Fluitest BIL T/D

BILIRUBIN JENDRASSIK/GRÓF METHOD

Order information: Testing procedure:

Catalog-No. Contents Applications for automated systems are available on request.

R1 1x 50 ml R2 1x 10 ml Materials provided
1965 • Working solutions as described above
R3 1x 100 ml R4 1x 100 ml Additional materials required
• Calibrators and controls as indicated below
Intended use: • NaCl - sol. 0.9%
In vitro test for the quantitative determination of direct bilirubin and total bilirubin in
serum, heparinized plasma or EDTA plasma by the Jendrassik- Grof method.
Procedure Bilirubin Total:
Wavelength: Hg 578 nm (560 – 600 nm)
Summary: Temperature: +20 to +25°C
80-85% of bilirubin originates on degradation of hemoglobin with the other 15-20% Cuvette: 1 cm
being derived from cytochrome, myoglobin and catalases. Unconjugated bilirubin, Zero adjustment: against sample blank
which binds to plasma albumin, is producted in the course of degradation in the
Sample blank sample
reticuloendothelial system, liver Kupffer cells, spleen and bone marrow.
Unconjugated (primary, indirect, water-insoluble) bilirubin is soluble in lipids and toxic. R1 200 µl 200 µl
With the aid of the glucuronyl transferase enzyme, bilirubin is conjugated primarily by R2 ----- 50 µl
glucuronic acid in the microsomes of hepatic parenchymal cells. In contrast to R3 1000 µl 1000 µl
unconjugated bilirubin, conjugated (secondary, direct) bilirubin is soluble in water, and sample 200 µl 200 µl
is excreted via the kidneys. Bilirubin assays are suitable for evaluating the degree of
severity of icteric clinical symptoms as well as for monitoring and objectively Mix and incubate at room temperature for 10 – 60 minutes. Add:
assessing these symptoms. Distinguishing between direct and indirect bilirubin is a
R4 1000 µl 1000 µl
valuable aid in the differential diagnosis of different forms of jaundice. A direct bilirubin
value of <20% total bilirubin is an indicator of jaundice of pre-hepatic origin. This value Mix and incubate at room temperature for 5 – 30 minutes. Read absorbance of
can increase to >50% in hepatic and post-hepatic jaundice. sample against sample blank.

Test principle: Calculation:

Jendrassik-Gróf method with factors
In the presence of caffeine accelerator, total bilirubin couples with sulfanilic acid to Concentration in mg/dl 10.8 x ΔABilirubin Total
form a red azobilirubin dye, the color intensity which is proportional to the bilirubin Concentration in µmmol/l 185 x ΔABilirubin Total
concentration. Determination of direct bilirubin is performed without caffeine additive.
with calibrator
The addition of alkaline tartrate causes a transformation from the red azobilirubin dye
to a blue dye and the absorbance maximum from 546nm to 578nm. ∆E sample
x calibrator conc. = bilirubin conc.
HCl ∆E calibrator
Sulfanilic acid + NaNO2 → diazotized sulfanilic acid
HCl
Bilirubin + diazotized sulfanilic acid → azobilirubin Procedure Bilirubin Direct:
Wavelength: Hg 546 nm (530 – 555 nm)
Reagents – contents and concentrations: Temperature: +20°C to +25°C
R1:
Cuvette: 1 cm
Sulfanilic acid 29 mmol/l
Zero adjustment: against sample blank
HCl 0.17 mol/l
R2: Sample blank sample
Sodium nitrite 25 mmol/l
R3: R1 200 µl 200 µl
Caffeine 0.26 mol/l R2 ----- 50 µl
Sodium benzoate 0.52 mol/l NaCl - sol. 0.9% 2000 µl 2000 µl
R4: Sample 200 µl 200 µl
Tartrate 0.93 mol/l Mix and incubate at room temperature for 5 minutes. Read absorbance of
NaOH 1.9 mol/l sample against sample blank.
Calculation:
Preparation and stability:
R1 ready for use. with factors
Concentration in mg/dl 13.7 x ΔABilirubin Direct
Unopened kit components: Up to the expiration date at + 2 to + 8°C.
Concentration in µmmol/l 234 x ΔABilirubin Direct
Close bottles after use.
with calibrator
Specimen:
Fresh serum, heparinized plasma or EDTA plasma.
∆E sample
x calibrator conc. = bilirubin conc.
Hemolysis interferes with the test. Don’t use lipemic sera. ∆E calibrator
Keep out of light and protect the sample from the effects of sunlight.
Centrifuge samples containing precipitate before performing the assay.
Stability: Total Direct Measuring /reportable range:
1 day 2 days at +20 to +25°C Bilirubin direct: Up to 6.0 mg/dl (102 µmol/l)
7 days 7 days at +4 to +8°C Bilirubin total: Up to 14 mg/dl (238 µmol/l)
6 months 6 months at – 20°C Dilute determine samples having higher concentrations with 0.9% NaCl or
distilled/deionized water (e.g. 1 + 3) and repeat test. Multiply the result by the
Note: appropriate dilution factor (e.g. factor 4).
For in vitro diagnostic use.
The material safety data sheet contains further safety-related information. It is Expected values in serum:
available for download from our homepage http://www.analyticon-diagnostics.com. Total bilirubin up to 1.0 mg/dl or 17.1 µmol/l
Exercise the normal precautions required for handling all laboratory reagents. Direct bilirubin up to 0.25 mg/dl or 4.3 µmol/l

Limitations - interference: Analytical sensitivity (lower detection limit):

Criterion: Recovery within ± 10% of initial value. 0.01 mg/dl (0.17 µmol/l)
Hemolysis: Elevated levels of haemoglobin may interfere. The lower detection limit represents the lowest measurable Bilirubin concentration
Lipemia (Intralipid): Elevated levels of triglycerides may interfere. There is poor that can be distinguished from zero.
correlation between turbidity and triglycerides concentration.
Protect samples from light to avoid false low values.
The effect of drugs or their metabolic products on the test is not known in all cases.
In case of doubt it is recommended to repeat the test after the medication has been
discontinued. However, the medication may only be discontinued according to
instructions of the attending physician.

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Am Mühlenberg 10, 35104 Lichtenfels / Germany
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BILIRUBIN JENDRASSIK/GRÓF METHOD

Imprecision:
Reproducibility was determined using controls in an internal protocol within (n = 20).
The following results were obtained:

BILIRUBIN TOTAL

Between day
Sample Mean SD CV
mg/dl mg/dl %
Sample 1 1.00 0.014 1.40
Sample 2 1.84 0.018 1.00
Sample 3 4.79 0.051 1.07

Within run
Mean SD CV
Sample
mg/dl mg/dl %
Sample 1 1.14 0.017 1.47
Sample 2 1.82 0.021 1.18
Sample 3 5.14 0.020 0.39

BILIRUBIN DIRECT

Between day
Sample Mean SD CV
mg/dl mg/dl %
Sample 1 0.73 0.021 2.90
Sample 2 0.90 0.029 3.28
Sample 3 2.15 0.035 1.63

Within run
Sample Mean SD CV
mg/dl mg/dl %
Sample 1 0.33 0.008 2.38
Sample 2 0.95 0.008 0.80
Sample 3 2.16 0.013 0.62

Method comparison:
A comparison of the Analyticon Fluitest BILI T/D (y) with a commercial obtainable
assay (x) gave the following result (mg/dl):
y = 1.001 x + 0.0245; r = 0.996

Quality Control:
Human Control Serum
Contronorm Plus 5 x 5 ml #1205
20 x 5 ml #1220
Contropath Plus 5 x 5 ml #1305
20 x 5 ml #1320
The control intervals and limits must be adapted to the individual laboratory and
country-specific requirements. Values obtained should fall within established limits.
Each laboratory should establish corrective measures to be taken if values fall outside
the limits.

Calibration:
S1: 0.9% NaCl
S2: Bio-Cal 20 x 3 ml #1420
Bio-Cal E 10 x 3 ml #1430

Literature:
1. Jendrassik L et al. Biochem Z 1938 ;297 :81.
2. Malloy HT, Evelyn KA. J Biol Chem 1937;119:481.
3. Richterin R. Klinische Chemie, 3. Auflage Basel: Karger Verlag, 1971:450-452.
4. Schellong G, Wende U. Technik für die Eichung von Methoden zur
Serumbilirubin-Bestimmung. Klin Wschr 1960;38:703.
5. Schmidt E, Schmidt FW. Diagnostik des Ikterus. Dt med Wschr 1984;109:139-
144
6. Sherlock S. Liver Disease. London: Chuchill, 1951:204.
7. Silbernagel S, Despopoulus A. Physiologie für die Praxis, Medical 1983; 4 ; 492
– 495
8. Stiehl A. Hyperbilirubinämie bei Lebererkrankungen. Fortschr Med 1982;
100:842-845
9. Thaler H. Bilirubin: Ein Wegwerfprodukt bleibt weiter aktuell. Dt. med Wschr
1984; 109:283 - 284
10. Thomas L. Labor und Diagnose, Marburg: Med Verlagsges, 1984.

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Bestellinformation: Einschränkung des Verfahrens - Interferenzen:

Als Bewertung gilt: Wiederfindung ± 10% vom Ausgangswert.
Katalog-Nr. Inhalt Hämolyse: Schon geringe Mengen Hämoglobin können die Messwerte beeinflussen.
R1 1x 50 ml R2 1x 10 ml Lipämie: Schon geringe Mengen Triglycerid können die Messwerte beeinflussen.
1965 Belichtung der Proben führt ebenfalls zu niedrigeren Messwerten, daher vor Licht
R3 1x 100 ml R4 1x 100 ml schützen.
Die Auswirkung von Medikamenten oder deren Metaboliten auf den Test ist nicht in
Anwendungszweck: allen Fällen bekannt. Im Zweifelsfall wird deshalb empfohlen, den Test nach Absetzen
In vitro Test zur quantitativen Bestimmung von Direktem Bilirubin und Gesamt- der Medikation zu wiederholen. Ein Absetzen der Medikation darf allerdings nur nach
Bilirubin im Serum, Heparin- oder EDTA-Plasma nach der Methode Jendrassik-Gróf. Anweisung des behandelnden Arztes erfolgen.

Zusammenfassung: Testverfahren:
Bilirubin entsteht zu 80-85% beim Abbau von Hämoglobin und zu 15-20% aus Cyto- Applikationen für automatisierte Systeme sind auf Anfrage erhältlich.
chromen, Myoglobin und Katalasen. Beim Abbau im retikuloendothelialen System,
den Kupffer´schen Sternzellen der Leber, in der Milz und im Knochenmark wird Gelieferte Materialien
unkonjugiertes Bilirubin gebildet und dann an Plasmaalbumin gebunden. Unkon- • Gebrauchsfertige Lösungen wie vorher angegeben.
jugiertes (primäres, indirektes, wasserunlösliches) Bilirubin ist lipidlöslich und toxisch. Zusätzlich benötigte Materialien
In den Mikrosomen der Leberparenchymzellen wird es unter Beteiligung des Enzyms • Kalibrations- und Kontrollmaterial wie nachfolgend beschrieben.
Glucuronyltransferase überwiegend mit Glucuronsäure konjugiert. Kon-jugiertes • Natriumchlorid-Lösung (0,9%)
(sekundäres, direktes) Bilirubin ist im Gegensatz zur unkonjugierten Form
wasserlöslich und kann über die Nieren ausgeschieden werden. Die Bestimmung von
Testdurchführung Bilirubin Total:
Bilirubin ist geeignet zur Erfassung des Schweregrades und des Verlaufs sowie zur Wellenlänge: Hg 578 nm (560 – 600 nm)
Objektivierung des klinischen Symptoms „Ikterus“. Die Unterscheidung von direktem Reaktionstemperatur: +20 bis +25°C
und indirektem Bilirubin trägt zur Differentialdiagnose der Ikterusformen bei. Ein Schichtdicke: 1 cm
Anteil des direkten Bilirubins deutet auf eine prähepatische Ursache des Ikterus hin, Messung: gegen Probenleerwert
während bei hepatischer und posthepatischer Gelbsucht dieser Anteil auf über 50%
ansteigen kann. Probenleerwert Probe
R1 200 µl 200 µl
Testprinzip: R2 ----- 50 µl
Methode Jendrassik-Gróf R3 1000 µl 1000 µl
Gesamt-Bilirubin wird in Gegenwart von Koffein als Akzelerator mit diazotierter Probe 200 µl 200 µl
Sulfanilsäure zu rotem Azobilirubin umgewandelt, dessen Farbintensität propor-tional
der Bilirubinkonzentration ist. Die Bestimmung des „Direkten“ Bilirubins erfolgt ohne Mischen und 10 – 60 Minuten bei RT inkubieren, dann zufügen:
Koffeinzusatz. Die Zugabe von alkalischem Tartrat gibt dem Azofarbstoff eine blaue
Farbe und verschiebt das Absorbtionsmaximum von 546nm auf 578nm. R4 1000 µl 1000 µl
Mischen und 5 – 30 Minuten bei RT inkubieren. Extinktionen der Probe gegen
HCl
Sulfanilsäure + NaNO2 → diazotierte Sulfanilsäure Probenleerwert messen.
HCl Berechnung:
Bilirubin + diazotierte Sulfanilsäure → Azobilirubin
mit Faktor
Konzentration in mg/dl 10,8 x ΔEBilirubin Total
Konzentration der Reagenzien: Konzentration in µmmol/l 185 x ΔEBilirubin Total
R1:
Sulfanilsäure 29 mmol/l mit Kalibrator
HCl 0,17 mol/l
∆E Probe
R2: x Kalibratorkonz. = Bilirubinkonz.
Natriumnitrit 25 mmol/l ∆E Kalibrator
R3:
Koffein 0,26 mol/l
Natriumbenzoat 0,52 mol/l Testdurchführung Bilirubin Direkt:
R4: Wellenlänge: Hg 546 nm (530 – 555 nm)
Tartrat 0,93 mol/l Reaktionstemperatur: +20°C bis +25°C
NaOH 1,9 mol/l Schichtdicke: 1 cm
Messung: gegen Probenleerwert
Herstellung und Haltbarkeit:
Die Reagenzien sind gebrauchsfertig. Probenleerwert Probe
Haltbarkeit der ungeöffneten Komponenten: R1 200 µl 200 µl
bei + 2°C - + 8°C bis zum angegebenen Verfallsdatum. R2 ----- 50 µl
NaCl - Lsg. 0,9% 2000 µl 2000 µl
Reagenzien vor Licht schützen und Flaschen nach Gebrauch gut verschließen. Probe 200 µl 200 µl
Mischen und 5 Minuten bei RT inkubieren. Extinktionen der Probe gegen
Untersuchungsgut:
Probenleerwert messen.
Frisches Serum, Heparin- oder EDTA-Plasma.
Hämolyse stört. Lipämische Seren können nicht verwendet werden. Berechnung:
Probe vor Licht und Sonneneinwirkung schützen.
mit Faktor
Proben, die Präzipitate enthalten, müssen vor dem Test zentrifugiert werden.
Konzentration in mg/dl 13,7 x ΔEBilirubin Direct
Konzentration in µmmol/l 234 x ΔEBilirubin Direct
Haltbarkeit: Total Direkt
1 Tage 2 Tag bei +20 bis +25°C mit Kalibrator
7 Tage 7 Tage bei +4 bis +8°C
6 Monate 6 Monate bei – 20°C ∆E Probe
x Kalibratorkonz. = Bilirubinkonz.
∆E Kalibrator
Hinweis:
In vitro Diagnostikum.
Weitere sicherheitsrelevante Informationen sind im Sicherheitsdatenblatt enthalten. Messbereich:
Dieses steht auf unserer Homepage http://www.analyticon-diagnostics.com zum Bilirubin direkt: Bis 6.0 mg/dl (102 µmol/l)
Download bereit. Bilirubin total: Bis 14 mg/dl (238 µmol/l)
Die beim Umgang mit Laborreagenzien üblichen Vorsichtsmaßnahmen beachten. Bei höheren Konzentrationen werden die Proben 1 + 3 mit 0,9%iger Kochsalzlösung
verdünnt. Die Analyse wird wiederholt und das Ergebnis mit 4 multipliziert.

Normalwerte im Serum:
Gesamtes Bilirubin bis 1,0 mg/dl bzw. 17,1 µmol/l
Direktes Bilirubin bis 0,25 mg/dl bzw. 4,3 µmol/l

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BILIRUBIN JENDRASSIK/GRÓF METHODE

Sensitivität (analytische Nachweisgrenze): 9. Thaler H. Bilirubin: Ein Wegwerfprodukt bleibt weiter aktuell. Dt. med Wschr
0,01 mg/dl (0.17 µmol/l) 1984; 109:283 - 284
Die Nachweisgrenze entspricht der niedrigsten messbaren Bilirubinkonzentration, die 10. Thomas L. Labor und Diagnose, Marburg: Med Verlagsges, 1984.
von Null unterschieden werden kann.

Impräzision:
Die Reproduzierbarkeit wurde mit Kontrollproben bestimmt und ergab folgende
Ergebnisse (n=20):

BILIRUBIN TOTAL

Tag / Tag
Probe MW SD VK
mg/dl mg/dl %
Probe 1 1,00 0,014 1,40
Probe 2 1,84 0,018 1,00
Probe 3 4,79 0,051 1,07

In der Serie
Probe MW SD VK
mg/dl mg/dl %
Probe 1 1,14 0,017 1,47
Probe 2 1,82 0,021 1,18
Probe 3 5,14 0,020 0,39

BILIRUBIN DIRECT

Tag / Tag
Probe MW SD VK
mg/dl mg/dl %
Probe 1 0,73 0,021 2,90
Probe 2 0,90 0,029 3,28
Probe 3 2,15 0,035 1,63

In der Serie
Probe MW SD VK
mg/dl mg/dl %
Probe 1 0,33 0,008 2,38
Probe 2 0,95 0,008 0,80
Probe 3 2,16 0,013 0,62

Methodenvergleich:
Bei einem Vergleich von Analyticon Fluitest BILI-T/D (y) mit einem kommerziell
erhältlichen Test (x) wurden folgende Ergebnisse erhalten (mg/dl):
y = 1,001 x + 0,0245; r = 0,996

Qualitätskontrolle:
Humane Kontrollseren:
Contronorm Plus 5 x 5 ml #1205
20 x 5 ml #1220
Contropath Plus 5 x 5 ml #1305
20 x 5 ml #1320
Die Kontrollintervalle und Kontrollgrenzen sind den individuellen Anforderungen jedes
Labors und den länderspezifischen Richtlinien anzupassen. Die Ergebnisse müssen
innerhalb der festgesetzten Bereiche liegen. Jedes Labor sollte
Korrekturmaßnahmen für den Fall beschreiben, dass Werte außerhalb des Bereichs
liegen.

Kalibration:
S1: 0.9% NaCl
S2: Bio-Cal 20 x 3 ml #1420
Bio-Cal E 10 x 3 ml #1430

Literatur:
1. Jendrassik L et al. Biochem Z 1938 ;297 :81.
2. Malloy HT, Evelyn KA. J Biol Chem 1937;119:481.
3. Richterin R. Klinische Chemie, 3. Auflage Basel: Karger Verlag, 1971:450-452.
4. Schellong G, Wende U. Technik für die Eichung von Methoden zur
Serumbilirubin-Bestimmung. Klin Wschr 1960;38:703.
5. Schmidt E, Schmidt FW. Diagnostik des Ikterus. Dt med Wschr 1984;109:139-
144
6. Sherlock S. Liver Disease. London: Chuchill, 1951:204.
7. Silbernagel S, Despopoulus A. Physiologie für die Praxis, Medical 1983; 4 ; 492
– 495
8. Stiehl A. Hyperbilirubinämie bei Lebererkrankungen. Fortschr Med 1982;
100:842-845

Analyticon® Biotechnologies AG (PBILTD_GB-D_21_001_07.01_2017-06-07) S4/4

Am Mühlenberg 10, 35104 Lichtenfels / Germany