juntamente com o uso de rodenticidas. Os insetos também devem ser
controlados periodicamente (SONCINI, 2004).
A qualidade da matéria-prima utilizada para a fabricação das rações deve ser
rigorosamente avaliada, evitando as contaminadas com Salmonella spp.. Dar preferencia a
rações vegetais para as aves reprodutoras e que são tratadas por calor através do processo de
peletização (SONCINI, 2004).
A utilização dos resíduos derivados da produção avícola, como farinhas de vísceras,
sangue, penas, carne e ossos constitui uma alternativa economicamente viável na formulação
de rações, no entanto, a contaminação com Salmonella sp. nesses ingredientes de rações é
importante e gera riscos a saúde pública (CARDOZO, 2011). Por esse motivo, a exclusão de
subprodutos avícolas como matéria-prima para fabricação de ração têm sido praticada. Além
disso, amostras de Salmonella spp. originárias de aves podem ser mais prejudiciais as aves se
comparadas a amostras originadas de outras espécies, devido a maior adaptação ao hospedeiro
(ANDREATTI, 2009).
As Salmonellas são sensíveis ao calor, uma vez que não resistem a temperaturas entre
55 e 62 oC (JUNEJA; EBLEN; RANSOM, 2001). A temperatura e o tempo de tratamento
durante a peletização funcionam como potentes antibacterianos. O tratamento por 30
segundos a temperatura de 80 oC é suficiente para inativar os principais micro-organismos
patogênicos exceto quando houver uma taxa bacteriana extremamente alta (EFSA, 2008).
A utilização de antibióticos de maneira preventiva, têm sido largamente utilizada no
controle de Salmonella, diminuindo a mortalidade porém sem eliminar totalmente a infecção,
levando ao desenvolvimento de aves portadoras que excretam ativamente a bactéria através
das fezes. Os principais antimicrobianos utilizados são as sulfonamidas, penicilinas,
polipeptídeos, lincosamidas, cefalosporinas e quinolonas. No entanto, essa pratica têm sido
apontada como uma das causas da resistência antimicrobiana. Minharro et al. (2015)
demonstraram que a maioria dos sorovares de Salmonella foram resistentes para o grupo de
sulfonamidas (sulfametoxazol e sulfonamida) e beta-lactâmicos (amoxicilina / ácido
clavulânico).
Após a proibição do uso de diversas moléculas antibióticas na União Européia através
da EC n. 1831/2003 tem-se observado um aumentado na busca por alternativas para melhorar

 
 53  
 

o desempenho dos animais, diminuir a contaminação das aves e das carcaças por bactérias
patogênicas, sem deixar resíduos nocivos que possam causar problemas de saúde aos
consumidores finais da carne de frango. Enzimas, extratos de plantas, óleos, ácidos orgânicos,
prebióticos, probióticos e suas associações estão entre compostos mais estudados.
Diversos estudos tem demonstrado a ação benéfica de probióticos na alimentação de
aves, conforme pode ser observado no quadro 9:

QUADRO 7 – Ação dos probióticos sobre Salmonella sp.

Probiótico Desafio Efeito
Aumento do ganho de peso e conversão
Bacillus cereus var Toyoi 104 Salmonella Enteritidis
Redução de 100% na presença de SE.
Redução da recuperação de SE 24 horas pós
Lactobacillus spp. tratamento;
104 Salmonella Enteritidis
(11espécies) Redução da presença de SE em tratamento
via cloacal.
Redução da contagem de ST em baço,
intestino e fígado;
Redução na infiltração de neutrófilos;
Lactobacillus casei 108 Salmonella Typhimurium
Aumento da atividade fagocítica de
macrófagos;
Aumento de IgA no intestino.
Redução de 99% da viabilidade de ST em
Lactobacillus rhamnosus e pH 4,5 e microaerofilia;
Salmonella Thphimurium
Lactobacillus.reuteri Redução de 20% de ST em pH7,5 e
microaerofilia.
Lactobacillus casei,
Redução de SE em aves tratadas por 24
Lactobacillus delbrueckii,
horas, uma hora pós-inoculação;
Lactobacillus fermentum; 104 Salmonella Enteritidis
Redução de SE em aves tratadas 24 horas
Lactobacillus spp.
pré-inoculação.
(11 espécies)
Aviguard®, Saccharomyces
Salmonella spp. proveniente Redução da contaminação no corpo da
cereviseae e Pediococcus
do incubatório ave, na carcaça e no ceco.
acidilactici
Fonte: adaptado de KURITZA, WESTPHAL, SANTIN, 2014.

 
 54  
 

Apesar do desconhecimento de todos os mecanismos de ação dos probióticos é

evidente que a sua utilização na avicultura é benéfica, tanto no controle de Salmonella, quanto
como melhorador de desempenho (SILVA; ANDREATTI, 2000).
A vacinação de reprodutoras também é um método eficiente auxiliar no controle de
Salmonella, porém essa medida não substitui nenhuma das outras estratégias de controle, uma
vez que previne a manifestação clínica, mas ainda pode ocorrer a infecção e a eliminação de
Salmonella (SONCINI, 2004).
O controle de Salmonella é um desafio para a saúde pública e para a indústria avícola,
por esse motivo as medidas de biosseguridade devem ser implantadas e vistoriadas em toda
cadeia produtiva uma vez que, animais portadores são fatores epidemiológicos importantes,
devido à ausência de sinais e a dificuldade técnica em detectá-los antes ou durante a inspeção
sanitária das aves. Além disso, mais estudos são necessarios acerca da epidemiologia da
Salmonella e sua prevalência nos ambientes de produção.

 
 55  
 

4 CONCLUSÕES  

O estágio curricular supervisionado em Medicina Veterinária proporcionou uma ampla

visão sobre a importância do controle sanitário tanto na avicultura quanto na suinocultura. A
partir das atividades acompanhadas foi possível formar opiniões críticas perante as
enfermidades de maior prevalência, enfatizando a importância do diagnóstico definitivo e a
associação desse com a realidade vivenciada no campo.
Dessa forma, é possível concluir também que os conhecimentos teórico e prático
adquiridos no estágio supervisionado foram fundamentais para a capacitação profissional.

 
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ANEXO A – Certificado Do Estágio Curricular Supervisionado Em Medicina

Veterinária