Article 

Low‐Molecular‐Weight Heparins (LMWH) and Synthetic Factor 
X Inhibitors Can Impair the Osseointegration Process   
of a Titanium Implant in an Interventional Animal Study 
Dragos Apostu 1, Bianca Berechet 2, Daniel Oltean‐Dan 1, Alexandru Mester 3, Bobe Petrushev 2, Catalin Popa 4, 
Madalina Luciana Gherman 5, Adrian Bogdan Tigu 6, Ciprian Ionut Tomuleasa 7,8,9,*, Lucian Barbu‐Tudoran 10,   
Horea Rares Ciprian Benea 1 and Doina Piciu 11 

1  Department of Orthopedics, Traumatology and Pediatric Orthopaedics, University of Medicine and Pharmacy 
Cluj‐Napoca, 400347 Cluj‐Napoca, Romania 
2  Department of Gastroenterology, “Octavian Fodor” Institute of Gastroenterology and Hepatology,   

400347 Cluj‐Napoca, Romania 
3  Department of Oral Health, University of Medicine and Pharmacy Cluj‐Napoca,   

400012 Cluj‐Napoca, Romania 
4  Department of Materials Science and Engineering, Technical University of Cluj‐Napoca,   

400114 Cluj‐Napoca, Romania 
Citation: Apostu, D.; Berechet, B.;  5  Experimental Center, University of Medicine and Pharmacy Cluj‐Napoca, 400012 Cluj‐Napoca, Romania 

Oltean‐Dan, D.; Mester, A.;  6  Research Center for Advanced Medicine—MedFuture, Department of Translational Medicine,   

Petrushev, B.; Popa, C.;    University of Medicine and Pharmacy Cluj‐Napoca, 400347 Cluj‐Napoca, Romania 
7  Department of Hematology, University of Medicine and Pharmacy Cluj‐Napoca,   
Gherman, M.L.; Tigu, A.B.;   
Tomuleasa, C.I.; Barbu‐Tudoran, L.;  400012 Cluj‐Napoca, Romania 
8  Department of Hematology, Ion Chiricuta Clinical Cancer Center, 400015 Cluj‐Napoca, Romania 
et al. Low‐Molecular‐Weight   
9  Medfuture Research Center for Advanced Medicine, University of Medicine and Pharmacy Cluj‐Napoca, 
Heparins (LMWH) and Synthetic 
400012 Cluj‐Napoca, Romania 
Factor X Inhibitors Can Impair the  10  Electron Microscopy Center, Faculty of Biology and Geology, Babes‐Bolyai University,   
Osseointegration Process of   
400006 Cluj‐Napoca, Romania 
a Titanium Implant in an    11  Nuclear Medicine Department, University of Medicine and Pharmacy Cluj‐Napoca,   

Interventional Animal Study.    400012 Cluj‐Napoca, Romania 
Medicina 2022, 58, 1590. https://  *  Correspondence: ciprian.tomuleasa@gmail.com 
doi.org/10.3390/medicina58111590 
Abstract: Background and objectives: Cementless total hip arthroplasty is a common surgical procedure 
Academic Editors: Woo Jong Kim 
and Gavriel Chaushu 
and perioperative thromboprophylaxis is used to prevent deep vein thrombosis or pulmonary embo‐
lism. Osseointegration is important for long‐term implant survival, and there is no research on the 
Received: 4 October 2022 
effect of different thromboprophylaxis agents on the process of osseointegration. Materials and Meth‐
Accepted: 31 October 2022 
ods: Seventy rats were allocated as follows: Group I (control group), Group II (enoxaparin), Group III 
Published: 3 November 2022 
(nadroparin), and Group IV (fondaparinux). Ovariectomy was performed on all subjects, followed by 
Publisher’s  Note:  MDPI  stays  neu‐ the introduction of an intramedullary titanium implant into the femur. Thromboprophylaxis was ad‐
tral  with  regard  to  jurisdictional  ministered accordingly to each treatment group for 35 days postoperatively. Results: Group I had sta‐
claims in published maps and institu‐ tistically significantly lower anti‐Xa levels compared to treatment groups. Micro‐CT analysis showed 
tional affiliations. 
that nadroparin had lower values compared to control in bone volume (0.12 vs. 0.21, p = 0.01) and 
percent bone volume (1.46 vs. 1.93, p = 0.047). The pull‐out test showed statistically significant differ‐
  ences  between  the  control  group  (8.81  N)  compared  to  enoxaparin,  nadroparin,  and  fondaparinux 
groups (4.53 N, 4 N and 4.07 N, respectively). Nadroparin had a lower histological cortical bone tissue 
Copyright: © 2022 by the authors. 
and a higher width of fibrous tissue (27.49 μm and 86.9 μm) at the peri‐implant area, compared to 
Licensee MDPI, Basel, Switzerland. 
This article is an open access article 
control (43.2 μm and 39.2 μm), enoxaparin (39.6 μm and 24 μm), and fondaparinux (36.2 μm and 32.7 
distributed under the terms and con‐ μm). Conclusions: Short‐term administration of enoxaparin, nadroparin, and fondaparinux can reduce 
ditions of the Creative Commons At‐ the osseointegration of titanium implants, with nadroparin having the most negative effect. These re‐
tribution (CC BY) license (https://cre‐ sults show that enoxaparin and fondaparinux are preferred to be administered due to a lesser negative 
ativecommons.org/licenses/by/4.0/).  impact on the initial implant fixation. 
   

 
Medicina 2022, 58, 1590. https://doi.org/10.3390/medicina58111590  www.mdpi.com/journal/medicina 
Medicina 2022, 58, 1590  2  of  15 
 

Keywords:  aseptic  loosening;  cementless  hip  arthroplasty;  enoxaparin;  fondaparinux;  implant   

osseointegration; nadroparin 
 

1. Introduction 
Total hip replacement is a common procedure performed worldwide to treat hip os‐
teoarthritis.  This  pathology  affects  10  to  13%  of  people  over  60  years  old  [1].  Total  hip 
replacement implants are made from titanium alloys. The most frequently used titanium 
alloy in total hip replacements is Ti90Al6V4, consisting of titanium, aluminium and vana‐
dium. Although offering good results overall, complications of total hip replacement exist. 
The most frequent late complication of this type of this surgical procedure is a deficient 
implant fixation, called aseptic loosening, which leads to increased pain and disability [2]. 
Patients affected by this complication cannot weight‐bear on the affected limb, thus lead‐
ing to an important functional deficit. When aseptic loosening is present, revision surgery 
is required, which is expensive for the healthcare system [3]. Moreover, it is technically 
demanding, requires an experienced team, and is usually performed in tertiary‐care hos‐
pitals. Additionally, the revision of the total hip replacement often results in a lower pa‐
tient satisfaction rate than the primary hip replacement [4]. 
Aseptic loosening can be prevented with a more enhanced osseointegration process, 
represented by bone apposition at the titanium surface of the total hip arthroplasty im‐
plant [5,6]. This complex process is dependent on the processes of bone formation, per‐
formed by osteoblasts, and bone resorption, performed by osteoclasts. The process of os‐
seointegration is regulated by many cellular pathways which modulate the activity of os‐
teoblasts and osteoclasts [6]. Osteoblasts arise from mesenchymal stem cells (MSC) under 
the influence of cytokines, such as tumour necrosis factor (TNF) alpha, interleukin (IL) 1, 
IL‐6 and IL‐11. On the other hand, osteoclastogenesis is positively modulated by macro‐
phage colony‐stimulating factor (M‐CSF) and transforming growth factor beta (TGF‐β1). 
The more active the osteoblasts are compared to osteoclasts, the stronger the implant fix‐
ation will be and the lower the risk of aseptic loosening. The process of osseointegration 
is similar in the case of titanium intramedullary implants and titanium dental implants 
[7–9]. Our study group has proven that osseointegration can be influenced by many fac‐
tors, including systemic drugs [10]. 
Low‐molecular‐weight heparins (LMWH) and synthetic factor X inhibitors are rou‐
tinely administered postoperatively to prevent deep vein thrombosis (DVT) and pulmo‐
nary embolism. Among the most commonly used drugs to prevent DVT postoperatively 
following total hip replacement are enoxaparin, nadroparin, and fondaparinux.   
Previous studies by Kock et al. and Osip et al. showed that LMWHs could inhibit 
osteoblastogenesis during in vitro experimental studies [11–14]. These studies were the 
first to prove that low‐molecular‐weight heparins have an impact on bone metabolism. 
One explanation is that LMWHs can alter the function of the cytokines involved in osteo‐
blastogenesis and osteoclastogenesis [15]. As a result, the whole osseointegration process 
can  be  affected  [15].  Numerous  in  vivo  studies  were  performed  to  study  the  effects  of 
LMWHs on bone biology. Enoxaparin, dalteparin, nadroparin and tinzaparin were shown 
to increase osteoclastogenesis and bone resorption by modulating M‐CSF and TGF‐ β1, 
[16–22]. Additionally, researchers studied the effects of LMWHs on bone metabolism in 
the case of fracture healing. A study performed by Strett et al. showed that enoxaparin 
attenuated the bone repair process compared to the control group [23]. The result is con‐
firmed by a more recent study by Li et al., which concluded that enoxaparin suppresses 
osteoblastogenesis [24]. On the other hand, other studies showed that LMWHs did not 
impair the fracture process [25,26].   
Although previous studies showed that LMWHs have an impact on bone biology, 
the  overall  effect  is  still  controversial.  Moreover,  we  did  not  find  any  study  to  test  the 
effects of LMWHs on the process of osseointegration of the titanium implant. We consider 

 
Medicina 2022, 58, 1590  3  of  15 
 

that in vivo studies are essential to test the osseointegration process of titanium implants 
because there is an implication of osteoclasts, osteoblasts and the titanium surface, which 
are impossible to replicate in the case of in vitro studies. We also consider it essential to 
know whether thromboprophylaxis agents can impair the titanium implant osseointegra‐
tion. Clinical trials are challenging to be performed due to a lack of specific examinations 
for the osseointegration process in the clinical setting, which are available in an animal 
model. Moreover, the long follow‐up to study the rate of aseptic loosening makes clinical 
trials more difficult to perform. 
This  study  aims  to  test,  for  the  first  time  in  the  literature,  the  impact  of  thrombo‐
prophylaxis agents on the process of osseointegration in vivo. For this study, we tested 
three of the most commonly used drugs in DVT prophylaxis: enoxaparin, nadroparin, and 
fondaparinux, in terms of early implant fixation in vivo.   

2. Materials and Methods 
2.1. Animal Model 
The study received approval from the Ethical Commission of the local university (no. 
210/02/04/2020). The experiments were performed at the Center of Experimental Medicine 
Cluj‐Napoca and according to the European guidelines (directive 2010/63/EU). A total of 
70 female albino Wistar rats of 8–10 weeks old and with a weight of 190 ± 30 mg were 
used. The animals were raised at the same animal facility without any genetic modifica‐
tion, while food and water were provided ad libitum. A veterinary doctor checked all of 
the subjects to be enrolled in the study to be clinically healthy. The subjects were random‐
ized into four groups: Group I (OVX group, n = 22), Group II (OVX + enoxaparin, n = 16), 
Group III (OVX + nadroparin, n = 16), and Group IV (OVX + fondaparinux, n = 16).   

2.2. Ovariectomy (OVX) Procedure 
The procedures were performed on all subjects at the time of enrolment, and each 
subject’s weight was determined preoperatively. General anaesthesia was induced with a 
mixture of 80–100 mg/kg of ketamine and 10–12.5 mg/kg of xylazine injected intraperito‐
neally. Skin preparation using betadine and sterile draping was performed. Following an 
abdominal midline incision, the ovaries were identified and excised with electrocautery 
(Figures 1a and 2). The abdominal wall was sutured, and a local antibiotic was applied. 
Postoperatively, analgesics were provided in the drinking water. 

(a)  (b)  (c) 

 
Figure 1. Intraoperative images: (a) Ovariectomy procedure; (b) Opening of the femoral canal; (c) 
Implantation of the titanium intramedullary nail. 

 
Medicina 2022, 58, 1590  4  of  15 
 

 
Figure 2. Project’s timeline: group allocation, ovariectomy procedures, intramedullary nailing, treat‐
ment administration, blood sample collection, euthanasia, and femoral specimen preparation. 

2.3. Intramedullary Nail 
Three months after the ovariectomy procedure, bilateral femoral intramedullary nail‐
ing was performed in all subjects under general anaesthesia. Both legs were prepared, and 
sterile draping was performed. The femoral condyles were palpated, and using a sterile 
18‐gauge  needle,  and  the  femoral  canal  was  opened  percutaneously  at  the  level  of  the 
femoral notch (Figures 1b and 2). Then, Ti90Al6V4 alloy nails (Goodfellow Cambridge Ltd., 
Huntingdon, UK) with a diameter of 1 mm and 20 mm in length were introduced into the 
femur (Figure 1c). There was no need for a suture since the technique was entirely percu‐
taneous. A local antibiotic was applied to the insertion site. Postoperatively, analgesics 
were provided in the drinking water. 

2.4. Treatment 
Starting on day one postoperatively, the subjects were weighted daily, and treatment 
was administered subcutaneously according to each group (Figure 2). Group I received 
saline subcutaneously daily for 35 days. Group II received enoxaparin 1 mg/kg subcuta‐
neously daily for 35 days. Group III received receive nadroparin 10 mg/kg subcutaneously 
daily for 35 days and group IV received receive fondaparinux 0.1 mg/kg subcutaneously 
daily for 35 days.   

2.5. Collection of Samples 
Three months after the intramedullary nailing, blood samples were harvested. Under 
general anaesthesia, the subjects were euthanised. We looked for uterus atrophy and the 
absence  of  ovaries.  Moreover,  the  bilateral  femoral  bones  were  collected  and  placed  in 
10% formaldehyde. The femurs underwent histological, micro‐CT, and mechanical pull‐
out test examinations. 

2.6. Serum Analysis 
Using the ELISA method, we tested the rat coagulation factor Xa (NovusBiologicals®, 
Cambridge, UK). The calibration was performed using the following concentrations: 40 
ng/mL, 20 ng/mL, 10 ng/mL, 5 ng/mL, 2.5 ng/mL, 1.25 ng/mL and 0.63 ng/mL. The samples 
were diluted five times. We used the TECAN Spark 10M (TECAN, Grödig, Austria) mi‐
croplate reader. 

2.7. Micro‐CT Examination 
Bruker Skyscan 1172® (Billerica, MA, USA) with a 50 mm image field width and 11 
Mp X‐ray camera was used at a resolution of 2000 × 2000 px for the micro‐CT scanning. 
We analysed a region of interest of a round shape, and a diameter of 120 mm centred on 
the implant. The length of the area of interest was 600 slices (8.1 mm) starting from the 
distal metaphysis proximally. The Bruker CTAn® v.1.18. software was used to calculate 
bone volume (BV), percent bone volume (BV%), bone surface (BS), bone surface/volume 
ratio (BS/VR), tissue surface (TS), mean total cross‐sectional bone area, trabecular number 
(TN),  cross‐sectional  thickness,  and  trabecular  diameter  (TD).  The  measurements  were 
performed while the examinator was unaware of group allocation.   

 
Medicina 2022, 58, 1590  5  of  15 
 

2.8. Mechanical Pull‐Out Test 
An osteotomy of the femoral diaphysis in the proximal one third was sequentially 
performed until 5 mm of the intramedullary nail was exposed. The nail was tightened in 
a pneumatic grip, and the Zwick/Roell Z005® (Ulm, Germany) tensile testing device with 
a maximum test load of 5 kN was used to measure the force needed for nail extraction. 
The forces were measured in newtons at a low speed of 1 mm/min. The measurements 
were performed while the examinator was unaware of group allocation. 

2.9. Histological Examination 
Following the mechanical pull‐out test, the femoral bones were decalcified and sec‐
tioned  longitudinally  along  the  implant  site.  Hematoxylin–eosin  and  Tricom  Masson 
stainings were performed and analysed with a Leica DM750® (Wetzlar, Germany) micro‐
scope. We used ImageJ® software for the morphometric measurements. The thickness of 
the cortical bone at the peri‐implant site was measured at five different points at about 20‐
0 μm apart. The same method was applied to measure the fibrous tissue at the peri‐im‐
plant site. Two independent measurements were performed by different examinators who 
did not know the allocation within the groups, and the average was noted. 

2.10. SEM/EDX Analysis 
We tested a total of 12 samples equally divided into groups. The samples were fixed 
in  glutaraldehyde  (2.7%  in  PBS),  dehydrated  in  alcohol,  and  infused  with  hexamethyl‐
disilane.  After  sputter‐coating  with  7  nm  of  gold in an  Agar  Automatic Sputter‐Coater 
B7341 (Essex, UK), samples were examined in a Hitachi SU8230 HRCFEG SEM (Tokyo, 
Japan). 

2.11. Statistical Analysis 
The  sample  size  was  calculated  during  the  study  design  using  the  StatMate®  soft‐
ware. For the sample size calculation, we used the results obtained from previous studies 
on titanium implant osseointegration following systemic administration [27,28]. The type 
I/II error rates we used during calculations were alpha values of 0.05 and power of the 
study of 80%. Moreover, we assumed a 20% mortality rate due to the two surgical inter‐
ventions  and  general  anaesthesia.  The  statistical  analysis  was  performed  using  the 
GraphPad Prism 6.0® software, and we calculated means, standard deviations, frequen‐
cies, percentages, and correlation tests. The distribution was calculated using the Shapiro–
Wilk test. The results were considered statistically significant if the p‐value was less than 
0.05.   

3. Results 
Of  the  seventy  subjects  included  in  the  study,  nine  died  throughout  the  process: 
seven died due to anaesthesia, and two died from infection. Five of the subjects belonged 
to Group I, one subject belonged to Group II, and three subjects belonged to Group IV.   

3.1. Weight 
All of the subjects were weighed during the study. The average weight before the 
ovariectomy procedure was 216 ± 22 g. The mean weight according to each group are as 
follows: 209.4 ± 17.5 g (Group I), 221.5 ± 23 g (Group II), 216 ± 25 g (Group III), and 222 ± 
21 g (Group IV). Group I had a statistically significant lower weight compared to Groups 
II, III and IV (p < 0.05). 
At the end of the study, the mean weight according to each group were as follows: 
215 ± 16.5 g (Group I), 230 ± 20 g (Group II), 225 ± 27 g (Group III), and 229 ± 21 g (Group 
IV). Additionally, Group I had a statistically significantly lower weight than Groups II, III 
and IV (p < 0.05). Nevertheless, all of the subjects increased in weight during the study. 

 
Medicina 2022, 58, 1590  6  of  15 
 

3.2. Serum Analysis 
The rat coagulation factor Xa was calculated in all of the subjects at the end of the 
study (n = 61), as follows: 17 subjects in Group I, 15 subjects in Group II, 16 subjects in 
Group III and 13 subjects in Group IV. The results are available in Figure 3. Group I had 
statistically significantly lower levels than Groups II, III and IV (p < 0.001). There were no 
statistically significant differences between Groups II, III and IV.   

 
Figure  3.  Rat  coagulation  factor  Xa  levels  at  the  end  of  the  study  in  Group  I  (control),  Group  II 
(enoxaparin), Group III (nadroparin) and Group IV (fondaparinux). 

3.3. Micro‐CT Examination 
A total of 12 samples were analysed, equally divided within the groups. The results 
of the calculate bone volume (BV), percent bone volume (BV%), bone surface (BS), bone 
surface/volume ration (BS/VR), tissue surface (TS), mean total cross‐sectional bone area, 
trabecular number (TN), cross‐sectional thickness and trabecular diameter (TD) are avail‐
able in Table 1. The only statistically significant differences observed were between Group 
I and Group III in terms of bone volume (p = 0.001) and percent bone volume (p = 0.047). 
Images obtained during micro‐CT examinations are available in Figure 4. 

Table 1. Results of micro‐CT examination expressed in mean (± standard deviation). 
Group I (Control)  Group II (Enoxaparin)  Group III (Nadroparin)  Group IV (Fondaparinux) 
Parameter 
n = 3  n = 3  n = 3  n = 3 
Bone volume (BV)  0.21 (±0.02) b  0.20 (±0.04)  0.12 (±0.06) a  0.22 (±0.03) 
Percent bone volume (BV%)  1.93 (±0.15) b  1.72 (±0.5)  1.46 (±0.2) a  1.75 (±0.4) 
Bone surface (BS)  39.46 (±6.5)  38.54 (±7.5)  32.23 (±9.2)  40.21 (±4.8) 
Tissue surface (TS)  43.21 (±2.4)  45.32 (±4.2)  56.56 (±7.1)  43.32 (±5.3)   
Bone surface/volume ratio (BS/VR)  207.68  226.7  230.21  236.52 
Mean total cross‐sectional bone area  0.038 (±0.02)  0.034 (±0.025)  0.029 (±0.05)  0.036 (±0.045) 
Cross‐sectional thickness  0.013 (±0.002)  0.014 (±0.004)  0.010 (±0.004)  0.016 (±0.002) 
Trabecular diameter  0.020 (±0.003)  0.023 (±0.0025)  0.016 (±0.005)  0.021 (±0.002) 
Trabecular number  8.82 (±0.53)  9.2 (±0.63)  7.52 (±0.78)  8.26 (±0.32) 
Note: a Statistically significant compared to Group I; b Statistically significant compared to Group 
IV. 

 
Medicina 2022, 58, 1590  7  of  15 
 

 
Figure 4. Images obtained following micro‐CT examinations: (a) cross‐sectional view of the intrame‐
dullary nail at the distal epiphysis; (b) cross‐sectional view of the intramedullary nail at the middle 
of the femoral diaphysis; (c) longitudinal view of the intramedullary nail; (d) longitudinal view of 
the intramedullary nail with automatic detection of the metal implant by the software. 

3.4. Mechanical Pull‐Out Test 
The mechanical pull‐out test was performed in all of the subjects (n = 61). The average 
values of the maximum force needed to extract the intramedullary nail are available in 
Figure 5. The control group had the highest average force needed for intramedullary nail 
extraction,  followed  by  enoxaparin.  There  were  statistically  significant  differences  be‐
tween Group I and Group III (p = 0.01), Group I and Group IV (p = 0.03), as well as between 
Group I and Group II (p = 0.04). There were no statistically significant differences between 
the treatment groups. 

 
Medicina 2022, 58, 1590  8  of  15 
 

 
Figure 5. Mechanical pull‐put test in Group I (control), Group II (enoxaparin), Group III (nadro‐
parin) and Group IV (fondaparinux). 

3.5. Histological Analysis 
Histological analysis was performed on all of the subjects within the study (n = 60), 
except for one subject in Group IV whom we excluded after SEM/EDX analysis due to 
higher concentrations of calcium and phosphorus on the implant after its removal. Images 
from the measurements of the fibrous tissue and bone tissue are seen in Figures 6 and 7.   

 
Figure 6. Histological measurements of cortical bone tissue and fibrous tissue in the peri‐implant 
site within Group I (control). 

 
Medicina 2022, 58, 1590  9  of  15 
 

 
Figure 7. Histological measurements of cortical bone tissue and fibrous tissue in the peri‐implant 
site within Group III (nadroparin). 

In terms of cortical bone surrounding the implant site, the nadroparin group had the 
lowest width (see Figure 8). The only statistically significant result was obtained between 
Group I and Group III (p = 0.0002).   

 
Figure 8. The average width of the cortical bone tissue at the peri‐implant region. 

Regarding  fibrous  tissue  surrounding  the  implant,  the  nadroparin  group  had  the 
highest values (see Figure 9). The only statistically significant results were between Group 
II and Group III (p = 0.02) and between Group III and Group IV (p = 0.04). 

 
Medicina 2022, 58, 1590  10  of  15 
 

 
Figure 9. The average width of the fibrous tissue at the peri‐implant region. 

3.6. SEM/EDX Analysis 
The  SEM/EDX  analysis  was  performed  on  a  number  of  three  titanium  implants 
within each group, resulting in a total of twelve implants. Except for one case, the maxi‐
mum Wt% of both calcium and phosphorus was 1.3%. There were no statistically signifi‐
cant differences between groups in terms of calcium and phosphorus concentrations.   
Moreover, the EDX analysis of the titanium, aluminium, and vanadium showed an 
average concentration of 88.6%, 7.3%, and 3.8%, respectively. The images obtained from 
the SEM/EDX analysis are available in Figure 10. 

(a) 

 
Medicina 2022, 58, 1590  11  of  15 
 

(b) 

(c) 
 
Figure 10. (a,b) Scanning electron microscopy image at different image magnification; (c) EDX anal‐
ysis diagram. 

There was one case belonging to Group IV (Figure 11), where the Wt% of calcium 
was 52.9% and 25.4% in the case of phosphorus.   

 
Figure 11. Scanning electron microscopy image of one case with an increased concentration on both 
calcium and phosphorus. 

 
Medicina 2022, 58, 1590  12  of  15 
 

4. Discussion 
To  our  knowledge,  this  is  the  first  in  vivo  study  to  test  and  compare  the  effect  of 
enoxaparin, nadroparin, and fondaparinux on the process of titanium implant osseointe‐
gration.   
The  rat  animal  model  was  used  due  to  the  high  resemblance  of  bone  metabolism 
compared to humans. They also represent the most commonly used animal model for the 
study of osseointegration. In clinical practice, patients requiring total hip arthroplasty are 
frequently osteoporotic and have a deficient bone metabolism [29]. Therefore, we decided 
to  perform  an  ovariectomy  to  induce  osteoporosis  in  our  animal  model.  Additionally, 
when  an  osteoporotic  animal  model  is  used,  there  is  a  higher  impact  on  the  treatment 
involved, meaning a lower number of subjects is needed to obtain statistically significant 
results  [30].  In  the  literature,  osteoporosis  is  generally  accepted  to  be  obtained  at  three 
months; therefore, we performed the intramedullary implantation of the nails at 12 weeks. 
For this study, we used Ti90Al6V4 alloy nails which resemble the alloy of cementless total 
hip arthroplasties. Moreover, throughout the study, we had no deaths due to pulmonary 
embolism  because  the  surgical  intervention  was  minimally  invasive  and  the  subjects 
could completely weight bear after the surgery.   
 The treatment was administered for 35 days after titanium nail implantation, which 
is the current protocol in our country. The doses were obtained from different studies in 
which deep vein thrombosis prophylaxis was performed in rat animal models using the 
three types of treatment [31–33]. In order to test the efficiency of the treatment administra‐
tion, rat coagulation factor Xa was determined. Additionally, we performed the SEM/EDX 
analysis  of  the  extracted  implants  to  identify  any  bone  tissue  extracted  along  with  the 
implant. 
The anti‐Xa levels were statistically significantly increased in the treatment groups 
compared to the control group, showing a good treatment administration. Nevertheless, 
we  do  not  have  an  established  therapeutic  range  in  the  animal  model.  As  a  result,  the 
serum analysis does not provide information about the dosing.   
The micro‐CT analysis showed that nadroparin statistically significantly has a lower 
bone volume around the implant compared to the control group. Moreover, there were 
no statistically significant differences between the treatment groups. These results show 
the effect of these drugs in the osseointegration process of titanium implants. Moreover, 
despite other differences observed, the sample size in the case of micro‐CT examinations 
was insufficient to provide other statistically significant results. 
The pull‐out test is an essential tool to assess the strength of the osteointegration pro‐
cess because it tests both the quantity and the quality of the implant fixation. During the 
pull‐out test, all treatment groups showed a significantly lower force needed for implant 
extraction compared to the control group. This result shows a stronger implant fixation in 
the absence of treatment.   
The histological analysis found a significantly lower cortical bone mass around the 
implant site in the case of nadroparin compared to the control group. Despite enoxaparin 
and fondaparinux also showing an overall lower cortical bone mass compared to the con‐
trol, as well, the results were not statistically significant. Nevertheless, the biggest differ‐
ence was when comparing the fibrous tissue around the implant site, which was signifi‐
cantly higher in the nadroparin group than in all other groups. The histological results 
show that nadroparin significantly reduces implant fixation than in all other groups.   
We also performed the SEM/EDX analysis to determine whether bone tissue was still 
present on the implant surface after its extraction from the femoral bone during the pull‐
out test. The EDX analysis only showed small concentrations of calcium and phosphorus 
in all of the implants, except in one case, where there was a high concentration of calcium 
and phosphorus and was later excluded from the histological examination. These results 
show that most implants did not contain relevant concentrations of calcium or phospho‐
rus following implant removal. 

 
Medicina 2022, 58, 1590  13  of  15 
 

We have found no similar studies to compare our study’s results. Nevertheless, other 
studies on bone metabolism showed that enoxaparin and nadroparin increase osteoclas‐
togenesis, thus leading to an increased bone resorption process [16–22]. These results are 
according to our study, where the osseointegration process is impaired by enoxaparin and 
nadroparin.  Other  studies  on  fracture  healing  have  shown  that  enoxaparin  can  impair 
bone growth compared to control, a result related to our study due to a deficient bone 
metabolism [23]. 
Bruker  Skyscan 1172  micro‐CT  is  a  microfocus  X‐ray  microtomography  optimized 
for small samples offering good precision for osseointegration examination. The error and 
tolerance are insignificant since a standard method of determining the region of interest 
was used in all samples. The Zwick/Roell Z005® testing machine has a machine compli‐
ance correction, offering real‐time modifications for the highest possible level of precision. 
The study also has some limitations. The main limitation of our study is the inability 
to perform the histological analysis with the implant in situ. This could provide a better 
assessment of the histological bone–implant contact. During the implant removal, even 
though it is performed at low speeds, a quantity of bone and fibrous tissue could still be 
attached to the implant and therefore provide deficient information when the bone spec‐
imens are analysed. In order to test this hypothesis, we performed an SEM/EDX analysis 
which showed that only a small quantity of calcium and phosphorus had been removed 
along with the implants, with only one exception, which was later excluded. This result 
provides sufficient information to state that the implant removal during the pull‐out test 
at low speed does not affect the histological analysis of the implant site.   
Another limitation is the lack of a known therapeutic range for the anti‐Xa coagula‐
tion  factor  level  for  us  to  know  whether  or  not  the  dosing  was  correct.  This  limitation 
could influence the study’s results due to potentially different concentrations of drugs. 
Additionally, a limitation of our study is the relatively low number of subjects for micro‐
CT analysis and SEM/EDX analysis. 
Our study has shown, for the first time in the literature, that some low‐molecular‐
weight heparins (LMWH) and synthetic factor X inhibitors can affect the process of osse‐
ointegration in vivo. An impaired osseointegration process can lead to aseptic loosening 
of cementless total hip arthroplasties. Our study’s results are significant, especially due to 
the long‐term follow‐up needed to determine the association between aseptic loosening 
and the type of thromboprophylaxis drug in a clinical setting. We found no clinical studies 
to determine this association and we recommend further studies be performed in this di‐
rection, since our study has proven the implication of thromboprophylaxis agents on the 
process of osseointegration. 

5. Conclusions 
Short‐term administration of enoxaparin, nadroparin, and fondaparinux can reduce 
the osseointegration of titanium implants, while nadroparin resulted in the highest quan‐
tity of fibrous tissue and the lowest quantity of cortical bone tissue surrounding the im‐
plant site. Further clinical research is needed to test the influence of thromboprophylaxis 
agents on the process of osseointegration. 

Author Contributions: Conceptualization, D.A. and D.P.; methodology, D.A., B.B., D.O.‐D., A.M. 
and M.L.G.; formal analysis, D.A., B.B., D.O.‐D., A.M., M.L.G. and H.R.C.B.; investigation, A.B.T., 
B.P., C.P., L.B.‐T. and H.R.C.B.; resources, D.A., D.P. and C.I.T.; data curation, D.A.; writing—orig‐
inal  draft  preparation,  D.A.;  writing—review  and  editing,  D.P.  and  C.I.T.;  supervision,  D.P.  and 
C.I.T.; project administration, D.A.; funding acquisition, D.A., D.P. and C.I.T. All authors have read 
and agreed to the published version of the manuscript. 
Funding: This work was supported by a grant from the Romanian Ministry of Education and Re‐
search, CNCS‐UEFISCDI, project number PN‐III‐P1‐1.1‐PD‐2019‐0124, within PNCDI III. The work 
was funded by an international grant awarded by the Novo Nordisk Haemophilia Foundation to 
the Romanian Hematology Society—Romania 4. 

 
Medicina 2022, 58, 1590  14  of  15 
 

Institutional Review Board Statement: The study received approval from the Ethical Commission 
of the local university (no. 210/02/04/2020). The experiments were performed at the Center of Exper‐
imental Medicine Cluj‐Napoca and according to the European guidelines (directive 2010/63/EU). 
Conflicts of Interest: The authors declare no conflict of interest. 

Abbreviations 
BS  Bone surface 
BS/VR  Bone surface/volume ratio 
BV  Bone volume 
BV%  Percent bone volume 
DVT  Deep vein thrombosis 
EDX  Energy‐dispersive X‐ray spectroscopy 
IL  Interleukin 
LMWH Low‐molecular‐weight heparins 
MSC  Mesenchymal stem cell 
M‐CSF  Macrophage colony‐stimulating factor 
OVX  Ovariectomy 
SEM  Scanning electron microscope 
TD  Trabecular diameter 
TGF‐β1 Transforming growth factor beta 1 
TN  Trabecular number 
TNF  Tumour necrosis factor 
TS  Tissue surface 

References 
1. Zhang, Y.; Jordan, J.M. Epidemiology of Osteoarthritis. Clin. Geriatr. Med. 2010, 26, 355–369. 
2. Kochbati, R.; Rbai, H.; Jlailia, M.; Makhlouf, H.; Bouguira, A.; Daghfous, M.S. Predictive factors of aseptic loosening of cemented 
total hip prostheses. Pan. Afr. Med. J. 2016, 24, 260. 
3. Vanhegan, I.S.; Malik, A.K.; Jayakumar, P.; Islam, S.; Haddad, F.S. A financial analysis of revision hip arthroplasty: The eco‐
nomic burden in relation to the national tariff. J. Bone Jt. Surg. Br. 2012, 94, 619–623. 
4. Adelani, M.A.; Crook, K.; Barrack, R.L.; Maloney, W.J.; Clohisy, J.C. What is the Prognosis of Revision Total Hip Arthroplasty 
in Patients 55 Years and Younger? Clin. Orthop. Relat. Res. 2014, 472, 1518–1525. 
5. Coelho, P.G.; Jimbo, R. Osseointegration of metallic devices: Current trends based on implant hardware design. Arch. Biochem. 
Biophys. 2014, 561, 99–108. 
6. Apostu, D.; Lucaciu, O.; Lucaciu, G.D.; Crisan, B.; Crisan, L.; Baciut, M.; Onisor, F.; Baciut, G.; Campian, R.S.; Bran, S. Systemic 
drugs that influence titanium implant osseointegration. Drug Metab. Rev. 2017, 49, 92–104. 
7. Minervini, G.; Del Mondo, D.; Russo, D.; Cervino, G.; D’Amico, C.; Fiorillo, L. Stem Cells in Temporomandibular Joint Engi‐
neering: State of Art and Future Persectives. J. Craniofacial Surg. 2022, 33, 2181–2187. 
8. Minervini, G.; Romano, A.; Petruzzi, M.; Maio, C.; Serpico, R.; Lucchese, A.; Candotto, V.; Di Stasio, D. Telescopic overdenture 
on natural teeth: Prosthetic rehabilitation on (OFD) syndromic patient and a review on available literature. J. Biol. Regul. Home‐
ost. Agents 2018, 32 (Suppl. 1), 131–134. 
9. Minervini, G.; Fiorillo, L.; Russo, D.; Lanza, A.; D’Amico, C.; Cervino, G.; Meto, A.; Di Francesco, F. Prosthodontic Treatment 
in Patients with Temporomandibular Disorders and Orofacial Pain and/or Bruxism: A Review of the Literature. Prosthesis 2022, 
4, 253–262. 
10. Apostu, D.; Lucaciu, O.; Mester, A.; Oltean‐Dan, D.; Gheban, D.; Benea, H.R.C.; Tibolone, alendronate, and simvastatin enhance 
implant osseointegration in a preclinical in vivo model. Clin. Oral Implant. Res. 2020, 31, 655–668. 
11. Kock, H.J.; Handschin, A.E. Osteoblast Growth Inhibition by Unfractioned Heparin and by Low molecular Weight Heparins: 
An In‐Vitro Investigation. Clin. Appl. Thromb. Hemost. 2002, 8, 251–255. 
12. Osip, S.L.; Butcher, M.; Young, E.; Yang, L.; Shaughnessy, S.G. Differential effects of heparin and low molecular weight heparin 
on osteoblastogenesis and adipogenesis in vitro. Thromb. Haemost. 2004, 92, 803–810. 
13. Bhandari, M.; Hirsh, J.; Weitz, J.I.; Young, E.; Venner, T.J.; Shaughnessy, S.G. The effects of standard and low molecular weight 
heparin on bone nodule formation in vitro. Thromb. Haemost. 1998, 80, 413–417. 
14. Mavrogenis, A.F.; Dimitriou, R.; Parvizi, J.; Babis, G.C. Biology of implant osseointegration. J. Musculoskelet. Neuronal Interact. 
2009, 9, 61–71. 
15. Kapetanakis, S.; Nastoulis, E.; Demesticha, T.; Demetriou, T. The Effect of Low Molecular Weight Heparins on Fracture Healing. 
Open Orthop. J. 2015, 9, 226–236. 

 
Medicina 2022, 58, 1590  15  of  15 
 

16. Sudrova, M.; Kvasnicka, J.; Kudrnova, Z.; Zenahlikova, Z.; Mazoch, J. Influence of long‐term thromboprophylaxis with low 
molecular weight heparin (enoxaparin) on changes of bone metabolism markers in pregnant women. Clin. Appl. Thromb. 2011, 
17, 508–513. 
17. Sarahrudi, K.; Kaizer, G.; Thomas, A. The influence of low molecular weight heparin on the expression of osteogenic growth 
factors in human fracture healing. Int. Orthop. 2011, 36, 1095–1098. 
18. Folwarczna, J.; Janiec, W.; Gavor, M. Effects of enoxaparin on bone histomorphometric parameters in rats. Pol. J. Pharm. 2004, 
56, 451–457. 
19. Wawrzynska, L.; Tomkowski, W.Z.; Przedlacki, J.; Hajduk, B.; Torbicki, A. Changes in bone density during long term admin‐
istration of low molecular weights heparins or acenocoumarol for secondary prophylaxis of venous thromboembolism. Patho‐
physiol. Haemost. Thromb. 2003, 33, 64–67. 
20. Matziolis, G.; Perka, C.; Disch, A.; Zippel, H. Effects of fondaparinus compared with dalteparin, enoxaparin and unfractionated 
heparin on human osteoblasts. Calcif. Tissue Int. 2003, 73, 370–379. 
21. Folwarczna, J.; Sliwinski, L.; Janiec, W.; Pikul, M. Effects of standard heparin and low molecular weight heparins on the for‐
mation of murine osteoclasts in vitro. Pharm. Rep 2005, 57, 635–645. 
22. Handschin, A.E.; Trenz, O.A.; Hoerstrup, S.; Kock, H.J.; Wanner, G.A.; Trentz, O. Effect of low molecular weight heparin (dalte‐
parin) and fondaparinux (arixtra) on human osteoblasts in vitro. Br. J. Surg. 2005, 92, 177–183. 
23. Street, J.T.; Mc Grath, M.; Regan, K. Thromboprophylaxis using a low molecular weight heparin delays fracture repair. Clin. 
Orthop. 2000, 381, 278–289. 
24. Li, Y.; Liu, L.; Li, S.; Sun, H.; Zhang, Y.; Duan, Z.; Wang, D. Impaired bone healing by enoxaparin via inhibiting the differentia‐
tion of bone marrow mesenchymal stem cells towards osteoblasts. J. Bone Miner. Metab. 2022, 40, 9–19. 
25. Filho, M.S.; Vidigal, L.; Canova, A.R. The effects of low molecular weight heparin (enoxaparin) on bony callus formation in rats 
femurs—An experimental study. Acta Orthop. Bras. 2006, 14, 78–82. 
26. Demirtas, A.; Azboy, I.; Bulut, M.; Ucar, B.Y.; Alabalik, U.; Necmioglou, N.M. Investigation of the effects of Enoxaparin, Fondap‐
arinux, and Rivaroxaban used in thromboembolism prophylaxis on fracture healing in rats. Eur. Rev. Med. Pharm. Sci. 2013, 17, 
1850–1856. 
27. Duan, Y.; Ma, W.; Li, D.; Wang, T.; Liu, B. Enhanced osseointegration of titanium implants in a rat model of osteoporosis using 
multilayer bone mesenchymal stem cell sheets. Exp. Ther. Med. 2017, 14, 5717–5726. 
28. Ozaras, N.;    Rezvani, A. Diffuse skeletal pain after administration of alendronate. Indian J. Pharm. 2010, 42, 245–246. 
29. da Silva Mello, A.S.; dos Santos, P.L.; Marquesi, A.; Queiroz, T.P.; Margonar, R.; de Souza Faloni, A.P. Some aspects of bone 
remodeling around dental implants. Rev. Clin. Periodoncia Implantol. Rehabil. Oral 2016, 11, 49–53. 
30. Oh, K.C.; Moon, H.S.; Lee, J.H.; Park, Y.B.; Kim, J.‐H. Effects of alendronate on the peri‐implant bone in rats. Oral Dis. 2015, 21, 
248–256. 
31. Figuero‐Filho, E.A.; Aydos, R.D.; Senefonte, F.R.; Ferreira, C.M.; Pereira, E.F.; de Oliveire, V.M.; de Menezes, G.P.; Bosio, M.A.C. 
Effects of enoxaparin and unfractioned heparin in prophylactic and therapeutic doses on the fertility of female Wistar rats. Acta 
Cir. Bras. 2014, 29, 410–416. 
32. Hiebert, L.M.; Ping, T.; Wice, S.M. Repeated doses of oral and subcutaneous heparins have similar antithrombotic effect in rat 
carotid arterial model of thrombosis. J Cardiovasc. Pharm. 2012, 17, 110–116. 
33. Miklosz, J.; Kalaska, B.; Kaminski, K.; Szczubialka, K.; Pawlak, D.; Nowakowska, M.; Mogielnicki, A. Heparin binding copoly‐
mer reverses the anticoagulant activity of low molecular weight heparins: Safety and efficacy data in rats. Cardiovasc. Res. 2018, 
114 (Suppl. 1), S95.