Qisti, Pujiyanto, Wijanarka dan Fahrurrozi Berkala Bioteknologi, vol. 2, no.

2, November 2019

Skrining Aktivitas Antibakteri dan Identifikasi Molekuler Berdasarkan

Gen 16S rRNA Isolat Aktinomiset Asal Pulau Enggano dan Bali

Rahmah Qisti Nandina1, Sri Pujiyanto1, Wijanarka1, Fahrurrozi2

1
Laboratorium BioteknologiDepartemen Biologi FSM Undip
Fakultas Sains dan Matematika Universitas Diponegoro
Semarang 50275 Tlp. (024) 7474754; Fax. (024) 76480690
2
Laboratorium Mikrobiologi Terapan Bioteknologi LIPI
Email: rahmah_qisti@yahoo.co.id

ABSTRACT

Actinomycetes are a Gram positive bacteria who plays an important role in

pharmaceutical industry because of its ability to produce an antibacterial compound. This
study aims to select actynomycetes isolates that has antibacterial activity and to identify the
isolates based on 16S rRNA gene squence. The actinomycetes isolates were inoculated using
ISP-2 medium and cultured in SYP (starch, yeast, peptone) media for 13 days. The cultures
were extracted using etyl acetate solvent and antibacterial activity was tested against Bacillus
subtilis and Escherichia coliusing agar diffusion method.Positive isolates were identified
based on 16S rRNA gene sequence. The 16S rRNA gene from positive isolates was
sequenced and analyzed with computerized help and was deposited at NCBI. The
antibacterial activity test revealed 5 from 22 isolates had an antebacterial activity shown by
the clear zone around the whatman filter paper on both tested bacteria. The identification
revealed these five isolates were identified asStreptomyces mutabilis, Streptomyces sp, and
Streptomyces griseorubens. This study shows these isolates from Enggano and Bali Island are
potential as antibacteri producer.

Keywords : actynomycetes, antibacterial activity, 16S rRNA.

ABSTRAK

Aktinomiset merupakan bakteri Gram positif yangmampu memproduksi senyawa

metabolit sekunder. Penelitian ini bertujuan untuk menyeleksi isolat aktinomiset yang
memiliki aktivitas antibakteri dan mengidentifikasinya berdasarkan gen 16S rRNA. Isolat
aktinomiset diremajakan pada medium ISP-2 kemudian dikultur pada medium cair SYP
(starch, yeast, peptone) selama 13 hari. Kultur diekstraksi menggunakan pelarut etil asetat
dan aktivitas antibakteri diuji tehadap bakteri Bacillus subtilis dan Escherichia coli dengan
metode difusi agar.Isolat positif diidentifikasi berdasarkan gen 16S rRNA. Gen 16S rRNA
dari kelima isolat disekuens dan dianalisis dengan bantuan komputerisasi BLAST dan pada
basis data NCBI. Hasil uji aktivitas antibakteri dari 22 isolat diperoleh 5 isolat memiliki
aktivitas antibakteri yang ditunjukkan dengan adanya daerah bening disekitar kertas cakram
pada kedua bakteri uji. Identifikasi molekuler berdasarkan gen 16S rRNA kelima isolat ini
teridentifikasi sebagaiStreptomyces mutabilis, Streptomyces sp, dan Streptomyces
griseorubens.

Kata kunci : aktinomiset, aktivitas antibakteri, 16S rRNA.

PENDAHULUAN Penyakit infeksi (Infectious diseases)
adalah penyakit yang disebabkan oleh
mikroba patogen. Secara umum proses mewakili atau berhubungan dengan bakteri
terjadinya penyakit melibatkan tiga faktor patogen.
yang saling berinteraksi yaitu : faktor Aktinomiset dikenal sebagai bakteri
penyebab penyakit (agen), faktor manusia penghasil antibiotik, karena lebih dari
atau pejamu (host), dan faktor lingkungan. 10.000 antibiotik yang telah ditemukan,
Profil data kesehatan Indonesia tahun dua pertiganya dihasilkan oleh bakteri ini.
2014, menyebutkan terdapat beberapa Sebagai penghasil senyawa antibiotik,
kasus infeksi bakteri di Indonsia, seperti aktinomiset banyak digunakan dalam
tuberkulosis yang disebabkan infeksi industri obat, pakan ternak atau unggas,
bakteri Mycobacterium tuberculosis pengawetan makanan, pertanian, dan
dengan 183 kasus per 100.000 penduduk, perikanan. (Susilowati et.al, 2007).
difteri yg disebabkan bakteri Aktinomiset menjadi kelompok terbesar
Corynebacterium diphtheride dengan 396 sebagai sumber daya mikroba yang
kasus dan 16 diantaranya meninggal, menghasilkan antibiotika dan juga
tetatanus yg disebabkan oleh bakteri memproduksi berbagai metabolit bioaktif
Clostridium tetani dengan 84 kasus dan 54 nonantibiotika, seperti enzim, inhibitor
diantaranya meniggal, dan penyakit kusta enzim, regulator imunologi, antioksidasi
yg disebabkan oleh bakteri reagen.
Mycobacterium leprae dengan 17.025 Aktinomiset memiliki potensi besar
kasus. untuk mensintesis metabolit sekunder
Pengobatan penyakit infeksi bioaktif. Penelitian ini dilakukan dengan
tergantung dari penyebabnya. Jika tujuan untuk melakukan seleksi isolat
disebabkan oleh jamur, maka diobati aktinomiset asal Pulau Enggano dan Bali
dengan antijamur,jika oleh virus maka penghasil senyawa antibakteri dan
diobati dengan antivirus, jika oleh bakteri melakukan identifikasi terhadap isolat
maka diobati dengan antibakteri atau penghasil senyawa antibakteri berdasarkan
sering disebut antibiotik. Antibiotik gen 16S rRNA.
merupakan obat pilihan utama dalam
mengatasi penyakit infeksi, terutama yang METODE PENELITIAN
diakibatkan oleh bakteri, namun demikian,
selain masalah toksisitas dan efek samping Bahan dan Isolat
yang ditimbulkan, resistensi bakteri Bahan-bahan yang digunakan adalah 22
terhadap antibiotik saat ini semakin isolat aktinomiset koleksi bioteknologi
meningkat dan menjadi masalah utama LIPI asal Pulau Enggano dan Bali, media
dalam mengatasi penyakit infeksi.
ISP-2, media SYP, bakteri Bacillus subtilis
Kebutuhan antibiotik barumasih sangat
tinggi, terutama yang efektif melawan dan Escherichia coli, TE buffer, Tris-HCl,
mikroba patogen yang resisten terhadap NaCl, EDTA, SDS, sodium asetat, dan
beberapa jenis antibiotik. isopropanol.
Antibiotik mempunyai nilai ekonomi
tinggi di bidang kesehatan, karena Peremajaan Isolat Aktinomiset
kegunaannya untuk mengobati berbagai Isolat Aktinomiset diremajakan pada
jenis penyakit infeksi. Cara utama dalam media ISP-2 yang terdiri dari 4 g ekstrak
menemukan antibiotika yaitu melalui ragi, 10g ekstrak malt, 4 g glukosa, dan 20
‘screening’. Sejumlah isolat g agar dalam 1liter air dengan masa
mikroorganisme penghasil antibiotik yang inkubasi 7-14 hari (Ratnakomalasari et.al,
diperoleh dari alam, diuji dengan bakteri 2016).
uji. Bakteri yang digunakan untuk
pengujian, dipilih dari berbagai tipe, dan Produksi Aktinomiset pada Kultur Cair
 Produksi aktinomiset pads kultur Pengujian aktivitas antibakteri
cair menggunakan media SYP (Starch, dilakukan dengan metode difusi
yeast, peptone).Produksi awal aktinomiset menggunaan 2 lapis media Mueller Hinton
dilakukan dengan membuat pre-kultur (lapisan bawah dan lapisan atas).Lapisan
aktinomiset pada 5 ml SYP di dalam bawah merupakan 10 – 15 ml Mueller
tabung reaksi. Isolat aktnomiset pada Hinton, sedangkan lapisan atas adalah 5 ml
cawan petri diambil menggunakan sedotan Mueller Hinton dengan komposisi ½ resep.
steril sebanyak 1 sedotan dan di hancurkan Bakteri Uji dengan nilai transmitan 25%
menggunakan tusuk sate di tabung reaksi. pada panjang gelombang 580 nm
Pre-kultur diinkubasi selama 3 hari pada (kementrian kesehehatan Indonesia,2010)
inkubator shaker 120 rpm. Setelah 3 hari ditambahkan pada lapisan atas dan dituang
pre-kultur dipindahkan ke dalam media ke cawan petri yang sudah dituang lapisan
kultur yaitu 95 ml SYP. Kulture diinkubasi bawah sebelumnya. Bakteri uji
kembali di incubator shaker pada suhu 27- diinokulasikan pada media sebanyak 0,2%
30 ºC selama 10 hari (Nurkanto et.al, E.coli dan 0,1% B.subtilis(Miyadoh dan
2012). Otoguro, 2004).
Ektrak diteteskan pada papper disk
Ektraksi Senyawa Aktif Aktinomiset 5mm sebanyak 30µl dengan dua kali
Ekstraksi dilakukan menggunakan penetesan dan dibiarkan sampai
100 ml pelarut etil asetat pada kultur mengering.Papper disk diletakkan pada
aktinomiset. Kultur diinkubasi pada shaker permukaan Mueller Hinton yang telah
selama 1 jam untuk memaksimalkan diinokulasikan bakteri uji.Papper disk
pelarutan senyawa aktif dari aktinomiset. dengan tetesan methanol dan
Etil asetat selanjutnya dipisahkan dari kloramfenikol digunakan sebagai kontrol
kultur dan dievaporasi pada suhu 50ºC (Wahyuni et.al, 2004).
sampai tersisa kurang lebih 3 ml. Hasil
ektraksi selanjutnya dimasukkan ke dalam Amplifikasi Gen 16S rRNA
vial gelas lalu diuapkan kembali sampai Endapan aktino pada kultur murni
mengering. Ekstrak dikeringkan dan sebanyak 1 ml disentrifuge selama 5 menit
ditimbang. Pelarut Metanol digunakan pada 13.000 rpm. Pellet kemudian
ketika ektrak akan digunakan.Metanol digunakan untuk ektraksi DNA dengan
merupakan pelarut yang bersifat universal metode sederhana hasil modifikasi LIPI
sehingga dapat melarutkan analit yang dengan rujukan lisdiyanti et.al(2001).
bersifat polar dan nonpolar (Astarina, Primer 9F (forward :5’-
2013). GAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’) dan
1541R (reverse: 5’-
AAGGAGGTGATCCAGCC-3’)
Peremajaan Bakteri Uji digunakan untuk mengamplifikasi gen 16S
Bakteri uji yang digunakan adalah rDNA pada reaksi PCR. Primer ini akan
Escherichia coli dan Bacillus subtilis. menghasilkan amplikon sepanjang
Bakteri uji diremajakan pada media NA 1500bp. PCR dilakukan menggunakan
dan diinkubasi selama 24 – 48 jam. Kappa 2G fast master kit dengan total
Bakteri uji yang telah diremajakan, volume 50 µl yang terdiri dari 20 μL
ditumbuhkan kembali pada 5 ml media NB dH2O, 25 μL PCR master mix, 2 μL
dan di shaker selama 24 jam sebelum primer 9F (20 pmol), 2 μL primer 1541R
digunakan (wahyuni et.al, 2014). (20 pmol), and 1 μL DNA template. PCR
dilakukan dengan kondisi denaturasi awal
pada 96 °C selama 5 menit, denaturasi
Uji Aktivitas Antibakteri Ektrak pada 96°C selama 30 detik, annealing pada
Aktinomiset 55°C selama 30 detik, elongasi pada 72°C
selama 1 menit, dan ekstensi pada 72°C fermentasi apabila dibandingkan dengan n-
for 7 min. PCR dilakukan sebanyak 30 heksan ataupun kloroform
siklus. Hasil PCR divisualisai (Sulistyani;Akbar, 2014). Penambahan etil
menggunakan elektroforesis gel pada 1x asetat pada kultur cair aktinomiset
TE buffer (Aeny et.al, 2018). Produk PCR membentuk dua lapisan yang disebut
dikirimkan ke Genetika Science untuk supernatan (lapisan atas berwarna bening)
reaksi sekuens. Hasil sekuens dianalisis dan subnatan (lapisan bawah). Supernatan
menggunakan program BioEdit dan adalah lapisan cairan etil asetat yang
dianalisis BLAST pada situs NCBI. diperkirakan telah melarutkan senyawa
aktif antibakteri.
HASIL DAN PEMBAHASAN Pengujian aktivitas antibakteri
Hasil Peremajaan Isolat Aktinomiset dilakukan dengan tujuan untuk mengetahui
selama 7- 14 hari membentuk isolat yang ada atau tidaknya pengaruh ekstrak dalam
berspora ditandai dengan munculnya spora menghambat pertumbuhan bakteri
yang menyerupai serbuk (gambar1). uji.Hasil penapisan pada 22 isolat
aktinomiset terhadap bakteri uji,
menunjukkan bahwa dari 22 isolat,
terdapat 5 isolat yang memililki daya
hambat terhadap bakteri uji dan 17 isolat
tidak memiliki daya hambat. Kadar ekstrak
yang digunakan adalah ekstrak yang sudah
dilarutkan pada metanol sebanyak 1 ml
sebagai ektrak pekat dan ektrak yang
sudah diencerkan 10x. Variasi kadar
Gambar 1.Morfologi Makroskopis Isolat dilakukan dengan tujuan untuk melihat
Aktinomiset hasil peremajaan umur 7-14 perbedaan diameter hambat dari masing-
hari. masing kadar yang digunakan. Isolat
positif ditunjukkan dengan adanya zona
Isolat ditumbuhkan pada kultur starter bening disekitar papper disk. 5 isolat yang
(5 ml SYP). Kultur starter selanjutnya memiliki aktivitas antibakteri adalah SHP
disubkultur pada media dengan volume 22-7, SHP 2-1, BSE 7F, BSE 7-9, dan
yang lebih besar dan diinkubasi selama BSE 11A..Hasil pengukuran diameter zona
selama 13 hari.Isolat Aktinomiset, pada bening ditunjukkan pada Tabel 1.
kultur cair akan membentuk granul dan Menurut Davis dan Stout (2009), jika
memiliki larutan yang jernih.Kultur starter diameter daerah hambatan kurang dari 5
dibuat agar ada proses penyesuaian mm maka aktivitas penghambatannya
aktinomiset dengan media yang digunakan dikategorikan lemah, daerah hambatan 5 –
dan agar pertumbuhan sudah mencapai 10 mm dikategorikan sedang, daerah
fase eksponensial, yaitu fase pertumbuhan hambatan 10 – 20 mm dikategorikan kuat
sel yang paling optimal. Pada umumnya dan jika diameter hambatan lebih dari 20
selama 13 hari tersebut, Actinomycetes mm maka dikategorikan sangat kuat.
sudah memasuki fase stasioner (Sulistiyani Berdasarkan kategori tersebut isolat SHP
dan Mulyadi 2013). 22-7 dan BSE 7F tergolong pada katagori
Ekstraksi senyawa aktif dari isolat daya hambat sedang, baik pada kadar
aktinomiset menggunakan pelarut etil ektrak pekat maupun kadar ektrak yang
asetat. Etil asetat merupakan pelarut polar
yang mampu menarik metabolit sekunder
dengan jumlah paling banyak dari cairan
Tabel 1.Hasil pengukuran diameter zona bening yang dihasilkan
terhadap bakteri uji Bacillus subtilis dan Escherichia coli.
 Daya Hambat (mm)
Kadar isolat kode isolat
B.Subtilis E.coli
Ektrak pekat SHP 22- 7 9 8
BSE 7F 9 8
BSE 7-9 18 16
SHP 2-1 22 12
BSE 11A 12 13
x
Pengenceran 10 SHP 22- 7 - 6.3
BSE 7F 7.3 7.3
BSE 7-9 11.3 14
SHP 2-1 14.6 8,3
BSE 11A 9.3 8,3
Kontrol Positif kloramfenikol 35 20
Kontrol Negatif Aquades - -
Metanol - -

telah diencerkan. BSE 7-9 dapat Berdasarkan hasil pengamatan dan

dikategorikan pada aktivitas pengukuran yang dilakukan, kelima
penghambatan kuat pada kedua kadar ekstrak isolat aktinomiset tersebut mampu
ektrak uji. SHP 2-1 tergolong kategori menghambat pertumbuhan kedua bakteri
sangat kuat pada ektrak pekat dan kategori uji yang merupakan perwakilan bakteri
kuat pada esktrak yang diencerkan. Gram positif dan Gram negatif. Hal ini
Sedangkan BSE 11A tergolong pada menunjukkan senyawa yang dihasilkan
kategori penghambatan kuat untuk ekstrak kemungkinan tergolong dalam antibiotika
yang pekat, dan kemampuannya menurun spektrum luas. Menurut Wahyuni (2014),
menjadi kategori sedang pada ekstrak yang ruang lingkup antibakteri terbagi menjadi
telah diencerkan. MenurutRahmah et.al 3 bagian. Pertama, antibiotika spektrum
(2017), kemampuan suatu antimikroba luas (board spectrum) yaitu senyawa
dalam menghambat mikroorganisme antibiotika yang dapat menghambat
tergantung pada konsentrasi bahan berbagai macam mikroba.Kedua
antimikroba dan jenis bahan antimikroba antibiotika spektrum terbatas (limited
yang dihasilkan.Semakin besar konsentrasi spectrum) apabila antibiotika tersebut
suatu antimikroba, maka semakin besar efektif menghambat organisme tunggal
zona bening yang terbentuk. Hal ini atau organisme penyebab penyakit
disebabkan karena semakin tinggi tertentu.Ketiga, antibiotika berspektrum
konsentrasi bahan antimikroba, maka sempit (narrow spectrum) yang hanya
semakin banyak zat aktif yang efektif menghambat sebagian bakteri
terkandung di dalamnya sehingga Gram positif atau Gram negatif.
efektivitas dalam menghambat bakteri Pengamatan dan pengukuran terhadap
akan semakin meningkat dan aktivitas antibakteri dilakukan pada 24 jam
menghasilkan zona bening yang lebih luas. dan 48 jam. Dari pengamatan tersebut
Sebaliknya, pada konsentrasi yang rendah diperoleh hasil bahwa zona hambat yang
maka zat antimikroba yang terdapat di terbentuk tidak berubah dan tidak terlihat
dalam suatu bahan antimikroba akan bahwa intesitas zona bening berkurang.
semakin sedikit, sehingga aktivitasnya Dari hasil ini dapat dikatakan bahwa
akan semakin berkurang.
 A A B
A

C D E
Gambar 2. Hasil uji aktivitas antibakteri terhadap bakteri Escherichia coli(A) ekstrak pekat
A A
(B)Aekstrak encer BSE 7-9 (C) ektrak encer BSE 7F (D) ektrak encer BSE 11A
(E) ektrak encer SHP 2-1

A B C
A A

D E F
Gambar 3. Hasil uji aktivitas antibakteri terhadap bakteri Escherichia coli(A) ekstrak pekat
A A A
(B) ekstrak encer SHP 2-1 (C) ektrak encer BSE 7-9 (D) ektrak encer BSE 11A
(E) ektrak encer SHP 22-7(F) ekstrak encer BSE 7F.

senyawa antibakteri dari isolat aktinomiset Sedangkan bakteriosidal dideskripsikan

yang diperoleh bersifat sebagai suatu agen antibakteri yang
bakteriosidal.Senyawa dengan aktivitas menyebabkan kematian terhadap bakteri
antibakteri terbagi menjadi bakteriostatik tersebut.(Adzitey, F 2015).
dan bakteriosidal.Bakteriostatik Gen 16S rRNA digunakan sebagai
dideskripsikan sebagai suatu agen acuan untuk identifikasi bakteri karena gen
yangdapat menghambat pertumbuhan ini merupakan gen yang paling tahan
bakteri untuk sementara waktu. Ketika terhadap perubahan atau evolusi. Hasil
kadar obat sudah berkurang atau habis, identifikasi pada BLASTditunjukkan pada
maka bakteri akan kembali tumbuh. Tabel 2.
 Tabel 2. Hasil Identifikasi Isolat Aktinomiset berdasarkan gen 16S rRNA

Kode Teridentifikasi Sebagai Accesion

kemiripan
Isolat
SHP 22- 7 Streptomycesmutabilis 99% KY120282.1
SHP 2-1 Streptomycessp. SRh7 99% KY120282.1
BSE 7-9 Streptomycesgriseorubens 99% KF733396.1
BSE 7F Streptomycesgriseorubens 99% LM644089.1
BSE 11A Streptomyces sp. SR-R35 99%- KP900825.1

Hasil ini sesuai dengan pendapat Anderson isolat termasuk dalam margaStreptomyces
& Wellington (2001) yang menyatakan yang terdiri dari 16 jenis.
bahwa aktinomisetes terutamagenus
Streptomyces merupakan penghasil utama KESIMPULAN
antibiotik,dan dua pertiga antibiotik yang Hasil pengujian aktivitas
telah dipasarkan saat ini dihasilkan oleh antibakteri terhadap 22 isolat aktinomiset
Streptomyces. Hal ini juga selaras dengan asal Pulau Enggano dan Bali, diperoleh 5
penelitian penelitian Ratnakomala et.al isolat memiliki daya hambat terhadap
(2016), lebih dari 90% aktinomisetes yang bakteri uji Bacillus subtilis dan
terisolasi di Pulau Enggano adalah dari Escherichia coli. 5 isolat
kelompok marga Streptomyces. Penelitian terpilihmenunjukkan isolat-isolat tersebut
tersebut menyebutkan, dari 23 isolat yang teridentikasi sebagai
telah berhasil diidentifikasi berdasarkan Streptomycesmutabilis, Streptomyces sp,
sekuen gen 16S rRNAnya, sebanyak 22 dan Streptomyces griseorubens.

Gambar 4.Pohon filogenetik isolat aktinomiset dengan metode Neighbor-Joining pada

1000 kali replikasi bootstrap.
UCAPAN TERIMA KASIH Nurkanto, A., Heddy, J. Andria, A.,
Terimakasih kepada kepala dan Wellyzar, S. 2012. Screening
seluruh staff laboratorium mikrobiologi Antimicrobial Activity of
terapan bioteknologi LIPI atas seluruh Actinomycetes Isolated from Raja
fasilitas dan bantuan selama menjalankan Ampat, West Papua, Indonesia.
penelitian. Makara Journal of Science. 16(1): 21-
26.
Rahmah, R. P. A., Meiskha, B., Yanti, H.
DAFTAR PUSTAKA 2017. Uji Daya Hambat Filtrat Zat
Adzitey, F. 2015. Antibiotic Classes and Metabolit Lactobacillus
Antibiotic Susceptibility of Bacterial plantarumTerhadap Pertumbuhan
Isolates from Selected Poultry; A Mini Shigella dysenteriae Secara In Vitro.
Review.World Vet J. 5(3): 36-41. Jurnal Biogenesis UIN Alaudin. 5(1) :
Aeny, T. N., Joko, P., Radix, S., 34-41.
Suskandini R. D., Efri, Ainin, N. Ratnakomala, S., Pamella, A., Fahrurrozi,
2018.Isolation and identification of Puspita, L., Wien, K. 2016.Aktivitas
actinomycetes potential as the Antibakteri Aktinomisetes Laut Dari
antagonist of Dickeya zeae pineapple Pulau Enggano. Jurnal Ilmu-ilmu
soft rot in Lampung, Indonesia. Hayati.15(3) : 275-283.
BIODIVERSITAS. 19(6): 2052-2058. Sulistyani, N. dan Akbar, N.A.
Anderson , A. S., Wellington , E. M. 2001. 2014.Aktivitas Isolat Actinomycetes
The taxonomy of Streptomyces and dari Rumput Laut (Eucheuma
related genera. Int. J. of Systematic cottonii) sebagai Penghasil Antibiotik
and Evolutionary Microbiology, 51, terhadap Staphylococcus aureus dan
797-814. Escherichia coli. Fakultas Farmasi
Astarina, N. W. G., Astuti, K. W., Universitas Ahmad Dahlan. Jurnal
Warditiani, N. K. 2013. Skrining Ilmu Kefarmasian Indonesia. 12 (1) :
Fitokimia Ekstrak Metanol Rimpang 1-9.
Bangle (Zingiber purpureum Roxb.). Wahyuni, D.S.,Mirnawati, B.,Sudarwanto,
Jurnal Farmasi Udayana Puspita, L.2014.Screening of
Davis WW & Stout TR. 2009. Disc Plate Antibacterial Activities of
Method of Microbiological Actinomycetes Isolates from
Antibiotic Assay. Applied and Indonesia.Global Veterinaria. 13(2):
Enviromental Microbiology. 22 (4): 266-272.
666-670.
Lisdiyanti, P., Hiroko, K., Tatsuji, S.
Yuzo, Y. Tai, U. Kazuo, K. 2001.
Identification of Acetobacter strains
isolated from Indonesian sources,
and proposals of Acetobacter
syzygiisp.nov., Acetobacter
cibinongensissp. nov., and
Acetobacter orientalissp. nov.The
Journal of general and applied
microbiology.47(3): 119-131.
Miyadoh S., Otoguro M. 2004. Workshop
on Isolation Methods and
Classification of Actinomycetes.
Bogor (ID): Biotechnology Centre,
LIPI.