Biohydrogen Production 

Using Cyanobacteria
Kaitlyn Baab
Cluster 1: Biotechnology
COSMOS 2009, UC Davis
The Problem
Figure 1
Depletion of Fossil Fuels
ƒ Today, fossil fuels (coal, oil, natural gas) supply over 80% 
of the world’s energy needs
ƒ Fossil fuels are being depleted much faster than they are 
being formed
ƒ Eventually we will run out of fossil fuels
Global Pollution
ƒ Burning of fossil fuels leads to emission of green house 
gases (i.e. carbon dioxide) which causes global warming
ƒ Global Warming‐ increase in Earth’s average 
temperature leading to rising sea levels
 The Solution

ƒ Find an alternative energy source!!!

Figure 2
Figure 4

Figure 3
 Hydrogen
Figure 5

ƒ A renewable energy source
ƒ Non‐polluting, non‐greenhouse gas emitting
ƒ The most abundant element, but cannot be captured from 
most sources
ƒ Can be used with fuel cells and other similar technologies to 
produce energy
ƒ However, “hydrogen is only as good as the energy used to 
make it”‐ NREL
ƒ Today, most of the hydrogen produced uses steam 
reformation of methane and fossil fuels
ƒ We need to find a clean, cost effective way to produce 
hydrogen!!!
Biohydrogen

ƒ The production of hydrogen using microorganisms
ƒ These organisms produce H2 from renewable energy 
sources such as sunlight
ƒ Some of these organisms include green algae and 
cyanobacteria
ƒ Average of 10% solar conversion efficiency

Sunlight Biological Catalysis Hydrogen

Adapted from U.S. 
Department of Energy
Cyanobacteria
ƒ Also known as blue‐green algae
ƒ Prokaryotes (lack nucleus and internal organelles)
ƒ Unicellular, filamentous, free‐living, or colonies
ƒ Use carbon dioxide as carbon source & produce ATP and 
oxygen through photosynthesis
ƒ Under certain conditions they use energy to produce 
hydrogen gas

Figure 6
Why Cyanobacteria?

ƒ They have very simple nutritional requirements
ƒ They need:
ƒ Air (for CO2 and N2)
ƒ Water (for electrons)
ƒ Light (for energy)
ƒ Mineral Salts

Figure 7
Enzymes Responsible for Hydrogen 
Production
Enzymes: 
1. Nitrogenase‐ produces hydrogen during nitrogen 
fixation
2. Uptake Hydrogenase‐ recycles the hydrogen 
produced
3. Bidirectional Hydrogenase‐ hydrogen production and 
consumption
ƒ Some cyanobacteria use nitrogenase/uptake 
hydrogenase or bidirectional hydrogenase and some 
use both
Nitrogenase and Uptake Hydrogenase

N2 ƒ ATP is required
ƒ Sensitive to 
Nitrogenase NH3 oxygen
ƒ H2 produced is 
taken up by 
uptake 
hydrogenase
ƒ Used only by 
2H+ + 2e‐ Uptake Hydrogenase H2
nitrogen fixing 
bacteria
Adapted from Filipe Pinto
Bidirectional Hydrogenase

2H+ + 2e‐ Bidirectional 

H2
Hydrogenase

Adapted from Filipe Pinto

ƒ ATP requirement is lower than for nitrogenase
ƒ Sensitive to oxygen
ƒ Hydrogen uptake when hydrogen partial pressure is high
ƒ Used by both nitrogen fixing and non‐nitrogen fixing 
bacteria
Current Obstacles Associated with 
Cyanobacteria
ƒ Overall low production of hydrogen
ƒ Oxygen inhibition in nitrogenase and 
hydrogenase
ƒ Hydrogen consumption by uptake 
hydrogenase

Figure 8
 Nostoc punctiforme ATCC 29133
ƒ A strain of cyanobacteria Figure 10

ƒ Nitrogen fixing bacteria with 
vegetative and heterocyst cells
ƒ Filamentous bacteria has 
vegetative cells 
(photosynthesis) and 
heterocyst cells (nitrogen 
fixing)
ƒ Produces hydrogen only 
through nitrogenase
ƒ This strain is unique because  it 
does not contain bidirectional 
hydrogenase
NHM5 Mutant
What it is‐
ƒ A genetically engineered form of Nostoc punctiforme ATCC 29133 
with no uptake hydrogenase
ƒ Genetically engineered in 2002 by Lindberg et al.
How they created it‐
ƒ Created a non‐working uptake hydrogenase (hupL‐) by  taking an 
uptake hydrogenase gene (hupL) and interrupting it using 
neomycin resistance (npt)
ƒ Neomycin resistance gene was used both to interrupt hupL and 
to select for correctly transformed cells
ƒ Inserted hupL‐ into plasmid and put this plasmid into Ecoli cells
ƒ Transferred the plasmid into Nostoc
ƒ The hupL‐ gene was inserted into the genome of the cyanobacteria
 NHM5 Mutant

N2

Nitrogenase NH3 ƒ End result is  a strain of 

Nostoc punctiforme
ATCC 29133 that 
contained no uptake 
hydrogenase
ƒ Produces more 
2H+ + 2e‐ Uptake Hydrogenase H2 hydrogen gas
Adapted from Filipe 
Pinto
Researchable Question

ƒ Will hydrogen production efficiency increase 
in the cyanobacterium Nostoc punctiforme
ATCC 29133 if a gene for uptake hydrogenase 
is knocked out while the gene for bidirectional 
hydrogenase is inserted into the 
cyanobacterium?

Figure 9
My Experiment
ƒ Use a similar system to that of Lindberg et al.
ƒ Create an uptake hydrogenase deficient Nostoc strain, but in 
addition to inserting hupL‐ also insert a gene for bidirectional 
hydrogenase
▪ Take the bidirectional hydrogenase from cyanobacterium 
Synechocystis PCC 6803 
▪ Coded for by the hox operon (not one gene, but many 
subunits)

Figure 11
Materials

ƒ Bidirectional hydrogenase gene from 
Synechocystis PCC 6803 
ƒ Designed primers
ƒ pRneoK plasmid from E. coli
ƒ E. coli cells
ƒ Nostoc punctiforme ATCC 29133
ƒ Photobioreactor
ƒ Gas chromatograph 
Method

Step 1: Take hox locus from Synechocystis
PCC 6803 and insert it into pRneoK plasmid

Step 2: Insert plasmid into E. coli

Step 3:Transfer plasmid from E. coli cells to 
Nostoc punctiforme ATCC 29133

Step 4: Cultivate cyanobacteria

Step 5:Measure hydrogen production
 Protocol
Figure 12
ƒ Step 1: Take hox locus 
(bidirectional hydrogenase) 
from Synechocystis PCC 6803 
and insert it into plasmid 
pRneoK 
▪ Use designed primers and 
PCR to amplify the hox locus 
including promoter hox locus 
▪ Plasmid includes the  will be 
antibiotic resistance gene  inserted 
neomycin to select for  here
transformed cells
▪ Use standard recombinant 
DNA techniques to insert 
gene into plasmid
Protocol
Figure 13

ƒ Step 2: Insert 
plasmid into E. coli
▪ Use electroporation 
(electric shock)
▪ Grow E. coli cells in LB 
media with neomycin 
(to select for 
transformed cells)
Protocol
Figure 14
ƒ Step 3: Transfer plasmid from 
E. coli cells to Nostoc
▪ Using tri‐parental mating according 
to the protocol of Cohen et al. 
(1994) Figure 15
 E. coli with plasmid, E. coli
capable of conjugation, and 
cyanobacteria
▪ Antibiotic resistance and sucrose 
sensitivity will select for 
transformed Nostoc
▪ Homologous recombination‐
exchanges genetic materials from 
plasmid and genome because have 
similar flanking sequences
Protocol
Figure 16
ƒ Step 4: Cultivate cyanobacteria
▪ Pick colonies of transformed Nostoc 
punctiforme ATCC 29133 with 
bidirectional gene from plate
 Isolate DNA and check for construct with 
PCR
▪ Grow Nostoc punctiforme ATCC 
29133 in photobioreactor
 Photobioreactor‐a bubble column 
reactor, the medium is continually mixed 
& air is bubbled through
 Also, test the controls (wild type of 
Nostoc and Nostoc without 
hydrogenase) in the same environment
Protocol
ƒ Step 5: Measure hydrogen 
production Figure 17
▪ Measure hydrogen 
production with a gas 
chromatograph
 If hydrogen production in 
Nostoc with bidirectional 
hydrogenase is greater than 
the Nostoc without 
hydrogenase then we know 
it worked!!
Potential Problems

ƒ Oxygen could inhibit the production of hydrogen
▪ Potential solution: try to grow in anaerobic environment 
or change culture conditions
ƒ Bidirectional could uptake hydrogen instead of produce 
hydrogen
▪ Potential solution: pump gas out of chamber to keep 
partial pressure of hydrogen low
ƒ Cohen MF, Wallis JG, Campbell EL, Meeks JC.  Transposon mutagenesis of  Nostoc 
sp. strain ATCC 29133, a 7lamentous cyanobacterium with multiple  cellular 
diEerentiation alternatives. Microbiology 1994;140:3233–40.
ƒ Dutta, Debajyoti, et al. “Hydrogen Production by Cyanobacteria.” Microbial Cell 
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 Bibliography (Images)
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R&_user=4421&_rdoc=1&_fmt=&_orig=search&_sort=d&_docanchor=&view=c&_searchStrI
d=968479764&_rerunOrigin=google&_acct=C000059598&_version=1&_urlVersion=0&_user
id=4421&md5=55452763b8679d049b07f8cfd5abd486>
ƒ Figure 13: <http://jakst.files.wordpress.com/2009/06/e‐coli1.jpg>
ƒ Figure14:<http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/0/0a/Bacterial_Conjuga
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